TWI504402B - 大戟科植物活性物質及其應用 - Google Patents

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大戟科植物活性物質及其應用
本發明係關於大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物質及其活性成分在動物保健領域上的應用，特別是關於大戟科植物活性物質及其活性成分在預防及治療動物病毒感染上的應用。
近年來中草藥在醫學上的應用逐漸受到重視；與化學合成的藥物相比，這些天然植物的萃取物副作用較少而且相對安全。有文獻指出海桐科植物(Pittosporaceae)與大戟科植物(Euphorbiaceae)的萃取物具有抑制人類巨大細胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)的能力(Semple et al.,1998)；另外也有文獻指出，大戟科同科不同屬之植物萃取物，能夠抑制B型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)(Unander et al.,1995)或是具有抑制第二型皰疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)的能力(Lin et al.,2002)；另有文獻指出大戟科之植物萃取物能夠抑制HEp-2 cell及HeLa cell等癌細胞的生長(Galvis et al.,2002)；此外，也有文獻提到大戟科植物萃取物具有良好的抗氧化能力，並且對於環境中的常在菌，如芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌與白色念珠菌具有抵抗能力(Shi et al.,2008)。
大戟科植物金剛纂(Euphorbia neriifolia)在分類上屬於植物界、木蘭植物門、木蘭綱、大戟目、大戟科、大戟屬(Euphorbia)，其主要分布於熱帶與亞熱帶地區，原產地為印度與斯里蘭卡，其特徵為多年生灌木多肉植物，莖直立且內含白色乳汁，樹皮粉綠白色，上部多分歧，植株高可達3~8公尺。大戟科植物金剛纂(Euphorbia neriifolia)為民間常用之草藥，全株皆有藥理 功效，如莖部具有治療腫毒、皮膚病與水腫之藥效；葉部可治療腹瀉、子宮癌、胃癌及大腸直腸癌等病狀；而花蕊則具有解毒消腫的療效。金剛纂(Euphorbia neriifolia)經成分分析，發現其富含三萜類、固醇類、黃酮類、醣類等組成物(Sharma et al.,2011；Ahmed et al.,2011)。
目前市面上的抗病毒藥劑，幾乎都是以治療人類疾病為目的而研發的；若將這些昂貴的抗病毒藥劑應用於經濟動物上，除了有成本上的考量之外，也可能有食物安全的隱憂；然而，若無有效的疫苗來預防某一動物病毒，當畜群受該病毒感染時，只能使用支持性療法處理，但效果往往不彰，而造成畜牧業重大損失；因此，具有低副作用且安全的特性的動物抗病毒藥劑的開發，對動物保健產業而言，可說是刻不容緩且極為重要的事。
本發明於第一部份中提供一種大戟科植物(Euphorbiaceae)活性物質，該活性物質具有抗動物病毒活性。
於一實施例中，該大戟科植物為金剛纂(Euphorbia neriifolia)。
於一實施例中，該大戟科植物活性物質係以下列步驟獲得：以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而獲得一乙醇萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質係以下列步驟獲得：(1)以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩 個相；(4)從該兩個相中分離出含正己烷之分離層；以及(5)去除該含正己烷之分離層中的正己烷而獲得一正己烷萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質係以下列步驟獲得：(1)以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；(4)從該兩個相中分離出含水之分離層；(5)添加與水相同體積的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(6)從該兩個相中分離出含乙酸乙酯之分離層；以及(7)去除該含乙酸乙酯之分離層中的乙酸乙酯而獲得一乙酸乙酯萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質係以下列步驟獲得：(1)以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；(4)從該兩個相中分離出含水之分離層；(5)添加與水相同體積的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(6)從該兩個相中再次分離出含水之分離層；(7)添加與水相同體積的正丁醇(n-Butanol)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(8)從該兩個相中分離出含正丁醇之分離層；以及(9)去除該含正丁醇之分離層中的正丁醇而獲得一正丁醇萃取之活性物質。
本發明於第二部份中提供一種大戟科植物活性物質之製備方法，包含萃取該植物之莖葉。
於一實施例中，該大戟科植物活性物質之製備方法包含下列步驟：以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而獲得一乙醇萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質之製備方法包含下列步驟：(1)以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；(4)從該兩個相中分離出含正己烷之分離層；以及(5)去除該含正己烷之分離層中的正己烷而獲得一正己烷萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質之製備方法包含下列步驟：(1)以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；(4)從該兩個相中分離出含水之分離層；(5)添加與水相同體積的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(6)從該兩個相中分離出含乙酸乙酯之分離層；以及(7)去除該含乙酸乙酯之分離層中的乙酸乙酯而獲得一乙酸乙酯萃取之活性物質。
