TWI500385B - Perfusion culture of organs or tissues, and perfusion culture devices - Google Patents

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TWI500385B
TWI500385B TW100103449A TW100103449A TWI500385B TW I500385 B TWI500385 B TW I500385B TW 100103449 A TW100103449 A TW 100103449A TW 100103449 A TW100103449 A TW 100103449A TW I500385 B TWI500385 B TW I500385B
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Description

臟器或組織之灌流培養方法以及灌流培養裝置
本發明係關於：用來長時間保存主要是以移植為目的而被摘取出來的臟器或組織之灌流培養方法以及灌流培養裝置。
針對於生病或者因事故所導致的臟器之不可逆的功能不全之治療，現在主要是實施臟器移植。隨著免疫抑制劑和移植技術的進展，移植件數不斷增加而且成功率也飛躍性地上昇當中，然而慢性的臟器不足則成為移植醫療的深刻問題(請參考：非專利文獻1)。為了對應這種臟器的不足，乃針對於移植動物的臟器的移植方法、或不易引起免疫學上的排斥反應之基因改造動物的開發(請參考：非專利文獻2、3)、甚至於朝著以人造臟器來取代臟器的功能之目標而從事的人工臟器的開發，都正在被進行開發當中(請參考：非專利文獻4)，但是無論是哪一種技術開發也都尚未達到可以完全取代成體臟器的功能之成果。
供移植用的捐贈者的臟器不足的問題，不僅是所提供的臟器的數量上的問題而已，所摘取出來的臟器在可供移植的狀態下之能夠保存的時間很短，也是一個很大的原因。因此，有人從事開發：將所摘取出來的臟器在活體外，在可供移植的狀態下，能夠長期間予以保存的技術。現在最為廣泛被使用的方法係單純冷卻法，這種方法是為了抑制細胞的代謝速度，先將臟器內的血液置換成低溫的臟器保存液之後，再浸泡在低溫的保存液中的方法。又，也有一種灌流冷卻保存法，係基於除去正在保存中的臟器內的老廢物之目的，一面對於臟器內的血管網灌流低溫的臟器保存液，一面在低溫下於以浸泡保存的方法，這種方法，最近在歐美已進行治療實驗了(請參考：非專利文獻5)。但是，利用這些方法所保存的臟器之可以安全使用的期間有其限度(例如：利用單純冷卻法之肝臟能夠使用的時限被認為是20小時)，因此就需要有一種能夠延長保存期間的技術。
曾經有人提出一種人工臟器系統的技術方案，是作為可將肝臟予以長期間保存的裝置，係將臟器支撐管插入到肝臟的下大靜脈切斷端，將整個肝臟吊掛，肝臟係受到該支撐管以及容器部上的肝臟載置面所支撐，而能夠在擴張的狀態下被保持支撐(例如請參考：專利文獻1的段落0024、第2圖以及第4圖)。
[先行技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2003-206201號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Lechler RI. et al.: Nat. Med. 11(6): 605,2005
[非專利文獻2]Eventov-Friedman S. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(8): 2928,2005
[非專利文獻3]Yang YG. et al.: Nat. Rev. Immunol. 7(7): 519,2007
[非專利文獻4]Malchesky PS. et al.: Artif. Organs. 30(9): 655,2006
[非專利文獻5]Moers C. et al.: N. Engl. J. Med. 360(1): 7,2009
[非專利文獻6]Butler AJ. Et al.: Transplantation 73(8): 1212,2002
[非專利文獻7]Nui A. et al.: Int. J. Artif. Ogans 26(1): 46,2003
根據專利文獻1的方法，因為是將支撐管插入到臟器，所以容易對於臟器造成損傷。又，本發明者等曾經以類似的構成方式來進行實驗的結果，確認出灌流液並無法行遍整個肝臟。
因此，本發明就以提供：藉由可讓灌流液行遍臟器的各角落的作法，在可充分維持其功能的狀態下，能夠將臟器予以長時間保存之灌流培養方法以及灌流培養裝置，作為本發明的技術課題。
本發明者等，為了解決上述課題而不斷進行檢討之結果，找到了一種創見，就是在對於臟器或組織(以下，有時候也會稱為「臟器等」)進行灌流培養時，不要將臟器等的自體本身吊掛，而是將在活體內與臟器等相連的第二臟器或組織也和臟器等一起摘取出來，藉由將該第二臟器或組織加以固定，而將欲培養的臟器等予以吊掛的作法，就不會對於臟器等造成損傷，而且又可以讓灌流液行遍整個臟器的方式來進行培養。
此外，也發現了：在將臟器等予以吊掛而進行培養的時候，藉由以讓臟器等的至少有一部分承受到浮力的方式，將臟器等予以浸泡在浸泡用液體中的作法，可讓灌流液更為行遍到達臟器等的各角落，能夠維持功能的時間明顯地變得更長之創見，因而完成了本發明。
亦即，本發明的其中一種面相(one aspect)係關於：
[1]一種臟器或組織之灌流培養方法，係將從哺乳類動物摘取出來的臟器或組織予以灌流培養的方法，該臟器或組織係和在活體內與前述臟器或組織相連的第二臟器或組織一起被摘取出來的，包含：藉由將前述第二臟器或組織加以固定，而將前述臟器或組織予以吊掛的工序、以及將灌流液灌流到前述臟器或組織的血管的工序；
[2]如上述[1]所述的灌流培養方法，其中，係在前述灌流工序中，將前述臟器或組織的至少一部分浸泡在臟器等的浸泡用液體中；
[3-1]如上述[1]或[2]所述的灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是肝臟，前述第二臟器或組織是橫隔膜；
