TWI530686B - 用於肝纖維化診斷之生物標記 - Google Patents

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Description

用於肝纖維化診斷之生物標記
本發明係基於對於診斷肝纖維化之三種新穎的血清生物標記，即尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase type plasminogen activator,uPA)、間質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)與β-2-微球蛋白(β-2-microglobulin,β-2MG)的非預期發現(GenBank編號請見第六頁)。
肝纖維化涉及細胞外間質蛋白(extracellular matrix proteins)(例如膠原蛋白)於肝臟細胞上之過度聚集而產生疤痕組織。其發生於大部分之慢性肝臟疾病中，例如代謝性肝臟疾病及與B或C型肝炎感染和飲酒相關的(alcohol consumption)肝病。較嚴重之肝纖維化可能導致肝硬化(cirrhosis)、肝癌、肝衰竭(liver failure)與肝門靜脈高壓症(portal hypertension)等。
目前，肝穿刺(biopsy)是用來偵測肝纖維化與確認其嚴重度之最適方法。然而，肝穿刺為侵入性檢查，非為最理想診斷方法。
目前肝纖維化相關的血清生物標記已被發展用來做非侵入式診斷。但此方法之準確度與靈敏度非常依賴所使用之生物標記。因此，鑑定出能以高靈敏度區分纖維化與非纖維化族群之可靠的生物標記非常重要。
本發明係基於對於診斷肝纖維化之三種新穎的血清生物標記，即尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase type plasminogen activator,uPA)、間質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases9,MMP9)與β-2-微球蛋白(β-2-microglobulin,β-2MG)的非預期發現。
因此，本發明之一實施態樣係根據上列三種生物標記之一或多個組合的表現程度，且視需要結合一或多個血清生物標記，例如麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOP)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)與α-胎兒蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)作為診斷肝纖維化的方法。
上述之診斷方法包括至少四個步驟：(i)自一被懷疑具有肝纖維化之人類個體(例如B或C型肝炎病毒帶原者，或具有飲酒相關之肝臟疾病或代謝性肝臟疾病的病患)獲得一血液樣本，(ii)偵測上述所列生物標記之一或多個於該血液樣本中的表現程度，(iii)根據該表現程度計算其疾病分數，(iv)根據該疾病分數確認該個體是否具有纖維化。診斷方法在步驟(iv)之後可視需要包括額外步驟(v)：根據該疾病分數與指出不同纖維化程度之預先確認的截斷值(cutoff value)進行比較來評估該個體之纖維化程度。此處使用之用詞“診斷”意指確認於一個體(例如，人類)中之肝纖維化的存在與否或評估於一個體中之該疾病嚴重程度。血液樣 本可為獲得自血液之任何樣本，包括血清樣本或血漿樣本。
肝纖維化相關生物標記之疾病分數，可使用鑑別函數分析(discriminant function analysis)、脊迴歸分析(ridge regression analysis)或邏輯迴歸分析(logistic regression analysis)等方法運算。
本發明之另一實施態樣以含有與不同抗原決定位結合之至少兩種抗體(例如，完整之免疫球蛋白分子)的診斷套組。此兩種抗體之一為專一於尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9或β-2-微球蛋白之抗體，而另一則為專一於尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶或α-胎兒蛋白之抗體。此兩抗體具有不同之抗原專一性。在一例子中，套組含有一抗-尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之抗體，與一抗-間質金屬蛋白酶9之抗體，以及一抗-β-2-微球蛋白之抗體。在另一例子中，套組基本上由上述抗體所組成，即僅包含專一於要被偵測之抗原(例如，纖維化相關生物標記)的抗體，用以診斷肝纖維化。
並列於本發明範圍中者為上述之任何抗體於診斷肝纖維化中或於製造肝纖維化診斷套組中的使用。
本發明之一或多個實施例的細節列舉於以下之敘述中。自以下數個實施例的詳細敘述及其申請專利範圍會顯示出本發明之其它特徵或優點。
在一方面，本發明與診斷肝纖維化的方法相關，其係根據尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase type plasminogen activator,uPA)、間質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)、β-2-微球蛋白(β-2-microglobulin,β-2MG)、其組合，或組合(a)一或多個尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白與(b)一或多個額外之纖維化生物標記(例如，麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOP)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)與α-胎兒蛋白(alpha-fetoprotein,AFP))之血液濃度的組合。此方法可提供至需要之人類病患以確認於那病患中之肝纖維化的存在與否，或其纖維化程度。人類病患可為B型肝炎病毒或C型肝炎病毒的帶原者，或具有酒精性相關之肝臟疾病(例如，脂肪肝(fatty liver)與酒精性肝炎(alcoholic hepatitis))、代謝性肝臟疾病或肝癌的病患。
人類尿激素纖維蛋白溶酶原活化子具有兩種異構物(isoform)，其兩者皆可被使用於本發明之診斷方法中。異構物1之GenBank獲得編號為NP_002649.1(18-OCT-2009)，而異構物2之GenBank獲得編號為NP_001138503.1(18-OCT-2009)。其它兩個新穎的標記，間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白的GenBank獲得編號分別為NP_004985.2(22-NOV-2009)與NP_004039.1(25-OCT-2009)。