於另一實施例中，該大戟科植物活性物質之製備方法包含下列步驟：(1) 以50至99體積百分比濃度之乙醇萃取該大戟科植物，並去除該乙醇而形成一固相活性物質；(2)添加該固相活性物質之重量的1至10倍體積的乙醇以及該固相活性物質之重量的3至30倍體積的水至該固相活性物質，以形成一懸浮液；(3)添加與水相同體積的正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；(4)從該兩個相中分離出含水之分離層；(5)添加與水相同體積的乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(6)從該兩個相中再次分離出含水之分離層；(7)添加與水相同體積的正丁醇(n-Butanol)至該含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；(8)從該兩個相中分離出含正丁醇之分離層；以及(9)去除該含正丁醇之分離層中的正丁醇而獲得一正丁醇萃取之活性物質。
本發明於第三部份中提供一種大戟科植物活性物質在製備動物抗病毒藥物中的用途。於一實施例中，該大戟科植物活性物質為大戟科植物乙醇萃取之活性物質。於另一實施例中，該大戟科植物活性物質為大戟科植物正己烷萃取之活性物質。於另一實施例中，該大戟科植物活性物質為大戟科植物乙酸乙酯萃取之活性物質。於另一實施例中，該大戟科植物活性物質為大戟科植物正丁醇萃取之活性物質。於另一實施例中，該大戟科植物活性物質為羽扇醇(Lupeol)。於另一實施例中，該大戟科植物活性物質為豆甾醇(Stigmasterol)。
由本發明之實施例可知，本發明所提供之大戟科植物活性物質具有抗病毒效果，可以有效抑制病毒在宿主細胞內的增殖，尤其是大戟科植物正己烷萃取之活性物質的抗病毒效果優於商品化抗病毒藥劑Ribavirin的抗病毒效果。因此，本發明所提供之大戟科植物活性物質可用來抑制動物病毒 在動物體內增殖。
於一實施例中，本發明所提供的大戟科植物活性物質可預防豬繁殖與呼吸道綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的感染；相較於未處理藥物的細胞，預先處理本發明所提供的大戟科植物活性物質的細胞對於PRRSV病毒的感染具有較佳的抵抗力，處理組的細胞具有較高的細胞存活率，且細胞懸浮液及細胞內的PRRSV病毒數量較低。
於另一實施例中，本發明所提供的大戟科植物活性物質可治療PRRSV病毒的感染；相較於已感染PRRSV病毒但未處理藥物的細胞，對已感染PRRSV病毒的細胞處理本發明所提供的大戟科植物活性物質後，處理組的細胞具有較高的細胞存活率，且細胞懸浮液及細胞內的PRRSV病毒數量較低。
於另一實施例中，本發明所提供的大戟科植物活性物質可預防犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)的感染；相較於未處理藥物的細胞，預先處理本發明所提供的大戟科植物活性物質的細胞對於CDV病毒的感染具有較佳的抵抗力，處理組的細胞具有較高的細胞存活率，且細胞懸浮液及細胞內的CDV病毒數量較低。
於另一實施例中，本發明所提供的大戟科植物活性物質可治療CDV病毒的感染；相較於已感染CDV病毒但未處理藥物的細胞，對已感染CDV病毒的細胞處理本發明所提供的大戟科植物活性物質後，處理組的細胞具有較高的細胞存活率，且細胞懸浮液及細胞內的CDV病毒數量較低。
本發明於第五部份中提供一種抗動物病毒組成物，包含本發明大戟科 植物乙醇萃取之活性物質、正己烷萃取之活性物質、乙酸乙酯萃取之活性物質、正丁醇萃取之活性物質、大戟科植物活性物質羽扇醇(Lupeol)以及大戟科植物活性物質豆甾醇(Stigmasterol)組成的物質群中至少一種物質，以及一藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。
該藥學上可接受之賦形劑可為適合於腸外、腸內或滴鼻施用的藥學上可接受之有機或無機載體物質，且該賦形劑不會與活性組合物產生有害的反應。適合的賦形劑包含但不限於水、鹽類溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明膠、直鏈澱粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、脂肪酸單甘酯和甘油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
該藥學上可接受之載劑包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、界面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
術語“預防、保護、對抗”意謂，相較於未使用本發明大戟科植物活性物質或活性物質的動物或細胞樣本，使用本發明大戟科植物活性物質或活性物質的動物或細胞樣本，具有較高的存活率，且該樣本內的病毒數量較低。
術語“治療”意謂，預防或部份預防疾病、症狀、病況，及/或部份或完全治癒或緩解疾病、症狀、病況、或因疾病所造成的不利影響。
術語“抑制”意謂，與基線相比，在質量或數量上的減少。例如，在本發明的背景下，抑制病毒的複製，是指與基線相比，病毒複製減少。同理， 抑制病毒感染，是指與基線相比，減少病毒感染。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一 大戟科植物活性物質之製備 1.乙醇(Ethanol)萃取之活性物質
