BR112013001191B1 - Método ex vivo para isolamento de ilhotas de pâncreas de tecido pancreático - Google Patents

Abstract

métodos para aumentar os rendimentos de isolamento de produtos celulares a presente invenção se refere a métodos para o isolamento de produtos celulares, tal como ilhotas pancreáticas, que podem ser usados na pesquisa do diabetes e transplante terapêutico. os métodos podem envolver fornecer um tecido doador que tem células desejadas e células indesejadas, perfundir o tecido doador com uma solução de perfusão, desenvolver edema durante a perfusão do tecido doador para formar um tecido inchado, e separar as células desejadas do material celular indesejado para obter um produto celular. os métodos podem, também, incluir romper o tecido, e separar as células desejadas do material celular indesejado para obter o produto celular. os métodos podem resultar em um maior rendimento do produto celular que retém integridade funcional suficiente para ser útil como um recurso para transplantes.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

[001] Este pedido de patente não provisório reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/365.103 depositado em 16 de julho de 2010. A revelação do pedido de patente prévio é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] Na medicina moderna, terapias celulares, medicina regenerativa e engenharia de tecidos envolvem tecnologias de coleta, expansão, modificação e reimplante de células e tecidos viáveis vivos. Um exemplo primário é o transplante das ilhotas pancreáticas de Langerhans isoladas para o tratamento de diabetes Tipo I (dependente de insulina). Desde as primeiras tentativas experimentais de melhoria do diabetes Tipo I através do transplante do aloenxerto de ilhotas de um doador, o campo foi desafiado pela necessidade de métodos melhorados de recuperação de ilhotas do pâncreas do doador. De fato, há um esforço mundial considerável para desenvolver o conceito para o tratamento do diabetes Tipo I por transplante de ilhotas, mas a aplicação clínica das técnicas desenvolvidas em modelos animais é repleta de numerosos desafios. O campo de transplante de ilhota geralmente depende de processos de digestão enzimática que destroem a matriz extracelular tecidual, liberando as ilhotas capturadas para processamento e purificação adicionais. Este procedimento largamente praticado tem desvantagens principalmente graças à dificuldade de controlar o processo digestivo para produzir uma quantidade ótima de células viáveis.

[003] A fonte das ilhotas também permanece uma questão primária, e o isolamento do pâncreas do doador exige a solução de questões acerca da fonte, fornecimento e condição dos órgãos do doador A confiança em um fornecimento adequado de órgãos humanos com esta finalidade é considerada fútil, tal que fontes alternativas têm sido ativamente procuradas (Bonner-Weir, S. et al., New sources of pancreatic beta-cells, Nat. Biotechnol. 23:857-861, 2005; Hering, B. J. et al., Prolonged diabetes reversal after intraportal xenotransplantation of wild-type porcine islets in immunosuppressed nonhuman primates, Nat. Med., 12:301-303, 2006; Inada, A.; Bonner-Wier, S. et al., How can we get more beta cells?, Curr. Diab. Rep., 6:96-101, 2006).

[004] Diversos mamíferos são considerados ótimos candidatos para o transplante de ilhota xenogeneica. Dos mamíferos potenciais, porcos são considerados a espécie doadora de escolha para transplante de ilhota xenogeneica por diversas razões convincentes. Os porcos compartilham muitas similaridades fisiológicas com os seres humanos e a insulina porcina demonstrou eficácia clínica por muitos anos. Os porcos são criados como uma fonte de alimento e fornecem uma fonte ética de ilhotas de doador alojadas em um ambiente controlado para assegurar a segurança do xenotransplante da ilhota porcina. Entretanto, as experiências em muitos laboratórios por 10 anos mostram que o isolamento de ilhotas porcinas parece ser mais difícil (Finke, E., et al., Large scale isolation, function, and transplantation of islets of Langerhans from the adult pig pancreas. Transplant. Proc. 23:772-773, 1991; Giannarelli, R. et al., Preparation of pure, viable porcine and bovine islets by a simple method. Transplant. Proc., 26:630-631, 1994; Marchetti, P. et al., Automated largescale isolation, in vitro function and xenotransplantation of porcine islets of Langerhans, Transplantation 52:209-213, 1991; O'Neil, J. J. et al., The isolation and function of porcine islets from market weight pigs. Cell Transplant., 10:235-246, 2001; Toso, C. et al., Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant., 9:297-305, 2000), em comparação ao isolamento das ilhotas humanas (Kenmochi, T. et al., Improved quality and yield of islets isolated from human pancreas using two-step digestion method, Pancreas 20:184-190, 2000), bovinas (Figliuzzi, M. et al., Influence of donor age on bovine pancreatic islet isolation, Transplante, 70:1032-1037, 2000), ou de roedor (Shapiro, A. M. et al., High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion-a comparison with standard technique, Cell Transplant., 5:631-638, 1996).

[005] As ilhotas porcinas são menos compactas e tendem a fra gmentar durante o procedimento de isolamento e durante períodos prolongados de cultura in vitro (Ricordi, C. et al., A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancreas, Diabetes, 35:649653, 1986). Além disso, a idade, e mesmo a linhagem, do porco doador foram documentadas por vários grupos por influenciar acentuada- mente no processo de isolamento da ilhota, com os chamados porcos jovens com porte de mercado, (<6 meses) provando ser particularmente difíceis como uma fonte de ilhotas transplantáveis (Bottino, R. et al., Isolation outcome and functional characteristics of young and adult pig pancreatic islets for transplantation studies, Xenotransplantation, 14:74-82, 2007; Dufrane, D. et al., Impact of porcine islet size on cellular structure and engraftment after transplantation: Adult versus young pigs, Pancreas 30:138-147, 2005; Toso, C. et al., Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant., 9:297-305, 2000). Ilhotas de porcos adultos (> 2 anos) ofereceram não somente rendimentos superiores, mas mantiveram a capacidade de conservar a morfologia intacta durante o processo de isolamento e cultura, em associação com propriedades funcionais superiores após o transplante. Apesar do desafio encontrado por muitos grupos tentando isolar ilhotas de porcos jovens, porcos doadores com porte de mercado (<80 kg = <12 meses de idade) são preferenciais reprodutores com atividade encerrada (> 200 kg => 2 anos) devido à sua abundância, custos menores por ani mal e de produção pecuária, e são mais adequados para satisfazer as referências reguladoras do tecido do doador para o xenotransplante. Os métodos desta revelação podem melhorar o rendimento do produto celular de tecidos doadores e melhorar a eficácia de perfusão da máquina hipotérmica (HMP) de tecidos doadores, tais como pâncreas, antes do uso, tal como durante o isolamento de ilhota.

[006] A base científica para a conservação com perfusão hipo- térmica de órgãos é baseada no efeito da temperatura sobre todos os processos biológicos e químicos, que são fundamentalmente diminuídos por uma redução da temperatura. Por isso as consequências deletérias de isquemia e anóxia podem ser atenuadas pela aplicação de hipotermia, que tem fornecido a base da maioria dos métodos de conservação de órgãos eficazes em uso comum hoje. A conservação por perfusão hipotérmica é baseada na premissa fundamental que os dispositivos podem ser projetados para facilitar a substituição do sangue na circulação de um órgão ex vivo com fluidos especialmente projetados para maximizar os efeitos protetores da hipotermia sobre o tecido isquêmico.

[007] Desde o advento do transplante clínico de órgão nos anos 60, uma variedade de máquinas de perfusão foi desenvolvida principalmente para a conservação de rins, mas até pouco tempo estas não eram empregadas clinicamente devido ao custo e complexidade relativamente altos e comparação com técnicas de armazenamento a frio simples. Hoje, há um uso crescente da perfusão mecânica para conservação de rins do doador devido ao efeito relatado de resultado melhorado usando os chamados órgãos de doador "marginais" ou de "critérios estendidos". Esta técnica, por isso, tem o principal impacto potencial de aumentar o número de órgãos disponíveis para transplante. Uma das máquinas comercialmente disponíveis (LifePort®; LifeLine Scientific) aprovada para o uso clínico para rins pode ser utilizada nos métodos associados com o presente pedido de patente melhorando o rendimento de produto celular de tecidos doadores com ou sem conservação hipotérmica.

[008] Estudos mais recentes demonstraram que a conservação hipotérmica de órgãos, tais como o pâncreas, por perfusão mecânica é factível e pode ser seguramente estendida a 24 e 48 h (Alteveer, R. J. et al., Hemodynamics and metabolism of the in vivo vascularly isolated canine Pancreas, Am. J. Physiol., 236:E626-E632, 1979; Florack, G. et al., Preservation of canine segmental pancreatic autografts: Cold storage versus pulsatile machine perfusion, J. Surg. Res., 34:493-504, 1983; Leeser, D. B. et al., Pulsatile pump perfusion of pancreatas before human islet cell isolation, Transplant, Proc. 36:1050-1051, 2004; Tersigni, R. et al., Pancreaticoduodenal preservation by hypothermic pulsatile perfusion for twenty-four hours, Ann. Surg., 182: 743-748, 1975; Toledo-Pereyra, L. H., Hypothermic pulsatile perfusion: Its use in the preservation of pancreases for 24 to 48 hours before islet cell transplantation, Arch. Surg., 115:95-98, 1980; Moers, C. et al., Ma-chine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation, N. Engl. J. Med., 360:7-19, 2009; Rakhorst, G. et al., Revival of machine perfusion: New chances to increase the donor pool? Expert Rev. Med. Devices 2:7-8, 2005; Reznik, O. N. et al., Increasing kidneys donor's pool by machine perfusion with the LifePort-pilot Russian study, Ann. Transplant, 11:46-48, 2006; Taylor, M. J. et al., Current state of hypothermic machine perfusion preservation of organs: The clinical perspective, Cryobiology, in press).

[009] Sistemas de perfusão renal dedicados podem ser empre gados pelos métodos da presente revelação após modificações apropriadas feitas para acomodar as características do respectivo órgão, tais como, por exemplo, o baixo fluxo fisiológico e os requerimentos de pressão do pâncreas. As últimas ajudam a evitar o excessivo edema do órgão que o transplante pós-segmentário e a reperfusão resulta em hemorragia subcapsular, necrose hemorrágica, congestão venosa e secreções pancreático-duodenais hemorrágicas documentadas.

[0010] O transplante de produtos celulares foi anteriormente rela tado. Por exemplo, foi relatado que ilhotas transplantadas isoladas a partir de pâncreas canino 24 h perfundidas resultam na sobrevida do recipiente pós-transplante de 60%, fornecendo resultado similar ao implante de ilhotas frescas. As ilhotas isoladas do pâncreas humano após 13 h de armazenamento estático frio e 4 h de perfusão pulsátil hipotérmica em um sistema Waters RM3 foram caracterizadas por rendimento viável e índice de estimulação superiores em relação a células isoladas de órgãos que sustentaram mais de 8 h somente em armazenamento estático (Gondolesi, G. E. et al., Reduction of ischemia-reperfusion injury in parenchymal and nonparenchymal liver cells by donor treatment with DL-alpha-tocopherol prior to organ harvest, Transplant. Proc., 34:1086-1091, 2002).

[0011] Estes estudos fornecem claramente a base de um impacto clínico/comercial fundamental de novas tecnologias que fornecem métodos melhorados desesperadamente necessários para a conservação do pâncreas para produzir melhores rendimentos de ilhotas de alta qualidade. Claramente, o transplante de ilhota está emergindo como uma opção viável para o tratamento de diabetes mellitus dependente de insulina, e testes clínicos estão em andamento em muitos centros em torno do mundo (Alejandro, R. et al., 2008 atualização do Collaborative Islet Transplant Registry, Transplantation 86:1783-1788, 2008; e Shapiro, A. M. et al., International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N. Engl. J. Med. 355:1318-1330, 2006). Consequentemente, a necessidade de ilhotas de doadores está se intensifi-cando e continuará crescendo. Dessa forma, há uma necessidade por qualidade e quantidades mais altas de ilhotas.

[0012] Apesar de muitos esforços de melhorar a técnica de isola mento de ilhota, o campo permanece reprimido pelas limitações e ex-centricidades de digestão enzimática de uma glândula que compreende menos de 5% do tecido endócrino. Consequentemente, coletar ilhotas de um pâncreas doador único muitas vezes produz massa de ilhota insuficiente para reverter o diabetes em um recipiente, tal que múltiplos doadores muitas vezes têm que ser considerados para tratamento de um recipiente único.

[0013] O potencial do xenotransplante para melhoria da demanda em um fornecimento inadequado de pâncreas humanos depende da eficiência de técnicas para isolamento das ilhotas dos pâncreas fonte (Hering, B. J. et al., The International Xenotransplantation Association consensus statement on conditions for undertaking clinical trials of porcine islet products in type 1 diabetes-executive summary, Xenotransplantation 16:196-202, 2009). Entretanto, neste momento, a aquisição do pâncreas doador para isolamento e transplante de ilhotas ainda não é largamente praticada em parte graças a preocupações com a is- quemia pós-morte nos campos de ilhotas funcionais.

SUMÁRIO

[0014] Métodos são descritos para o isolamento de produtos celu lares pela aplicação da perfusão mecânica hipotérmica (HMP) e pelo desenvolvimento de edema intersticial conservando a integridade dos produtos celulares, tais como ilhotas, que aumenta muito a quantidade e a qualidade dos produtos celulares que podem ser recuperados em comparação com os métodos convencionais aplicados a tecidos doadores não perfundidos (isto é, tecidos doadores frescos ou armazenados a frio estático).

[0015] Em modalidades, um produto celular pode ser isolado por métodos compreendendo o edema que se desenvolve durante a per- fusão do tecido doador. Em tais modalidades, o desenvolvimento de edema durante a perfusão do tecido doador pode ocorrer aumentando uma primeira velocidade de fluxo da solução de perfusão através do tecido para alcançar uma segunda velocidade de fluxo, aumentando uma primeira pressão de perfusão aplicada pelo aparelho de perfusão ao tecido para alcançar uma segunda pressão de perfusão e/ou seleção de uma composição da solução de perfusão que causa o edema do tecido.

[0016] Em modalidades, um produto celular, tal como ilhotas, he- patócitos ou cardiomiócitos, pode ser isolado por métodos compreendendo: fornecimento de um tecido doador, desenvolvimento de edema durante a perfusão do tecido doador para formar um tecido inchado, e separação das células desejadas do material celular indesejado para obter um produto celular.

[0017] Em modalidades, o desenvolvimento do edema pode ocor rer aumentando uma primeira velocidade de fluxo da solução de perfu- são através do tecido para alcançar uma segunda velocidade de fluxo, aumentando uma primeira pressão de perfusão aplicada pelo aparelho de perfusão ao tecido para alcançar uma segunda pressão de perfu- são, e/ou seleção de uma composição da solução de perfusão que cause o edema do tecido doador, onde a extensão do edema pode ser avaliada monitorando a flutuabilidade do tecido doador, monitorando a área superficial do tecido doador, monitorando uma circunferência do tecido doador, monitorando peso e/ou massa do tecido doador, e ou monitorando o volume do tecido doador.

[0018] Em modalidades, um produto celular pode ser isolado por métodos compreendendo fornecimento de um tecido tendo as células desejadas que são menos propensas ao congelamento destrutivo e células indesejadas que são mais propensas ao congelamento destrutivo, congelamento do tecido, rompimento do tecido, aquecimento do tecido e separação das células desejadas do material celular indeseja- do para se obter o produto celular.

[0019] Em modalidades, o produto celular pode ser isolado por métodos compreendendo o pré-tratamento de um tecido tal que as células desejadas sejam menos propensas ao congelamento destrutivo e as células indesejadas sejam mais propensas ao congelamento destrutivo, congelamento do tecido, rompimento do tecido, aquecimento do tecido, e separação das células desejadas do material celular inde- sejado para se obter o produto celular.

[0020] Em modalidades, o produto celular que conserva integrida de funcional suficiente para ser útil como um recurso de transplante pode ser isolado por métodos compreendendo preparação cirúrgica de um tecido ex vivo para canulação vascular e dutal, resfriamento do tecido, equilíbrio do tecido com um agente crioprotetor, opcionalmente congelamento do tecido a uma temperatura de aproximadamente - 10°C a aproximadamente -200°C, opcionalmente rompimento mecânico do tecido mantendo o tecido congelado, opcionalmente descongelamento do tecido, filtragem do tecido, lavagem do tecido, purificação do produto celular, tal como por purificação por gradiente, e/ou opcionalmente cultura do produto celular.

[0021] Em modalidades, o tecido pode ser o tecido pancreático e o produto celular compreende as ilhotas pancreáticas. Em modalidades, as ilhotas de um pâncreas podem ser isoladas por métodos compreendendo infusão de tecido da ilhota com uma solução crioprotetora compreendendo um agente crioprotetor (CPA) através de um sistema vascular, infundindo o tecido acinar com uma solução aquosa através de um sistema ductal, congelando o pâncreas, rompendo o pâncreas, aquecendo o pâncreas e separando as ilhotas. Em modalidades, o tecido da ilhota pancreática conserva a integridade funcional suficiente para ser útil como um recurso de transplante.