[3-2]如上述[1]或[2]所述的灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是肝臟，前述第二臟器或組織是橫隔膜以及肋骨；
[4]如上述[1]或[2]所述的灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是腎臟，前述第二臟器或組織是位於腎臟的周圍的脂肪組織；以及
[5]一種臟器或組織之灌流培養方法，係將從哺乳類動物所摘取出來的臟器或組織予以灌流培養的方法，包含：
將前述臟器或組織予以吊掛，且將該臟器或組織的至少一部分浸泡在臟器等的浸泡用液體中的工序、以及將灌流液灌流到前述臟器或組織的血管的工序。
亦即，本發明的另外一種面相(another aspect)係關於：
[6]一種臟器或組織之灌流培養裝置，係具備：將臟器或組織予以吊掛的懸吊手段、用來將灌流液流入前述臟器或組織的灌流液流入用插管、以及用來從前述臟器或組織流出灌流液的灌流液流出用插管；
[7]如上述[6]所述的灌流培養裝置，其中，又具備：在將前述臟器或組織予以吊掛的狀態下，可將該臟器或組織的至少一部分浸泡在臟器等的浸泡用液體之容器；
[8-1]如上述[6]或[7]所述的灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是肝臟，並且又具備：用來回收膽汁之膽管用插管；
[8-2]如上述[6]、[7]或[8-1]所述的灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是肝臟，前述懸吊手段的結構，是可將從哺乳類動物中與肋骨以及橫隔膜一起被摘取出來的肝臟，利用該肋骨加以固定；
[9-1]如上述[6]或[7]所述的灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是腎臟，並且又具備：用來回收尿液的尿管用插管；以及
[9-2]如上述[6]、[7]或[9-1]所述的灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是腎臟，前述懸吊手段的結構，是可將從哺乳類動物中與周圍的脂肪組織一起被摘取出來的腎臟，利用該脂肪組織加以固定。
根據本發明的臟器或組織之灌流培養方法以及灌流培養裝置，不會對於臟器造成損傷，可將灌流液行遍臟器的各角落，因此可在臟器維持其功能的狀態下做長時間保存，能夠在良好的狀態下供進行移植。
 [臟器或組織之灌流培養方法]
本發明的臟器灌流培養方法的第一種態樣，是將從哺乳類動物摘取出來的臟器或組織予以灌流培養的方法，其特徵為：該臟器或組織係和在活體內與前述臟器或組織相連的第二臟器或組織一起被摘取出來的，包含：藉由將第二臟器或組織加以固定，而將臟器或組織予以吊掛的工序、以及將灌流液灌流到臟器或組織的血管的工序。
在本說明書中，所稱的「哺乳類動物」並未特別限定，本發明的灌流培養方法係可利用到所有的哺乳類動物的臟器等。要將本發明的方法所培養後的臟器等使用於移植的情況下，哺乳類動物係可因應接受臟器等的移植的對象(亦即，接受移植者)而適正地進行選擇，例如係可舉出：人、豬、牛、猿猴、狒狒、狗、貓等。接受移植者是人的情況下，主要是使用從腦死患者身上摘取出來的臟器等。
在本說明書中，所稱的「臟器或組織(臟器等)」，只要是適合灌流培養的臟器或組織即可，並未特別地限定，例如係可舉出：心臟、肝臟、腎臟、肺、胰臟、胃、小腸、大腸、牙齒及其周圍組織、毛髪及其周圍組織等。
在本發明中所稱的「灌流培養」係指：將插管之類的軟管連結到所摘取出來的臟器等的血管，與血流同樣地令灌流液流入及流出來以資培養臟器。灌流液則是本行業人士可因應哺乳類動物和臟器的種類，適當地選擇公知的組成分或者與其相當的組成分。例如：只要是含有可供細胞生存所必須的糖類、胺基酸等等的營養素的灌流液即可，可採用：一般的細胞培養所用的培養液、或臟器保存所用的臟器保存液，其組成分並未特別的限定。
本發明的灌流培養方法的臟器等，係使用：和在活體內與臟器等相連的第二臟器或組織一起被摘取出來的臟器等。根據這種方式，藉由將該第二臟器或組織加以固定，就可將欲培養的臟器等予以吊掛，所以不會對於欲培養的臟器等造成損傷，可以令培養液行遍到臟器等的各角落。
第二臟器或組織係在活體內與臟器等相連的臟器或組織為宜，更好的是在活體內與臟器等的上部相連的臟器或組織。使用這種臟器或組織來吊掛的話，就可在類似於活體內的結構的環境下來進行臟器等的培養。此處所稱的「類似於在活體內的結構的環境」，意指：臟器等並未受到來自於容器的內面等的硬質材料的壓迫，可維持自然的形狀的環境。以往的臟器等的灌流培養，都是將臟器等載置在培養皿等的容器內來進行的，因此，與培養皿相接觸的部分的血管會受到壓迫而無法讓灌流液充分地遍及。根據本發明的方法，係將臟器等予以吊掛，在類似活體內的結構的環境下進行培養，所以能夠令灌流液行遍整個臟器等。
又，將第二臟器或組織加以固定的情況下，因為即使第二臟器或組織受到損傷也無大礙，因而可利用「插入支撐管」、「利用夾子予以夾住」、「利用縫合線予以縫合」之類的方法，牢牢地加以固定。
例如：欲培養的臟器是肝臟的情況下，在活體內時，肝臟的上部係與橫隔膜相連，該橫隔膜又連接著肋骨。因此，可單獨地將橫隔膜，或者將橫隔膜與肋骨一起作為第二臟器或組織來使用。從哺乳類動物將肝臟摘取出來的時候，如果是與橫隔膜一起摘取出來的話，藉由將該橫隔膜加以固定，即可在近似於活體內的環境下將肝臟予以吊掛。如果是除了橫隔膜之外，連肋骨也一起摘取出來的話，則可將肋骨加以固定，因此可更為穩定地予以吊掛。
第二臟器或組織的其他的例子，如果是在培養腎臟、胰臟的情況下，係可舉出：附著在這些臟器的表面的脂肪組織；如果是在培養消化系統的臟器的情況下，係可舉出：鄰接於上游的臟器(具體而言，如果是培養小腸的情況下，是指：胃、十二指腸；如果是培養大腸的情況下，是指：小腸)；如果是培養牙齒及其周圍組織的情況下，是指：顎骨、齒槽骨、齒根骨、齒肉；如果是培養毛髪及其周圍組織的情況下，是指：表皮、真皮、脂肪組織等，但並不限定於這些。
在本發明的灌流培養方法中，將灌流液灌流到臟器等的血管的工序(灌流工序)例如：係將連繫於臟器等的血管的軟管連結到泵浦，而可利用泵浦來使得灌流液流入以及流出。