大戟科植物金剛纂(Euphorbia neriifolia)採集自台灣宜蘭。先將採集之金剛纂以水洗淨並將葉與莖部分開，靜置晾乾後秤重並切成片狀，再將莖部與葉部分別置於可避光的棕色玻璃瓶內，加入95%乙醇使金剛纂莖葉完全浸泡於乙醇中，於室溫靜置萃取，待乙醇由透明無色轉變為深綠色或深咖啡色時(約3~10日)，收集乙醇萃取液，接著進行減壓濃縮去除乙醇，以取得金剛纂莖部及葉部乙醇萃取之活性物質。
2.正己烷(Hexane)萃取之活性物質
取上述金剛纂乙醇萃取之活性物質10g溶於100ml乙醇與300ml水(此液相稱為水層)，並將該水層混合物倒入分液漏斗中，再加入300ml正己烷(Hexane)，將該水層混合物與正己烷充分混合後，將該分液漏斗避光靜置，待水層與正己烷完全分離後，分別收集下層液體(水層)以及上層液體(正己烷萃取液層)，接著將正己烷萃取液進行減壓濃縮得到金剛纂正己烷萃取之活性物質。
3.乙酸乙酯(Ethyl acetate,EtOAc)萃取之活性物質
將經過正己烷萃取後的下層液體(水層)倒入另一分液漏斗內，並加入300ml乙酸乙酯(EtOAc)，將該水層混合物與乙酸乙酯充分混合後，將該分液漏斗避光靜置，待水層與乙酸乙酯完全分離後，分別收集下層液體(水層)以及上層液體(乙酸乙酯萃取液層)，接著將乙酸乙酯萃取液進行減壓濃縮得到金剛纂乙酸乙酯萃取之活性物質。
4.正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質
將經過乙酸乙酯萃取後的下層液體(水層)倒入另一分液漏斗內，並加入300ml正丁醇(n-Butanol)，將該水層混合物與正丁醇充分混合後，將該分液漏斗避光靜置，待水層與正丁醇完全分離後，分別收集下層液體(水層)以及上層液體(正丁醇萃取液層)，接著將正丁醇萃取液進行減壓濃縮得到金剛纂正丁醇萃取之活性物質。
實施例二 大戟科植物乙醇萃取之活性物質抗PRRSV病毒感染的初步活性分析
將實施例一得到的金剛纂莖部及葉部乙醇萃取之活性物質先分別進行連續兩倍稀釋(500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml、1.953125μg/ml、0.9765625μg/ml)，接著處理Marc-145細胞後再感染PRRSV病毒，以評估金剛纂乙醇萃取之活性物質是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤中(1.5x104顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞 兩次後，將連續稀釋的金剛纂莖部及葉部乙醇萃取之活性物質分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時(每個稀釋濃度四重複)。接著，每個測試樣本中加入100 TCID50 PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞4天後，以Alamar blue reduction assay kit分析細胞存活率，並計算半數細胞毒性濃度(concentration of 50% cellular cytotoxicity,CC50)及半數抑制濃度(50% antiviral inhibitory concentration,IC50)，以評估金剛纂乙醇萃取之活性物質是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。
結果如表一所示，金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質對Marc-145細胞的半數細胞毒性濃度(CC50)為83.15±0.4μg/ml，而金剛纂葉部乙醇萃取之活性物質對Marc-145細胞的半數細胞毒性濃度(CC50)則大於500μg/ml；另一方面，金剛纂莖部及葉部乙醇萃取之活性物質皆具有抗PRRSV病毒能力，雖然金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質對Marc-145細胞的半數細胞毒性濃度(CC50)較高，但其抑制半數PRRSV病毒活性的濃度(IC50)為10.51±0.5μg/ml，較金剛纂葉部乙醇萃取之活性物質抑制半數PRRSV病毒活性的濃度(IC50=255.65±25.3μg/ml)低了將近25倍。若以選擇性指標(selective index,SI)來看，金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質較金剛纂葉部乙醇萃取之活性物質具有較佳的抗PRRSV病毒能力。
實施例三 不同作用時間下大戟科植物莖部乙醇萃取之活性物質抗PRRSV病毒感染的活性分析
將實施例一得到的金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質(2μg/ml)，處理Marc-145細胞不同時間後再感染PRRSV病毒，以評估金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質與Marc-145細胞共培養多少時間會有最佳的抑制PRRSV病毒能力。
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤中(1.5x104顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將2μg/ml金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質(試驗組)或80μM商品化抗病毒藥劑Ribavirin(正對照組)加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內分別培養4、8、16、24小時(每個時間點四重複)；接著，每個測試樣本中加入100 TCID50 PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞4天後，以Alamar blue reduction assay kit分析細胞存活率，以評估金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質與Marc-145細胞共培養多少時間會有最佳的抑制PRRSV病毒能力。