[0022] Em modalidades, o tecido doador pode ser do fígado e o produto celular compreende hepatócitos. Em modalidades, o tecido doador pode ser do coração e o produto celular compreende cardio- miócitos.

[0023] Em modalidades, o desenvolvimento do edema durante a perfusão do tecido doador compreende: aumento de uma primeira velocidade de fluxo da solução de perfusão através do tecido para alcançar uma segunda velocidade de fluxo, aumento de uma primeira pressão de perfusão aplicada pelo aparelho de perfusão ao tecido para alcançar uma segunda pressão de perfusão, e ou seleção de uma composição da solução de perfusão que causa o edema do tecido. Em modalidades, os métodos da presente revelação compreendem: monitoramento da flutuabilidade do tecido doador para avaliar a extensão do edema, monitoramento da área superficial do tecido doador para avaliar a extensão do edema, monitoramento da circunferência do tecido doador para avaliar a extensão do edema, monitoramento da massa do tecido doador para avaliar a extensão do edema e/ou monitoramento do volume do tecido doador para avaliar a extensão do edema.

[0024] Os atributos e as vantagens adicionais da presente inven ção são descritos, e serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada das modalidades.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] A Figura 1 é uma ilustração de um diagrama mostrando o pâncreas extirpado com um segmento da aorta descendente para ca- nulação do tronco celíaco (CT) e artéria mesentérica superior (SMA);

[0026] as Figuras 2A-D são fotografias representando a canulação de um pâncreas de porco extirpado, (A) pâncreas de porco extirpado com a seção duodenal ligada para conservar as artérias pancreático- duodenais superiores e inferiores, (B) diminuição do vaso arterial (CT) ilustrando os primeiros ramos laterais que podem ser fechados quando canulados diretamente; (C) ilustra as aberturas de CT e SMA em um patch aórtico fixado dentro do anel de vedação da cânula, (D) um pâncreas de porco imerso na solução de perfusão em um cassete de órgão e perfundido através de uma do anel de vedação da cânula instalada na máquina de perfusão LifePort®, a barra de escala em cada painel é 2 cm;

[0027] as Figuras 3A e B são representações gráficas de campos de ilhota expressos tanto como equivalentes de ilhota (IEQ) por grama de pâncreas (A) como IEQ total (B) onde os dados de cada grupo são expressos como a média (±SEM);

[0028] as Figuras 4A-F representam micrografias óticas (amplia ção 100x) mostrando a pureza relativa das respectivas preparações de ilhota no fim da fase de digestão (A, C, E) e após purificação por gradiente de densidade (B, D, F), todos os painéis são mostrados na mesma ampliação e representados pela barra de escala de 100 μm mostrada no canto esquerdo superior;

[0029] as Figuras 5A-F ilustram a histologia de biópsias pancreáti- cas escolhidas para cada um dos grupos de tratamento: (A) Pâncreas fresco controle; (B) armazenamento a frio 24 h em UW-Viaspan; (C) HMP 24 h perfundido com KPS1 (WIT = 0); (D) HMP 24 h perfundido com Unisol-UHK (WIT = 0); (E) 24 h perfundidos com KPS1 (WIT = 30 min); (F) HMP 24 h perfundido com KPS1 (WIT = 30 min). Barras de escala: 10 μm;

[0030] a Figura 6 são fotografias ilustrando a conservação por per- fusão hipotérmica de um pâncreas porcino em uma máquina LifePort®; o painel inferior mostra os atributos principais da LifePort®; o painel do meio mostra os detalhes de um pâncreas de porco instalado no cassete de perfusão e ligado à linha de entrada de perfusão através de uma do anel de vedação da cânula; esta cânula proprietária permite a perfusão simultânea do tronco celíaco (CT) e artéria mesentérica su perior (SMA) por meio de um patch aórtico fixado no anel de vedação da cânula (ver a inserção circular); a foto da inserção mostra a abertura de CT e SMA no patch aórtico (AP) que foi exposto para exame pela abertura do anel de vedação da cânula;

[0031] as Figuras 7A-F são micrografias óticas que ilustram o efei to de HMP sobre o isolamento de ilhota subsequente em várias ampliações, como indicado, mostrando a presença de ilhotas isoladas em estágios diferentes no processamento tanto do pâncreas fresco (painéis A-C) como HMP (painéis D-F); as ilhotas são identificadas pela marcação com ditizona e parecem púrpuras em contraste com o tecido exócrino puro que parece cinza acastanhado; a digestão pancreática marcada durante o processamento enzimático mostra uma digestão tipicamente mais uniforme e ilhotas clivadas isoladas no pâncreas perfundido (D) comparadas com a digestão mais não homogênea observada usando pâncreas recentemente isolado (A); a digestão mais homogênea tipicamente derivada usando pâncreas perfundido muitas vezes resultava em uma separação mais limpa de ilhotas isoladas no gradiente de densidade que produz uma preparação mais altamente purificada de ilhotas (E) comparada com pâncreas fresco (B) ou armazenado estaticamente a frio (não mostrado); esta separação diferencial durante a purificação de gradiente também se manifestou no exame do gradiente residual, caso em que o pâncreas fresco muitas vezes incluía muitas ilhotas capturadas ou introduzidas (C) comparado com pâncreas perfundidos que mostraram uma fração residual "limpa" com muito poucas ilhotas identificáveis (F); este efeito diferencial evidente sobre separação de ilhota e purificação foi também manifesto no rendimento de ilhotas obtidas como um produto final (ver dados na Tabela 5, abaixo);

[0032] a Figura 8 é uma representação gráfica dos parâmetros de perfusão de pâncreas exemplares monitorados continuamente durante a perfusão;

[0033] as Figuras 9A-D são fotografias que representam variações no método da canulação da perfusão pancreática no LifePort® Transporter; A. O método exemplar de canulação do pâncreas de porco jovem usando o anel de vedação da cânula proprietária (LifeLine Scientific), que evita a necessidade de inserir cânulas nas artérias individuais permitindo perfusão através das aberturas de CT e SMA em um patch aórtico fixado dentro do anel de vedação da cânula (ver também a Figura 6); B. Cânulas duais do anel de vedação cada uma suportando as aberturas de SMA e CT em patches aórticos individuais e ligadas através de um acoplador, Este arranjo é útil e necessário quando as aberturas destas duas artérias principais são espaçadas demasiado longe para serem acomodadas em uma cânula única do anel de vedação; C. A canulação direta de um grande pâncreas de porco, ou lobo pancreá- tico usando cânulas de inserção acopladas em conjunto através de um conector "T" para ligação com a porta de infusão; D. Uma combinação de uma do anel de vedação da cânula em uma artéria ligada a uma cânula de inserção direta em outra artéria, esta configuração pode ser usada como a variante do arranjo em B de maiores pâncreas de porco ou aqueles nos quais as aberturas estão anatomicamente demasiado longe para uma do anel de vedação da cânula única a ser usada;

[0034] a Figura 10 é uma fotografia representando a perfusão hi- potérmica do pâncreas humano no transportador LifePort®; e

[0035] a Figura 11 é uma fotografia representando uma diminuição vascular para ilustrar variantes anatômicas com os primeiros ramos laterais divergentes; a perfusão bem sucedida do pâncreas, especialmente de porcos jovens, através de SMA e tronco celíaco requer cuidado extremo para evitar a oclusão dos primeiros ramos laterais por cânulas inseridas, tais como os ilustrados aqui. Estas restrições anatômicas são prevalentes em pâncreas de porcos jovens como ilustrado pela diminuição de vaso mostrada aqui. O risco da oclusão indesejável destes ramos laterais é evitado pelo uso de uma do anel de vedação da cânula como descrita no texto e ilustrada na Figura 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

[0036] Em modalidades, os métodos são descritos para isolamen to de produtos celulares pela aplicação da perfusão mecânica hipo- térmica (HMP) e o desenvolvimento de edema intersticial conservando a integridade dos produtos celulares, tais como ilhotas, que aumenta muito a quantidade e a qualidade dos produtos celulares que podem ser recuperados em comparação com métodos convencionais aplicados a tecidos doadores não perfundidos (isto é, tecidos doadores frescos ou armazenados estáticos a frio).

[0037] "Edema" é usado neste pedido para referir-se a um acúmu lo de uma quantidade excessiva de fluido aquoso em células, tecidos ou cavidades serosas.

[0038] "Tecido ou órgão" são usados neste pedido para referir-se a qualquer tecido biológico ou órgão natural ou engendrado, incluindo, mas não limitados a tecido cardiovascular, tecido neuronal, tecido periodontal, tecido glandular, ilhotas de Langerhans, hepatócitos, cardi- omiócitos, tecido de órgão, e órgãos, tais como pâncreas, bexiga, rim, mama, fígado, intestino, coração e seções ou partes dos mesmos. Tal tecido pode ser obtido de qualquer organismo, tal como um mamífero, por exemplo, seres humanos ou de outra maneira, incluindo doadores com movimentos cardíacos, ou doadores sem movimentos cardíacos. Os tecidos podem ser usados inteiros ou em parte, tais como tecidos que foram cortados ou fatiados.

[0039] Como usado neste pedido, o termo "perfusão" significa o curso de um fluido pelo tecido. Técnicas para perfundir órgãos e tecidos são discutidas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.723.282 para Fahy et al., que é incorporada neste pedido em sua totalidade.

[0040] A excisão de um tecido para transplante significa que a is- quemia é total e inevitável embora o período possa ser breve. Uma consequência imediata da cessação do suprimento de sangue a um órgão é a privação do suprimento de oxigênio aos tecidos, mas a anó- xia (total) ou hipóxia (parcial) é somente uma de muitas consequências de uma falta de suprimento de sangue. Uma cascata multifatorial de eventos segue após iniciação da isquemia. O evento fundamental é a depleção de ATP, que ocorre dentro dos primeiros minutos da privação de oxigênio. Este primeiro evento conduz imediatamente a um deslocamento de metabolismo aeróbico para o anaeróbico, que muito rapidamente se torna autolimitante com a produção de lactato e prótons. A depolarização celular também ocorre muito precocemente na cascata que leva a um esgotamento da homeostase iônica, e uma concatenação de outros eventos intracelulares e associados à membrana que consequentemente culminam na morte celular por apoptose ou por necrose.

[0041] O princípio básico da conservação celular para aplicação clínica é minimizar os efeitos deletérios da isquemia e anóxia durante o intervalo de conservação. Isto pode ser alcançado farmacologica- mente usando uma larga variedade de fármacos citoprotetores, e/ou reduzindo a temperatura. De maneira interessante, a sabedoria convencional nos ensina que não há nenhum fármaco único, ou coquetel de fármacos, que possam suprimir tão seguramente e efetivamente o metabolismo e fornecer a proteção isquêmica de múltiplos tecidos e órgãos como a aplicação da hipotermia pode. Consequentemente, o foco se modifica para controlar o ambiente das células para otimizar a conservação hipotérmica.

[0042] Em modalidades, os métodos descritos neste pedido im plementam uma nova abordagem que utiliza avanços na tecnologia de perfusão e opcionalmente combinam aqueles avanços com soluções hipotérmicas de substitutos de sangue para melhorar a entrega de O2 por meio do aumento de PFC. Esta abordagem contorna várias faltas reconhecidas nos presentes modos de armazenamento clínico de órgãos, a mais notável das quais é a baixa penetração demonstrada de PFC e oxigênio usando o método convencional de duas camadas (TLM).

[0043] No caso específico de conservação do pâncreas antes do isolamento de ilhota, um efeito salutar de HMP no rendimento de ilhota em um modelo porcino jovem emergiu. Entretanto, considerando a vulnerabilidade de ilhotas a períodos até curtos (<10 h) de isquemia a frio, novas abordagens descritas neste pedido estendem a tolerância à isquemia contornando as restrições reconhecidas em técnicas convencionais de conservação de pâncreas. A inovação gira em volta da aplicação de um ou mais de três componentes individualmente importantes de conservação de órgãos, ou seja, perfusão mecânica para induzir o desenvolvimento do edema; substituição hipotérmica do sangue, e entrega de oxigênio melhorada por aumento de PFC.

[0044] Perfusão Mecânica Hipotérmica (HMP): métodos convenci onais para conservação de órgãos para transplante dependem principalmente do armazenamento estático a frio em gelo, uma técnica relativamente simples e econômica que foi usada durante várias décadas. Entretanto, demandas modernas para aumentar as quantidades de órgãos disponíveis para o transplante levaram a um ressurgimento de interesse na conservação de perfusão hipotérmica (HPP) de órgãos porque as técnicas de perfusão fornecem vantagens significantes em relação ao armazenamento estático a frio. Neste contexto, HPP é baseada na premissa fundamental que os dispositivos podem ser projetados para facilitar a substituição do sangue na circulação de um órgão ex vivo com fluidos especialmente projetados para maximizar os efeitos protetores da hipotermia no tecido isquêmico. Esta abordagem tem potencial, e já foi mostrada em muitas aplicações, de contornar algumas faltas reconhecidas do armazenamento a frio convencional. Entretanto, no campo da conservação do pâncreas, particularmente como se aplica a órgãos fonte para isolamento de ilhota, o armazenamento estático a frio impõe restrições severas no rendimento e qualidade das ilhotas obtidas de um pâncreas de doador único. Por exemplo, introduzir uma camada perfluoroquímicos para aumentar pretensamente o suprimento de oxigênio ao órgão isquêmico tem falhado em métodos de armazenamento estático a frio para fornecer a proteção adicionada.

[0045] Em modalidades, os métodos descritos neste pedido utili zam uma combinação de tecnologias em HMP e HBS junto com os méritos de oxigenação de PFC para gerar uma nova técnica híbrida que resolve os problemas dos métodos de armazenamento estático a frio tendo uma camada de perfluoroquímicos. A seleção do meio de referência ou perfusado em que para entregar PFC como uma emulsão também exige consideração do que será ótimo para a respectiva conservação das células (por exemplo, células pancreáticas, células cardíacas, etc.) sob condições hipotérmicas. Para este fim, esta revelação inclui a preparação de soluções de conservação projetadas como substitutos hipotérmicos do sangue.

[0046] Substitutos hipotérmicos do sangue como meios de conser vação: Tradicionalmente, uma variedade de soluções de conservação de órgão foi desenvolvida.

[0047] Patentes U.S. Nos. 5.643.712, 5.699.793, 5.843.024 para Brasile e Nos. 5.599.659, 5.702.881 para Brasile et al., as revelações de cada uma das quais são incorporadas neste pedido por referência em suas totalidades, descrevem soluções separadas de ressuscitação e conservação de tecidos e órgãos. As patentes de Brasile descrevem composições que podem ser usadas nos métodos desta revelação.

[0048] Taylor formulou e avaliou duas soluções designadas HypothermosolTM-purge (HTS-P) e HypothermosolTM-maintanance (HTS-m). Alguns aspectos destas soluções são descritos nas patentes U.S. Nos. 5.405.742 e 5.514.536 para Taylor, revelações de ambas as quais são incorporadas neste pedido por referência em suas totalidades. As patentes de Taylor descrevem composições que podem ser usadas nos métodos desta revelação.

[0049] As propriedades protetoras de soluções, tal como a família de soluções Unisol® (como descrita nas patentes U.S. Nos. 6.492.103 e 6.994.954, intituladas "System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution" para Taylor, as revelações das quais são por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades) podem ser usadas nos métodos desta revelação. Em modalidades, Unisol pode ser utilizado como a solução veículo para emulsionar PFCs para aumentar significativamente sua capacidade de entrega de oxigênio, além de aditivos citoprotetores.

[0050] Em modalidades, a solução principal pode ser uma solução hipercalêmica, "tipo intracelular" projetada para "manter" a integridade celular durante a exposição hipotérmica na temperatura de nadir (<10°C).

[0051] Aumento de entrega de oxigênio aos tecidos durante o ar mazenamento hipotérmico e o papel de PFCs: A solução "de manutenção" Unisol® foi desenvolvida e testada em temperaturas na faixa de 7 a 10°C, que se ajusta à faixa de temperatura na qual as reservas de ATP podem ser restabelecidas se um suprimento adequado de O2 for mantido por perfusão contínua. Por exemplo, numerosas investigações sugeriram que o suprimento de oxigênio seja essencial durante a conservação hipotérmica de fígados.

[0052] A rápida depleção de nucleotídeos adenina durante o ar mazenamento a frio de órgãos de 0 a 2°C (por exemplo, armazenamento convencional estático a frio em gelo) pode ser sugestiva que a função mitocondrial é severamente prejudicada pela hipotermia. Estes níveis de O2 podem precisar ser sustentados durante a perfusão para assegurar a mais alta quantidade e qualidade de produtos celulares, tais como ilhotas, e o uso de PFCs permite que isto ser realizado.