本發明的灌流培養方法，在灌流工序中，較佳方式係將臟器等的至少一部分浸泡在臟器等的浸泡用液體中而進行灌流為宜。如此一來，臟器等的至少一部分會承受到浮力，與單純予以吊掛的情況相比較，可營造出更為近似於活體內的結構的環境，因而可令灌流液行遍到達臟器等的各角落。臟器等係至少有其本身的30%存在於液體中的狀態為佳，更好是50%，更加好是80%，最好則是整個都存在於液體中的狀態。臟器等的浸泡用液體係與灌流液同樣地，係可配合哺乳類動物以及臟器等的種類而由本行業人士做適當地選擇，既可以是與灌流液相同的組成分，也可以是不同的組成分。
本發明的臟器或組織之灌流培養方法的第二種態樣，係將從哺乳類動物摘取出來的臟器等予以灌流培養的方法，其特徵為：包含將臟器等予以吊掛，並且將臟器等的至少一部分浸泡在臟器浸泡用液體的工序、以及將灌流液灌流到臟器等的血管的工序。
本發明的臟器或組織之灌流培養方法的第一種態樣中所使用的用語，在第二種態樣中也是以相同的意義被使用，所以此處將省略其說明。
在本發明的方法的第二種態樣中，將臟器等予以吊掛的工序，係只要能夠讓臟器等維持其功能的話，無論是哪一種方法皆可，但是，最好還是要保持成類似於活體內的環境的狀態。因此，最好是與在於活體內的上下方向都相同，並且儘可能採用非侵入式的方法予以吊掛。
[臟器或組織之灌流培養裝置]
本發明的臟器或組織之灌流培養裝置的特徵係具備：將臟器等予以吊掛的懸吊手段、將臟器等予以吊掛的狀態下，可讓該臟器等的至少一部分浸泡在臟器等的浸泡用液體內的容器、用來令灌流液流入臟器等的灌流液流入用插管、用來令灌流液從臟器等流出的灌流液流出用插管。
將該裝置應用於肝臟的培養的情況下，又具備有膽管用插管為佳。藉由在肝臟的膽管插入膽管用插管，即可在培養容器的外部進行回收由肝臟所分泌的膽汁。
將該裝置應用於腎臟的培養的情況下，又具備有尿管用插管為佳。藉由在腎臟的尿管插入尿管用插管，即可在培養容器的外部進行回收由腎臟所分泌的尿液。
又，在將該裝置應用於肝臟的培養，而且肝臟係與肋骨以及橫隔膜一起被摘取出來的情況下，懸吊手段的結構係以可將肋骨加以固定的結構為佳。
又，在將該裝置應用於腎臟的培養，而且腎臟係與周圍的脂肪組織一起被摘取出來的情況下，懸吊手段的結構係以可將脂肪組織加以固定的結構為佳。
作為本發明的灌流培養裝置之一例，係將肝臟培養裝置1顯示於第1圖，以下將說明其概要。肝臟培養裝置1係用來培養與橫隔膜以及肋骨一起被摘取出來的肝臟的裝置，肝臟係其整體被浸泡在液體中的狀態下被進行灌流培養。
<整體的構成>
肝臟培養裝置1係具備：肝臟固定用培養容器10、被固定在肝臟的灌流液流入用插管20以及灌流液流出用插管30，各插管係連接著軟管80、82。被連結到灌流液流入用插管20的軟管80係中介著灌流液流入用蠕動泵浦(peristaltic pump)70而連接到微型載體旋轉攪拌瓶(mirco carrier spinner flask)62，而將微型載體旋轉攪拌瓶62中的灌流液供給到灌流液流入用插管20。
經由灌流液流入用插管20而流入肝臟100的灌流液係又流出到灌流液流出用插管30，經由與灌流液流出用插管30相連結的軟管82等而被排出到微型載體旋轉攪拌瓶62。
以下，將針對各個構成要件的較佳例子進行說明。
<肝臟固定用培養容器10>
第2圖係顯示出肝臟固定用培養容器10的擴大圖。
在培養容器10中，係設置了可將肝臟100利用肋骨104予以吊掛的懸吊手段106、108。培養容器10的結構，係可在其內部充滿液體，並且係以可讓肝臟100承受到浮力的方式將整個肝臟100都被浸泡在液體內。又，在培養容器10的壁上，係形成有可供與插管相連結的軟管80、82穿過的貫通孔99a、99b。
又，在培養容器10上，係設有：用來固定插管或與插管相連結的軟管之固定具96、98。藉由將插管利用固定具96、98加以固定，可以防止插管太過於插入臟器的內部導致臟器受損傷，或者插管從臟器脫落的情事，可令培養液穩定地進行循環。固定具96、98係可採用例如：在前端設有可供插管或軟管嵌合之數厘米大小的細縫之柱狀構件。將該構件固設在培養容器內壁，藉由將插管嵌合在細縫，即可將插管予以固定。
培養容器10雖然是哪一種素材皆可，但是係可採用例如：玻璃、壓克力材質來製作。
<肝臟的灌流培養所使用的灌流液流入/流出用插管與膽管用插管>
灌流液流入用插管20係顯示於第3圖的上段，灌流液流出用插管30係顯示於第3圖的中段，膽管用插管40係顯示於第3圖的下段。第3圖所示的各插管係因應所適用的臟器或組織的種類，而可變更構成插管的各構件，例如：導管部分的尺寸等。例如：在肝臟的灌流培養時，灌流液流入/流出用插管，係切取下留置針(例如：流入用是22G號留置針、流出用是16G號留置針)的導管部分21、31，連接到矽膠軟管25、35(例如：內徑1 mm)之後，再以軟性絹製縫合線24、34在兩個地方予以綑綁固定，然後再捲繞保鮮膜(商品名：Para film) 22、32來製作的。膽管用插管40係將留置針(例如：27G號留置針)的導管部分41藉由魯厄式固定配件42(例如：1.5 mmID用；Luer lock fitting)來與矽膠軟管45(例如：內徑1 mm)相連接而製作的。各插管之與導管相反的一端，係連接著魯厄式固定配件23、33、43，因而能夠與軟管80、82、88(第1圖)相連結。
灌流液流入用插管20係直接或間接地連接於例如：肝臟100的門脈，而灌流液流出用插管30係直接或間接地連接於例如：肝臟的靜脈。
灌流液流入用插管20係連接於灌流液流入量蠕動泵浦70，藉由令泵浦70作動，即可讓灌流液由灌流液流入用插管20流入肝臟100。流入後的灌流液係通過肝臟100內部之後，再從灌流液流出用插管30流出，然後流入軟管82。又，由肝臟所分泌的膽汁係從膽管用插管40回收到膽汁回收迴路(膽汁回收軟管88以及膽汁回收瓶68)。
<肝臟的培養所用的灌流迴路>
灌流液流入用插管20係採用魯厄式固定配件23(例如：2.5 mmID用)來與矽膠軟管80(例如：內徑2 mm)相連結，同樣地採用魯厄式固定配件來將矽膠軟管與例如：內徑為3.15 mm的法美多軟管(音譯名，商標名為：PharMed Tube；以下都稱為：法美多軟管)相連接。在這個法美多軟管上面塗敷含氟潤滑脂，並且設置到灌流液流入用蠕動泵浦70。
灌流液流出用插管30係使用魯厄式固定配件33(例如：2.5 mmID用)而連結到矽膠軟管82(例如：內徑2 mm)。進而又將這個矽膠軟管連接到在瓶蓋上穿插著三根鐵氟龍軟管(例如：內徑1 mm；T1以及T2。第3根並未圖示出來)之附矽膠閥門的史考特瓶60(例如：100 ml)之其中的一根鐵氟龍軟管T1。