為了實施本發明之方法，血液樣本可獲得自被懷疑具 有肝纖維化之人類個體且可藉由常見方法，例如ELISA與西方轉漬墨點法(Westernblot)來確認上述生物標記之一或多個的程度。利用生物標記之程度的資料做適合的分析(例如，鑑別函數分析(discriminant function analysis)、邏輯迴歸分析(logistic regression analysis)、脊迴歸分析(ridge regression analysis)或主成分分析(principal component analysis))以產生能描述其生物標記的血清蛋白質圖譜(blood profile)特徵之疾病分數(例如藉由一數值之數字來表現)。其它臨床因子(例如年紀與性別)可視需要置入考慮中。之後將疾病分數與區分肝纖維化之有或無的截斷值(cutoff-value)，或者與區分不同纖維化程度的一組截斷值進行比較以評估該個體是否具有肝纖維化；且若有，位於哪個病程中。其截斷值之設定，可藉由使用相同分析方法，分析在無纖維化之個體中與在不同程度之肝纖維化病患中的相同生物標記之血清蛋白質圖譜來達成。例如，其可為介於無纖維化個體之疾病分數與纖維化病患之疾病分數間的中點(middle point)。
下述為根據被確認為與不同程度之纖維化相關因子來測定前述之截斷值的一示範步驟：(1)將肝纖維化之病患根據其疾病情況(例如纖維化程度與風險因子)歸類於不同群組；(2)測定於病患中可能與纖維化程度相關之潛在因子；(3)藉由單變數分析(univariate analysis)來鑑定那些 來自於不同病患群組間顯著不同的潛在因子；(4)使這些經鑑定之因子接受鑑別函數分析、邏輯迴歸分析、脊迴歸分析或一般線性模型(generalized linear model)以評估在纖維化診斷中之各因子的獨立值；(5)根據被鑑定之獨立因子(包括纖維化相關生物標記，與適當臨床因子)，建立一鑑別、脊迴歸或邏輯迴歸模型(例如，一公式)並計算其疾病分數，以及(6)根據表現各病患族群之疾病分數(例如，平均值)，與其它恰當的因子，例如靈敏度、專一度、陽性預測值(Positive predictive value,PPV)與陰性預測值(Negative predictive value,PPV)，來測定對於各疾病程度之截斷值。
藉由接收器操作特徵分析(receiver operating characteristic,ROC)以產生接收器操作特徵曲線(ROC curve)，可評估採用上述步驟建立之鑑別、脊迴歸或邏輯迴歸模型之診斷價值。於接收器操作特徵分析中，其最佳多變項模型(multivariable model)將得到最大的曲線下面積(Area under ROC Curve,AUROC)。參見敘述於以下實施例1-3中的模型。
也在本發明範圍中者為，用於上述診斷方法中的一套組。此套組包含一或多個專一於纖維化相關之生物標記尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之抗體，並視需要加入其它抗原(例如麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與α-胎兒蛋白)之抗體。在一實施例中，套組包括與相同生物標記結合之兩種不同 抗體(即一塗鍍抗體(coating antibody)與一偵測抗體)。通常偵測抗體可藉由其本身、或是經由與其它試劑結合，而鍵結發出可偵測訊號的分子。此處所使用之用詞“抗體”意指一完整之免疫球蛋白或維持抗原結合活性之其片段，例如Fab或F(ab’)2。其可為自然發生或經基因工程(例如，單鏈抗體、嵌合抗體(chimeric antibody)或人源化抗體)。
可自商業製造供應商獲得包含於本發明之套組中的抗體，或者可藉由一般方法製備。參見，例如Harlow and Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。為了製造抗如上列之特定生物標記的抗體，可視需要將生物標記(或其片段)與攜帶者蛋白(carrier protein)(例如，KLH)結合並與佐劑混合且注入宿主動物。之後可藉由親和層析(affinity chromatography)純化產生於動物中之抗體。一般使用之宿主動物包括兔子、小鼠、天竺鼠與大鼠。可被用來增加免疫反應之多種佐劑視宿主種類而定且包括佛朗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全與不完全)、礦物膠(mineral gel)，例如氫氧化鋁，CpG、表面活性物質(surface-active substance)，例如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(pluronic polyol)、聚陰離子(polyanion)、胜肽、油乳劑(oil emulsion)、裂螺科血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)與二硝基酚(dinitrophenol)。有效之人類佐劑包括BCG(bacille Calmette-Guerin)與短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。多株抗體，即異種群組(heterogeneous populations)之抗體分子表現於經免疫之動 物的血清中。
使用標準融合瘤技術(參見，例如Kohler et al.(1975)Nature 256,495；Kohler et al.(1976)Eur.J.Immunol.6,511；Kohler et al.(1976)Eur J Immunol 6,292；and Hammerling et al.(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.)可製備單株抗體，即同種群組(homogeneous populations)之抗體分子。特別是藉由培養連續細胞株(continuous cell line)而產生抗體的任何技術，例如敘述於Kohler et al.(1975)Nature 256,495 and U.S.Patent No.4,376,110；the human B-cell hybridoma technique(Kosbor et al.(1983)Immunol Today 4,72；Cole et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2026)，與EBV-融合瘤(EBV-hybridoma)技術(Cole et al.(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)亦可獲得單株抗體。此種抗體可為任何免疫球蛋白種類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD與其之任何次種類。可in vivo或in vitro培養本發明產生單株抗體之融合瘤。In vivo產生高效價之單株抗體的能力使其為特別有效製造方法之一。