結果如表二及圖一所示，Marc-145細胞與金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質共培養4小時與8小時再感染PRRSV病毒4天後的細胞存活率約為70~75%；共培養16小時與24小時後再感染PRRSV病毒4天後的細胞存活率可達100%；而Marc-145細胞與商品化抗病毒藥劑Ribavirin共培養24小時再感染PRRSV病毒4天後的細胞存活率為91%；相較之下，金剛纂莖部乙醇萃取之 活性物質具有顯著的抗病毒能力。
實施例四 大戟科植物莖部各活性物質抗PRRSV病毒感染的初步活性分析
將實施例一得到的金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質、正己烷(Hexane)萃取之活性物質、乙酸乙酯(EtOAc)萃取之活性物質、正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin先分別進行連續兩倍稀釋(500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml、1.953125μg/ml、0.9765625μg/ml)，接著處理Marc-145細胞後再感染PRRSV病毒，以評估金剛纂各活性物質是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤中(1.5x104顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細 胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將連續稀釋的金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質、正己烷(Hexane)萃取之活性物質、乙酸乙酯(EtOAc)萃取之活性物質、正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時(每個稀釋濃度二重複)。接著，每個測試樣本中加入100 TCID50 PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞4天後，以Alamar blue reduction assay kit分析細胞存活率，並計算半數細胞毒性濃度(CC50)、半數抑制濃度(IC50)以及選擇性指標(SI)，以評估金剛纂莖部各活性物質是否具有抑制PRRSV病毒感染的能力。
結果如表三所示，首先是細胞毒性試驗的部分：對細胞毒害效果最輕微的是金剛纂莖部正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質(CC50>500μg/ml)，其次是商品化抗病毒藥劑Ribavirin(CC50=400±100μg/ml)，接著是金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質(CC50=80±36μg/ml)與金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(CC50=28±6.3μg/ml)，而對於細胞最具有毒性的則是金剛纂莖部乙酸乙酯(EtOAc)萃取之活性物質(CC50=26±4.1μg/ml)。至於在抗病毒活性方面，金剛纂莖部各活性物質皆具有抗病毒能力；其中，金剛纂莖部正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質抑制半數病毒所需的劑量最高(IC50>500μg/ml)，其選擇性指標(SI)為1；而金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質抑制半數病毒所需的劑量最低(IC50=2.6±0.9μg/ml)，其選擇性指標(SI)為最高(SI=9.8)，因此是最具有作為抗病毒藥物潛力的活性物質。
實施例五 大戟科植物莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質其組成化合物對抗PRRSV病毒感染的活性分析
由實施例四結果得知，金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質是所有活性物質中最具有作為抗病毒藥物潛力的活性物質，為瞭解該活性物質中具有抗病毒能力的組成分為何，進一步將實施例一得到的金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質以氣相層析質譜儀(Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer,GC-MASS)比對出該正己烷(Hexane)萃取之活性物質之組成成分。
金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質的氣相層析質譜儀(GC-MASS)圖譜如圖二所示。選出其中9個含量高的化合物(化合物1~9)進行細胞毒性測試及抗病毒活性測試。待測化合物1~9在Marc-145細胞接種 16~24小時後，皆以40μM濃度與細胞作用，並以不含待測化合物1~9的1% FBS MEM培養液作為對照組，在待測化合物1~9與細胞共同培養24小時後，每個細胞樣本中加入100 TCID50的PRRSV病毒液，並置於37℃、5% CO2恆溫培養箱中培養4天，之後觀察細胞病變情形並測定存活率。
結果如表四所示，9個待測化合物中最具有抗PRRSV病毒效果的為化合物8(羽扇醇，Lupeol)及化合物9(豆甾醇，Stigmasterol)；處理羽扇醇(Lupeol)的細胞存活率為80.96±3.74%；而處理豆甾醇(Stigmasterol)的細胞存活率為96.51±3.89%。
實施例六 不同濃度的羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對抗PRRSV病毒感染的活性分析
將羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)先分別進行連續兩倍稀釋(1mM、500μM、250μM、125μM、62.5μM、31.25μM、15.625μM、7.8125μM、3.90625μM、1.953125μM、0.9765625μM)，接著處理Marc-145細胞後再感染PRRSV病毒，以評估不同濃度的羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)抑制PRRSV病毒感染的能力。
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤中(1.5x104顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將連續稀釋的羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時(每個稀釋濃度二重複)。接著，每個測試樣本中加入100 TCID50 PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞4天後，以Alamar blue reduction assay kit分析細胞存活率，並計算半數細胞毒性濃度(CC50)、半數抑制濃度(IC50)以及選擇性指標(SI)。
結果如表五所示，首先是細胞毒性試驗的部分：羽扇醇(Lupeol)的半數細胞毒性濃度(CC50)為38.3±20.7μM；而豆甾醇(Stigmasterol)的半數細胞毒性濃度(CC50)為488±5.44μM。至於在抗病毒活性方面，羽扇醇(Lupeol)抑制半數病毒所需的劑量為(IC50)3.17±0.14μM，其選擇性指標(SI)為12.1；而豆甾醇(Stigmasterol)抑制半數病毒所需的劑量為(IC50)36.63±2.5μM，其選擇性指標(SI)為13.3。且羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)的選擇性指 標(SI)皆大於金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質的選擇性指標(SI)，顯示此二化合物皆具有作為抗病毒藥物的潛力。
實施例七 大戟科植物活性物質對於PRRSV病毒之預防試驗
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於25cm2細胞培養瓶(2x106顆細胞/瓶)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(2.5μg/ml)、羽扇醇(Lupeol)(25μM)、豆甾醇(Stigmasterol)(25μM)以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin(80μM)分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時。接著，每個測試樣本中加入0.01 M.O.I.PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內繼續培養，並於攻毒後6、12、24、48、72、96小時取各測試樣本上清液測病毒力價，以得知各測試藥物在不同時間點抑制病毒的能力。
結果如圖三所示，未處理藥劑的PRRSV攻毒組的病毒量在攻毒後緩緩上升到48小時達高峰(106.75 TCID50/ml)，此時約有50%的細胞已經出現破碎圓化的病變情形；經過藥物處理過的組別在每個時間點病毒量都有減少的趨勢；特別是處理金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質的組別，在 PRRSV攻毒後6小時到48小時之間的病毒量皆比其他組別低，其中攻毒後24小時的病毒量比起未處理藥劑的PRRSV攻毒組少了將近50倍；此外，處理羽扇醇(Lupeol)的組別在PRRSV攻毒後72小時與96小時後，其PRRSV病毒量也顯著的低於其他組，其在PRRSV攻毒後96小時的病毒量比起未處理藥劑的PRRSV攻毒組少了10倍。
實施例八 大戟科植物活性物質對於PRRSV病毒之病毒斑減少試驗
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於6孔細胞培養盤中(5x105顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)、金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)、羽扇醇(Lupeol)(50μM、25μM、12.5μM)、豆甾醇(Stigmasterol)(50μM、25μM、12.5μM)以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin(160μM、80μM、40μM)分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時(每種處理二重複)；接著，每個測試樣本中加入100 TCID50 PRRSV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，等待感作時間(1小時)終了再以含有1% FBS的MEM甲基纖維素培養基覆蓋細胞，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞4天後，並以結晶紫染色計數病毒斑塊。
結果如圖四所示，金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質及金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質抑制半數病毒斑的濃度分別為2.1μg/ml及1.16μg/ml(圖四A)；而羽扇醇(Lupeol)、豆甾醇(Stigmasterol)以及商品化抗病毒 藥劑Ribavirin抑制半數病毒斑的濃度分別為28.8μM、40μM與240μM(圖四B)。結果顯示，與商品化抗病毒藥劑Ribavirin相較，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)只需使用較低的濃度，就可達到與商品化抗病毒藥劑Ribavirin相同的抑制病毒斑效果。