另一方面，史考特瓶60的另外兩根鐵氟龍軟管之其中一根則是在瓶內側連接著長度抵達瓶底的矽膠軟管(例如：內徑2 mm)(第1圖中的T2)，在瓶外側則是連接著在兩端連結有矽膠軟管(例如：內徑2 mm)之法美多軟管。矽膠軟管的另一端係經由灌流液流出用蠕動泵浦72，而連接到穿插在附矽膠閥門的微型載體旋轉攪拌瓶(例如：1000 ml)62的位於圖中右側的瓶蓋的三根鐵氟龍軟管(T3以及T4。第三根並未圖示出來)之中的鐵氟龍軟管T3(ASONE)，該鐵氟龍軟管T3在瓶內側並未連結矽膠軟管，其前端並未抵達液體表面。
穿插在史考特瓶60的瓶蓋的第三根鐵氟龍軟管，係在瓶外部連接於空氣濾清器。
灌流液係利用捲繞在微型載體旋轉攪拌瓶62上的加熱器來加以保溫。溫度係設定成：作為移植對象之哺乳類動物的平均體溫為宜，如果是人類的話，係設定成37℃前後為宜。至於加熱器，係可適合採用例如：Cell master可撓性加熱器(和研藥株式會社出品，京都市，日本)和Cell master 1700型加熱器(和研藥株式會社出品)、溫度電極(Mettler Toled，Tokyo，Japan)。
微型載體旋轉攪拌瓶62的兩個瓶蓋，分別穿插著三根鐵氟龍軟管，連結在穿插過位於圖中右側的瓶蓋之抵達瓶底的矽膠軟管(例如：內徑2 mm)的鐵氟龍軟管T4，係中介著灌流液流入用蠕動泵浦70來與矽膠軟管相連結。
穿插在位於圖中右側的瓶蓋的另一根鐵氟龍軟管則是在瓶外部連接到空氣濾清器。
此外，在於利用低溫來培養臟器等的時候，係可採用公知的保冷裝置來取代加熱器，來將灌流液予以保冷。保冷溫度係設定在4℃～35℃為宜，設定在20℃～35℃更佳。又，在於利用低溫來培養臟器等的時候，用來浸泡臟器等的液體也保持低溫，將培養中的臟器等也同時保冷為宜。作為這種方式的保冷所採用的保冷裝置，係可舉出例如：各種冷凝器、帕耳帖式(Peltier)冷卻裝置。
<灌流液回收用軟管的設置>
在灌流液流入用蠕動泵浦70與灌流液流入用插管20之間，以及在灌流液流出用插管30與史考特瓶60之間的矽膠軟管，安裝著流路切換用旋塞84、86，在其前端安裝著用來採取灌流液的灌流液回收用軟管(例如：15 ml)。
<氣泡除去用裝置的設置>
灌流液流入用定量送液泵浦70與灌流液流入用插管20之間係設置有氣泡除去裝置50。氣泡除去裝置50的構成方式係顯示於第4圖。以魯厄式固定配件插頭51作為水栓的矽膠軟管，係利用Y字型軟管予以連結，以資防止混進迴路中的氣泡流入肝臟，並且設置了可將那些氣泡從魯厄式固定配件插頭51(ISIS型)排出的裝置。Y字型軟管適合採用：迷你型接頭配件(F)53(6.5 mmID用：ISIS型)。
<培養基更換用灌流迴路>
為了在每24小時的灌流培養後就更換一次灌流液，係在第1圖所示的穿插在微型載體旋轉攪拌瓶62的圖中左側的瓶蓋的三根鐵氟龍軟管(T5以及T6。第三根並未圖示出來)之中，在於瓶內側並未連結矽膠軟管且前端未抵達液面的這一根鐵氟龍軟管T5、以及在於瓶內側連結著矽膠軟管且前端抵達液面的這一根鐵氟龍軟管T6都分別連接到在兩端連接著矽膠軟管之法美多軟管。另外一根的鐵氟龍軟管則是連接於空氣濾清器。連接於鐵氟龍軟管T5的矽膠軟管係經由灌流液追加用蠕動泵浦74而連結到含有新鮮的培養基之灌流液追加用史考特瓶64(例如：2000 ml)。
連接在鐵氟龍軟管T6的矽膠軟管係經由灌流液回收用蠕動泵浦78而連結於灌流液追加用史考特瓶66(例如：2000 ml)。
<製作用來將肝臟組入灌流迴路之前灌流迴路>
先架構一個如第5圖所示的前灌流迴路，以便於在將肝臟摘取出來的時候也能夠對其進行灌流液的送液。將灌流液流入用插管20利用魯厄式固定配件23來連結於矽膠軟管(例如：內徑2 mm)，將這個矽膠軟管連接到氣泡除去裝置50’。在氣泡除去裝置50’係有別個矽膠軟管連結於此，並且有連結一個塗敷著含氟潤滑脂的法美多軟管(例如：內徑3 mm)來設置蠕動泵浦94。在法美多軟管的另外一端係連結著矽膠軟管(例如：內徑2 mm)，從史考特瓶92將灌流液送出來。
如此一來，從史考特瓶92送出的灌流液就會經由灌流液流入用插管20而流入肝臟，進而流出到灌流液流出用插管30。灌流液流出用插管30係利用魯厄式固定配件33而連結於矽膠軟管(例如：內徑2 mm)，從肝臟流出來的灌流液係從矽膠軟管排出而被廢棄。
連接在前灌流迴路中的肝臟係利用魯厄式固定配件23、33來從矽膠軟管拆下灌流液流入用插管20以及灌流液流出用插管30，再藉由將魯厄式固定配件23、33連接到矽膠軟管80、82(第1圖)的魯厄式固定配件，就可以連接到第1圖所示的灌流迴路。
到此之前都是在說明本發明的灌流培養裝置之一例的肝臟培養裝置1的概要，但是也可以利用與肝臟培養裝置1同樣的構成方式來進行其他的臟器等的灌流培養。例如：腎臟也是可以利用同樣的構成方式來進行灌流培養。這種情況下，係可改變成下列的構成方式。
<腎臟的灌流培養所使用的灌流液流入/流出用插管與尿管用插管>
例如：灌流液流入/流出用插管係使用留置針(例如：流入用是26G號留置針、流出用是16G號留置針)的導管部分109、110，而尿管用插管係使用前端細小的滴管尖頭(例如：Eppendorf公司製造的GELoader Tip 0,5-20 ml)的前端部分111之外，其他部分都與第3圖所示的肝臟的灌流培養所使用的插管相同。
又，灌流液流入用插管20係直接或間接地連接到例如：腎臟的腎動脈；灌流液流出用插管30係直接或間接地連接到例如：腎臟的腎靜脈；尿管用插管40係直接或間接地連接到例如：尿管；除此之外，其他部份都與灌流培養肝臟的情況相同。
<腎臟的培養所使用的灌流迴路>
灌流液流入用插管20係使用魯厄式固定配件23(例如：1.5 mmID用)而連結到矽膠軟管80(例如：內徑1.0 mm)，同樣地使用魯厄式固定配件來將矽膠軟管連接到法美多軟管。在這個法美多軟管(例如：內徑1.6 mm)塗敷含氟潤滑脂，然後設置到灌流液流入用蠕動泵浦70。
灌流液流出用插管30係使用魯厄式固定配件33(例如：1.5 mmID用)而連結到矽膠軟管82(例如：內徑1 mm)。再將這個矽膠軟管連接到在瓶蓋穿插著三根鐵氟龍軟管(例如：內徑1 mm；T1以及T2。第三根並未圖示出來)的附矽膠閥門的史考特瓶60(例如：100 ml)的鐵氟龍軟管T1。