[0053] PFCs são hidrocarbonetos nos quais todos ou a maioria dos átomos de hidrogênio são substituídos por flúor (por exemplo, per- fluorocarbonos). Têm duas vezes a densidade da água e uma alta capacidade de dissolver gases respiratórios. A solubilidade de oxigênio dissolvido em PFC é aproximadamente 25 vezes maior do que em sangue ou água. A capacidade de PFCs de liberar oxigênio conforme a Lei de Henry não está significativamente sob o efeito da temperatura, tornando-os ideais para entregar oxigênio durante a conservação hipotérmica do órgão. Isto também é suportado por manifestações recentes que as propriedades de dissolução do gás e descarga do gás perfluorocarbono foram necessárias em uma aplicação de perfusão peritoneal para oxigenação sistêmica uma vez que o mesmo efeito não foi obtido quando a solução salina sozinha foi empregada como perfu- sado. Entretanto, o uso de perfluorocarbono sob condições hipotérmi- cas foi limitado.

[0054] Em modalidades, os métodos da presente revelação com preendem a prevenção de glicólise anaeróbica no tecido doador. Em modalidades, prevenir a glicólise anaeróbica no tecido doador pode compreender a introdução de perfluoroquímicos na solução de perfu- são e/ou prevenção de privação/depleção de oxigênio no tecido doador. Por exemplo, prevenir privação/depleção de oxigênio no tecido doador pode compreender a introdução de perfluoroquímicos na solução de perfusão e oxigenação da solução de perfusão.

[0055] Em modalidades, os métodos da presente revelação com preendem a perfusão com uma solução de perfusão, onde os perfluo- roquímicos representam de aproximadamente 10% a aproximadamen- te 90% do peso total da solução de perfusão, os perfluoroquímicos re-presentam de aproximadamente 10% a aproximadamente 80% do peso total da solução de perfusão, os perfluoroquímicos representam de aproximadamente 20% a aproximadamente 70% do peso total da solução de perfusão ou os perfluoroquímicos representam de aproximadamente 30% a aproximadamente 60% do peso total da solução de perfusão.

[0056] Em modalidades, os métodos da presente revelação podem compreender satisfação da demanda de O2 de um tecido doador em todas as partes de um intervalo/processo de conservação que ocorre a partir do momento em que o aparelho de perfusão é conectado ao tecido doador até o momento em que o aparelho de perfusão é desco- nectado do tecido doador. Tais métodos podem compreender o reabastecimento do conteúdo de O2 na solução de perfusão durante a perfusão, aumento do conteúdo de O2 na solução de perfusão durante a perfusão, e/ou diminuir o conteúdo de CO2 na solução de perfusão durante a perfusão. Os níveis de O2 e CO2 no tecido e/ou solução de perfusão podem ser monitorados por qualquer método conhecido.

[0057] Em modalidades, os métodos da presente revelação com preendendo monitoramento do espaço extracelular no tecido doador por microdiálise. Por exemplo, monitoramento do espaço extracelular no tecido doador por microdiálise pode compreender a implantação de uma sonda de diálise no tecido doador e avaliação da concentração de componentes do fluido intersticial. Tal sonda de diálise pode compreender uma membrana biocompatível semipermeável como a parte ativa. Em modalidades, nos métodos da presente revelação, a concentração de componentes do fluido intersticial é avaliada periodicamente. Componentes do fluido intersticial exemplares incluem qualquer analito contido na solução de perfusão ou tecido, incluindo um ou mais selecionados a partir do grupo consistindo de glicose, lactato, piruvato, glice- rol, ATP, O2 e CO2. Em modalidades, os métodos da presente revelação incluem a avaliação da taxa de consumo de oxigênio do tecido doador antes que o aparelho de perfusão seja conectado ao tecido doador, avaliando a taxa de consumo de oxigênio do tecido doador após o aparelho de perfusão ser conectado ao tecido doador, e/ou monitoramento da taxa de consumo de oxigênio do tecido doador após o aparelho de perfusão ser conectado ao tecido doador.

[0058] Como discutido abaixo, a aplicação de uma ou mais destas três estratégias de conservação de órgão delineadas acima minimiza o dano e a morte celular no tecido ou órgão doador, tal como o pâncreas, que pode promover um aumento o rendimento de ilhota total. Esta estratégia tem potencial de benefícios significantes para outros órgãos transplantáveis todos os quais sofrem injúria isquêmica durante o armazenamento a frio.

[0059] Como discutido acima, a aquisição e a conservação de pâncreas são importantes para o isolamento de ilhota como um prelúdio para o transplante de ilhota como uma opção do tratamento de diabetes mellitus Tipo I. A perfusão de pâncreas pode ser ainda aplicada para a conservação de órgãos expostos à isquemia a quente antes do isolamento de ilhota e otimizar a solução de conservação de pâncreas para um melhor rendimento e qualidade de ilhota. A conservação de órgão supracitada antes do isolamento de ilhotas pode dar mais tempo para a compatibilização doador-recipiente apropriada e o controle de qualidade de células isoladas, e oferece a possibilidade de células em bancos para disponibilidade aumentada a clínicos. A perfusão mecânica hipotérmica fornece uma resposta à falta de pâncreas para transplante melhorando o fluxo e reduzindo a resistência vascular e permitindo avaliação da qualidade do pâncreas antes do transplante.

[0060] Fisiologicamente, o pâncreas é um órgão de baixo fluxo. Em modalidades, os métodos desta revelação podem compreender a perfusão do pâncreas, que pode ser baseada em um fluxo direcionado de baixa pressão constante (aproximadamente 10 mmHg ou menos, tal como de aproximadamente 1 mmHg a aproximadamente 10 mmHg). O presente projeto do LifePort® pode não acomodar pressões de infusão menores que 10 mmHg. Dessa forma, valores de pressão mais baixos podem ser instalados a fim de alcançar as pressões de infusão desejadas menores que 10 mmHg para os métodos descritos neste pedido para conservação de pâncreas para transplante sem induzir irreversivelmente altos níveis de edema que podem ser prejudiciais para o órgão e/ou recipiente. O desenvolvimento controlado de edema e melhor resultado de perfusão tanto de isolamento de ilhotas como transplante de pâncreas inteiro pode ser melhor alcançado empregando um regime de fluxo constante ao contrário da pressão constante. Em modalidades, os valores de velocidade de fluxo direcionado podem ser selecionados conforme características e qualidade do órgão (tais como exposição de isquemia a quente, tamanho, espécies, etc.).

[0061] Em modalidades alternativas, os métodos da perfusão po dem ser baseados em um fluxo direcionado de alta pressão constante (aproximadamente 10 mmHg ou mais, tal como de aproximadamente 10 mmHg a aproximadamente 60 mmHg).

[0062] Em modalidades, os métodos descritos neste pedido em pregam um aparelho para perfundir um ou mais órgãos ou tecidos (a seguir geralmente referidos como tecidos doadores). Um aparelho exemplar é descrito no Pedido de Patente U.S. No. 12/379.239, que é uma divisão do Pedido de Patente U.S. No. 11/075.690, depositado em 10 de março de 2005 (emitido como Patente U.S. No. 7.504.201 em 17 de março de 2009) as revelações inteiras do qual são por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades. Em modalidades, os métodos descritos neste pedido empregam o transportador de plataforma LifePort® ou um transportador de plataforma modificado LifePort ® a fim de realizar perfusão com a máquina hipotérmica (HMP) de um tecido doador (tal como o pâncreas).

[0063] Em modalidades, HMP pode resultar no acúmulo de fluido uniforme dentro do tecido doador que por sua vez pode prover um espaço extracelular rompido com efeitos benéficos para o isolamento de ilhota sem comprometer a viabilidade e a função da ilhota. Os métodos desta revelação, descrita neste pedido com respeito a pâncreas porcinos jovens, podem ser facilmente aplicados aos pâncreas doadores de porcos adultos e seres humanos, o último sendo considerado como a fonte de escolha para transplante de ilhota xenogeneica, e/ou outros vários tecidos doadores de interesse, tais como coração e/ou fígado. Os métodos bem sucedidos descritos neste pedido dependem fortemente dos detalhes da aquisição cirúrgica, canulação e perfusão do pâncreas no LifePort®. Baseado nestes métodos, otimização de perfu- são hipotérmica do pâncreas pode ser alcançada para o desenvolvimento de métodos da avaliação de órgão e controle de qualidade durante a perfusão a fim de selecionar confiavelmente pâncreas de alta qualidade para transplante clínico.

[0064] Uma questão tecnológica principal a ser abordada na apli cação da técnica de perfusão renal "LifePort" estabelecida ao pâncreas são os parâmetros de perfusão diferentes necessários pelo pâncreas uma vez que este é um órgão de baixo fluxo, de baixa pressão comparado com o rim. Tipicamente, os parâmetros ótimos de perfusão de um rim em uma máquina LifePort®, que pelo projeto é um dispositivo controlado por pressão, são uma pressão de perfusão de conjunto de 25 a 40 mmHg (tipicamente produz uma velocidade de fluxo de 100-150 ml/min). Estes parâmetros de perfusão podem impactar a troca de fluidos entre os compartimentos vasculares e intersticiais do órgão e por isso o grau do edema sustentado durante o intervalo de per- fusão. O método descrito neste pedido demonstra a adaptação da máquina de perfusão LifePort® para o pâncreas com uma ênfase no desenvolvimento de uma quantidade específica de Edema. Em modalidades, a máquina de perfusão LifePort® para o pâncreas pode ser adaptada para operar em uma perfusão controlada por configuração de baixa pressão (aproximadamente 10 mmHg ou menos, tal como na faixa de aproximadamente 10 mmHg a aproximadamente 2 mmHg, ou na faixa de aproximadamente 8 mmHg a aproximadamente 4 mmHg) do pâncreas porcino como um prelúdio para o processamento de pâncreas para isolamento de ilhota.

[0065] Em modalidades, a máquina de perfusão LifePort® para o pâncreas pode ser adaptada para operar uma velocidade de fluxo de menos de 150 ml/min, tal como menos de 100 ml/min, ou de aproximadamente 10 ml/min a aproximadamente 100 ml/min, tal como de aproximadamente 15 ml/min a aproximadamente 50 ml/min, ou de aproximadamente 20 ml/min a aproximadamente 30 ml/min.

[0066] Em modalidades, a máquina de perfusão LifePort® para o pâncreas pode ser adaptada para operar em uma perfusão controlada por configuração de alta pressão (aproximadamente 10 mmHg ou mais, tal como na faixa de aproximadamente 10 mmHg a aproximadamente 60mmHg, ou na faixa de aproximadamente 20 mmHg a aproximadamente 50 mmHg) do pâncreas porcino como um prelúdio para o processamento de pâncreas para isolamento de ilhota. Em modalidades, a máquina de perfusão LifePort® para o pâncreas pode ser adaptada para operar uma velocidade de fluxo de menos de 200 ml/min, tais como menos de 150 ml/min, ou de aproximadamente 10 ml/min a aproximadamente 150 ml/min, tal como de aproximadamente 50 ml/min a aproximadamente 120 ml/min, ou de aproximadamente 60 ml/min a aproximadamente 110 ml/min.

[0067] Em modalidades, a máquina LifePort® pode assegurar o armazenamento estático a frio apropriado do tecido ou órgão doador se a bomba falhar e o transporte de fluido através do órgão parar. Por exemplo, dentro do transportador fechado, um recipiente de gelo apropriadamente enchido pode ser mantido em uma temperatura abaixo de aproximadamente 6°C por mais de 24 h, sem reabastecimento de gelo. O transportador LifePort® pode ser programado para permitir recir- culação de um perfusado desejado sob condições predeterminadas, por exemplo, o transportador pode ser programado para permitir um litro de recirculação de perfusado a 5 a 7°C por um fluxo constante de baixa pressão (aproximadamente 10mmHg) pulsátil (30 pulsos/min).

[0068] O sistema de perfusão pulsátil LifePort® foi empregado com sucesso para perfusão ex-vivo hipotérmica de pâncreas de porcos pequenos. O sistema é projetado e aprovado pelo FDA para per- fusão/conservação hipotérmica de rim para transplante clínico. Usando o sistema renal, o pâncreas inteiro de doadores porcinos jovens (25 a 32kg, 2 meses) pode ser continuamente perfundido em um circuito fechado ao ser completamente imerso na solução de perfusão dentro do banho do órgão. O último também serve de um reservatório de solução, o perfusado sendo retirado pela bomba, forçado a atravessar o filtro, captura de bolhas e a porta de infusão antes de retornar ao cassete de órgão e o pâncreas. A submersão de pâncreas no perfusado com temperatura controlada ajuda a eliminar gradientes de temperatura através da superfície do órgão e assegura conservação hipotérmica de alta qualidade.

[0069] As modalidades da invenção podem fornecer um método melhorado de isolamento de produtos celulares, que podem ser mais consistentes e confiáveis do que métodos convencionais que dependem da digestão enzimática. As modalidades também podem fornecer métodos que produzem uma quantidade ótima de células desejadas que conservam integridade funcional suficiente para serem úteis como um recurso de transplante.

[0070] Em modalidades, os métodos descritos neste pedido po dem ser usados para isolar qualquer produto celular para uso terapêutico e pesquisa, enquanto as células desejáveis e indesejáveis tiverem, ou puderem ser tratadas para promover, o desenvolvimento do edema. Tais métodos podem permitir a conservação da integridade das ilhotas além de facilitar muito isolamento de ilhota até o ponto em que o rendimento do produto celular pode aumentar significativamente (em algumas situações pelo menos aproximadamente duplicar o rendimento ou até triplicar o rendimento) comparado com o rendimento do produto celular obtido de tecidos não perfundidos e até tecidos frescos.

[0071] Em modalidades, um produto celular pode ser isolado por métodos compreendendo edema que se desenvolve durante a perfu- são do tecido doador aumentando uma primeira velocidade de fluxo da solução de perfusão pelo tecido para alcançar uma segunda velocidade de fluxo, aumentando uma primeira pressão de perfusão aplicada pelo aparelho de perfusão ao tecido para alcançar uma segunda pressão de perfusão e/ou selecionando uma composição da solução de perfusão que causa o edema do tecido.

[0072] Em modalidades, o desenvolvimento do edema em tecidos doadores para formar um tecido inchado pode ocorrer pela aplicação da perfusão mecânica hipotérmica (HMP). A aplicação da HMP para o tecido doador, tal como HMP para o pâncreas, como um prelúdio para o isolamento de ilhota também capitaliza alguns benefícios de HMP demonstrados para outros vários órgãos (principalmente o rim) como um meio de melhor conservação durante períodos extensos de armazenamento, especialmente para órgãos subótimos. Além disso, um efeito salutar inesperado da perfusão mecânica aplicada à aplicação de coleta de produto celular, tal como ilhotas, emergiu.

[0073] O desenvolvimento progressivo do edema durante a perfu- são mecânica estendida de órgãos é um fenômeno que é geralmente considerado como indesejável. De fato, as medidas são normalmente tomadas para minimizar o problema ajustando os parâmetros mecânicos de perfusão, tais como fluxo e pressão, bem como composição do perfusado, para minimizar o desenvolvimento do edema intersticial. Na resolução de um problema técnico com respeito à canulação dos tecidos doadores (neste caso, o pâncreas) que afeta a eficiência da perfu- são, foi determinado que 24 h de HMP resultaram em edema moderado na glândula em comparação com os controles que foram simplesmente lavados e imersos na solução fria UW-Viaspan. Entretanto, ao contrário das expectativas, desenvolvimento de edema, tal como acima de aproximadamente 280% (isto é, um ganho de 180% no parâmetro particular que é monitorado para avaliar a extensão do edema, tal como, por exemplo, peso, massa, circunferência, flutuabilidade e/ou volume), ou até aproximadamente 250%, ou até 150% não provou ser deletério à coleta de produto celular, mas foi observado ser de benefício considerável estando em correlação com uma perturbação mais eficiente do pâncreas durante a digestão enzimática para produzir um número significativamente maior de ilhotas.

[0074] Em modalidades, desenvolver edema durante a perfusão do tecido doador para formar um tecido inchado pode resultar em um tecido inchado que exibe um peso, massa, circunferência, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume de aproximadamente 110% (isto é, ganho em peso, massa, circunferência, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume de aproximadamente 10%) daquele do tecido doador não perfundido inicial ou original, tal como de aproximadamente 120% a aproximadamente 280% (isto é, ganho em peso, massa, circunferência, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume de aproximadamente 20% a aproximadamente 180%), ou de aproximadamente 130% a aproximadamente 250% (isto é, ganho em peso, massa, circunferên- cia, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume de aproximadamente 30% a aproximadamente 150%). Em modalidades adicionais, o tecido inchado tem uma massa que é menos de 300% de uma massa não perfundida inicial do tecido doador, o tecido inchado tem um volume que é pelo menos 110% de um volume não perfundido inicial do tecido doador, o volume do tecido inchado é de aproximadamente 150% a aproximadamente 250% do volume do tecido doador, o volume do tecido inchado é de aproximadamente 120% a aproximadamente 280% do volume do tecido doador, em que o volume do tecido inchado é de aproximadamente 130% a aproximadamente 250% do volume do tecido doador, ou o tecido inchado tem um volume que é menos de 300% de um volume não perfundido inicial do tecido doador.

