TWI508751B - 核酸複合物用於製備基因沉默藥物上之用途 - Google Patents

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核酸複合物用於製備基因沉默藥物上之用途
本發明係關於一種用於基因沉默之核酸複合物與其之使用方法，尤指一種包覆髮夾式多核苷酸鏈之微脂粒載體之核酸複合物與其之使用方法。
標靶治療(Target therapy)是一種治療癌症的專一性方法，針對癌細胞表面特有的表面標記、或各種訊息傳遞途徑之分子，作為治療上的「作用目標(Target)」，進而達到抑制癌細胞增生、分化；破壞供給癌細胞養分之血管生成；促使癌細胞凋亡等效果，以促進癌症治療之療效。並且，在不傷害正常細胞之情況下，將癌症治療之副作用降到最低，提升癌症治療之品質。
近年來，對癌症基因進行之標靶治療係利用小片段干擾核醣核酸(small interfering RNA,siRNA)之基因治療(gene therapy)，誘導核醣核酸(RNA)干擾機制，並降解其同源(homologous)的傳訊核醣核酸(mRNAs)。但在臨床應用上，siRNA技術仍有許多限制，如：siRNA需要轉染載體，以提升siRNA進入細胞的機率；然而，轉染載體進入人體後，可能會發生不正常之免疫反應。此外，有研究指出：siRNA應用於人體時，實際之siRNA有效濃度並不高，故對癌症治療之助益並不顯著。
此外，限制酶(restriction enzyme)係一種能將雙股去氧核糖核酸(DNA)切開的酵素。雖然限制酶可在不破壞核苷酸與鹼基下，將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷；但限制酶只能辨識短的序列且需特定緩衝溶液，且其應用範圍主要在分子生物學與遺傳工程學領域之研究，無法實際使用於標靶治療上。
有鑑於此，目前亟需發展一種用於基因沉默之核酸複合物，以有效抑制目標基因的表現，協助癌症治療，降低癌症病患之復發風險，並延長癌症病患的寶貴生命。
本發明之主要目的係在提供一種用於基因沉默之核酸複合物，俾能使特定多核苷酸鏈大量進入細胞，以進行基因調控。
本發明之另一目的係在提供一種用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，俾能專一性辨識標的核酸之序列，以有效抑制標的核酸之蛋白表現，進而用於細胞實驗或活體動物實驗上。
為達成上述目的，本發明係提供一種用於基因沉默之核酸複合物，包括：一微脂粒載體(liposome)；以及一第一多核苷酸鏈，係包覆於該微脂粒載體內，其中該第一多核苷酸鏈係專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，且該第一端與該第二 端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式(hairpin-looped)。
本發明另提供一種用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，包括以下步驟：提供一核酸複合物及一標的核酸，其中該核酸複合物包括：一微脂粒載體；以及一第一多核苷酸鏈，係包覆於該微脂粒載體內，其中該第一多核苷酸鏈係專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式；以及將該核酸複合物與該標的核酸接觸，使該核酸複合物之該多核苷酸鏈專一性辨識該標的核酸之序列。
微脂粒載體是脂質空心微球，所形成的脂質層雙面為親水性，夾層內為疏水性。水溶性物質可包在微脂粒載體之球心，而油溶性物質可夾在微脂粒載體之膜層內，故微脂粒載體可作為水性物質及油性物質之載體。藉由磷脂雙分子雙層膜所形成的空心微球，包裹多核苷酸鏈以形成核酸複合物。由於生物體質膜的基本結構亦為磷脂雙分子層膜，加上微脂粒載體之較小的球體體積，因此，由微脂粒載體包裹的核酸複合物，其具有很好的生物相容性，可攜帶大量多核苷酸鏈進入細胞並有效地抑制標的核酸的表現。
在本發明之用於基因沉默之核酸複合物中，該核酸複合物與該標的核酸接觸後，該核酸複合物之該多核苷酸鏈為第三股寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide,TFO)， 其可專一性辨識該標的核酸之序列，並形成穩定的三股螺旋結去干擾標的核酸之轉錄，產生基因沉默(gene silencing)現象，進而抑制蛋白表現。其中，TFO可透過胡格斯丁鍵結(hoogsteen bond)或反胡格斯丁鍵結(reverse hoogsteen bond)結合至DNA的主溝槽(major grove)，以形成穩定的三股螺旋結構。