此外，藉由已知技術可產生抗體片段。例如，此種片段包括，但不限於F(ab’)2片段，其可藉由胃蛋白脢(pepsin)分解抗體分子而產生；與Fab片段，其可藉由還原F(ab’)2片段之雙硫鍵(disulfide bridge)產生。
無更進一步詳細闡述，熟悉此技藝領域人士相信可以根據上述，利用本發明至其最大範圍。因此，下述特定實 施例僅被建構來說明，且不論於任何形式中並非為所揭露的限制，所有此處提及之出版物被引用作為本說明書的揭示內容。
【實施例】
實施例1：根據尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白與其它纖維化相關標記之血清濃度於C型肝炎病毒陽性病患中診斷其肝纖維化狀態。
材料與方法
(i)病患
全部233個個體，其中含140個C型肝炎病毒陽性病患(經由一免疫分析ELISA或RIA之血清測試來確認)與93個健康個體參與此研究。這些個體隨機被指派至一訓練組(training set)(n=148)與一測試組(testing set)(n=85)。其所有個體均接受例行性實驗室檢查，包括肝功能指數(麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(GOT/AST)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT/ALT)、血清總膽紅素(bilirubin)、鹼性磷酸酶與血清白蛋白(albumin))、凝血酶原時間(Prothrombin Time)/國際標準化比值(International normalized ratio,INR)、α-胎兒蛋白(AFP)、用以排除肝臟疾病之其它起因的測試、肝臟超音波、上內視鏡與經調整過之Skinner調查(用以確認飲酒習慣)。
(ii)肝穿刺分析
自病患獲得肝臟組織，且根據METAVR分數系統來分析其組織學特徵。簡單而言，將這些樣本(長度大於10mm)固定、以石蠟(paraffin)包埋，且以蘇木精伊紅番紅花(hematoxylin eosin safran)與Masson氏之三色(Masson’s trichrome)來染色以確認損傷或以苦味酸天狼星紅(Picrosirius-red)來染色用於偵測膠原蛋白。根據下列標準來評估各切片之肝纖維化程度(即纖維化的量)：
F0：無纖維化。
F1：肝門的(portal)纖維化無隔膜(septa)。
F2：少數隔膜。
F3：為數眾多的隔膜無肝硬化(cirrhosis)。
F4：肝硬化。
也採用一般方法測定各切片之級別(grade)(即由C型肝炎病毒感染導致之發炎程度)。
(iii)血清學分析
自各病患取得10mL之靜脈血液，收集於無添加劑之試管中，於室溫維持靜止30分鐘。之後將血液樣本於4℃進行離心1600g，15分鐘，且收集浮在表層之血清樣本。
使用IMUBIND uPA ELISA套組(American Diagnostica Inc)，根據製造商提供之操作指南來測量尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之血清濃度。簡單而言，將血清樣本稀釋1/20於包含於此套組的稀釋液中。將100μL之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子標準品(提供於套組中)或經稀釋之樣本置 於預先以鼠科抗-尿激素纖維蛋白溶酶原活化子單株抗體塗鍍之微量測試盤(microtest plate)中。將此盤密封，隔夜培養於4℃，且之後以清洗緩衝溶液清洗4次。之後將鍵結生物素的(biotinylated)抗-尿激素纖維蛋白溶酶原活化子單株抗體加至盤中。在於室溫培養1小時後，將此盤清洗且加入一卵白素(streptavidin)連結之山葵過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)。1小時後，將一含山葵過氧化酶受質的溶液，即高硼酸鹽(perborate)/3’3,5,5,-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)加至盤中，其維持於室溫20分鐘以允許酵素反應發生。藉由加入50μL 0.5N H2SO4來終止反應，且使用Spectramax M5(Molecular Devices)來測量於450nm之吸光值。使用四參數適配(four-parameter fit)(SoftMax Pro software,Molecular Devices)建立一標準校正曲線(standard calibration curve)。之後根據吸光值對照標準曲線，來測定血清尿激素纖維蛋白溶酶原活化子濃度。根據製造商之操作指南，將所有測量執行三重複。
藉由Quantikine間質金屬蛋白酶9免疫分析(Quantikine MMP9 Immunoassay)(R&D Systems,Minneapolis,MN)來測定間質金屬蛋白酶9的血清濃度。此分析設計來測量間質金屬蛋白酶9的總量，包括其92kDa前驅物與82kDa成熟型兩者。簡單而言，將經稀釋之血清樣本(1：100)置於以抗-人類間質金屬蛋白酶9抗體預塗鍍之微孔盤中。兩小時後，將此盤進行清洗且加入鍵 結生物素的(biotinylated)抗-間質金屬蛋白酶9抗體。將此盤培養於室溫1小時，且加入卵白素連結之山葵過氧化酶後加入3’3,5,5,-四甲基聯苯胺(TMB)。藉由1mol/L硫酸終止反應且使用微量測量盤讀取器(microplate reader)Spectramax M5(Molecular Devices)測量在450nm與540nm的吸光值差值。根據此吸光值差值，如上述推算血清間質金屬蛋白酶9的濃度。根據製造商之操作指南，將所有測量執行三重複。