[0075] Acredita-se que a presença de uma quantidade predetermi nada do edema causa perturbação suficiente à matriz extracelular e à arquitetura da glândula pancreática que a distensão subsequente e digestão da glândula prosseguem mais efetivamente. Isto é evidenciado por tempos de digestão significativamente mais curtos (Tabela 3; abaixo), um produto de digestão mais homogêneo (Fig. 4), e melhor purificação de gradiente que resulta em rendimentos e pureza mais altos da preparação de ilhota final. A estrutura e a função das ilhotas por si não pareceram estar comprometidas pelo nível do edema de tecido encontrado nestes estudos. As preocupações que uma modificação na hidratação das ilhotas isoladas devido à HMP pudesse alterar a densidade de flutuação das ilhotas e por meio disso alterar sua capacidade de ser separada do tecido exócrino em um gradiente de densidade não pareceram ser um problema. Isto pode ser presumivelmente devido a que qualquer edema inerente nas ilhotas é neutralizado pela incubação do pré-gradiente na solução UW, que é um meio hipertônico que desidrataria as ilhotas durante a incubação a frio 30min antes da carga no gradiente de densidade da purificação, que é geralmente usado em protocolos de isolamento de ilhota (Lakey, J. R. T., Technical aspects of islet preparation and transplantation, Transpl. Int., 16:613-632, 2003; Lakey, J. R. T.; Current human islet isolation protocol, Chuo-ku, Osaka: Medical Review Co. Ltd., 2004; cujas descrições estão aqui incorporadas por referência em suas totalidades).

[0076] A integridade morfológica das ilhotas in situ nos pâncreas conservados pode ser avaliada tomando biópsias em cunha no fim de um intervalo de conservação. As modificações associadas com a is- quemia e o modo da conservação são ilustradas e discutidas com respeito à Figura 5. A marcação com ditizona tanto das amostras de digestão como das frações de purificação pode ser usada para avaliar a estrutura bruta, pureza e números de ilhotas nas respectivas amostras. A Figura 4F mostra a aparência típica das preparações de pureza mais alta obtidas dos pâncreas tratados com HMP. As ilhotas têm um formato de grupo irregular que foi descrita como "similar a cacho de uvas" (Rijkelijkhuizen, J. K., et al., Pretransplant culture selects for high- quality porcine islets, Pancreas 32:403-407, 2006) e esta aparência pode ser característica de ilhotas isoladas de porcos jovens, refletindo a forma irregular observada no pâncreas endógeno antes do isolamento (Bottino, R. et al., Isolation outcome and functional characteristics of young and adult pig pancreatic islets for transplantation studies, Xenotransplantation 14:74-82, 2007). Esta aparência irregular, fragmentada, característica de ilhotas de porcos jovens, contrasta acentuadamente com o formato arredondado regular mais normal das ilhotas de porcos adultos e pode não ser um reflexo do método de conservação. A Figura 4B mostra que ilhotas dos pâncreas controle frescos têm a mesma morfologia.

[0077] O benefício mecânico imprevisto de HMP descrito acima pode ser alcançado sem comprometer a qualidade das ilhotas coletadas. Os dados apresentados na seção de Exemplos demonstram que a capacidade funcional, em termos do seu índice secretório de insulina, das ilhotas isoladas dos pâncreas perfundidos nas quais uma quantidade moderada do edema foi desenvolvida é equivalente àquele dos controles incluindo o pâncreas fresco. Além disso, o conteúdo de insulina foi significativamente mais alto do que o grupo controle compreendendo pâncreas armazenados estaticamente na solução fria UW-Viaspan, que é atualmente o método padrão empregado clinicamente. Estes efeitos e os padrões da conservação podem ser alcançados usando qualquer uma das duas soluções proprietárias, KPS1 e Unisol-UHK.

[0078] Melhoras e benefícios adicionais a esta técnica podem ocorrer otimizando a composição destes perfusados de referência adicionando agentes citoprotetores projetados para minimizar a conservação e a injúria de reperfusão, e/ou PFCs. Por exemplo, aditivos cito- protetores podem ser aditivos que exibem eficácia durante conservação em baixa temperatura e por isso uma alta probabilidade de que terão um impacto positivo na qualidade de conservação do pâncreas durante a perfusão mecânica hipotérmica, tais como antioxidantes, agentes antiapoptóticos e fatores tróficos.

[0079] Em modalidades, os métodos da presente revelação com preendem a perfusão do órgão e/ou tecido com uma solução de perfu- são compreendendo aditivos citoprotetores, tais como um ou mais an- tioxidantes, agentes antiapoptóticos e fatores tróficos. Tal solução de perfusão pode ser qualquer solução de perfusão, tal como qualquer solução de perfusão descrita na presente revelação, incluindo substitutos hipotérmicos de sangue, incluindo aqueles compreendendo: um ou mais agentes citoprotetores e perfluoroquímicos.

[0080] Em modalidades, os métodos da presente revelação podem compreender uma etapa de aumento dos níveis de ATP nos tecidos doadores durante a perfusão e/ou uma etapa de introdução de agen- tes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para prevenir a morte celular induzida por frio do tecido doador. Em modalidades, os métodos da presente revelação podem compreender uma etapa de introdução de agentes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para impedir células de um tecido doador, tais como um pâncreas, de entrar em vias destrutivas. Por exemplo, os métodos podem compreender introdução de agentes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para inibir a disfunção mitocondrial em células de um pâncreas doador.

[0081] Antioxidantes: Radicais livres derivados de oxigênio (ODFR) foram o foco da atenção como mediadores das várias injúrias de tecido e particularmente injúria microvascular. É possível para a produção de radicais livres injuriosos ser aumentada durante o armazenamento a frio, é importante apreciar que o dano celular resultante pode não ocorrer inteiramente em baixa temperatura. Ao contrário, há um corpo crescente de evidência que reintrodução de oxigenação através de um suprimento de sangue regular no reaquecimento e re- perfusão fornece um potente ímpeto de estresse oxidativo adicional. Uma via principal é a estimulação enzimaticamente direcionada em reações de radicais, tais como o sistema xantina/xantina oxidase que envolve a interação de produtos catabólicos de ATP com oxigênio molecular. Acredita-se que células endoteliais vasculares sejam particularmente vulneráveis a este tipo da injúria mediada por geração de radical livre por este chamado mecanismo de "explosão respiratória". No entanto, as baixas concentrações de oxigênio molecular, tal como aquele dissolvido em soluções de conservação de órgão podem ser suficientes para suportar a geração de radicais livres durante armazenamento prolongado. Por isso, sem o balanço próprio de antioxidan- tes, a exposição ao frio pode preparar o terreno de um desenvolvimento progressivo da injúria de tecido em consequência de reações e pro- cessos que ocorrem durante a hipotermia.

[0082] Em modalidades, antioxidantes podem estar presentes em uma quantidade suficiente para eliminar substancialmente o dano celular e/ou estresse oxidativo.

[0083] Enquanto as células empregam diversos mecanismos de reparo para se recuperarem de injúrias que ocorrem em consequência da atividade de radical livre, a sobrevivência celular depende se as vias de recuperação estão sobrecarregadas ou se um ponto de dano irreversível é alcançado durante o processo do armazenamen- to/reativação tal que a morte celular torne-se inevitável. Consequentemente, em modalidades, antioxidantes, e quantidades dos mesmos, são selecionados para contornar o estresse oxidativo e injúria de re- perfusão tanto sob condições hipotérmicas como sob normotérmicas. Antioxidantes exemplares podem incluir dibutiril-cAMP (db-cAMP), α- tocoferol (Vitamina E), Trolox™, e hipotermosol mais EDTA como mais Vitamina E.

[0084] Agentes Antiapoptóticos: Embora muitos de diversos es tresses conhecidos por causar morte celular necrótica, também tenham sido relatados que induzem apoptose em uma variedade de células, o papel de baixas temperaturas como um estímulo possível da morte celular programada somente começou recentemente a emergir. É estabelecido agora que a apoptose desempenha um papel integrante na morte celular induzida pelos rigores tanto da hipotermia como da criopreservação. Mais especificamente, a apoptose foi identificada estar associada diretamente com morte celular de início retardado (DOCD). Isto é definido como morte associada com exposição ao frio que não é evidente imediatamente após o reaquecimento, mas aumenta durante o período de recuperação pós-exposição. Pesquisa recente nas vias apoptóticas e necróticas causadoras responsáveis pela DOCD induzida por baixa temperatura identificou a contribuição de múltiplas vias apoptóticas, incluindo apoptose induzida por receptor e por mitocôndria. Investigações nestas vias, sua progressão, e sua indução de estressores começaram a facilitar novos métodos para melhorar a eficácia de conservação pela modulação das respostas celulares e moleculares de uma célula sendo submetida à conservação (tanto hipotérmica como criopreservação).

[0085] Foi relatado agora que a incorporação de inibidores de pro tease apoptóticos específicos em meios de conservação melhora acentuadamente a sobrevivência de uma variedade de células e tecidos. Além disso, investigação na modificação do meio de veículo daquele de meios de culturas tipo extracelular padrão com ou sem crio- protetores, àquela de soluções de conservação tipo intracelular especificamente projetadas, tais como Unisol™, ou sua predecessora Hypothermosol, levou a estudos mostrando melhora significante na eficácia de conservação.

[0086] Agentes antiapoptóticos podem ser selecionados a partir daqueles que possuem atividades antioxidantes reconhecidas e por isso continham atividade antiapoptótica. Por exemplo, glutationa reduzida é um componente de ambas as formulações como uma molécula multifacetada que também é conhecida por cumprir um papel natural na regulação da apoptose, ácido bongkrékico (BA) foi mostrado ser um potente inibidor da transição dos poros de permeabilidade mitocondrial (PT) que se formam durante a apoptose. Além disso, BA pode inibir a liberação de citocromo c que está sob o efeito de Bax, uma proteína 85 pró-apoptótica. Foi mostrado que BA, inibidor estável de PT, aumenta a viabilidade celular e níveis de produção proteica após infecção por vírus. Com respeito à inibição das caspases, foi mostrado que uma variedade de compostos é eficaz para células mamíferas na cultura. Outros compostos exemplares incluem, P35, que confere inibição irreversível a um grande número de caspases, e Z-VAD.fmk (ou sua última contraparte de largo espectro, Q-VD-OPH), que tem a capacidade de inibir tanto as vias intrínsecas como extrínsecas.

[0087] Fatores Tróficos: Muitas vias de sinalização celular conser vam a atividade em temperaturas muito baixas e podem ser afetadas pela administração de fator trófico. A privação de fator trófico interrompe muitos aspectos da função celular e é bem conhecida por induzir apoptose e morte celular em uma ampla variedade de células cultivadas. O suplemento de fator trófico (TFS) leva a um resultado acentua- damente melhorado no armazenamento de rim e influencia injúria is- quêmica a frio por interação com o tecido durante o armazenamento a frio e não simplesmente estando presente durante o reaquecimento e reperfusão. Fatores de trópico exemplares, que podem ser empregados incluem, por exemplo, Fator de crescimento similar à insulina 1 (IGF-1) Fator de crescimento epidérmico (EGF), Peptídeo de neutrófilo bovino 1 (BNP-1), também referido como bactenecina 98, Substância P (SP), que tem efeitos mitogênicos para uma variedade de tipos celulares e estimula a síntese de DNA em linhagens celulares oculares, EGF, um fator de crescimento de polipeptídeo (seus efeitos podem ser aditivos ou sinérgicos com outros fatores de crescimento e citocinas), e fatores de crescimento de polipeptídeo similares à insulina (IGFs), tal como IGF-1.

[0088] Em modalidades, os PFCs podem possuir uma ou mais das seguintes qualidades: (1) a capacidade de dissolver grandes quantidades de muitos gases, (2) podem transportar estes gases para se difundirem através de distâncias, (3) são não tóxicos, (4) biologicamente inertes, (5) líquidos biostáticos à temperatura ambiente. Em modalidades, PFCs com densidades de aproximadamente 1,5 a 2,0 g/mL e alta solubilidade de oxigênio e dióxido de carbono podem ser selecionados.

[0089] Em modalidades, o produto celular pode ser isolado por pré-tratamento de um tecido tal que as células desejadas sejam menos propensas ao congelamento destrutivo e as células indesejadas sejam mais propensas ao congelamento destrutivo como descrito no Pedido de Patente U.S. No. Serial 12/654.147, intitulado "Method for Isolating Cellular Products by Cryopreservation" para Michael J. Taylor et al., que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.

[0090] Em modalidades, a criopreservação pode ser aplicada para conservar seletivamente as células desejadas e/ou destruir as células indesejadas. A criopreservação é um processo complexo de transferência acoplada de calor e de massa, geralmente realizada sob condições de não equilíbrio. Simplesmente congelar células ou tecidos geralmente resulta em materiais mortos, não funcionais.

[0091] Em modalidades, o método compreende pré-tratamento de tecidos doadores tal que (1) o produto celular desejado seja menos suscetível a eventos que resultem em destruição celular, tais como congelamento destrutivo, e/ou (2) o tecido indesejado é tornado mais suscetível a eventos que resultem em destruição celular, tais como congelamento destrutivo. Por exemplo, quando o tecido doador é um pâncreas, o pré-tratamento pode ocorrer pela perfusão diferencial tal que a destruição do tecido acinar seja maximizada enquanto o tecido da ilhota é conservado. Em tais modalidades, o tecido da ilhota pode ser infundido com uma solução crioprotetora compreendendo um agente crioprotetor (CPA) através de um sistema vascular, tal como pelo tronco celíaco e artéria mesentérica superior; após o equilíbrio adequado do tecido da ilhota, o tecido acinar pode ser infundido com uma solução aquosa pelos tubos pancreáticos.

[0092] Em modalidades, o pré-tratamento do tecido doador pode ocorrer sob condições controladas para equilibrar preferencialmente o produto celular dentro do tecido. Por exemplo, o pré-tratamento do pâncreas pode ocorrer sob condições controladas para equilibrar pre-ferencialmente o tecido da ilhota dentro da glândula pancreática de uma temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 35°C. Além disso, a perfusão pode ser mantida suficientemente longa para permitir o equilíbrio do tecido da ilhota, mas não da glândula inteira, com o CPA permeante. Por exemplo, a perfusão pode ser mantida por um período de aproximadamente 20 min. a aproximadamente 70 min., tal como aproximadamente 25 a 35 min. ou aproximadamente 30 min. A base lógica desta etapa é entregar CPA suficiente ao tecido da ilhota para protegê-lo contra a injúria de congelamento durante o resfriamento subsequente ou ao congelamento do pâncreas, que pode ocorrer durante a conservação e/ou o transporte.

[0093] Em modalidades, por uma variedade de motivos, tal como conservação, transporte, e/ou rompimento, o tecido doador pode ser resfriado até uma temperatura suficiente para atenuar o metabolismo, tal como uma temperatura de cerca de 15°C a cerca de -20°C, tal como de cerca de 10°C a cerca de -10°C, ou de cerca de 10°C a cerca de 0°C. Em modalidades, por uma variedade de motivos, tal como conservação, transporte, e/ou rompimento, o tecido doador pode ser congelado até uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de -200°C, tal como de cerca de -40°C a cerca de -170°C, ou de cerca de -80°C a cerca de -130°C. Em modalidades, a taxa de resfriamento pode ser de cerca de 0,5°C/min a cerca de 5°C/min. Em modalidades, o congelamento e/ou resfriamento do tecido doador pode ocorrer a uma taxa de resfriamento de cerca de 1°C/min a cerca de 20°C/min, tal como de cerca de 6°C/min a cerca de 15°C/min.

[0094] Em modalidades, a taxa de resfriamento e/ou congelamen to do tecido doador acoplada com uma rápida taxa de aquecimento (como as taxas acima para resfriamento e congelamento multiplicadas por um fator de pelo menos 1,5, tal como um fator na faixa de 1,5 a 10, tal como um fator de 2, ou 3, ou 4, ou 5) durante aquecimento do tecido doador pode fornecer condições ótimas para recuperação do tecido funcional da ilhota. O aquecimento do tecido doador pode ser obtido, em modalidades, por imersão direta em um meio morno, tal como meio tamponado osmoticamente.