實施例九 大戟科植物活性物質對於PRRSV病毒之治療試驗
首先，將Marc-145細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於12孔細胞培養盤中(3.5x105顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，每個測試樣本中加入2500 TCID50 PRRSV病毒液，感作2小時；感作完畢後將金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(2.5μg/ml)、羽扇醇(Lupeol)(50μM)、豆甾醇(Stigmasterol)(50μM)以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin(80μM)分別加入細胞培養物中，於攻毒後6、12、24、48、72、96小時，各別收取上清液與細胞內病毒液測病毒力價。
結果如圖五所示，未處理藥劑的PRRSV攻毒組於病毒感染72小時後，約有70%的細胞出現嚴重的病變情形(圖五B)；而處理羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)的組別在病毒感染72小時後，只有少於20%的細胞出現圓化病變的情形(圖五C、D)。在病毒力價方面，結果如圖六所示，未處理藥劑的PRRSV攻毒組於病毒感染48小時後，細胞內病毒力價為106.5 TCID50/ml，上清液病毒力價也高達106.75 TCID50/ml。而處理羽扇醇(Lupeol)的組別不論是上清液病毒量或是細胞內病毒量，在病毒感染後的每個時間點力價均顯著低於未處理藥劑的PRRSV攻毒組、處理豆甾醇(Stigmasterol)的組別、處理 金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質的組別以及處理商品化抗病毒藥劑Ribavirin的組別，特別是處理羽扇醇(Lupeol)組別的細胞內部在攻毒後72小時與96小時均測不到PRRSV病毒。
實施例十 大戟科植物活性物質抗犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)的初步活性分析
將實施例一得到的金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質、正己烷(Hexane)萃取之活性物質、乙酸乙酯(EtOAc)萃取之活性物質、正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin先分別進行連續兩倍稀釋(500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml、1.953125μg/ml、976ng/ml、488ng/ml、244ng/ml、122ng/ml、61ng/ml)，接著處理VERO細胞後再感染CDV病毒，以評估金剛纂活性物質是否具有抑制CDV病毒感染的能力。
首先，將VERO細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤中(8x103顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將上述連續稀釋的活性物質分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養24小時(每個稀釋濃度四重複)。接著，每個測試樣本中加入1x103 TCID50 CDV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞6天後，以硫醯羅明丹(Sulforhodamine B assay,SRB)分析細胞存活率(OD515)，並計算半數細胞毒性濃度(CC50)及半數抑制濃度(IC50)，以評估金剛纂活性物質是否具有抑制 CDV病毒感染的能力。
結果如表六所示，由細胞毒性試驗結果顯示，除了金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質(CC50=80±36μg/ml)與金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(CC50=28±6.3μg/ml)對細胞毒性較高些以外，其他活性物質對VERO細胞具有低細胞毒性。而抗CDV病毒活性試驗結果顯示，金剛纂莖部各活性物質皆具有抗病毒能力；其中，金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質抑制半數病毒所需的劑量最低(IC50=0.9μg/ml)，是最具有作為抗CDV病毒藥物潛力的活性物質。
實施例十一 不同作用時間下大戟科植物莖部活性物質抗犬瘟熱病毒(CDV)感染的活性分析
將VERO細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培 養盤中(8x103顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將0.625μg/ml金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質、正己烷(Hexane)萃取之活性物質、乙酸乙酯(EtOAc)萃取之活性物質、正丁醇(n-Butanol)萃取之活性物質或20μg/ml商品化抗病毒藥劑Ribavirin加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內分別培養0.5、2、4、8、16、24小時(每個時間點四重複)；接著，每個測試樣本中加入1x103 TCID50 CDV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，再於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞6天後，以SRB分析細胞存活率(OD515)，以評估金剛纂莖部活性物質與VERO細胞共培養多少時間會有最佳的抑制CDV病毒能力。
