TWI507199B - 用於基因沉默之核酸複合物與其之使用方法 - Google Patents

Description

用於基因沉默之核酸複合物與其之使用方法

本發明係關於一種用於基因沉默之核酸複合物與其之使用方法，尤指一種包覆髮夾式多核苷酸鏈之奈米粒之核酸複合物與其之使用方法。

標靶治療(Target therapy)是一種治療癌症的專一性方法，針對癌細胞表面特有的表面標記、或各種訊息傳遞途徑之分子，作為治療上的「作用目標(Target)」，進而達到抑制癌細胞增生、分化；破壞供給癌細胞養分之血管生成；促使癌細胞凋亡等效果，以促進癌症治療之療效。並且，在不傷害正常細胞之情況下，將癌症治療之副作用降到最低，提升癌症治療之品質。

近年來，對癌症基因進行之標靶治療係利用小片段干擾核醣核酸(small interfering RNA,siRNA)之基因治療(gene therapy)，誘導核醣核酸(RNA)干擾機制，並降解其同源(homologous)的傳訊核醣核酸(mRNAs)。但在臨床應用上，siRNA技術仍有許多限制，如：siRNA需要轉染載體，以提升siRNA進入細胞的機率；然而，轉染載體進入人體後，可能會發生不正常之免疫反應。此外，有研究指出：siRNA應用於人體時，實際之siRNA有效濃度並不高，故對癌症治療之助益並不顯著。

此外，限制酶(restriction enzyme)係一種能將雙股去氧核糖核酸(DNA)切開的酵素。雖然限制酶可在不破壞核苷酸與鹼基下，將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷；但限制酶只能辨識短的序列且需特定緩衝溶液，且其應用範圍主要在分子生物學與遺傳工程學領域之研究，無法實際使用於標靶治療上。

有鑑於此，目前亟需發展一種用於基因沉默之核酸複合物，以有效抑制目標基因的表現，協助癌症治療，降低癌症病患之復發風險，並延長癌症病患的寶貴生命。

本發明之主要目的係在提供一種用於基因沉默之核酸複合物，俾能使特定多核苷酸鏈大量進入細胞，以進行基因調控。

本發明之另一目的係在提供一種用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，俾能專一性辨識標的核酸之序列，以有效抑制標的核酸之蛋白表現，進而用於細胞實驗或活體動物實驗上。

為達成上述目的，本發明係提供一種用於基因沉默之核酸複合物，包括：一奈米粒；以及一第一多核苷酸鏈及一第二多核苷酸鏈之至少一者，其中該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈係分別與該奈米粒連接，該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈係分別專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二 端，該第一端連接該奈米粒，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式(hairpin-looped)，而該第二多核苷酸鏈係呈直鏈式。

本發明另提供一種用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，包括以下步驟：提供一核酸複合物及一標的核酸，其中該核酸複合物包括：一奈米粒；以及一第一多核苷酸鏈及一第二多核苷酸鏈之至少一者，其中該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈係分別與該奈米粒連接，該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈係分別專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式，而該第二多核苷酸鏈係呈直鏈式；以及將該核酸複合物與該標的核酸接觸，使該核酸複合物之該第一多核苷酸鏈及/或該第二多核苷酸鏈專一性辨識該標的核酸之序列。

經檸檬酸鈉還原合成之奈米粒具有高表面積/體積比及高表面能量，易與帶負電荷的單股多核苷酸鏈鍵結，一個奈米粒可裝載約100條直鏈式多核苷酸鏈，大幅提升了多核苷酸鏈的負載量，使實際傳遞效率增加、毒性減低並減少多核苷酸鏈之降解。此外，奈米粒具有較小的球體體積及高生物相容性，故由奈米粒攜帶的核酸複合物，可攜帶大量多核苷酸鏈進入細胞及其細胞核，並有效地抑制標的核酸的表現。其中，該奈米粒可為一金奈米棒、一金奈米粒、或一外金殼之核殼型奈米粒，但不受限於此。

在本發明之用於基因沉默之核酸複合物中，該核酸複合物與該標的核酸接觸後，該核酸複合物之該多核苷酸鏈為第三股寡核苷酸，其可專一性辨識該標的核酸之序列，並形成穩定的三股螺旋結構(triplex forming oligonucleotide,TFO)去干擾標的核酸之轉錄，產生基因沉默(gene silencing)現象，進而抑制蛋白表現。其中，TFO可透過胡格斯丁鍵結(hoogsteen bond)或反胡格斯丁鍵結(reverse hoogsteen bond)結合至DNA的主溝槽(major grove)，以形成穩定的三股螺旋結構。

其中，該第二多核苷酸鏈可為直鏈式或髮夾式，較佳為直鏈式；並且，該第一多核苷酸鏈與該第二多核苷酸鏈所專一性辨識該標的核酸之序列可為彼此相同或相異。再者，視使用需要，本發明之核酸複合物可再包括更多個多核苷酸鏈，以同時辨識多個標的核酸之序列，達成更有效的抑制蛋白表現情形。