[0095] Em modalidades, a extensão de equilíbrio com CPA pode ou não atingir a totalidade, o que pode ser benéfico porque as condições para o equilíbrio completo das ilhotas in situ podem não ser facilmente determinadas em relação à necessidade de permeação mínima do CPA nas células exócrinas.

[0096] Em modalidades, o tecido doador pode ser dividido em pe daços menores, fraturado, e/ou fragmentado. De modo a acentuar a fratura de um tecido doador, tal como o pâncreas, o aquecimento volumétrico pode ser combinado com a adição de um trocador de calor de ar comprimido imerso em um banho de água quente. Em modalidades nas quais o tecido doador é resfriado ou congelada em uma plataforma de conservação ou transporte, isto pode permitir o descongelamento do tecido doador sem a necessidade de removê-lo da plataforma. A divisão ou fratura do tecido doador pode ocorrer a qualquer tempo antes da exposição à enzima digestiva, tal como durante o aquecimento do tecido doador.

[0097] Em modalidades, pode ser vantajoso expor o tecido doador a várias doses de uma enzima digestiva para ajudar na dispersão do tecido conjuntivo para permitir a liberação do produto celular, tal como ilhotas (que podem ser, opcionalmente, ilhotas crioprotegidas) a partir do tecido rompido.

[0098] Em modalidades, após a extensão do edema ter atingido um nível pré-determinado, tal como um nível de edema no qual há ganho de peso, massa, circunferência, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume de até cerca de 200% (isto é, se o peso, massa, circunfe- rência, área superficial, flutuabilidade, e/ou volume inicial ou original do tecido for X (tal como 100 gramas), um ganho de cerca de 200% resultaria em um peso final de 3X (300 gramas), tal como um ganho de até cerca de 150%, ou um ganho de até cerca de 100%, o tecido doador pode ser rompido para liberar produto celular do tecido doador desintegrado. Em modalidades, o rompimento do tecido doador pode ocorrer enquanto o tecido doador é congelado, enquanto o tecido doador é aquecido e/ou após o tecido alcançar a temperatura ambiente. Em modalidades, o rompimento pode ser obtido por esforço mecânico, esforço termomecânico induzido por expansão diferencial, esforço ter- momecânico induzido por gradientes de temperatura crescentes, e esforço termomecânico induzido por alteração de volume mediante congelar, através de uma enzima digestiva, ou uma combinação dos mesmos.

[0099] O esforço termomecânico pode ser o resultado da tendên cia do material em contrair mediante congelamento, o que pode ser induzido por três diferentes efeitos: alteração do volume mediante congelamento, conforme descrito acima, gradiente de temperatura crescente e expansão diferencial em materiais compósitos. Na prática, dois ou mais dos efeitos acima podem atuar em conjunto.

[00100] Em outras modalidades, o rompimento do tecido doador pode ser obtido por fraturar mecanicamente um tecido doador congelado. Por exemplo, isto pode ser obtido em dois estágios. O primeiro estágio pode ser dividir fisicamente o tecido doador congelado em pedaços, por exemplo, com um martelo e cinzel. O segundo estágio pode ser moer os pedaços de tecido congelado enquanto imersos em água morna ou meio isotônico, por exemplo, pelo uso de um triturador ou misturador elétrico de gelo. Isto também pode servir para fazer aquecimento e diluição rápida de um crioprotetor, se incluído, ao mesmo tempo em que o tecido é triturado mecanicamente.

[00101] Em modalidades, o método compreende, adicionalmente, separar o produto celular do material de tecido doador indesejado. A separação do produto celular pode ser obtida, por exemplo, por filtração, separação por gradiente de densidade, cultura de tecido, ou uma combinação dos mesmos. Filtração pode ser feita usando um aparelho de filtração, tal como uma rede de aço inoxidável (peneira de chá). A separação pode incluir lavagem do tecido doador filtrado com um meio contendo um inibidor de protease, tal como PEFABLOC®, e uma de- soxirribonuclease, tal como PULMOZYME®, de modo que as proteases endógenas nocivas e o DNA do tecido exócrino lisado sejam removidos. Em modalidades, o tecido doador filtrado pode ser corado com um indicador para identificar o produto celular, tal como ditizona para corar ilhotas, e examinado sob o microscópio para avaliar a presença do produto celular intacto.

[00102] O produto celular separado pode não ser clivado de forma limpa do tecido doador e nem todo o produto celular pode estar completamente intacto. Por exemplo, no que diz respeito às ilhotas, algum tecido de ilhota pode ter uma estrutura difusa ou frouxa que poderia refletir choque osmótico devido à imersão direta em um meio aquoso durante aquecimento de um pâncreas congelado. Em modalidades, este problema pode ser evitado por empregar tamponamento osmótico durante a eluição do CPA do tecido da ilhota durante ou após o descongelamento de um pâncreas congelado. A utilização da técnica de tamponamento osmótico em modalidades pode proteger a estrutura do tecido da ilhota e reduzir a expansão osmótica e lise durante o efluxo do CPA permeante. Em contrapartida, em tais modalidades, o tampo- namento osmótica não afeta a destruição e lise simultânea das células acinares porque estas células não foram protegidas pela permeação de CPA.

[00103] Em modalidades, uma clivagem suficientemente limpa do tecido da ilhota pode ser obtida por um método de crio-isolamento, em modalidades, em combinação com uma digestão enzimática moderada para purificar o tecido da ilhota. Outra abordagem pode ser usar cultura de tecido como uma modalidade para o processo de "limpeza" uma vez que o tecido acinar residual lesionado durante o processo de crio- isolamento morrerá e se desintegrará em cultura.

[00104] Exemplos são apresentados mais adiante neste documento e são ilustrativos das diferentes composições e condições que podem ser utilizadas na prática das modalidades. Todas as proporções são expressas em peso, exceto onde indicado em contrário. Será evidente, entretanto, que a descrição pode ser praticada com muitos tipos de composições e pode ter muitos usos diferentes de acordo com a descrição acima e como indicado mais adiante no presente documento. Por exemplo, estes exemplos serão facilmente reconhecidos pelos versados na técnica como também sendo aplicáveis ao isolamento de ilhotas humanas porque o pâncreas de porco é um modelo reconhecido na técnica para pâncreas humano.

[00105] O pâncreas de porco é um modelo útil pelo menos pelas seguintes razões: (1) o pâncreas de porco é um modelo animal grande, (2) os porcos são considerados a fonte mais promissora de ilhotas para futuro xenoenxerto clínico. Por exemplo, em vista do atual ressurgimento do interesse clínico na conservação da perfusão hipotérmica de órgãos para transplante, o porco fornece o modelo de escolha para avaliação pré-clínica em animais grandes da tecnologia de perfusão em equipamento hipotérmico (HMP) para conservação do pâncreas do doador segmentário. Em segundo lugar, o caso especial da conservação do pâncreas antes do isolamento da ilhota é de alto significado em vista do interesse mundial no xenotransplante de ilhota e nossos dados de que a HMP pode facilitar o maior rendimento da ilhota sem comprometer a função da ilhota.

[00106] Além disso, os planos estratégicos de consenso recentemente publicados pela associação internacional de xenotransplante para considerar testes clínicos de produtos de ilhotas de porco para diabetes tipo 1 enfatiza a necessidade e a importância de um ambiente estéril e livre de doença para os porcos fonte e os produtos. Para esta finalidade, o sistema LifePort® fornece um ambiente estéril conveniente para o transporte dos pâncreas fonte desde o local de aquisição até a instalação de processamento da ilhota. Esta abordagem é aplicada à conservação e à aquisição de ilhotas viáveis após perfusão hipotérmi- ca de pâncreas suíno porque os porcos são agora considerados as espécies doadoras de escolha para transplante xenogeneico de ilhotas por inúmeras razões irrefutáveis (O'Neil, J. J. et al., The isolation and function of porcine islets from market weight pigs, Cell Transplant. 10:235-246; 2001).

[00107] A idade do porco doador se mostrou um fator significativo no processo de isolamento da ilhota com porcos novos chamados de porcos com tamanho para comercialização (<6 meses de idade), se mostrando uma fonte particularmente difícil de ilhotas transplantáveis (7,10,50). Entretanto, apesar destes desafios, os porcos novos são favorecidos em relação aos reprodutores com atividade encerrada (>2 anos de idade) devido à sua abundância, aos custos menores do animal e da criação e são mais adequados para satisfazer as diretrizes regulatórias para tecido doador para xenotransplante. Os exemplos a seguir demonstram a eficácia da perfusão da máquina hipotérmica de pâncreas para porcos novos antes do isolamento da ilhota. Dados relacionados aos detalhes do modelo cirúrgico que foi desenvolvido à luz de considerações especiais para se obter perfusão uniforme do pâncreas suína durante 24 h de perfusão hipotérmica a 7°C também são apresentados.

[00108] O sucesso da perfusão hipotérmica de pâncreas suíno para o isolamento de ilhotas pode ser fortemente influenciado pelo procedimento cirúrgico de aquisição de órgãos e canulação do pâncreas para conservação em equipamento ex-vivo. O desenvolvimento do método de recuperação cirúrgica de pâncreas suíno não foi procedimento óbvio. Inicialmente, a falta de documentação detalhada sobre a anatomia do pâncreas de porco levou à conservação inapropriada da vasculatu- ra dos órgão durante a aquisição do pâncreas. A aquisição inadequada de órgãos resultou em perfusão da máquina de pâncreas inconsistente e incompleta e, desta forma, baixo rendimento e viabilidade da ilhota.

[00109] Até recentemente, a anatomia do pâncreas de porco não era bem documentada. Fisiologicamente e topograficamente, os pâncreas de porco e humano são considerados similares. O pâncreas é uma glândula retroperitoneal alongada, conforme mostrado na Figura 1. Em porcos e em seres humanos, a cabeça do pâncreas está intimamente relacionada com o duodeno proximal, mas para porcos, a abertura do duto pancreático é encontrada distal ao duodeno e separada do duto biliar comum (Swindle, M. M.; Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scand. J. Lab. Anim. Surg. 23:110; 1997). Há um número variável de vasos que se originam das artérias esplênicas, hepáticas, gastroduodenais, mesentéricas superiores e celíacas que têm individualmente configuração irregular de suprimento de sangue para o pâncreas. Comumente, o sangue para a cabeça é fornecido pelas arcadas posterior e anterior surgindo das artérias gastroduodenal e mesentérica superior (Figura 1). Em porcos, a cabeça não circunda as artérias e veias pancreático-duodenal — a última se situa entre a cabeça e o duodeno com as ramificações para o pâncreas sendo facilmente identificáveis. O pescoço e o corpo do pâncreas são geralmente vascularizados pelas artérias pancreáticas dorsal e inferior. A primeira pode se originar das artérias esplênica, hepática, ou diretamente da artéria celíaca. A artéria pancreática inferior pode começar na artéria mesentérica superior (SMA) sob o pescoço do pâncreas e, logicamente, em direção à cauda ao longo da margem posterior inferior da superfície pancreática em contato íntimo com a glândula. Ela pode se comunicar com um número variado de ramificações da artéria esplênica. O pescoço do pâncreas também é o local da veia portal na confluência das veias esplênica e mesentérica superior. A cauda do pâncreas recebe seu suprimento de sangue principalmente a partir da artéria esplênica.

[00110] Na preparação para a ligação do pâncreas à máquina de perfusão LifePort®, todas as ramificações arteriais expostas na margem dos lados gastroduodenal e hepático do pâncreas foram meticulosamente identificadas e ligadas para assegurar perfusão uniforme por toda a glândula e permitir que o efluente emergisse apenas a partir da veia portal. Esta abordagem cirúrgica se mostrou ótima para a per- fusão/ conservação do pâncreas para isolamento de ilhotas, conforme descrito por Taylor, M. J., et al., in Hypothermic perfusion of pâncreas: Emphasis on preservation prior to islet isolation. Em: Lee, C. Y., ed., Organ perfusion preservation. Boston, MA: Artech House Publisher; 2010, o qual está aqui incorporado a titulo de referência, em sua totalidade.

[00111] Conforme descrito por Taylor et al., uma abordagem cirúrgica exemplificadora pode incluir o seguinte: 1. Uma equipe de dois operadores para a aquisição do pâncreas; 2. Seguir os requisitos da instalação cirúrgica para os códigos de vestuário e equipamento de proteção pessoal; 3. Verificar com o técnico veterinário do centro cirúrgico que o porco está entubado e sob anestesia geral (isto é, 22mg/kg de cetamina, 0,2 mg/kg de acepromazina, e 0,025mg/kg de atropina); confirmar com o técnico veterinário do centro cirúrgico sobre a manutenção da anestesia do porco e ventilação adequada; 4. Verificar com o técnico veterinário do centro cirúrgico que todos os sinais vitais estão sendo monitorados (ECG, frequência cardíacanível de saturação de oxigênio, temperatura corporal, etc); 5. Verificar que um bisturi elétrico, uma linha de sucção e tubos estão disponíveis. 6. Verificar que a mesa cirúrgica do campo posterior do centro cirúrgico foi adequadamente preparada (instrumentos cirúrgicos, esponjas de absorção, gaze, solução salina gelada, fita umbilical, etc.); 7. Verificar que 2L de solução de Ringer lactato gelada foram colocados em gelo; 8. Verificar que um polo IV está disponível próximo da mesa de operação e que sua altura é adequada para a o fluxo in situ direcionado pela gravidade dos órgãos (cerca de 1,82 m (6 pés) a cerca de 1,98 m (6,5 pés); 9. Obter permissão do técnico veterinário do centro cirúrgico para proceder a cirurgia; 10. Reduzir a exposição do pâncreas à isquemia morna para 3 minutos, exceto se desejado de outro modo; 11. Quando a permissão tiver sido concedida, fazer uma incisão na linha média a partir da cartilagem do xifoide até logo acima da pelve e expor a cavidade abdominal; 12. Instruir o técnico veterinário do centro cirúrgico a administrar heparina ao porco (cerca de 150U/kg), permitir que se passem pelo menos três minutos antes de começar o fluxo in-situ; 13. Mover e manter de lado a bexiga e os intestinos (com a ajuda de esponjas de absorção) e identificar a aorta descendente; 14. Dissecar, abaixo dos rins, um segmento (cerca de 3cm) da aorta sem considerar o teci- do/vasos circundantes, colocar nós de fita umbilical em torno do segmento aórtico; cortar uma pequena abertura na aorta entre os dois nós enquanto o assistente da cirurgia aplica pressão sobre as paredes da aorta para impedir que o sangue jorre; 15. Inserir a cânula aórtica na abertura e amarrá-la no lugar (se certificar de que o nó de fita umbilical é colocado de forma segura sobre o colar da cânula); 16. Inserir duas lancetas do conjunto de irrigação nas portas de infusão adequadas das duas bolsas de solução de Ringer lactato (se certificar que o regulador de fluxo está fechado para evitar perda de solução); 17. Pendurar as bolsas de solução de Ringer lactato no polo IV e fazer fluir a tubulação do conjunto de irrigação para remover adequadamente todo o ar; fechar o regulador de fluxo; 18. Fazer pinçamento-cruzado da veia cava inferior e da aorta acima do diafragma; 19. Conectar a abertura da entrada da cânula à porta de saída de fluxo do conjunto de irrigação e abrir o regulador de fluxo para iniciar o fluxo in-situ direcionado pela gravidade; 20. Abrir com um corte a veia cava inferior acima do diafragma, a jusante da pinça para fluxo de saída de sangue; 21. Colocar imediatamente muito gelo dentro da cavidade abdominal em torno do pâncreas e do fígado para manutenção/proteção dos órgãos em baixa temperatura; 22. Usar a tubulação e os recipientes de sucção para coletar o sangue lavado; 23. Se certificar que o fluxo de solução das bol-sas, através da cânula para dentro da aorta não está obstruído e que há fluxo de saída da veia cava inferior; 24. Quando vazia, remover a bolsa de solução de Ringer lactato do polo IV e pendurar a bolsa de solução SPS-1 (anteriormente mantida sobre gelo), usar apenas metade do volume da solução de SPS-1 para lavar os órgãos; 25. Instruir o técnico veterinário do centro cirúrgico a eutanizar o porco usando uma dose letal de 5% de sódio pentobarbital administrado intravenosamente (forma aceita de eutanásia de acordo com as diretrizes da "American Veterinary Medical Association Panel on Euthanasia" (AVMA)) e terminar o fluxo in-situ; 26. Transferir a segunda metade da bolsa de solução de SPS-1 para a bolsa de risco biológico para transporte de pâncreas e colocar esta última sobre gelo; 27. Cuidadosamente e rapidamente (menos de 15 minutos) expor e dissecar o pâncreas do tecido e órgãos circundantes (adicionar gelo em torno dos órgãos viscerais, conforme necessário), se certificar de que a cápsula e a integridade do pâncreas são mantidas; 28. Manter um segmento de duodeno proximal (próximo do piloro e incluindo a maior parte da segunda porção descendente do duodeno) ligada à cabeça do pâncreas; se certificar de que o segmento do duodeno inclui a abertura do duto pancreático (Figura 1); 29. Ligar a veia e a artéria esplênica antes do desprendimento do baço; 30. Manter um segmento aórtico longo de cerca de 5 a cerca de 7 cm ligado ao pâncreas para futura canulação do órgão; o segmento aórtico deve incluir as aberturas da artéria mesentérica superior (SMA) e do tronco celíaco (CT); 31. Remover o pâncreas do corpo e com a cânula aórtica ligada, rapidamente remover por lavagem o sangue da superfície externa do pâncreas usando solução salina gelada; imergir o pâncreas na solução de SPS-1 dentro da bolsa de transporte; 32. Colocar a bolsa com o pâncreas sobre o gelo dentro do resfriador para o pâncreas para transporte até o laboratório de isolamento da ilhota.