另一方面，史考特瓶60之另外兩根鐵氟龍軟管之中的一根，在瓶內側係連接著抵達瓶底的長度之矽膠軟管(例如：內徑2 mm)(第1圖的T2)；在瓶外側係連接著在兩端連結著矽膠軟管(例如：內徑2 mm)之法美多軟管。矽膠軟管的另外一端係中介著灌流液流出用蠕動泵浦72，而與插穿在附矽膠閥門的微型載體旋轉攪拌瓶(例如：1000 ml)62之圖中右側的瓶蓋的三根鐵氟龍軟管(T3以及T4。第三根並未圖示出來)之中的在瓶內側並未連結矽膠軟管且前端並未抵達液面的這一根鐵氟龍軟管T3(ASONE)相連接。
插穿在史考特瓶60的瓶蓋的第三根的鐵氟龍軟管係在瓶外部與空氣濾清器相連接。
又，灌流液回收用軟管、氣泡除去用裝置、以及培養基更換用灌流迴路係可採用與肝臟培養裝置所使用的相同的結構。
<製作用來將腎臟組入灌流迴路中的前灌流迴路>
先架構好第5圖所示的前灌流迴路，以便於在將腎臟摘取出來的時候也可以進行灌流液的送液。係利用魯厄式固定配件23將灌流液流入用插管20連結於矽膠軟管(例如：內徑1.0 mm)，再將這個矽膠軟管連接到氣泡除去裝置50’。氣泡除去裝置50’又有別的矽膠軟管連結，進而連結塗敷了含氟潤滑脂的法美多軟管(例如：內徑1.6 mm)而設置於蠕動泵浦94。在法美多軟管的另外一端係連結矽膠軟管(例如：內徑1.0 mm)，而從史考特瓶92將灌流液送出。
如此一來，從史考特瓶92送出的灌流液係經由灌流液流入用插管20而流入腎臟，再流出到灌流液流出用插管30。灌流液流出用插管30係利用魯厄式固定配件33而連結到矽膠軟管(例如：內徑2 mm)，從腎臟流出來的灌流液係從矽膠軟管排出而被廢棄。
連接在前灌流迴路中的腎臟，係利用魯厄式固定配件23而從矽膠軟管拆下灌流液流入用插管20，再將魯厄式固定配件23連接於矽膠軟管80(第1圖)的魯厄式固定配件，藉此即可連接到第1圖所示的灌流迴路。
此外，本說明書中所使用的用語，只是為了說明特定的實施方式而採用的，並不是意圖限定本發明。
又，在本說明書中所用的「包含」的用語，除了在文脈上明顯地應該作不同的解讀的情況以外，係指：存在著所記述的事項(構件、步驟、要素、數字等)之意思，而且也不排除有這些以外的事項(構件、步驟、要素、數字等)的存在。
只要沒有不同的定義的話，此處所使用的所有的用語(包含技術用語及科學用語)係具有：與本發明所屬技術領域的本行業人士所廣泛理解的意思相同的意思。此處所使用的用語，只要沒有明白顯示其不同的定義的話，都應該被解釋為具有與本說明書以及相關連發明所屬技術領域中的意思相整合的意思，不應該被解釋成理想化或過度的形式上的意思。
本發明的實施方式雖然有時候係參照著示意圖來進行說明，但是在示意圖的情況下，為了要將說明予以明確，有時候會有誇張地表現的情況。
雖然為了要表現各種構成要素而使用了「第一」、「第二」等等的用語，但是這些構成要素並不該受到這些用語所限定。這些用語只是用來將其中一種構成要素與其他的構成要素做區別，例如：將第一要素寫成第二要素，同樣地將第二要素寫成第一要素時，也有可能並未脫離本發明的範圍。
以下將佐以圖面更詳細地說明本發明。然而，本發明係可藉由各種態樣而予以具體地實現，並不該被解釋為只限定為此處所記載的實施例。
[實施例]
以下將依據實施例來具體地說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。
1.　灌流液的製作
灌流液係採用：10%的FCS(Life Technologies公司製，California，US)與抗生素-抗真菌劑混合液(nacalai tesque公司製，Japan)，添加了健他黴素硫酸鹽(和光純藥公司製，Osaka，Japan)和L-麩胺醯胺(Glutamin)(Life Technologies公司製)之L-15介質(Sigma公司製，Missouri，US)。將1000 ml的灌流液置入附矽膠閥門的1000 ml微型載體旋轉攪拌瓶(Bellco)內，以37℃進行保溫。
2.　將肝臟摘取出來以及連接到前灌流迴路
從白老鼠將肝臟摘取出來，連接到第5圖所示的前灌流迴路。
將乙醚(和光純藥公司製)充滿於乾燥容器內，將8至10週齡的Wistar白老鼠(SLC)移動到乾燥容器內使其吸氣麻醉之後，使用25G的注射針(Terumo公司製)與1 ml的注射筒(Terumo公司製)來將最終濃度為25 mg/ml的戊巴比妥鈉(麻醉劑)(TCI公司製，Tokyo，Japan)溶液400 μl注射到腹腔內。
再從深層麻醉下的白老鼠的下腹部起迄喉部為止的皮膚沿著正中線切開。再切開腹膜，將消化系統的臟器移動而露出肝臟、門脈。將肝臟往肋骨側上提而露出肝動脈，從肝動脈的下方利用絹製縫合線No.7(Natume公司製)進行結紮。同樣地將肝下部的下大靜脈利用絹製縫合線No.4(Natume公司製)製作一個結紮用環圈。利用絹製縫合線No.7(Natume公司製)將脾胃靜脈結紮。使用兩根前端彎曲的絹製縫合線No.4(Natume公司製)隔開間隔在門脈上做出兩個結紮用環圈。以10 ml/min的速度預先將灌流液流到前灌流迴路(第5圖)，在較之兩個門脈結紮用環圈更遠離肝臟的部位，將門脈予以半切，並且迅速地將灌流液流入用插管20插入門脈。立即將肝下部的下大靜脈從較之結紮用環圈更下部予以切斷，將灌流液流入。
將兩個門脈結紮用環圈結紮而將插管20固定在門脈，將插管插入部分利用少量的瞬間接著劑(商品名：Aron Alpha A)(第一三共公司製，Tokyo，Japan)加以固定。將總膽管半切之後，插入膽管用插管40，利用瞬間接著劑(商品名：Aron Alpha A)(第一三共公司製)加以固定。使橫隔膜露出，將左右的橫隔動脈和靜脈以絹製縫合線No.7(Natume公司製)予以結紮。將肋骨的合間予以切開，針對每一肋骨將橫隔膜切出，將較之切出口更上部的肋骨切開直達喉部。在肋骨的其中一部分刻上切痕，利用絹製縫合線No.4(Natume公司製)在肝上部的下大靜脈製作兩個結紮用環圈。將環圈結紮，阻止灌流液從肝下部的下大靜脈流出，將右心房予以半切。將灌流液流出用插管30插入半切後的右心房部分，將肝上部的下大靜脈的兩個結紮用環圈結紮而將插管固定，將結紮部位、插管插入部位利用瞬間接著劑(商品名：Aron Alpha A)加以固定。將肝臟周圍的器官、結合組織切除之後，維持著將肋骨和橫隔膜連結於肝臟的狀態下，從背面將肝臟切離。