此外，本發明之核酸複合物及其之使用方法可更包括：一第二多核苷酸鏈，係包覆於該微脂粒載體內，且該第二多核苷酸鏈可專一性辨識該標的核酸之序列、或另一標的核酸之序列。其中，該第二多核苷酸鏈可為直鏈式或髮夾式；並具有一第一端及一相對之第二端。藉此，髮夾式之多核苷酸鏈與直鏈式之多核苷酸鏈相比，髮夾式之多核苷酸鏈與該標的核酸接觸後，可形成更穩定的三股去氧核酸寡鏈分子。再者，視使用需要，本發明之核酸複合物可再包括更多個多核苷酸鏈，以同時辨識多個標的核酸之序列，達成更有效的抑制蛋白表現情形。
其中，該第一多核苷酸鏈的長度及該第二多核苷酸鏈的長度不受限，較佳可介於10至30個核苷酸的範圍內；其中若該第一多核苷酸鏈及該第二多核苷酸鏈皆為髮夾式結構，該第一端與該第二端的序列配對長度較佳為3至10對鹼基對，但不受限於此。
此外，標的核酸可為一單股核醣核酸或一雙股脫氧核醣核酸，僅需與應用情況有關即可；例如，若應用在癌症治療上，標的核酸可選擇與癌細胞之生長、分化、或死亡 等相關之致癌基因或過表現基因之單股核醣核酸或雙股脫氧核醣核酸。此外，可根據個別病患之需，發展客製型功能性奈米粒子，加強核酸複合物之基因沉默效果，例如更有效抑制癌細胞等。
與習知相比，siRNA之基因治療需要轉染載體，且轉染載體進入人體後，可能會發生不正常之免疫反應；另siRNA之有效濃度並不高，需要耗費更大的給予量，以致於對癌症治療之助益並不顯著；此外，限制酶有辨識短序列與需特定緩衝溶液之限制。因此，本發明之核酸複合物中的多核苷酸鏈具有較好的穩定性，不容易被降解；亦不受序列限制。藉此，本發明之用於基因沉默之核酸複合物之使用方法，可有效抑制標的基因的表現，協助癌症治療，降低癌症病患之復發風險，並延長癌症病患的寶貴生命。
 [實施例1-製備核酸複合物]
如圖1A、1B所示，使用微脂粒載體1，包覆髮夾式多核苷酸鏈22，形成核酸複合物3；或可同時包覆直鏈式多核苷酸鏈21、及髮夾式多核苷酸鏈22，形成核酸複合物4。在本實案例中，使用的髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21是可辨識細胞中STAT3基因片段，由MDbio,Inc.(Taiwan,Taipei)合成。將微脂粒載體1及髮夾式多核苷酸鏈22與直鏈式多核苷酸鏈21以2~3：1的比例混合，且將混合液均勻混合15-45分鐘，最後製得的髮夾式核酸複合物與直鏈式核酸複合物。
[實施例2-測定STAT3蛋白表現量]
準備子宮頸癌細胞(Hela cells)，其由生物資源保存及研究中心(BCRC)所購得。培養條件如下：於添加10%胎牛血清及1% PSN(Gibco,Labs,Life.Technologies,Inc.,NY)之DMEM液態培養基中，於37℃恆溫、含有5% CO2 的培養箱中進行培養。設計出本發明之核酸複合物(微脂粒載體+髮夾式多核苷酸鏈，微脂粒載體+直鏈式多核苷酸鏈)作為實驗組，實驗組的多核苷酸鏈的序列可辨識細胞中STAT3基因片段；對照組為微脂粒載體；控制組為正控制組(β-actin))。將髮夾式核酸複合物與直鏈式核酸複合物以不同濃度分別餵予Hela細胞株8個小時後，取得蛋白質樣品後，以8% SDS-聚丙烯胺電泳展開，並轉印到PVDF纖維膜上，轉印後之PVDF纖維膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST緩衝液(TBS緩衝液1升含有0.5毫升的Tween-20)，在室溫下輕輕搖晃1小時，以TBST緩衝液漂洗3次，每次10分鐘。PVDF纖維膜將浸泡於一次抗體溶液(含辨識STAT3與β-actin的IgG抗體，以TBST溶液稀釋所需倍數)中，在4℃輕輕搖晃16小時。再以TBST緩衝液漂洗6次，每次10分鐘。再將PVDF纖維膜浸泡於二次抗體溶液(含HRP-共軛山羊抗小鼠IgG抗體，以5% TBST-milk溶液稀釋所需倍數)中，在室溫下輕輕搖晃1小時，以TBST緩衝液漂洗6次，每次10分鐘。於暗房中加入H2 O2 +促發光試劑(Enhanced luminol reagent,NEN104,PerkinElmer,USA)避光反應一分鐘，取出PVDF膜至於壓片夾中，先覆蓋一層透光投影片，再放上 底片，蓋上壓片夾感光反應一至五分鐘，取出底片至入顯影劑中，直到底片呈現訊號後，清水洗滌數次，再放入定影劑中作用直到底片呈現透明狀，取出以清水洗滌乾淨，完成壓片。
如圖2所示，與控制組及對照組相比，單獨包覆直鏈式多核苷酸鏈之核酸複合物1.0 μm至4.0 μm，能夠顯著抑制STAT3蛋白之表現量。另請參照圖3，而單獨攜帶髮夾式多核苷酸鏈之核酸複合物2.0 μm至4.0 μm，能夠顯著抑制STAT3蛋白之表現量。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
1‧‧‧微脂粒載體
21‧‧‧直鏈式多核苷酸鏈
22‧‧‧髮夾式多核苷酸鏈
3,4‧‧‧核酸複合物
圖1A至1B係本發明實施例1之核酸複合物之示意圖。
圖2係本發明實施例2之使用直鏈式多核苷酸鏈之STAT3表現量結果。
圖3係本發明實施例3之使用髮夾式多核苷酸鏈之STAT3表現量結果。
1‧‧‧微脂粒載體
21‧‧‧直鏈式多核苷酸鏈
22‧‧‧髮夾式多核苷酸鏈
3,4‧‧‧核酸複合物