[00112] A metodologia exemplificadora para canulação do pâncreas para perfusão em máquina pode incluir o seguinte: 1. Uma equipe de dois operadores é recomendada para a limpeza e canulação do pâncreas; 2. Fazer a canulação do pâncreas no laboratório de isolamento de modo a reduzir o dano por isquemia estática fria antes da perfusão em máquina; 3. Minimizar a exposição do pâncreas à isquemia estática ao frio para menos de 2 horas, o tempo de isquêmica estática fria é o tempo decorrido desde o início do fluxo in-situ até o começo da per- fusão em máquina; 4. Transferir o pâncreas do resfriador de transporte para a bandeja cirúrgica de aço inoxidável; colocar este último sobre o gelo e dispensar cerca de 20 a 30 mL de solução de SPS-1 da bolsa de transporte para a bandeja para ajudar a manter o pâncreas úmido e gelado; 5. Remover a cânula aórtica; limpar todo o tecido variado enquanto se presta atenção para manter a integridade do pâncreas; identificar e expor as veias SMA e CT; 6. Dissecar o segmento aórtico na linha média para expor os orifícios da SMA e do CT, neste ponto, os orifícios da SMA e do CT devem ser claramente vistos posicionados aparte sobre o manguito aórtico (1,5 cm x 4 cm); 7. Colocar e prender no lugar a cânula do anel de vedação de tamanho adequado, o tamanho correto deve fechar ambos os orifícios da SMA e do CT sem obstrução e permitir claramente sua visualização através da parede clara superior da cânula; 8. Testar para vazamentos; encher uma seringa de 20cc com a solução a ser usada para perfusão, prender a seringa a uma extremidade da cânula, remover o ar de dentro da cânula e tampar a outra extremidade da cânula, gentilmente infundir a solução no pâncreas e identificar vazamentos dos vasos expostos; 9. Meticulosamente identificar e ligar todas as ramificações arteriais expostas que estejam vazando na margem dos lados gastroduodenal e hepático do pâncreas (usar nós de fita umbilical e/ou seda, apropriadamente); 10. Canular o duto pancreático; remover a agulha do conjunto de infusão "surflo-winged" e usar sua tubulação como a cânula do duto; usar as tesouras para micro-cirurgia para cortar uma abertura no duto pancreá- tico como seu local de origem no duodeno e inserir a cânula; prender este último no lugar por suturar com nós à parede do duodeno; 11. Medir e registrar o peso (subtrair o peso da cânula), a massa (subtrair a massa da cânula), volume, circunferência, e/ou flutuabilidade do pâncreas.

[00113] A identificação e ligação justa de todos os vasos expostos nos lados hepático e gastroduodenal do pâncreas são de alta importância. Geralmente cerca de 12 a cerca de 14 vasos são amarrados antes da perfusão para eliminar a possibilidade de uma via para 'menor resistência' para o fluxo ao longo do órgão e para permitir ao efluente emergir apenas da veia portal. Escapes de vasos expostos comprometem a uniformidade da perfusão do órgão que pode, por sua vez, levar a gradiente de pressão e temperatura através da superfície do órgão e conservação subótima do pâncreas.

[00114] A metodologia exemplificadora para aplicação da perfusão em máquina no pâncreas pode incluir o seguinte (Figura 6): 1. Encher um recipiente gelado com uma mistura de gelo e água fria (consultar o manual de operações da LifePort™), colocar o recipiente na área principal do transportador; 2. Colocar o cassete do órgão dentro do espaço para o cassete, instalar a estrutura do tubo do circuito de perfusão no deque da bomba e fechar o braço de travamento de alumínio, conectar o sensor de pressão ao transdutor de pressão; 3. Pressionar POWER para ligar os controles de usuário do transportador e seguir as direções da tela externa para deixar o transportador pronto para perfusão; 4. Adicionar 1L de solução de perfusão gelada ao cassete do órgão; ajustar a pressão de infusão para cerca de 10mmHg no painel de controle, verificar que a temperatura do recipiente de gelo, conforme indicado pela tela externa, está abaixo de cerca de 8 °C; 5. Pressionar WASH para iniciar a bomba e circular o perfusado ao longo do circuito; se certificar de que todo o ar do circuito é removido; 6. Colocar o pâncreas (com o duodeno preso) dentro do cassete, e posicionar a cânula do órgão no suporte da cânula no berço, conectar a porta de entrada da cânula à linha de infusão e abrir a porta de saída da cânula; 7. Pressionar PRIME para remover o ar da cânula e da linhagem de infusão, e, então, tampar a cânula; o último irá parar o fluxo e a bomba com base na resistência detectada; 8. Pressionar STOP; pressionar INFUSE para iniciar o modo de perfusão do pâncreas, observar a bomba começar a rodar e aumentar sua velocidade até o ponto de pressão estabelecido ser alcançado (por exemplo, cerca de 10 mm de Hg); 9. Garantir visualização em tempo real e registrar os parâmetros de fluxo na tela externa e na estação de dados, os parâmetros de perfusão, conforme apresentado no painel externo são: ponto de ajuste de pressão (pressão sistólica, mmHg), taxa de fluxo (mL/min), resistência (mmHg/(mL/min)), temperatura (°C, dentro da seção gelada isolada do transportador, isto é, recipiente de gelo), para ler a temperatura de infusão (°C) e pressão diastólica (mmHg) pressionar as setas de rola- mento do lado direito da tela externa para alternar sequencialmente através destes parâmetros adicionais; 10. Permitir a perfusão do pâncreas durante a quantidade desejada de tempo, tal como menos que cerca de 24h (ou na faixa de cerca de 4h a cerca de 24h, tal como cerca de 8h a cerca de 16h), ou cerca de 24h ou mais, ou na faixa de cerca de 24h a cerca de 48h; parar a bomba e salvar o arquivo de dados (inclui a dinâmica de todos os parâmetros de perfusão); 11. Remover o pâncreas do cassete; medir o peso, massa, circunferência, flutuabili- dade, volume do pâncreas pós-perfusão e registrar estas informações; determinar o nível de acúmulo de fluido dentro do órgão (edema, %).

EXEMPLOS

[00115] A inclusão do segmento do duodeno junto com a cabeça do pâncreas permite uma perfusão consistente. Vazamentos de vasos pequenos que divergem das artérias pancreático-duodenais (as duas alças em torno da cabeça na Figura 1, que estão entre a cabeça e o duodeno em um porco) podem ser eliminados por manter a integridade dos vasos e assim permitir uma perfusão uniforme da cabeça e pescoço do pâncreas. Além disso, a abertura do duto pancreático no duodeno pode ser conservada. Este procedimento pode facilitar consideravelmente a canulação do duto pancreático por evitar as dificuldades encontradas com a identificação e canulação do duto retraído e ramificações do duto precoces conservadas. Este último pode ser necessário para assegurar boa distensão do órgão para digestão da glândula e isolamento da ilhota. A identificação e ligação justa de todos os vasos expostos nos lados hepático e gastroduodenal do pâncreas pode ser de alta importância. Antes da perfusão, pode ser necessário eliminar a possibilidade de uma via de "menor resistência" (por amarrar certos vasos) para o fluxo ao longo do órgão, o que pode resultar em gradientes inconsistentes de perfusão, pressão, e temperatura do órgão através da superfície do órgão e conservação subótima do pâncreas.

[00116] A perfusão do pâncreas no LifePort® pode ser monitorada usando vários parâmetros, como pressão de perfusão (mmHg, sistólica e diastólica), taxa de fluxo do perfusado (ml/min), resistência vascular (mmHg/(mL/min)), e temperatura (°C). As temperaturas do perfusado e da seção gelada isolada do transportador (recipiente de gelo) podem ser medidas. Todos estes parâmetros podem ser registrados e apresentados em tempo real pelos pela estação de registro de dados, conforme ilustrado na Figura 8. Durante a perfusão, cada uma destas dinâmicas de parâmetro pode ser visualizada e posteriormente correlacionada com o resultado da perfusão e/ou isolamento da ilhota. A per- fusão em máquina hipotérmica de pâncreas de porcos novos pode ser feita a uma temperatura de infusão entre cerca de 5°C e cerca de 7°C. O recipiente de gelo é projetado especificamente para acomodar esta faixa de temperatura através do volume da mistura de gelo/água e as características de troca de calor. Além disso, a bomba pode ser programada para parar se a temperatura no recipiente de gelo aumentar acima de uma temperatura pré-determinada, tal como cerca de 8°C, conforme lido pelo sensor de temperatura localizado fora do recipiente no invólucro principal e em contato íntimo com a parede do recipiente. Sob estas circunstâncias, a conservação reverte para armazenamento frio estático pela duração remanescente a menos que haja intervenção do operador para reinicializar a bomba.

[00117] Um órgão pré-formado adequadamente fluindo in-situ e exposição limitada do pâncreas à isquemia antes da perfusão pode resultar em uma baixa resistência vascular do órgão. O último pode ser ilustrado por início imediato da perfusão do órgão e/ou uma redução constante na resistência vascular e aumento na taxa de fluxo por toda a duração da perfusão (Figura 8). Para circuitos de fluxo aberto, com pâncreas, tubos e conexões com escape, o transportador falha em manter a pressão de infusão imposta, resultando assim em perfusão errônea e inativação da bomba. Este evento pode ser remediado por intervenção do operador para identificar e corrigir quaisquer vazamentos responsáveis pelo estado de baixa resistência vascular.

MATERIAIS

[00118] Aquisição cirúrgica de pâncreas de porco: Instalação cirúrgica de pesquisa designada a animais (o centro cirúrgico deve fornecer ambiente e instrumentação adequados para assegurar anestesia adequada do porco, ventilação e monitoramento de sinais vitais durante a aquisição do pâncreas); porcos de criação domésticos machos Yorkshire, 25 a 32 kg; resfriador para recuperação de pâncreas contendo: uma cânula aórtica (tamanho 18, Brad), um conjunto de irrigação com duas lancetas em 'Y' (Medline), uma bolsa de risco biológico estéril, 1L de solução UW gelada (SPS-1, sistemas para recuperação de órgãos); bolsa de gelo cheia pela metade com gelo para transporte do órgão a partir do centro cirúrgico até o laboratório de isolamento; solução de Ringer lactato, 2L (B Braun Medical.).

[00119] Canulação do pâncreas para perfusão em máquina: A bandeja e os instrumentos cirúrgicos (tesouras Mayo e Metzenbaum, pinça DeBakey, pinça hemostática curva e reta, tesouras de mola para micro-cirurgia, seguradores de agulha); gazes (4"x 4") e fita umbilical (segmentos de 10"); sutura estéril, Vicryl revestido, agulha afunilada 40, RB-1, 17 mm, 1/2c (Ethicon); linhas estéreis, seda 0 (métrica 3,5), trançado preto (Ethicon); conjunto de infusão "surflo-winged", 21Gx3/4", tubulações de 12", V=0,45mL (Terumo); agulhas estéreis (16G, 18G) e seringas de 20cc; cânulas com anel de vedação de 10x35mm e 7x20mm descartável LifePort (Organ Recovery Systems); cânula reta e acoplador reto LifePort descartável de 3, 5, 8mm (Organ Recovery Systems); solução de perfusão, 1L, (KPS-1, UHK, Organ Recovery Systems, Inc.); escala de pesagem do tecido; e bandejas.

[00120] Perfusão de pâncreas em máquina: Transportador de rins LifePort™, configuração pulsátil (inclui cobertura isolante, recipiente de gelo, cabo de energia e captura de dados, baterias, Organ Recovery Systems); cassete para órgãos (inclui condutores duplos ventilados e berço para órgãos com suporte para cânula, Organ Recovery Systems); estrutura do circuito de perfusão com sensor de pressão embutido (inclui filtro e câmara de compatibilidade, Organ Recovery Systems); estação de registro de dados (computador e programa de estação dados).

[00121] Pequenos porcos de criação (Yorkshire doméstico, macho, 25 a 32 kg; Hambone Farms, SC) foram usados como doadores de pâncreas. Após indução de anestesia geral com cetamina (22 mg/kg), acepromazina (0.2 mg/kg), e atropina (0,025 mg/kg), e manutenção da anestesia com isoflurano em oxigênio, os animais foram entubados e conectados a uma ventilação mecânica. A cavidade abdominal foi aberta através de uma incisão na linha média a partir da cartilagem do xifoide até logo acima da pelve e a aorta decrescente foi identificada e canulada abaixo dos rins. A veia cava inferior e a aorta foram identificadas, isoladas, e fechadas por pinçamento acima do diafragma. Um fluxo direcionado pela gravidade in situ do pâncreas foi iniciado usando 2 L de solução de Ringer lactato gelada enquanto para o fluxo san-guíneo a veia cava inferior foi aberta por um corte acima do diafragma, abaixo da pinça. O porco foi eutanizado através de exsanguinações e uma dose letal de 5% de sódio pentobarbital foi administrada intravenosamente. Esta última é uma forma aceita de eutanásia de acordo com as últimas diretrizes da American Veterinary Medical Association Panel on Euthanasia (AVMA). Todo o cuidado e manuseio dos animais estava de acordo com as políticas e aprovação do Comitê Institucional para Cuidado e Uso de Animais (Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)) na Universidade Médica da Carolina do Sul (Medical University of South Carolina), onde as aquisições de órgão foram executadas.

[00122] A exposição do órgão à isquemia morna foi mantida abaixo de 3 min usando o fluxo vascular de solução fria e por colocar gelo dentro da cavidade abdominal durante a excisão cirúrgica do pâncreas. O pâncreas foi cuidadosamente e rapidamente exposto e dissecado do tecido e órgãos circundantes. Um segmento do duodeno proximal começando próximo do piloro e incluindo a maior parte da segunda alça descendente do duodeno foi mantido intacto com o pâncreas para proteger as artérias pancreático-duodenal superior e inferior (Figura 1). O duto biliar comum e as aberturas do duto pancreático foram incluídos como parte do segmento do duodeno. Isto facilitou consideravelmente a canulação do duto pancreático por evitar as dificuldades encontradas com a identificação e canulação do duto retraído e ramificações do duto precoces conservadas. Este último foi necessário para assegurar boa distensão do órgão para digestão da glândula e isolamento da ilhota. A veia e a artéria esplênica foram ligadas antes do desprendimento do baço (Figura 1). Um segmento aórtico longo de 5 a 7 cm foi deixado ligado ao pâncreas para futura canulação do órgão. O segmento incluiu as aberturas da artéria mesentérica superior (SMA) e das veias do tronco celíaco (CT). 1). O pâncreas foi removido do corpo, imerso em solução da Universidade de Wisconsin (University of Wisconsin (UW; Viaspan, Fisher Scientific)) gelada, e colocado sobre gelo para transporte desde o centro cirúrgico até o laboratório de pesquisa, uma viagem de menos de 30 min. No todo, desde o início do fluxo in situ gelado até o início da perfusão hipotérmica ex vivo, a ex-posição do pâncreas à isquemia estática fria foi mantida abaixo de 2h. Ao chegar no laboratório, todas as ramificações arteriais expostas na margem dos lados gastroduodenal e hepático do pâncreas foram meticulosamente identificadas e ligadas para assegurar perfusão uniforme por toda a glândula e permitir que o efluente emergisse apenas a partir da veia portal por evitar escapes a partir das muitas ramificações arteriais.

CANULAÇÃO E PERFUSÃO DO PÂNCREAS

[00123] Devido às configurações anatômicas e as variações da vascularização no pâncreas de porcos jovens, provou ser difícil obter uma preparação de infusão consistente pelo uso da canulação direta da SMA e do tronco celíaco individualmente. Isso era devido a ramos colaterais arteriais que eram facilmente bloqueados e impedidos pelas cânulas, como ilustrado na Figura 2A e 2B. Esse problema foi evitado pelo emprego de uma cânula com anel de vedação (10 x 35 mm. Organ Recovery Systems), que tem um desenho geométrico que permitiu um acesso direto as aberturas de SMA e CT através de um patch aór- tico como ilustrado na Figura 2C.