3.　將肝臟連接到灌流迴路
3-1.　靜置固定方法(以往的方法)
首先，係在連接於前灌流迴路的狀態下，將灌流液流入用插管20固定在培養容器10的固定具96，將灌流液流出用插管30固定在固定具98，也將膽管用插管40固定在固定具(未圖示)。膽管用插管40係藉由魯厄式固定配件43(ISIS型)與流出到培養容器20的外部之膽汁回收迴路(軟管88及史考特瓶68)相連接。
接下來，將連接在灌流液流入用插管20的矽膠軟管(ASONE)利用裴安(Pean)止血鉗子(Natume公司製)予以夾住，暫時地使其停止液體流動之後，隨即將灌流液流出用插管30使用魯厄式固定配件33(ISIS型)連結到軟管82，因而連接到灌流迴路。然後，立即將灌流液流入用插管20使用魯厄式固定配件23(ISIS型)從前灌流迴路切離，將灌流液流入用插管20與軟管80藉由魯厄式固定配件23(ISIS型)予以連結，藉此，可與為了防止氣泡混入肝臟中而預先充滿培養液之已經除去氣泡後的灌流迴路做無菌方式的連接。此外，與此同時地，藉由取下灌流迴路上的裴安止血鉗子(Natume公司製)，又開始讓灌流迴路的液體流動。
肝臟100係被載置在培養容器10內的台上。
3-2.　在溶液中的靜置固定方法(以往的方法)
係利用與3-1同樣的方法來將肝臟100連接到灌流迴路。
肝臟100係被載置到培養容器10內的台上，當液體充滿培養容器10的內部時，係以讓肝臟不會因浮力而上浮的方式，預留著不會產生壓迫的程度之間隙，以紗布覆蓋肝臟，將紗布固定於台上。
然後，以PBS(-)充滿培養容器10內，讓肝臟輕輕地浮游之後，再將容器予以密閉。
3-3.　吊掛型固定方法(本案發明的方法)
係利用與3-1同樣的方法將肝臟100連接到灌流迴路。
如第2圖所示般地，使用絹製縫合線No.4(Natume公司製)106來將肋骨104固定在培養容器10附屬的固定具108的幾個地方之後，先將培養容器10密閉之後，再將培養容器縱置而使得流入用插管20來到下側，利用肋骨104與橫隔膜102來將肝臟100吊掛。
3-4.　在溶液中的吊掛型固定方法(本案發明的方法)
係利用與3-1同樣的方法將肝臟100連接到灌流迴路。
使用絹製縫合線No.4(Natume公司製)106來將肋骨104固定在培養容器10附屬的固定具108的幾個地方之後，將培養容器10的內部充滿PBS(-)而使肝臟浮游。先將培養容器密閉之後，再將培養容器10縱置以使得流入用插管20來到下側，利用肋骨104與橫隔膜102將肝臟100吊掛而使其浮游。
4.　肝臟的灌流培養
將灌流液流入用插管20與微型載體旋轉攪拌瓶62(Bellco公司製)之間的蠕動泵浦70(岩木公司製)的流速調節成10 ml/min，而使灌流液流入肝臟100。
將培養容器較之旋轉攪拌瓶62更朝垂直方向上抬並且予以靜置，利用高低差所產生的重力，以使得流出速度為10 ml/min的方式來調節培養容器的高度。這些的流速的調節，係利用在一定的時間內從灌流液回收用軟管所回收的灌流液量來執行的。此外，100 ml的史考特瓶60(DURAN公司製)與微型載體旋轉攪拌瓶62之間的蠕動泵浦72(岩木公司製)的流速也被調節成10 ml/min。此外，在史考特瓶60與微型載體旋轉攪拌瓶62的瓶蓋設置了透氣過濾器(Millipore公司製)以使得迴路內部的壓力不會因為蠕動泵浦72而產生變化。
5.　對於灌流液在臟器內血管內的循環進行確認
對於利用3-1至3-4所記載的各種固定方法來加以固定後的肝臟，依照「4.肝臟的灌流培養」的方法，將利用PBS(-)來稀釋成5倍後的台酚藍色素溶液(Sigma公司製) 10 ml進行送液之後，對於肝臟的外觀、以及微型電腦斷層(CT)圖像進行攝影。將結果顯示於第6圖。在第6圖中，3-1係顯示通常的靜置固定；3-2係顯示在液體中的靜置固定；3-3係顯示吊掛型固定；3-4係顯示液體中的吊掛型固定。在第6圖中，A是顯示肝臟的外觀的照片，B是顯示肝臟的微型電腦斷層(CT)圖像。在顯示外觀的照片中，以虛線圍繞的區域是被台酚藍色素所染色的部分。
在通常的靜置固定方法(3-1)以及在液體中的靜置固定方法(3-2)中，臟器整體並未被染成藍色，在肝臟的各葉重疊的區域並未觀察到有染色。在吊掛型固定方法(3-3)中，雖然係有一部分未受到染色的區域的存在，但是臟器的近乎整體是被染色，與通常的靜置固定方法、在液體中的靜置固定方法相比較，明顯地觀察到臟器內的灌流液的循環有所提昇。在液體中的吊掛型固定方法(3-4)中，臟器整體係被均勻地染成藍色，由此可知其較之吊掛型固定方法更可提昇循環效果，顯示出整個臟器內血管都有灌流液進行循環。
6.　灌流率的測定
利用3-1以及3-4所記載的固定方法進行固定，針對於24小時灌流培養後的肝臟，每1小時，就從連接在流路切換用旋塞的15 ml軟管(BD公司製)採取30秒鐘的灌流液，來測定了流入肝臟的灌流液的流速、以及從肝臟流出的灌流液的流速。計算出相對於流入量之流出量的百分率，將其當作灌流率。
無論是哪一種固定方法，因為其24小時的灌流率都是維持在90%以上，所以都被確認出都是在進行正常的灌流培養。
7.　障礙酵素活性的測定
每1小時從連接在流路切換用旋塞84的15 ml軟管(BD公司製)回收30秒鐘的灌流液，將所回收的灌流液分注到0.5ml小試管(eppendolf公司製，Hamburg，Germany)各50μl，以-80℃進行凍結保存。隔天再將凍結保存的灌流液融解，以15,000 rpm的轉速進行5分鐘離心式分離，針對其上澄液中的GOT以及GPT酵素活性，根據添附在商品名為：轉氨酶CII-和光測定劑之GOT及GPT酵素活性測定劑(和光純藥公司製)的方法來進行測定。灌流液之更換後的測定值，係將更換前後發生變化的測定值予以累加來計算。
將測定結果顯示於第7圖。通常的靜置固定方法、吊掛型固定方法、在溶液中的吊掛型固定方法，無論是哪一種，直到灌流培養18小時之後為止都是GOT為20 IU/總介質(total medium)以下，GPT為10 IU/總介質以下。