結果如圖七所示，VERO細胞與金剛纂莖部乙醇萃取之活性物質或正己烷(Hexane)萃取之活性物質共培養16小時與24小時再感染CDV病毒6天後，VERO細胞存活率普遍上升，因此金剛纂活性物質對CDV病毒具有顯著的抑制效果。
實施例十二 不同作用時間下大戟科植物莖部活性物質抗犬瘟熱病毒(CDV)感染的活性分析
將VERO細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於25cm2細胞培養瓶(1.2x106顆細胞/瓶)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質(1.25μg/ml)以及商品化抗病毒藥劑Ribavirin(80μM)分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養 箱內培養24小時。接著，每個測試樣本中加入0.03 M.O.I CDV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內繼續培養，並於攻毒後48、60、72、84、96、108、120、132小時取各測試樣本上清液測病毒力價，以得知各測試藥物在不同時間點抑制病毒的能力。
結果如圖八所示，相較於未處理藥劑的CDV攻毒組以及處理商品化抗病毒藥劑Ribavirin組，處理金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質的VERO細胞培養物，在感染CDV病毒後的各時間點，其病毒量皆比前述兩組低，顯示金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質具有比商品化抗病毒藥劑Ribavirin更好的抑制病毒能力。
實施例十三 羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對於犬瘟熱病毒(CDV)之預防試驗
將VERO細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於96孔細胞培養盤(8x103顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，將金剛纂活性成分羽扇醇(Lupeol)(40μM)及豆甾醇(Stigmasterol)(40μM)分別加入細胞培養物中，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內分別培養8、16、24小時。接著，每個測試樣本中加入200 TCID50 CDV病毒液，並以含有1% FBS的MEM培養液做為負對照組，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內繼續培養，並於攻毒後5天以SRB測細胞存活率(OD515)。
結果如圖九所示，處理羽扇醇(Lupeol)8小時的組別在CDV攻毒後的細胞存活率高，而處理羽扇醇(Lupeol)16小時的組別在CDV攻毒後的細胞存活 率更高；相較之下，處理豆甾醇(Stigmasterol)8小時的組別在CDV攻毒後的細胞存活率並不高，但處理豆甾醇(Stigmasterol)16小時及24小時的組別在CDV攻毒後的細胞存活率大幅提高；結果顯示，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)皆具有抗CDV病毒的活性。
實施例十四 大戟科植物莖部活性物質羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇對於犬瘟熱病毒(CDV)之治療試驗
將VERO細胞懸浮於含有5% FBS的MEM培養液，並接種於12孔細胞培養盤中(2x105顆細胞/孔)，於37℃、5% CO2恆溫培養箱內培養細胞16~24小時後，移除上層培養液並以含有1% FBS的MEM培養液清洗細胞兩次後，每個測試樣本中加入5000 TCID50 CDV病毒液，感作4小時；感作完畢後將金剛纂活性物質羽扇醇(Lupeol)(50μM)及豆甾醇(Stigmasterol)(50μM)分別加入細胞培養物中，於攻毒後24、48、72、96小時收取上清液及細胞測試病毒力價。
結果如圖十A、圖十B所示，金剛纂活性物質羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)在CDV病毒感染後48小時的病毒力價，比處理商品化抗病毒藥劑Ribavirin的組別的病毒力價，以及未處理藥劑的組別的病毒力價，減少了將近100倍，不論是上清液或是細胞內的病毒力價皆有相同的情形，顯示本發明金剛纂活性物質具有治療CDV病毒感染的效果。
綜上所述，本發明所提供之大戟科植物活性物質具有抗病毒的活性，除了在病毒感染前施用可預防病毒感染之外，在病毒感染後施用亦可抑制病毒數量增加，甚至是減少在細胞中的病毒數量，達到治療病毒感染的效 果。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
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圖一為金剛纂莖部活性物質與Marc-145細胞共培養不同時間後抗PRRSV病毒活性分析的結果。
圖二為利用GC-MASS分析金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質之圖譜。
圖三為金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質、羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對PRRSV病毒之預防試驗結果。
圖四A為金剛纂莖部乙醇及正己烷(Hexane)萃取之活性物質對PRRSV病毒之病毒斑減少試驗的結果；圖四B為羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對PRRSV病毒之病毒斑減少試驗的結果。