此外，該第一多核苷酸鏈之該第一端及該第二多核苷酸鏈，其分別與該奈米粒連接，連接方式不受限，較佳可以一硫醚基(thioether)連接。藉此，髮夾式之多核苷酸鏈與直鏈式之多核苷酸鏈相比，髮夾式之多核苷酸鏈與該標的核酸接觸後，可形成更穩定的三股去氧核酸寡鏈分子。

其中，該第一多核苷酸鏈的長度及該第二多核苷酸鏈的長度不受限，較佳可介於10至30個核苷酸的範圍內；其中若該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈皆為髮夾式結 構，該第一端與該第二端的序列配對長度較佳為3至10對鹼基對，但不受限於此。

此外，標的核酸可為一單股核醣核酸或一雙股脫氧核醣核酸，僅需與應用情況有關即可；例如，若應用在癌症治療上，標的核酸可選擇與癌細胞之生長、分化、或死亡等相關之致癌基因或過表現基因之單股核醣核酸或雙股脫氧核醣核酸。並且，可挑選適當之標的核酸以提升癌細胞對藥物的敏感度。此外，可根據個別病患之需，發展客製型功能性奈米粒子，加強核酸複合物之基因沉默效果，例如更有效抑制癌細胞等。

與習知相比，siRNA之基因治療需要轉染載體，且轉染載體進入人體後，可能會發生不正常之免疫反應；另siRNA之有效濃度並不高，需要耗費更大的給予量，以致於對癌症治療之助益並不顯著；此外，限制酶有辨識短序列與需特定緩衝溶液之限制。因此，本發明之核酸複合物中的多核苷酸鏈具有較好的穩定性，不容易被降解；亦不受序列限制。藉此，本發明之用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，可有效抑制標的基因的表現，協助癌症治療，降低癌症病患之復發風險，並延長癌症病患的寶貴生命。

[實施例1-製備核酸複合物]

如圖1A、1B所示，使用平均粒徑13nm之金奈米粒1，以硫醚基與髮夾式多核苷酸鏈22之第一端221相接，形成核 酸複合物3；或可同時與直鏈式多核苷酸鏈21、及髮夾式多核苷酸鏈22相接，形成核酸複合物4。

在本實案例中，金奈米粒1為球狀之金奈米粒子，此粒子的準備方法為檸檬酸鈉還原法，於磨口圓肚瓶中加入20nM 2.5ml四氯金酸(HAuCl₄)水溶液和47.5ml二次去離子水，攪拌加熱至130~140℃，之候將溫度控制在130℃，並快速加入38.8nM 5ml檸檬酸鈉(sodium citrate)，持續攪拌10分鐘，然後將溫度降至室溫攪拌15分鐘，最後將製備好的奈米金粒子用連續波長400-700nm掃瞄。接著，準備髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21，在髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21之5’端及3’端分別修飾成硫醇基(SH，thiol)及胺基(NH₂，amino)，且前述官能基與核苷酸之間則以6個碳原子做連接，並由MDbio,Inc.(Taiwan,Taipei)合成。將金奈米粒1及髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21以莫耳數比1：100混合，且將混合液均勻混合16小時，使髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21得藉由其上之硫醇基氧化成硫醚基後而可與金奈米粒1以共價鍵結連結。以10000rcf的轉速離心去掉上清液，去除沒結合上金奈米粒1的髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21，再利用1ml的二次去離子重複此步驟，最後以相同的轉速離心去除廢液，並回溶至0.5ml二次去離子水中，最後製得的髮夾式核酸複合物與直鏈式核酸複合物。

[實施例2-測定STAT3蛋白表現量]

準備子宮頸癌細胞(Hela cells)，其由生物資源保存及研究中心(BCRC)所購得。培養條件如下：於添加10%胎牛血清及1%PSN(Gibco,Labs,Life.Technologies,Inc.,NY)之DMEM液態培養基中，於37℃恆溫、含有5%CO₂的培養箱中進行培養。設計出本發明之核酸複合物(實驗組為金奈米粒+髮夾式多核苷酸鏈，金奈米粒+直鏈式多核苷酸鏈；控制組為正控制組(β-actin))作為實驗組，實驗組的多核苷酸鏈的序列可辨識細胞中STAT3基因片段。將髮夾式核酸複合物與直鏈式核酸複合物特別地餵予Hela細胞株8個小時後，取得蛋白質樣品後，以8%SDS-聚丙烯胺電泳展開，並轉印到PVDF纖維膜上，轉印後之PVDF纖維膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST緩衝液(TBS緩衝液1升含有0.5毫升的Tween-20)，在室溫下輕輕搖晃1小時，以TBST緩衝液漂洗3次，每次10分鐘。PVDF纖維膜將浸泡於一次抗體溶液(含辨識STAT3與β-actin的IgG抗體，以TBST溶液稀釋所需倍數)中，在4℃輕輕搖晃16小時。再以TBST緩衝液漂洗6次，每次10分鐘。再將PVDF纖維膜浸泡於二次抗體溶液(含HRP-共軛山羊抗小鼠IgG抗體，以5%TBST-milk溶液稀釋所需倍數)中，在室溫下輕輕搖晃1小時，以TBST緩衝液漂洗6次，每次10分鐘。於暗房中加入H₂O₂+促發光試劑(Enhanced luminol reagent,NEN104,PerkinElmer,USA)避光反應一分鐘，取出PVDF膜至於壓片夾中，先覆蓋一層透光投影片，再放上底片，蓋上壓片夾感光反應一至五分鐘，取出底片至入顯影劑中，直到底片呈現訊號後， 清水洗滌數次，再放入定影劑中作用直到底片呈現透明狀，取出以清水洗滌乾淨，完成壓片。實驗結果顯示，與控制組相比，單獨攜帶直鏈式多核苷酸鏈之核酸複合物未能顯著抑制STAT3蛋白之表現量；而單獨攜帶髮夾式多核苷酸鏈之核酸複合物能夠顯著抑制STAT3蛋白之表現量。