根據培養24小時之後的通常的靜置固定方法(3-1)，GOT是85 IU/總介質以上，GPT是30 IU/總介質以上；根據吊掛型固定方法(3-3)，GOT是70 IU/總介質以上，GPT是25 IU/總介質以上。另一方面，根據培養24小時之後的在溶液中的吊掛型固定方法(3-4)，GOT是40 IU/總介質以下，GPT是10 IU/總介質以下。由此測定結果可知，對於整體臟器內血管的循環受到確保之在溶液中的吊掛型固定方法係較之通常的靜置固定方法和吊掛型固定方法，其對於臟器的障礙係受到明顯的抑制。
8.　尿素合成量的測定
每1小時就從連接在流路切換用旋塞84的15 ml軟管(BD公司製)回收30秒鐘的灌流液，將所回收的灌流液分注到1.5 ml的小試管(eppendolf公司製，Hamburg，Germany)各1 ml，以-80℃進行凍結保存。隔天再將凍結保存後的灌流液融解，以15,000 rpm的轉速進行5分鐘離心式分離，依據添附在商品名為F-KIT的尿素測定試劑(J.K國際公司製)的方法，進行測定了尿素含量。灌流液之更換後的測定值，係將更換前後發生變化的測定值予以累加來計算。
將測定結果顯示於第8圖。根據在溶液中的吊掛型固定方法，灌流培養14小時後係1.098 mM；培養24小時後係2.566 mM、培養41.5小時後係3.529 mM。
由此結果可知，對於整體臟器內血管的循環受到確保之在溶液中的吊掛型固定方法，在超過以往方法之肝臟的保存界限的20小時之後，依然可以維持尿素合成功能。
9.　膽汁生產量的測定
針對於被回收到膽汁回收迴路(軟管88以及史考特瓶68)的膽汁量，每1小時就從所回收到的重量，使用電子秤來測定膽汁的生產量。將測定結果顯示於第9圖。根據在溶液中的吊掛型固定方法，係被確認出：從灌流培養開始時起至培養40小時為止，係有毎小時為0.06 g的經時性的膽汁生產。
由此結果可知，對於整體臟器內血管的循環受到確保之在溶液中的吊掛型固定方法，在超過以往方法之肝臟的保存界限的20小時之後，依然可以維持膽汁生產功能。
10.　腎臟的摘取以及將其連接到前灌流迴路
從白老鼠身上摘取出腎臟，藉由腎臟的灌流培養所用的灌流液流入/流出用插管20、30將腎臟連接到第5圖所示的前灌流迴路來取代肝臟。
將乙醚(和光純藥公司製)充滿於乾燥容器內，將8至10週齡的Wistar白老鼠(SLC)移動到乾燥容器內，進行吸氣麻醉之後，使用25G注射針(Terumo公司製)與1 ml的注射筒(Terumo公司製)來將最終濃度25 mg/ml的戊巴比妥鈉(麻醉劑)(TCI公司製，Tokyo，Japan)溶液400μl注射到腹腔內。
將深層麻醉下的白老鼠的下腹部起至喉部為止的皮膚，沿著正中線切開。切開腹膜，將消化系統的臟器移開而使腎臟、腎動脈、腎靜脈、尿管露出來。從周邊組織將腎動脈、腎靜脈、尿管剝離，從腎動脈、腎靜脈、尿管之各自的下方利用絹製縫合線No.4(Natume公司製)分別製作兩個結紮用環圈。預先在前灌流迴路(第5圖)內以0.2 ml/min的速度讓灌流液流動，在較之兩個腎動脈結紮用環圈更遠離腎臟的部位，將腎動脈半切之後，迅速地將灌流液流入用插管20插入腎動脈。隨即將背部大靜脈切斷，使灌流液流入。
將兩個腎動脈結紮用環圈結紮而將灌流液流入用插管20固定於腎動脈，將腎靜脈半切之後，迅速地將灌流液流出用插管30插入腎靜脈，將兩個腎靜脈結紮用環圈結紮以將灌流液流出用插管30固定在腎靜脈，將插管插入部分利用少量的瞬間接著劑(商品名：Aron Alpha A)(第一三共公司製，Tokyo，Japan)加以固定。將尿管半切之後，插入尿管用插管40，將環圈結紮，利用瞬間接著劑(商品名：Aron Alpha A)(第一三共公司製)加以固定。
為了將腎臟摘取出來，先將其他的器官切除後，將腎臟周圍的脂肪組織維持在與腎臟相連結的狀態，從背面將腎臟切離。
11.　將腎臟連接到灌流迴路
11-1.　靜置固定方法(以往的方法)
首先，在將腎臟維持在連接於前灌流迴路的狀態下，將灌流液流入用插管20固定在培養容器10的固定具96，將灌流液流出用插管30固定在固定具98，將尿管用插管40也固定在固定具(未圖示)。尿管用插管40則是藉由魯厄式固定配件43(ISIS型)而連接到往培養容器10的外部流出的尿液回收迴路(軟管88以及史考特瓶68)。
接下來，將連接在灌流液流入用插管20的矽膠軟管(ASONE)利用裴安止血鉗子(Natume公司製)予以夾住，暫時地停止液體流動之後，隨即將灌流液流出用插管30使用魯厄式固定配件33(ISIS型)來連結到軟管82，以資連接到灌流迴路。然後，隨即使用魯厄式固定配件23(ISIS型)將灌流液流入用插管20由前灌流迴路切離，藉由將灌流液流入用插管20與軟管80經由魯厄式固定配件23(ISIS型)來加以連結，可與為了防止氣泡混入腎臟而預先充滿培養液以將氣泡預先除去的灌流迴路進行無菌方式的連接。此外，與此同時地，取下灌流迴路上的裴安止血鉗子(Natume公司製)即可開始進行灌流迴路的液體流動。
腎臟係被載置在培養容器10內的台上。
11-2.　在溶液中的吊掛型固定方法(本案發明的方法)
首先，在於將腎臟連接於前灌流迴路的狀態下，維持著腎臟與腎動脈、腎靜脈、尿管之位置關係的狀態，將腎臟移動到矽膠之上，將灌流液流入用/流出用/尿管用插管20、30、40利用25G注射針(Terumo公司製)而固定在矽膠。各插管的固定方式，係以將兩根注射針交叉而橫跨各插管的方式刺入矽膠，而予以按押固定。此外，將腎臟周圍的脂肪組織使用25G注射針(Terumo公司製)固定在矽膠。
將灌流液流入用插管20固定在培養容器10的固定具96，將灌流液流出用插管30固定在固定具98，將尿管用插管40也固定在固定具(未圖示)。尿管用插管40係經由魯厄式固定配件43(ISIS型)而連接到往培養容器20的外部流出的尿液回收迴路(軟管88以及史考特瓶68)。
接下來，將連接於灌流液流入用插管20的矽膠軟管(ASONE)利用裴安止血鉗子(Natume公司製)予以夾住，暫時地停止液體流動之後，隨即使用魯厄式固定配件33(ISIS型)將灌流液流出用插管30連結到軟管82，而連接到灌流迴路。然後，隨即使用魯厄式固定配件23(ISIS型)將灌流液流入用插管20由前灌流迴路切離，藉由將灌流液流入用插管20與軟管80經由魯厄式固定配件23(ISIS型)而相連結，可與為了防止氣泡混入肝臟而預先充滿培養液而將氣泡預先除去的灌流迴路進行無菌方式的連接。此外，與此同時地，將預先夾住的裴安止血鉗子(Natume公司製)予以拆下，即可開始灌流迴路的液體流動。