圖五為攻毒72小時後，羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對PRRSV病毒感染之治療試驗的結果；圖五A為未處理化合物及病毒的Marc-145細胞；圖五B為只處理PRRSV病毒組；圖五C為處理羽扇醇(Lupeol)及PRRSV病毒組；圖五D為處理豆甾醇(Stigmasterol)及PRRSV病毒組；以及圖五E為 處理商品化抗病毒藥劑Ribavirin及PRRSV病毒組。
圖六為羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對PRRSV病毒感染之治療試驗的結果。
圖七為金剛纂莖部活性物質與VERO細胞共培養不同時間後抗CDV病毒活性分析的結果。
圖八為為金剛纂莖部正己烷(Hexane)萃取之活性物質對CDV病毒之預防試驗結果。
圖九為羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對CDV病毒感染之治療試驗的結果。
圖十為羽扇醇(Lupeol)及豆甾醇(Stigmasterol)對CDV病毒感染之治療試驗的結果；圖十A為VERO細胞上清液的病毒力價；圖十B為VERO細胞內的病毒力價。

Claims (12)

  1. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)藥物中的用途，其中該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質係藉由一包含下列步驟之方法所製得：以乙醇萃取該大戟科植物Euphorbia neriifolia，並去除該乙醇而形成一固相，該固相即為大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該乙醇為50至99體積百分比濃度。
  3. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒藥物中的用途，其中該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質係藉由一包含下列步驟之方法所製得：以乙醇萃取該大戟科植物Euphorbia neriifolia，並去除該乙醇而形成一固相；添加乙醇以及水至該固相，以形成一懸浮液；添加正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；從該兩個相中分離出第一含水之分離層以及含正己烷之分離層；以及取該含正己烷之分離層，去除正己烷以得到大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該乙醇的添加量為該固相之重量的1至10倍體積。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該水的添加量為該固相之重量的3至30倍體積。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該正己烷的添加量與水的添加量相同。
  7. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒藥物中的用途，其中該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質係藉由一包含下列步驟之方法所製得：以乙醇萃取該大戟科植物Euphorbia neriifolia，並去除該乙醇而形成一固相；添加乙醇以及水至該固相，以形成一懸浮液；添加正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；從該兩個相中分離出第一含水之分離層以及含正己烷之分離層；添加乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該第一含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；從該兩個相中再次分離出第二含水之分離層以及含乙酸乙酯之分離層；以及取該含乙酸乙酯之分離層，去除乙酸乙酯以得到大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該乙酸乙酯的添加量與水的添加量相同。
  9. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒藥物中的用途，其中該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質係藉由一包含下列步驟之方法所製得：以乙醇萃取該大戟科植物Euphorbia neriifolia，並去除該乙醇而形成一固相；添加乙醇以及水至該固相，以形成一懸浮液； 添加正己烷(Hexane)至該懸浮液，將該懸浮液分為兩個相；從該兩個相中分離出第一含水之分離層以及含正己烷之分離層；添加乙酸乙酯(Ethyl Acetate)至該第一含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；從該兩個相中再次分離出第二含水之分離層以及含乙酸乙酯之分離層；添加正丁醇(n-Butanol)至該第二含水之分離層，將該分離層再次分為兩個相；從該兩個相中再次分離出第三含水之分離層以及含正丁醇之分離層；以及取該含正丁醇之分離層，去除正丁醇以得到大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該正丁醇的添加量與水的添加量相同。
  11. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒藥物中的用途，其特徵在於該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質為羽扇醇(Lupeol)。
  12. 一種大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質在製備抗豬繁殖與呼吸道綜合症病毒藥物中的用途，其特徵在於該大戟科植物Euphorbia neriifolia活性物質為豆甾醇(Stigmasterol)。
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