使用三明治酵素免疫分析套組(sandwich enzyme immunoassay kit)(GenWay Biotech)來測量血清之β-2-微球蛋白濃度，如下。將20μL之經稀釋之血清樣本(1：100)置於一以小鼠單株抗-β-2-微球蛋白抗體預塗鍍之微孔盤中，且以200μL之樣本稀釋液混合。將混合物於37℃培養30分鐘。將此盤以蒸餾水清洗4次，且之後加入山葵過氧化酶連接之綿羊抗-β-2-微球蛋白抗體。在於37℃培養30分鐘後，再次清洗此盤後加入3’3,5,5,-四甲基聯苯胺(TMB)。20分鐘後，藉由1N HCl終止酵素反應。以Spectramax M5(Molecular Devices)測量在450nm的吸光值，且採用前述方法測定-β-2-微球蛋白濃度。根據製造商之操作指南，將所有測量執行三重複。
藉由一般方法來測定其它纖維化相關標記，例如麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶或α-胎兒蛋白之血清濃度。
(iv)測定疾病分數
經由鑑別分析、脊迴歸分析或邏輯迴歸分析，並適時考慮臨床因子之相關性，來測定介於尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白或其組合之表現程度間的相互關係。根據靈敏度、專一度、陽性預測值與陰性預測值來評估對於三個生物標記之各個或其組合的診斷價值。且依疾病臨床診斷之需求來選取區分嚴重程度不同之截斷值(Cutoff point)(例如：所選取之Cutoff point需分別使得Sensitivity、Specificity、PPV、NPV、AUROC達到所設定個別需求之臨界值)，並依不同疾病嚴重程度之建議設定截斷值之範圍制定肝纖維化對照表。統計分析以R軟體處理。
結果
(i)病患特徵
包括獲得自上述實驗室測試之臨床因子與纖維化相關之生物標記的血清程度的病患特徵，顯示於以下表1中。
(ii)血清尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9或β-2-微球蛋白及其它臨床因子與肝纖維化之關連
如以下表2中所示，尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9或β-2-微球蛋白之血清程度與在訓練組及測試組病患兩者中之纖維化存在/不存在及嚴重度相關。
自沒有纖維化或具輕度纖維化的病患血清中測得低濃度的尿激素纖維蛋白溶酶原活化子與β-2-微球蛋白，而這兩個蛋白質的濃度在具有中度或嚴重纖維化病患中被顯著提高。尤其在訓練組中，於F0、F1、F2、F3與F4中之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子的血清濃度平均值被發現分別為0.46ng/mL、0.61ng/mL、0.75ng/mL、0.86ng/mL與1.66ng/mL，且於F0、F1、F2、F3與F4中之β-2-微球蛋白的血清濃度平均值被發現分別為1.26μg/mL、1.86μg/mL、2.22μg/mL、2.38μg/mL與4μg/mL。另一方面，健康病患或具有輕微纖維化之病患比起具有中度或嚴重纖維化之病患有顯著較高之間質金屬蛋白酶9的血清濃度。此標記之血清濃度平均值被發現分別為0.33μg/mL、0.16μg/mL、0.19μg/mL、0.14μg/mL與0.1μg/mL。自測試組獲得非常相似之資料。這些結果指出尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白均為用以診斷肝纖維化之可靠標記。
(iii)用以診斷肝纖維化之組合二個標記模型
來自此研究之結果指出尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸 轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶、α-胎兒蛋白與臨床因子之任兩個的經結合程度可被使用為用以診斷肝纖維化之可靠標記。以下顯示為兩個示範之組合二個標記模型，即尿激素纖維蛋白溶酶原活化子+間質金屬蛋白酶9，與尿激素纖維蛋白溶酶原活化子+麩胺酸丙酮酸轉胺酶，其包括根據各組合之經結合程度推算之用以計算疾病分數的方程式。這些方程式藉由鑑別函數分析、邏輯迴歸分析或脊迴歸分析來建立。也顯示於以下者為列出對於這些組合二個標記模型之截斷值、靈敏度、專一度、陰性預測值(NPV)與陽性預測值(PPV)與接收器操作特徵曲線下面積(area under the ROC curve,AUROC)的表(即表3-8)。
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子與間質金屬蛋白酶9
鑑別函數分析
疾病分數=1.4829×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-3.2605×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之係數值範圍(coefficient value)為0.741至1.763或1.26至1.705與間質金屬蛋白酶9之係數值範圍為-7.553至-2.839或-3.75至-2.771。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-2.2416+3.2059×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-5.6316×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)
常數項之係數(coefficient of intercept)範圍為-3至-1.48或-2.578至-1.905，尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之迴歸係數範圍為2.49至3.91或2.725至3.687，與間質金屬蛋白酶9之迴歸係數範圍為-8.01至-3.24或-6.477至-4.787。
脊迴歸分析
疾病分數=1.6641+1.7227×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.9821×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)
常項數之係數範圍為1.430至2.531或1.414至1.914，尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之迴歸係數範圍為1.191至1.938或1.464至1.895，與間質金屬蛋白酶9之迴歸係數範圍為-4.428至-1.501或-2.279至-1.685。
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子與麩胺酸丙酮酸轉胺酶
鑑別函數分析