將已經固定著腎臟的矽膠反轉過來而將腎臟吊掛，然後，使用絹製縫合線No.4(Natume公司製)106來將矽膠固定於培養容器10附屬的固定具108之後，在培養容器10內部充滿PBS(-)而令腎臟浮游起來。先將培養容器密閉之後，將培養容器10縱置，以使得流入用插管來到下側，將腎臟利用周圍的脂肪組織予以吊掛而使腎臟浮游。
12.　腎臟的灌流培養
適時地調節位於灌流液流入用插管20與微型載體旋轉攪拌瓶62(Bellco公司製)之間的蠕動泵浦70(岩木公司製)，以使尿量為0.3 ml/hour的方式來將灌流液流入到腎臟。
將培養容器朝向較之旋轉攪拌瓶62更垂直的方向上抬後予以靜置，利用高低差所產生的重力令灌流液從腎臟流出來。其他的做法則是與肝臟的灌流培養相同。
13.　障礙酵素活性的測定
將被回收到尿液回收迴路(軟管88以及史考特瓶68)的尿液，分注到0.5 ml的小試管(eppendolf公司製，Hamburg，Germany)各50 μl，以-80℃進行凍結保存。隔天再將凍結保存的尿液融解，以15,000 rpm的轉速進行5分鐘離心式分離，針對其上澄液中的GOT/GPT酵素活性，依據添附在在商品名為：轉氨酶CII-和光測定劑之GOT及GPT酵素活性測定劑(和光純藥公司製)的方法來進行了測定。
將測定結果顯示於第10圖。依據培養40小時之後的通常的靜置固定方法(11-1)，其GOT係0.6 IU/腎臟(Kidney)以上，GPT係0.08 IU/腎臟以上，相對於此，依據在溶液中吊掛型的固定方法(11-2)，GOT約為0.1 IU/腎臟，GPT近乎於0 IU/腎臟。此外，依據培養60小時後之在溶液中的吊掛型固定方法(11-2)，GOT約為0.3 IU/腎臟，GPT約為0.01 IU/腎臟。由此可知，在溶液中的吊掛型固定方法與通常的靜置固定方法相較，對於臟器的障礙明顯地受到抑制。
1．．．臟器灌流培養裝置
10．．．培養容器
20．．．灌流液流入用插管
21、31、41、109、110、111．．．肝臟用/腎臟用導管部分
22、32、42．．．保鮮膜
23、33、43．．．保鮮膜
24、34．．．軟性絹製縫合線
25、35、45．．．矽膠軟管
30．．．灌流液流出用插管
40．．．膽管用/尿管用插管
50、50’．．．氣泡除去裝置
60、64、66、68、92．．．史考特瓶
62．．．微型載體旋轉攪拌瓶
70、72、74、78、94．．．泵浦
80、82、88．．．軟管
84、86．．．流路切換用旋塞
96、98．．．固定具
99a、99b．．．貫通孔
100．．．肝臟
102．．．橫隔膜
104．．．肋骨
106．．．縫合線
108．．．固定具
第1圖係本發明的臟器或組織之灌流培養裝置之一例的示意圖。
第2圖係將第1圖的灌流培養裝置的培養容器予以擴大的示意圖。又，在第2圖的示意圖中，單純只是作為例示而畫出肝臟。
第3圖係本發明之與臟器或組織相連接的插管之一例的示意圖。
第4圖係氣泡除去裝置之一例的示意圖。
第5圖係前灌流迴路之一例的示意圖。
第6圖係對於利用各種固定方法來進行灌流培養後的肝臟，將台酚藍色素進行循環之後的外觀以及微型電腦斷層(CT)圖像。
第7圖係利用各種固定方法來進行灌流培養後的肝臟之GOT以及GPT的經時變化。
第8圖係利用在液體中的吊掛型固定方法來進行灌流培養後的肝臟之尿素合成量的經時變化。
第9圖係利用在液體中的吊掛型固定方法來進行灌流培養後的肝臟之膽汁產生量的經時變化。
第10圖係利用靜置固定方法以及在液體中的吊掛型固定方法來進行灌流培養後的肝臟之GOT以及GPT的經時變化。

Claims (9)

  1. 一種臟器或組織之灌流培養方法，係將從哺乳類動物摘取出來的臟器或組織予以灌流培養的方法，該臟器或組織係和在活體內與前述臟器或組織相連的第二臟器或組織一起被摘取出來的，包含：藉由將前述第二臟器或組織加以固定，而將前述臟器或組織予以吊掛的工序、以及將灌流液灌流到前述臟器或組織的血管的工序。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的臟器或組織之灌流培養方法，其中，係在前述灌流工序中，係將前述臟器或組織的至少一部分浸泡在液體中。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的臟器或組織之灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是肝臟，前述第二臟器或組織是橫隔膜。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述的臟器或組織之灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是肝臟，前述第二臟器或組織是橫隔膜以及肋骨。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述的臟器或組織之灌流培養方法，其中，前述臟器或組織是腎臟，前述第二臟器或組織是位於腎臟周圍的脂肪組織。
  6. 一種臟器或組織之灌流培養裝置，係具備：將臟器或組織予以吊掛的懸吊手段、用來將灌流液流入到前述臟器或組織的灌流液流入用插管、以及 用來讓灌流液從前述臟器或組織流出的灌流液流出用插管，當前述臟器或組織是肝臟的情況時，前述懸吊手段的結構是可將從哺乳類動物中與肋骨以及橫隔膜一起被摘取出來的肝臟，利用該肋骨加以固定的結構，當前述臟器或組織是腎臟的情況時，前述懸吊手段的結構是可將從哺乳類動物中與周圍的脂肪組織一起被摘取出來的腎臟，利用該脂肪組織加以固定的結構。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的臟器或組織之灌流培養裝置，其中，又具備：在將前述臟器或組織予以吊掛的狀態下，可將該臟器或組織的至少一部分浸泡在液體中的容器。
  8. 如申請專利範圍第6或7項所述的臟器或組織之灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是肝臟，並且又具備膽管用插管。
  9. 如申請專利範圍第6或7項所述的臟器或組織之灌流培養裝置，其中，前述臟器或組織是腎臟，並且又具備尿管用插管。
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