[00124] Para o pâncreas porcino, todos os problemas de fluxo são eliminados pelo uso da cânula com anel de vedação para a perfusão, Seu desenho geométrico permite o fluxo direto para o CT e vasos de SMA do pâncreas sem interferência. A cânula é colocada sobre o patch aórtico incluindo as aberturas dos dois vasos, sem obstrução dos vasos como ilustrado na Figura 6 e na Figura 9a. Isso contrasta com o uso de cânulas de inserção que entram na luz arterial e potencialmente impedem ou ocluem as aberturas para os ramos colaterais vasculares. A cânula com anel de vedação fornece uma ligação de fluxo selada entre o pâncreas e o sistema de perfusão e garante 24 h de perfu- são contínua uniforme sem eventos indesejáveis.

[00125] A máquina de perfusão LifePort™ forneceu uma perfusão pulsátil em alça fechada controlada em uma pressão sistólica de 10 mmHg. A fim de conectar o pâncreas a essa máquina para uma perfu- são consistente ininterrupta por 24 h, vários métodos de canulação foram avaliados. Inicialmente, um segmento aórtico com 5 a 7 cm de extensão, incluindo as aberturas da artéria mesentérica superior (SMA) e o tronco celíaco (CT), foi usado pela ligação de uma extremidade do segmento aórtico e inserção de uma cânula reta (conector OD 6,25 mm) na outra extremidade. A cânula foi acoplada à porta de infusão da bomba LifePort™. Entretanto, esse arranjo provou ser problemático devido à configuração da máquina LifePort™ clínica, que foi incapaz de alcançar e manter a pressão de perfusão desejada.

[00126] Para a canulação aórtica, um segmento aórtico com 5 a 7 cm de extensão, incluindo ambas as aberturas da artéria mesentérica superior e da artéria do tronco celíaco, é ligado em uma extremidade e canulado diretamente (cânula OD 6,25 mm) na outra extremidade. A extremidade canulada PE acoplada à porta de infusão da bomba. Sob essa configuração, possivelmente devido à elasticidade do segmento aórtico, a bomba foi incapaz de alcançar e sustentar sua pressão de perfusão desejada. Pelo projeto, sob essas circunstancias a LifePort™ é configurada para tentar compensar pelo aumento de sua velocidade até que o valor máximo permitido seja atingido (240 mL/min), depois do que a bomba para. Essas condições de velocidade aumentada da bomba resultam inevitavelmente em maior acúmulo de fluido no tecido como refletido pela duplicação do edema glandular. Nesse ponto, ge-ralmente dentro de 6 a 12 h do início da perfusão, a bomba para e a conservação do órgão reverte para o armazenamento estático a frio convencional pela imersão no fluido apenas, sem perfusado circulante. É presumido que a complacência inerente no segmento aórtico em relação à resistência vascular do pâncreas contribuiu para esse fenômeno.

[00127] Modos alternativos de canulação foram avaliados envolvendo a canulação reta direta de SMA e do tronco celíaco individualmente usando dois conectores OD luer-farfa de 4 mm unidos por um acoplador ligado a porta de bomba de infusão (Fig. 2). O sucesso desse arranjo provou ser dependente das diferenças anatômicas entre um pâncreas de porco e outro. Especificamente, a resistência de fluxo aumentada e a eventual parada da bomba com perfusão incompleta é problemática e pode ocorrer devido a oclusão dos ramos colaterais arteriais pelas cânulas inseridas na SMA e no CT como ilustrado na Figura 2, o que ocorreu em cerca de um terço dos casos. Esses problemas de fluxo foram aliviados pelo uso de uma cânula com vedação em anel patenteada (10 x 35 mm; Organ Recovery Systems) ilustrada na Figura 2C. Essas cânulas são desenhadas para abranger as aberturas de SMA e CT pelo pinçamento do arco aórtico como mostrado na Figura 2C. Dessa maneira, foi fornecida uma ligação de fluxo vedado mesmo que ramos colaterais precoces estivessem presentes. Essas restrições podem ser peculiares à anatomia de porcos jovens, mas o uso da cânula com vedação em anel permitiu a perfusão consistente, sem problemas por cerca de 24 h a até cerca de 48 h.

[00128] Usando o método da inserção da canulação reta, os vasos SMA e do CT são canulados individualmente com conectores OD luer- farpa de 4 mm que são inseridos diretamente dentro dos dois vasos (Figura 9c). Os dois conectores/cânulas são unidos ou com um acoplador (Figura 10) ou por um conector em "T" (Figura 9c). O último é acoplado a porta de bomba de infusão. No caso de pâncreas de porco jovem, essa abordagem é dependente da anatomia do órgão e, em muitos casos, tem fornecido perfusão inconsistente e resistência ao fluxo aumentada que, em última análise, leva a parada do fluxo, parada da bomba e perfusão incompleta do órgão por razões que serão discutidas agora. Em pâncreas de porco jovem, vários ramos vasculares pequenos divergem precocemente do tronco celíaco e das artérias mesentérica superior e podem ser bloqueados pela ponta da cânula (ilustrado na Figura 11). Embora a cânula avance normalmente apenas 6 mm dentro dos vasos (20 mm de comprimento), a obstrução do fluxo da cânula para os ramos leva a nenhuma perfusão ou a perfusão dife- rencial através da superfície do órgão. Em acentuado contraste, a ca- nulação direta da SMA e da artérias esplênica de pâncreas humano é um procedimento simples, básico que não está sujeito às mesmas restrições anatômicas como os pâncreas porcinos. Como para o pâncreas porcino, as duas cânulas são conectadas com um acoplador que por sua vez é acoplado à porta de infusão do transportador (veja a Figura 10). O pâncreas humano também pode ser perfundido com o segmento duodenal acoplado. O diâmetro da cânula reta varia de acordo com o tamanho e anatomia do pâncreas humano, normalmente ele abrange uma faixa entre cerca de 3 a cerca de 10 mm.

[00129] O sistema pulsátil LifePort™ foi projetado inicialmente, e aprovado pelo FDA para a perfusão/conservação hipotérmica do rim para transplante clínico (Baicu, S. C. et al., Interstitial fluid analysis for assessment of organ function, Clin. Transplant. 18, Suppl.12:16-21; 2004; Baicu, S. C., The role of preservation solution on acid-base regulation during machine perfusion of kidneys, Clin. Transplant. 20:113121, 2006; and Moers, C. et al., Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N. Engl. J. Med. 360:7-19; 2009). Usando o sistema para o rim, o pâncreas foi perfundido em uma alça fechada enquanto era completamente imerso na solução de per- fusão dentro do cassete do órgão, que acomodou confortavelmente o pâncreas inteiro desses porcos jovens (Fig. 2D). O cassete também serviu como reservatório da solução, o perfusado sendo retirado pela bomba, foi passado através de um filtro, captador de bolha, porta de infusão antes de retornar para o pâncreas e o cassete de órgão. A submersão do pâncreas no perfusado com temperatura controlada ajudou a eliminar os gradientes de temperatura através da superfície do órgão e garantir a conservação hipotérmica de alta qualidade. O perfusado selecionado (1L) foi mantido a 5-7°C. Um regime de fluxo pulsátil (30 pulsos/min) em pressão baixa constante foi imposto com um ajuste de 10 mmHg para a pressão sistólica. O valor da pressão de perfusão de 10 mmHg foi selecionado com base no fato de que fisiolo- gicamente o pâncreas é um órgão com baixo fluxo e todos os experimentos preliminares realizados para otimizar o regime de perfusão de pâncreas jovens indicaram uma necessidade ou de pressão baixa ou de taxa de fluxo baixa, dirigindo a conservação da perfusão. As características técnicas do sistema LifePort™, já comercialmente disponível, foram capazes de suportar essas demandas. A taxa e a pressão de fluxo de perfusão, a resistência do órgão e a temperatura do perfusado foram medidas, registradas e exibidas em tempo real. O peso do órgão foi medido antes e depois da perfusão e usado para determinar o acumulo de fluido pós-conservação dentro do órgão (edema). Mais detalhes do desenvolvimento do método de perfusão para o pâncreas estão descritos em Taylor, M. J., et al., Hypothermic perfusion of pancreas: Emphasis on preservation prior to islet isolation. In: Lee, C. Y., ed., Organ perfusion preservation. Boston, MA: Artech House Publisher, 2010, cuja descrição está incorporada aqui pela referencia em sua totalidade.

[00130] Distensão do Pâncreas e Isolamento das Ilhotas. Ilhotas foram isoladas de pâncreas frescos e conservados hipotermicamente. Acompanhando cada recuperação ou conservação de órgão, a enzima de dissociação (Liberase PI, Roche, Indianapolis, IN) foi liberada pelo pâncreas através do duto biliar pela infusão direta com seringa. Antes da sua utilização, a Liberase (0,5 g) foi reconstituída para um volume final de 350 ml com HBSS (solução salina balanceada de Hank, VWR, Suwanee, GA) e permanentemente mantida em gelo. Três lotes diferentes de Liberase PI foram empregados ao longo da duração dos experimentos aqui relatados. O valor médio da atividade de colagenase para os três lotes era de 2192,4 ± 114,6 Wunschs por frasco (500 mg) comum desvio padrão de 198,6 Wunschs. Depois da distensão intra- dutal do pâncreas, todo tecido estranho foi removido e o pâncreas foi cortado em sete a nove pedaços. Os últimos foram colocados em uma câmara de Ricordi de 1000 ml (BioRep Technologies Inc., Miami, FL) contendo nove esferas de aço inoxidável e uma peneira com malha de 500 μm. A câmara de dissociação, uma parte integrante do sistema de dissociação de ilhota Ricordi (um circuito de fluxo com 1200 ml direcionado por uma bomba com temperatura controlada), foi preparado (RPMI, Invitrogen, Carlsbad, CA) e colocado em temperatura fisiológica (36 ± 1°C). Através da agitação mecânica da câmara e da digestão enzimática combinada, as ilhotas foram liberadas sob condições controladas de temperatura e taxa de fluxo. Com o auxílio da coloração com ditiazona, a amostragem periódica do tecido digerido permitiu a visualização sob microscópio do progresso da digestão do tecido e do percentual de ilhotas livres e guiou a avaliação do ponto final da digestão. Quando o ponto final da digestão foi determinado, a digestão foi paralisada e a fase de diluição (com 4L de RPMI gelado) foi iniciada, enquanto o digesto de tecido contendo as ilhotas livres foi coletado e colocado sobre gelo. O digesto de tecido foi lavado três vezes (3 min, 4°C e 1000 rpm) com FCSHBSS 10% gelado e o pélete final de teci- do/ilhota foi consolidado em dois tubos cônicos de 250 ml. O volume celular peletizado foi pesado e registrado (menos do que 20 g/tubo), o pélete de ilhota foi ressuspenso em UW, até 100 ml por tubo e colocado sob gelo para a incubação a frio de pelo menos 30 min. O turbilho- namento periódico dos tubos foi realizado para evitar a compactação do pélete.

PURIFICAÇÃO DA ILHOTA

[00131] Com a finalização da incubação a frio na solução de UW, a purificação da ilhota baseada na centrifugação com gradiente de densidade foi realizada usando COBE 2991 (Gambro BCT, Lakewood, CO). Um gradiente contínuo com Ficoll de densidades 1108 e 1069 foi empregado para separar as células a 2400 rpm por 5 min. As frações de ilhota purificadas em Ficoll foram coletadas sequencialmente em seis tubos cônicos predeterminados (preenchidos previamente com meio FCS 2,5% - M199). O conteúdo remanescente da bolsa de purificação também foi recuperado no sétimo tubo. Todos os tubos foram centrifugados a 4°C e 1500 rpm por 3 min. Depois da remoção apropriada do sobrenadante, as frações foram amostradas (amostra de 0,5 ml em 2 ml de solução de ditizona) para determinar sob microscópio as frações mais puras. A solução de ditizona (50 mg de difeniltiocarbazo- na e 5 ml de dimetil sulfóxido em 45 ml de solução de tampão fosfato) foi usada para corar as ilhotas para sua identificação e quantificação. Imagens de todas as frações foram registradas para propósitos de comparação. As frações contendo as ilhotas foram recombinadas como apropriado, apropriadamente marcadas e designadas para a contagem de ilhotas e/ou teste de viabilidade.

QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ILHOTA

[00132] Depois do isolamento e da purificação da ilhota, o número total de ilhotas foi determinado usando técnicas convencionais (por exemplo, veja Ricordi, C. et al., Pancreatic islet cell transplantation. Austin, TX: R. G. Landes; 1992:132-142). Resumidamente, um volume de 100 μl de fração de ilhota foi colocado em 250 μl de solução de diti- zona dentro de um disco de tecido de 35 mm x 10 mm com grade. Portanto, as ilhotas foram coradas, contadas e convertidas em equivalentes de ilhota (IE) de acordo com a convenção padronizada. As contagens foram realizadas em duplicata por dois observadores independentes. A pureza da preparação de ilhota também foi avaliada pela comparação do tecido corado com ditizona com o tecido exócrino não corado CONTEÚDO DE INSULINA DA ILHOTA E ENSAIO DE SECREÇÃO ESTIMULADA

[00133] A liberação de insulina da ilhota depois da exposição às concentrações baixas e altas de glicose foi determinada depois de uma recuperação inicial de 1 h a 37°C em uma solução com pouca glicose (2 mM) (em RPMI-1640). Depois, períodos de incubação de 30 min. consecutivos das ilhotas (37°C banho de água com agitação) em uma solução com 2, 20 e 2 mM de glicose, respectivamente, foram realizados, cada um seguido pela remoção e congelamento do sobre- nadante (0,5 ml) e a ressuspensão da ilhota na próxima concentração de glicose em solução. As avaliações do conteúdo de insulina e da resposta da insulina estimulada pela glicose foram realizadas imediatamente depois da purificação e quantificação da ilhota, sem incuba- ção/cultura prévias. Com base no rendimento das frações mais puras de ilhota, alíquotas de pequeno volume de suspensão de ilhota contendo 25 IE foram distribuídas a cada um dos 12 tubos cônicos de 1,5 ml contendo 1 ml da solução de glicose correspondente. A sedimentação dirigida pela gravidade das ilhotas dentro dos tubos cônicos de 1,5 ml foi usada antes da remoção do sobrenadante (0,5 ml por tubo) no final de cada fase de estimulação com glicose.

[00134] A partir da(s) fração(ões) mais pura(s) de suspensão de ilhota, duas amostras de 0,5 ml foram removidas e subsequentemente congeladas para determinar mais tarde o conteúdo de insulina e ami- lase, respectivamente. A liberação de insulina depois da estimulação com a glicose dos sobrenadantes congelados e o conteúdo de insulina das amostras das frações mais puras foram quantitativamente determinadas usando os kits Insuline Porcine EIA (Alpco Diagnostics, Windham, NH). O último é um imunoensaio de enzima de dois sítios em fase sólida baseado na técnica sanduíche direta. De acordo com o protocolo do fabricante, dois anticorpos monoclonais são dirigidos contra determinantes antigênicos separados sobre a molécula de insulina, o anticorpo marcado ligado a enzima para a molécula de insulina é de- tectado pela reação com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina e o ponto final é lido espectrofotometricamente (Spectra Max Plus 384; Molecular Devices, 450 nm). Os resultados foram normalizados para equivalente de ilhota e expresso como ng/ml/IE. O kit EnzChek Ultra Amylase Assay (Molecular Probes, Carlsbad, CA) foi usado para medir o conteúdo de amilase, de acordo com as especificações do fabricante.

VIABILIDADE DA ILHOTA

[00135] Glutationa e ATP foram medidos como índices de dano te- cidual e estado de energia, respectivamente. Para isso, amostras de suspensão das frações mais puras de ilhota foram removidas, 1 e 0,5 ml para as medidas de glutationa e ATP, respectivamente, centrifugadas e imersas imediatamente em nitrogênio líquido depois da remoção completa do sobrenadante. Esses dois volumes satisfazem os requisitos da análise para os dois ensaios empregados para a quantificação de glutationa e ATP, usando o kit Glutathione Fluorimetric Assay (Sigma, St. Louis, MO) e o kit Viability-ATP Assay (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD), respectivamente. A análise da amostra foi realizada de acordo com as instruções do fabricante do ensaio; glutationa e ATP foram determinados, normalizados para IE e expressos em nM/IE.