疾病分數=1.5351×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)+0.0083×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子之係數範圍為0.949至1.750或1.305至1.719與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之係數範圍為0.006至0.017或0.007至0.01。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-3.7206+3.8376×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)+(-0.0001)×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-4.30至-3.14或-4.279至-3.274，及尿激素纖維蛋白溶酶原活化子與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為3.11至4.57或3.262至4.413與-0.01至0.002或-0.00012至-0.00008。
脊迴歸分析
疾病分數=0.9199+1.8321×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)+0.0034×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為0.705至1.281或0.782至1.03，及尿激素纖維蛋白溶酶原活化子與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為1.303至2.052或1.557至2.107與0.002至0.009或0.0029至0.0039。
(iv)用以診斷肝纖維化之組合三個標記模型
以下描述為根據尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶、α-胎兒蛋白與臨床因子之經結合血清程度之用於肝纖維化診斷的示範之組合三個標記模型。 這些模型藉由鑑別函數分析、邏輯迴歸函數分析與脊迴歸函數分析來建立。這些組合三個標記模型計算之疾病分數是以纖維化嚴重度為考量來進行分析。發現疾病分數與METAVIR纖維化程度判別有線性關係。
四個截斷值是針對(i)任何纖維化(健康對F1-F4)；(ii)中度纖維化(健康~F1對F2-F4)；(iii)嚴重纖維化(健康~F2對F3-F4)；以及(iv)肝硬化(健康~F3對F4)在訓練組中所決定並在測試組中驗證。
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白
鑑別函數分析
疾病分數=1.4159 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-3.0399×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0897×β-2-微球蛋白(μg/mL)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子的係數範圍為0.389至1.604或1.204至1.586、間質金屬蛋白酶9的係數範圍為-7.321至-2.302或-3.496至-2.584，與β-2-微球蛋白的係數範圍為0.048至1.114或0.076至0.103。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-3.8614+2.8761×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-4.0100×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.7853×β-2-微球蛋白(μg/mL)
常數項之係數範圍為-4.9至-2.28或-4.441至-3.282、尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之迴歸係數範圍分別為2.15至3.6或2.454至3.308、-6.4至-1.61或-4.611至-3.409及0.47至1.1或0.668至0.903。
脊迴歸分析
疾病分數=1.4645+1.6683×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.7868×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0926×β-2-微球蛋白(μg/mL)
常數項之係數範圍為0.558至2.418或1.245 tp 1.684；尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之迴歸係數範圍分別為0.818至1.907或1.418至1.835、-4.677至-0.997或-2.05至-1.519及0.076至0.825或0.079至0.106。
下方之表12顯示採用上述組合三個標記模型，於測試組的結果
根據上示結果，考慮訓練組之靈敏度、專一度、陽性預測值與陰性預測值，測定對於不同疾病程度之建議的截斷值範圍(參見下方表13)。
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與麩胺酸丙酮酸轉胺酶
鑑別函數分析
疾病分數=1.2295×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)+(-2.6571)×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0072×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之係數值範圍分別為0.539至1.456或1.045至1.414、-6.988至-2.053或-3.056至-2.391，及0.004至0.014或0.006至0.008。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯-值)/(1+exp(邏輯-值))，於其中邏輯-值=-2.1715+3.3171×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)+(-6.2008)×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+(-0.0018)×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-2.95至-1.38或-2.497至-1.846，而尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為2.56至4.07或2.82至3.649、-8.73至-3.66或-7.131至-5.271，及-0.02至0.001或-0.0021至-0.0015。