如圖2所示，與控制組相比，單獨攜帶直鏈式多核苷酸鏈之核酸複合物未能顯著抑制STAT3蛋白之表現量；而單獨攜帶髮夾式多核苷酸鏈之核酸複合物能夠顯著抑制STAT3蛋白之表現量。

[實施例3-測定癌細胞對藥物的敏感度]

Hela細胞株分別餵予不同濃度之實驗組核酸複合物(髮夾式核酸複合物與直鏈式核酸複合物)8個小時後，去掉實驗組核酸複合物，再給予不同濃度的Cisplatin藥物作用24與48個小時之後，以MTT方法分析有效抑制50%Hela細胞株生長之IC₅₀。實驗結果顯示，與控制組相比，單獨攜帶髮夾式多核苷酸鏈之核酸複合物比單獨攜帶直鏈式多核苷酸鏈之核酸複合物更能顯著提升Hela細胞株對cisplatin藥物之敏感度，於12.5μM的cisplatin濃度有顯著的差異，如圖3A(藥物作用24小時)、3B(藥物作用48小時)所示。

上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。

1‧‧‧奈米粒

21‧‧‧直鏈式多核苷酸鏈

22‧‧‧髮夾式多核苷酸鏈

221‧‧‧第一端

222‧‧‧第二端

3,4‧‧‧核酸複合物

圖1A至1B係本發明實施例1之核酸複合物之示意圖。

圖2係本發明實施例2之STAT3表現量結果。

圖3A係本發明實施例3之藥物作用24小時之癌細胞抑制結果。

圖3B係本發明實施例3之藥物作用48小時之癌細胞抑制結果。

1‧‧‧奈米粒

21‧‧‧直鏈式多核苷酸鏈

22‧‧‧髮夾式多核苷酸鏈

221‧‧‧第一端

222‧‧‧第二端

3,4‧‧‧核酸複合物

Claims (8)

1. 一種用於基因沉默之核酸複合物，包括：一奈米粒，係一金奈米棒、一金奈米粒、或一外金殼之核殼型奈米粒；以及一第一多核苷酸鏈，其中該第一多核苷酸鏈係與該奈米粒連接，該第一多核苷酸鏈係專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式；其中該第一多核苷酸鏈中該第一端與該第二端的序列配對長度為3至10對鹼基對。
2. 如申請專利範圍第1項所述之核酸複合物，其中該第一多核苷酸鏈的長度係分別介於10至30個核苷酸的範圍。
3. 如申請專利範圍第1項所述之核酸複合物，其中該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核糖核酸。
4. 如申請專利範圍第1項所述之核酸複合物，其中該第一多核苷酸鏈之該第一端與該奈米粒以一硫醚基(thioether)連接。
5. 一種用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，該方法係於活體外進行，包括以下步驟：提供一核酸複合物及一標的核酸，其中該核酸複合物包括：一奈米粒，係一金奈米棒、一金奈米粒、或一外金殼之核殼型奈米粒；以及一第一多核苷酸鏈，其中該第一 多核苷酸鏈係與該奈米粒連接，該第一多核苷酸鏈係專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式；以及將該核酸複合物與該標的核酸接觸，使該核酸複合物之該第一多核苷酸鏈專一性辨識該標的核酸之序列；其中該第一多核苷酸鏈中該第一端與該第二端的序列配對長度為3至10對鹼基對。
6. 如申請專利範圍第5項所述之使用方法，其中該第一多核苷酸鏈的長度係分別介於10至30個核苷酸的範圍。
7. 如申請專利範圍第5項所述之使用方法，其中該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核糖核酸。
8. 如申請專利範圍第5項所述之使用方法，其中該第一多核苷酸鏈之該第一端與該奈米粒以一硫醚基連接。