Claims (7)

  1. 一種核酸複合物用於製備基因沉默藥物上之用途，該核酸複合物包括：一微脂粒載體；以及一第一多核苷酸鏈，係包覆於該微脂粒載體內，其中該第一多核苷酸鏈係專一性辨識一標的核酸之序列，該第一多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，更包括一第二多核苷酸鏈，係包覆於該微脂粒載體內，且該第二多核苷酸鏈係專一性辨識該標的核酸之序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該第一多核苷酸鏈的長度係介於10至30個核苷酸的範圍。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該第一多核苷酸鏈中該第一端與該第二端的序列配對長度為3至10對鹼基對。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核醣核酸。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該第二多核苷酸鏈的長度係介於10至30個核苷酸的範圍。
  7. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核醣核酸。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2006138145A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
WO2011060065A2 (en) * 2009-11-10 2011-05-19 Lipella Pharmaceuticals Inc. Instillation of liposomal formulation of sirna and antisense oligonucleotides

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006138145A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-28 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
WO2011060065A2 (en) * 2009-11-10 2011-05-19 Lipella Pharmaceuticals Inc. Instillation of liposomal formulation of sirna and antisense oligonucleotides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. Huang et al., "Knockdown of STAT3 by shRNA inhibits the growth of CAOV3 ovarian cancer cell line in vitro and in vivo", Acta. Biochim. Biophys. Sin., 2008, Vol. 40, No. 6, p. 519~525 *
X. Ling et al., "Knockdown of STAT3 Expression by RNA Interference t Inhibits the Induction of Breast Tumors in Immunocompetent Mice", Cancer Research, 2005, Vol. 65, No. 7, p. 2532~2536. *

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