脊迴歸分析
疾病分數=1.5020+1.6479×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.7885×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0028×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為1.154至2.300 or 1.277至1.727，而尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為1.075至1.941或1.401至1.895、-4.192至-1.218或-2.057至-1.52，及0.001至0.007或0.0024至0.0032。
(v)用以診斷肝纖維化之組合四個標記模型
自本研究獲得之結果指出尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶、α-胎兒蛋白之任四個的組合，並適時考慮到臨床因子，為用以診斷肝纖維化之可靠標記。以下敘述為由尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白與麩胺酸丙酮酸轉胺酶所組成之一示範之組合4個標記模型。結果顯示於表17-19中。
鑑別函數分析
疾病分數=1.1645 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-2.4312 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0957 x β-2-微球蛋白(μg/mL)+0.0073×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之係數值範圍分別為0.196至1.376或0.99至1.339,-6.684至-1.623或-2.796至-2.067,0.055至0.974或0.081至0.11，及0.004至0.012 或0.0062至0.0084。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-3.6742+3.0107 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-4.4549 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.7074 x β-2-微球蛋白(μg/mL)+-0.0017 x麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-4.74至-2.61或-4.225至-3.123，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為2.24至3.77或2.559至3.462、-6.99至-1.92或-5.123至-3.787、0.39至1.02或0.6013至0.8135，及-0.004至0.001或-0.002至-0.001。
脊迴歸分析
疾病分數=1.2866+1.5874×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.5725×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0955×β-2-微球蛋白(μg/mL)+0.0029×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為0.297至2.109或1.094 to 1.48，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白與麩胺酸丙酮酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為0.748至1.800或1.349至1.778、-3.919至-0.776或-1.808至-1.337、0.077至0.830或0.0812至0.1098，及0.001至0.007或0.0025至0.0033。
(vi)用以診斷肝纖維化之組合五個標記模型
自本研究獲得之結果指出尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶、α-胎兒蛋白之任五個的組合，考慮適合之臨床因子，為用以診斷肝纖維化之可靠標記。以下敘述為由尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸草醯乙酸轉胺酶所組成之一示範之組合5個標記模型。結果顯示於表20-22中。
鑑別函數分析
疾病分數=1.1009 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子 (ng/mL)-2.2941 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0974 xβ-2-微球蛋白(μg/mL)+0.0065 x麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+0.0024 x麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸草醯乙酸轉胺酶之係數值範圍分別為-0.070至1.512或0.936至1.266、-6.453至-1.468或-2.638至-1.95、0.058至1.209或0.083至0.112、-0.002至0.019或0.0055至0.0075，及-0.011 至0.025或0.002至0.0028。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-3.4751+2.7416 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-4.5237 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.6952 xβ-2-微球蛋白(μg/mL)-0.0021 x麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+0.0007 x麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-4.54至-2.4或-3.996至-2.954，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸草醯乙酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為1.87至3.61或2.33至3.153、-7.13至-1.9或-5.202至-3.845、0.38至1.01或0.5909至0.799、-0.01至0.01或-0.0024至-0.0018，及-0.01至0.01或0.0006至0.0008。
脊迴歸分析
疾病分數=1.2750+1.3505×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.4346×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0978×β-2-微球蛋白(μg/mL)+0.0004×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+0.0056×麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)
常數項的係數範圍為0.145至1.909或1.084至1.466，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸草醯乙酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為0.576至1.826或1.148至1.553、-3.676至-0.603或-1.65至-1.219、0.077至0.862或0.0831至0.1125、-0.005至0.009或0.0003至0.0004，及-0.008至0.021或0.0047至0.0065。
(vii)用以診斷肝纖維化之組合六個標記模型
自本研究獲得之結果指出尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與α-胎兒蛋白的組合，適時考慮到臨床因子，為用以診斷肝纖維化之可靠標記。以下所示為根據此組合六個標誌標記模型之計算疾病分數的方程式(藉由鑑別函數分析、邏輯迴歸分析或脊迴歸分析來建立)及對於不同纖維化程度之截斷值(參見以下表23-25)。
鑑別函數分析
疾病分數=1.4401 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.2831 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0921 xβ-2-微球蛋白(μg/mL)-0.0099 x α-胎兒蛋白(ng/mL)+0.0129 x麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)-0.0004 x麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)+5
尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、α-胎兒蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸 草醯乙酸轉胺酶之係數值範圍分別為0.141至1.923或1.224至1.656、-5.052至-0.393或-1.476至-1.091,0.069至1.303或0.078至0.106、-0.032至0.054或-0.0114至-0.0084、0.002至0.032或0.011至0.0148，及-0.023至0.021或-0.00046至-0.00034。
邏輯迴歸分析
疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_值))，於其中邏輯_值=-4.1023+2.4436 x尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-6.8921 x間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+1.2869 x β-2-微球蛋白(μg/mL)-0.0112 x α-胎兒蛋白(ng/mL)-0.0015 x麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+0.0018 x麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-5.6至-2.61或-4.718至-3.487，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶、麩胺酸草醯乙酸轉胺酶與α-胎兒蛋白之迴歸係數範圍分別為1.38至3.5或2.077至2.81、-10.86至-2.92或-7.926至-5.858、0.82至1.75或1.0939至1.4799、-0.01至0.01或-0.0017至-0.0012、-0.01至0.01或0.0015至0.002，及-0.01至0.02或-0.01至-0.0095。
脊迴歸分析
疾病分數=0.9632+1.4215×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-1.0722×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+0.0986×β-2-微球蛋白(μg/mL)-0.0053×α-胎兒蛋白(ng/mL)+0.0019×麩胺酸丙酮酸轉胺酶(IU/L)+0.0058×麩胺酸草醯乙酸轉胺酶(IU/L)
常數項之係數範圍為-0.336至1.587或0.819至1.108，且尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9、β-2-微球蛋白、α-胎兒蛋白、麩胺酸丙酮酸轉胺酶與麩胺酸草醯乙酸轉胺酶之迴歸係數範圍分別為0.396至2.024或1.208至1.635、-2.763至-0.256或-1.239至-0.916、0.087至1.034或0.088至0.113、-0.021至0.037或-0.0061至-0.0045、-0.006至0.015或0.0016至0.0021，及-0.014至0.024或0.0049至0.0066。
於測試組中證實所有上述之模型，且觀察到相似之結果，包括截斷值、靈敏度、專一度、陰性預測值、陽性預 測值與接收器操作特徵曲線下面積。
實施例2：根據尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之血清濃度於B型肝炎病毒陽性病患中診斷肝纖維化。
在本研究中，單一標記或組合3個標記模型也於帶有B型肝炎病毒之30個病患與30個健康個體中被證實。下方表26列出此資料組的特徵。
如以下表27中所示，尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之各個的血清濃度與纖維化嚴重程度相關：
根據疾病分數之代表不同纖維化程度的診斷表現顯示於以下表28-30中(前述之健康測試提交於本研究)，疾病分數採用先前實施例1中之組合3個標記模型中所述的方程式計算出。
實施例3：根據尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之血清濃度於具有酒精相關肝臟疾病之病患中診斷肝纖維化情形。
53個具有酒精相關肝臟疾病之病患與30個健康個體參與本發明。病患特徵列於下方表31中。這些病患接受於前述實施例1中敘述之實驗室測試與調整過之Skinner檢查以確認其之飲酒習慣。
採用敘述於實施例1中之ELISA分析，檢驗於這些病患中之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子、間質金屬蛋白酶9與β-2-微球蛋白之血清濃度。由此獲得之結果顯示於下方表32中。
採用於先前實施例1中所述之組合3個標誌標記方程式來計算之這些病患的疾病分數與對於不同纖維化程度的診斷表現顯示於下方表33中。
其它實施例
可將於本說明書揭露之所有特徵結合成任何組合。藉由具有相同、相等或相似目的之替代特徵可取代揭露於本說明書中之各特徵。除非以別的方式特別敘述，所揭露之各特徵僅為相等或相似特徵之總的系列的一實施例。
從上面敘述，熟知本技術領域的人士可輕易地確定本發明之必要技術特徵，且在不違反本發明精神與範圍下，可作本發明之各種改變與修飾以適應各種用法與情況。因此，其它實施例也包含於申請專利範圍中。

Claims (7)

  1. 一種體外評估一人類個體是否具有患有肝纖維化(fibrosis)之風險的方法，包括：(a)提供來自被懷疑具有肝纖維化之一人類個體的血液樣本；(b)偵測於該血液樣本中之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase type plasminogen activator,uPA)的表現程度、間質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)的表現程度與β-2-微球蛋白(β-2-microglobulin,β-2MG)的表現程度；(c)將所偵測出之該些表現程度根據一公式計算出一疾病分數；以及(d)評估是否該人類個體具有纖維化，其中若該疾病分數高於一預先確認的疾病分數，則該人類個體被評估為具有患有肝纖維化的風險，又其中該預先確認的疾病分數係藉由將在一組無肝纖維化個體中之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子的表現程度、間質金屬蛋白酶9的表現程度與β-2-微球蛋白的表現程度，同樣根據步驟(c)中所使用之該公式經計算來獲得，而該公式係擇自由下列所組成之群組：(i)疾病分數=X1×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-X2×間質金屬蛋白酶9(ng/mL)+X3×β-2-微球蛋白(ng/mL)+5，其中X1為0.389至1.604，X2為7.321至2.302，而X3為0.048至1.114；(ii)疾病分數=exp(邏輯_值)/(1+exp(邏輯_ 值))，於其中邏輯_值=-Y1+Y2×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-Y3×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+Y4×β-2-微球蛋白(μg/mL)，其中Y1為4.9至2.28，Y2為2.15至3.6，Y3為6.4至1.61，而Y4為0.47至1.1；以及(iii)疾病分數=Z1+Z2×尿激素纖維蛋白溶酶原活化子(ng/mL)-Z3×間質金屬蛋白酶9(μg/mL)+Z4×β-2-微球蛋白(μg/mL)，其中Z1為0.558至2.418，Z2為0.818至1.907，Z3為4.677至0.997，而Z4為0.076至0.825。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之體外評估一人類個體是否具有患有肝纖維化之風險的方法，其中該血液樣本為一血清樣本。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之體外評估一人類個體是否具有患有肝纖維化之風險的方法，其中該人類個體係選擇自由C型肝炎帶原者、B型肝炎帶原者、遭受酒精相關之肝臟疾病的病患與遭受代謝性肝臟疾病之病患所組成的群組中。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之體外評估一人類個體是否具有患有肝纖維化之風險的方法，其中該人類個體為一C型肝炎帶原者、一B型肝炎帶原者或具有酒精相關之肝臟疾病。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之體外評估一人類個體是否具有患有肝纖維化之風險的方法，更包括，若評估該人類個體為具有肝纖維化，則藉由將該疾病分數與指出纖維化之程度的預先確認的截斷值(cutoff-value)進行比較來 評估該人類個體之肝纖維化程度，其中該預先確認的截斷值之設定係藉由將在具有一特定肝纖維化程度之病患群組中之尿激素纖維蛋白溶酶原活化子的表現程度、間質金屬蛋白酶9的表現程度與β-2-微球蛋白的表現程度，根據與步驟(c)中所使用之相同之該公式計算出該特定肝纖維化程度之病患群組的疾病分數來達成，而該疾病分數位於該預先確認的截斷值的範圍內則評估該人類個體為具有該特定肝纖維化程度的風險。
  6. 一種用以偵測肝纖維化的套組，係由下列所組成：一第一抗體其與尿激素纖維蛋白溶酶原活化子專一結合、一第二抗體其與間質金屬蛋白酶9專一結合與一第三抗體其與β-2-微球蛋白專一結合。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之用以偵測肝纖維化的套組，其中該些抗體為完整之免疫球蛋白分子。
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