ANÁLISE ESTRUTURAL

[00136] Um protocolo para o processamento de tecido do pâncreas foi desenvolvido para visualizar as alterações morfológicas induzidas pelos métodos de conservação de órgão. Nesse protocolo, todas as biópsias em cunha foram fixadas por uma noite em solução de gluta- raldeído 2%/tampão de Sorenson 0,1 M; Depois disso, as amostras foram enxaguadas (tampão de Sorenson 0,1 M) e colocadas em Ós- mio 2%/ tampão de Sorenson 0,1 M por 1 h. Depois de outra lavagem, as amostras foram desidratadas usando uma série graduada de solução de acetona e infiltradas com resina Araldite 502, usando inicial- mente uma mistura 1:1 de resina/acetona. Depois de 30 minutos, as amostras foram movidas para uma mistura 9:1 de resina/acetona, colocadas em um rotor vertical e deixadas por uma noite. No dia seguinte, as amostras foram transferidas para moldes contendo 100% de resina, assegurando que nenhuma bolha de ar estivesse presente e po- limerizada a 60°C por 24 horas. Seções espessas (2 μm) foram cortadas usando um ultramicrótomo, coradas com azul de toluidina e visualizadas com o auxílio de um microscópio de luz.

[00137] Os dados a seguir demonstram os efeitos da natureza do perfusado e a isquemia quente prévia sobre o isolamento de ilhota de pâncreas de porcos jovens. Os grupos experimentais em relação às condições de conservação estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Grupos Experimentais

SOLUÇÕES DE CONSERVAÇÃO

[00138] Três soluções foram usadas para a conservação hipotérmi- ca do pâncreas: (i) UW (Viaspan, Barr), para o armazenamento estático frio; (ii) KPS-1 (Organ Recovery Systems), autorizada pelo FDA para máquina de perfusão renal; e (iii) Unisol-UHK, parte da família pro prietária de soluções Unisol™ (Organ Recovery Systems and Cell and Tissue Systems, Charleston, SC) (Veja Patente U.S. No. 6.492.103). Atualmente, Viaspan, considerada a solução "padrão ouro" para a conservação de órgãos hipotérmicos, é a solução mais comumente usada no transplante de órgãos. KPS-1, uma solução híbrida "extracelu- lar/intracelular", é o padrão industrial atual para máquina de perfusão renal (23; Szust, J. et al., A comparison of OPOpulsatile machine preservation practices and results. J. Transpl. Coord. 9:97-100, 1999).

[00139] A família Unisol™ de soluções, da qual Unisol-UHK é um componente, tem sido designada como um sistema de solução universal para a conservação ótima de célula, tecido e órgão. UHK, a solução base intracelular de Unisol™, foi designada para aplicação em temperaturas hipotérmicas profundas (< 15°C). A Tabela 2 mostra as formulações químicas para as soluções usadas nesse pedido. A solução UHK, antes do seu uso, foi suplementada com glutationa reduzida fresca (3mM), de acordo com sua formulação química (Baicu, S. C. et al., The role of preservation solution on acid-base regulation during machine perfusion of kidneys, Clin. Transplant. 20:113-121, 2006; Baicu, S. C. et al, Modulating biochemical perturbations during 72-hour machine perfusion of kidneys: Role of preservation solution, Cryobiology, 54:114-120, 2007; Patente U.S. No. 6.492.103; Taylor, M. J., Biology of cell survival in the cold: The basis for biopreservation of tissues and organs. In: Baust, J. G., Baust, J. M., eds., Advances in biopreservation, Boca Raton, LA: CRC Press, 2007:15-62; Taylor, M. J. et al., Design of Preservation Solutions for Universal Tissue Preservation in vivo: Demonstration of efficacy in pre-clinical models of profound hypothermic cardiac arrest. Transpl. Proc. 37: 303-307, 2005; cujas descrições estão incorporadas aqui por referencia em suas totalidades). A solução KPS-1 contém a mesma quantidade de glutationa, mas foi adicionada no momento da fabricação da solução. Tabela 2. Formulações de Solução de Conservação

[00140] Cada pâncreas foi designado para um de seis grupos de tratamento de conservação: controles frescos - processados imediatamente (isquemia fria < 1 h) (G1, n=7); armazenamento estático frio - irrigado com UW-Viaspan gelado e armazenado em UW-Viaspan a 24°C sem WIT prévio (G2, n=9); perfundido com HMP em uma máquina LifePort® a 4-6°C e baixa pressão (10 mmHg) por 24 h com solução de KPS1 (G3, n = 7) ou Unisol-UHK (G4, n = 7). Grupos de tratamento adicionais para avaliar os efeitos da isquemia quente prévia examinaram o isolamento de ilhota depois de 30 min de WIT in situ sem (G5, n = 6) ou com HMP 24-h HMP com KPS1 (G6, n = 7). O pâncreas foi distendido por via intradutal com a enzima Liberase PI e normotermica- mente digerido. As ilhotas isoladas foram purificadas pela centrifugação com um gradiente contínuo de densidade. O edema glandular induzido pela perfusão era G3 = 138 ± 19%, G4 = 160 ± 16%, e G6 = 127 ± 22%. Rendimento em ilhota (IEQ/g de pâncreas) variou entre os grupos: G1 = 1,425 ± 610, G2 = 1,002 ± 262, G3 = 2,242 ± 449 (p < 0.05 vs. G2), G4 = 1,901 ± 420 (p < 0.05 vs. G2), G5 = 1,756 ± 329, e G6 = 1,396 ± 243.

[00141] O método de conservação teve um impacto significativo sobre a extensão do tempo de digestão e a quantidade de ilhotas livres liberadas a partir do digesto pancreático. Os dados estão resumidos na Tabela 3. O exame microscópico das diferentes preparações usando a coloração com ditizona para as ilhotas mostrou uma digestão consistentemente mais uniforme do pâncreas de G3 e G4 comparado com G1 e G2, com maior separação de tecido e menos ilhotas capturadas (Fig. 4). O digesto de tecido do grupo de controle fresco (G1) e SCS (G2) de pâncreas mostrou mais ilhotas ocultas (ilhotas incompletamente clivadas com tecido exócrino aderente) e capturadas (Fig. 4A-D) em comparação com órgãos perfundidos (Fig. 4E e F). A amostragem de ilhota durante o processo de digestão revelou ilhotas livres e um digesto mais homogêneo, sem fragmentos de tecido exócrino, para o pân-creas perfundido com máquina (Fig. 4E). Os dados de recuperação de ilhota estão resumidos na Figura 3, que mostra que a perfusão do pâncreas resultou em um alto rendimento em ilhotas que foi estatisticamente significativo (p < 0,05) quando comparado com o grupo expe- rimental de descarga fria (G2). A perfusão com máquina permitiu que o sangue remanescente fosse lavado e também, com base no acúmulo de água (edema), forneceu uma ruptura do espaço extracelular sem um impacto negativo sobre a distensão ductal. Em última análise, essas ilhotas liberadas mais rapidamente e a correlação entre o edema e o tempo de digestão existe com tempos de digestão mais curtos em pâncreas como edema maior (Tabela 3). O edema levemente negativo observado no grupo com descarga fria (-2,8 ± 0,7%) parece ter sido devido à hipertonicidade da solução UWViaspan. Tabela 3. Conservação do Pâncreas e Índices de Isolamento de Ilhota

*N=4. † N=6. †‡ P < 0,05 versus G1, G2 (Anova, pós-teste de Tukey) § p < 0,01 versus G1, G2, G3, G4 (ANOVA, pós-teste de Tukey) ¶ p < 0,01 versus G1, G2, G3 (ANOVA, pós-teste de Tukey). # p < 0,05 versus G2. ** p < 0,01 versus G2-G6.

[00142] Depois da purificação, para todos os grupos experimentais, as ilhotas purificadas foram encontradas em duas frações; frequentemente, uma fração tinha mais ilhotas do que a outra, que geralmente continha ilhotas maiores e menos tecido exócrino. As frações foram marcadas cronologicamente, na ordem da coleta, de 1 a 7. A maioria das ilhotas puras livres nas preparações de pâncreas perfundidos, com ou sem 30 min de exposição a isquemia quente (G3, G4, G6), foram encontradas nas frações 3 e 4. As ilhotas mais puras de pâncreas com armazenamento estático (G2) e órgãos isquêmicos (30 min) quentes não bombeados (G5) eram comumente vistas nas frações 2 e 3. Entretanto, no caso de pâncreas frescos e do grupo de controle com Vias pan, as ilhotas livres também estavam contidas nas frações 5 e 6, para esse grupo de pâncreas a preparação revelou ilhotas capturadas dentro de fragmentos de tecido exócrino que foram incapazes de migrar no gradiente de densidade.

[00143] No grupo HMP, onde tempos de digestão significativamente mais curtos foram necessários e as preparações mais uniformes de ilhotas separadas e tecido exócrino foram vistas, a separação por gradiente de densidade foi mais eficiente, com maior rendimento e pureza das ilhotas (veja a Fig. 4). A fração 7, que continha os remanescentes da bolsa de gradiente de densidade, não tinha ilhotas para pâncreas perfundidos enquanto continha ilhotas capturadas a partir de órgãos de controle e fresco (Fig. 4B, direita). A pureza das preparações de ilhotas depois da purificação por gradiente de densidade, medida como a proporção de insulina (das ilhotas) para amilase (das células exócrinas), também estava aumentada nos grupos perfundidos comparados com o fresco e de armazenamento frio estático (Tabela 3). A distribuição de tamanho das ilhotas coletadas nos diferentes grupos está resumida na Tabela 4, que mostra que um percentual muito alto (>90%) das ilhotas coletadas de pâncreas conservados estava na faixa de 50 a 100 μm, sem levar em consideração o modo de conservação. Isso não foi signi-ficativamente diferente (ANOVA) da distribuição de tamanho obtidas nos pâncreas de controle não tratados obtidos desses porcos jovens. As contagens de ilhotas, dada na Tabela 4, representa o rendimento expresso como números absolutos de ilhota independentemente do seu tamanho (>50 μm) e é distinto dos rendimentos mostrados na Figura 3, que são expressos em termos de "equivalentes de ilhota", usando a convenção padronizada (34). A distribuição de tamanho das ilhotas obtidas desses porcos jovens concorda com os relatos prévios na literatura comparando doadores porcinos adultos e jovens (Dufrane, D. et. al., Impact of porcine islet size on cellular structure and engraf- tment after transplantation: Adult versus young pigs. Pancreas 30:138147, 2005; Jay, T. R., et al., The distribution of porcine pancreatic betacells at ages 5, 12 and 24 weeks. Xenotransplantation 6:131-140, 1999; Jay, T. R., The distribution of porcine pancreatic betacells at ages 5, 12 and 24 weeks. Xenotransplantation 6:131-140, 1999; Toso, C. et al., Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant., 9:297-305, 2000; Ulrichs, K. et al., Histomorphological characteristics of the porcine pancreas as a basis for the isolation of islets of langerhans. Xenotransplantation 2:176-187, 1995). Tabela 4. Distribuição de Tamanho da Ilhota

[00144] A contagem total de ilhotas representa o número de ilhotas individuais com um diâmetro maior do que 50 μm.

[00145] A perfusão dos pâncreas de doadores porcinos adultos maiores (mais do 2 anos de idade e acima de 180 kg (400 lb)) também foi realizada usando um transportador LifePort®. A fim de acomodar um tecido de um doador com maior resistência do órgão, tal como do- adores porcinos adultos, o seguinte ajuste foi feito ao transportador LifePort®: (i) maiores valores de pressão de perfusão podem ser ajustados para equilibrar a maior resistência do órgão e a vascularização aumentada (pelo projeto, o transportador pode regular a pressão de infusão entre 10 e 65 mmHg), (ii) o berço para o órgão pode ser removido do cassete de órgão para permitir a imersão no perfusado gelado do tecido completo do doador, tal como o pâncreas, para controle apropriado da temperatura e/ou (iii) pode ser empregada a perfusão lobular do pâncreas (isto, cabeça, cauda, etc., podem ser separada e individualmente perfundidas). A canulação direta discutida abaixo) dos vasos principais do segmento selecionado do pâncreas pode ser considerada para a perfusão lobular.

[00146] Em modalidades, a perfusão lobular é uma opção alternativa para a perfusão do tecido completo do doador, quando o tamanho do tecido ou órgão do doador excede o volume do cassete. Por exemplo, com relação ao pâncreas, depois da recuperação do corpo e da limpeza, os lobos do pâncreas são identificados e visualmente delimitados do tecido circundante. Ferrer et al documentaram recentemente em grandes detalhes a anatomia do pâncreas do porco e as variações em sua configuração vascular e ductal (Ferrer J., Scott W.E., III, Weegman B.P. et al., Pig pâncreas anatomy: implications for pâncreas procurement, preservation, and islet isolation. Transplantation 2008, 86:1503-1510). Para a perfusão lobular, o(s) vaso(s) princi- pal/principais de cada lobo/segmento do pâncreas pode(m) ser individualmente canulados diretamente (a cânula é inserida na luz do vaso). Se mais do que uma cânula for usada, um acoplador é empregado para unir todas as cânulas e conectá-las à porta de infusão como ilustrado na Figura 9. Por exemplo, a SMA ou seu ramo e a artéria esplênica são recomendadas para a máquina de perfusão da cauda do pâncreas usando a canulação direta.

[00147] O efeito da isquemia quente prévia sobre o rendimento em ilhota também é mostrado na Figura 3. A recuperação da ilhota de pâncreas de porcino jovem não foi comprometida depois de 30 min. de isquemia quente (G5) e foi adicionalmente mantida depois de 24 h de perfusão hipotérmica na máquina (G6). A Tabela 3 de Integridade da Ilhota resume os dados para a função da ilhota em termos de conteúdo de insulina e a habilidade para responder a um desafio secretório com glicose. O último é expresso como o Índice de Estimulação, determinado pela comparação da insulina liberada durante a exposição sequencial a uma concentração de glicose baixa (não estimuladora, 2 mM) e alta (estimuladora, 20 mM). O conteúdo médio de insulina das ilhotas isoladas de pâncreas perfundidos foi significativamente maior do que aquele do grupo de controle armazenado a frio com UW- Viaspan e não foi significativamente diferente dos valores médios do tecido fresco. Além disso, os índices de estimulação mostraram que a função secretória da insulina das ilhotas isoladas de pâncreas perfundidos não foi comprometida quando comparada com os grupos de controle, mesmo depois de 30 min. de isquemia quente. A isquemia sozinha, sem perfusão subsequente, produziu grande variabilidade na função secretória (G5) comparada com todos os outros grupos como refletido no erro padrão que foi uma ordem de magnitude maior. Entretanto, a imposição de HMP depois de 30 min de WIP (G6) pareceu estabilizar essa resposta e a função secretória da insulina não foi signifi-cativamente diferente para os controles). O estado da energia das ilhotas isoladas, em termos de conteúdo de ATP, também estava conservado durante a técnica de perfusão por 24 h.

[00148] A integridade histológica dos pâncreas foi avaliada a partir de biópsias em cunha retiradas no fim do intervalo de conservação e exemplos dos grupos de controle e experimental são mostrados na Fig. 5. A Figura 5A mostra a morfologia típica do tecido fresco com uma ilhota intacta, que cora mais levemente com azul de toluidina do que os ácinos circundantes, que são caracterizados pela abundancia de grânulos de zimogênio. Em contraste acentuado, o tecido armazenado por 24 h em UW-Viaspan mostra algumas alterações degenerativas características de lesão isquêmica (Fg. 5B). Essas incluem células com brotamento, arredondadas e vacuoladas. A ruptura dos ácinos também é aparente com a separação das células e a degranulação. Micrografias comparáveis preparadas a partir de pâncreas perfundidos por 24 h com KPS1 ou Unisol-UHK são mostradas na Figura 5C e D, respectivamente. A Figura 5C mostra uma ilhota intacta circundada pelo tecido acinar que mostra claramente alterações nos ácinos comparado com o tecido fresco (Fig. 5A). As células exócrinas dos ácinos parecem ter uma estrutura frouxa, consistentes com o edema moderado que se desenvolveu durante a perfusão. A Figura 5D mostra uma ilhota no pâncreas perfundido com Unisol-UHK que possui a morfologia intacta circundada pelo tecido acinar. Nesse espécime, o tecido exócrino parece mais bem conservado com menos ruptura do que aquela detectada no grupo de armazenamento a frio por 24 h (Figura 5B) ou no grupo perfundido com KPSI (Fig. 5C). As Figuras 5E e F ilustram a morfologia das ilhotas e do tecido acinar em cortes de pâncreas perfundido por 24 h com KPSI depois de 30 min. de isquemia quente. Novamente, alguma ruptura acinar está aparente, consistente com as alterações do edema tecidual e da isquemia quente, mas as ilhotas possuem uma morfologia intacta comparável com aquela de ilhotas submetidas a perfusão hipotérmica sem isquemia quente prévia.

[00149] Os índices de estimulação da ilhota foram equivalentes entre os grupos e similares aos controles (G1). O conteúdo de insulina (ng/ml/IEQ) foi diferente entre os grupos de tratamento com o conteúdo de insulina mais elevado em ilhotas coletadas de pâncreas HMP. A coloração com ditizona para as ilhotas mostrou uma digestão mais consistentemente uniforme dos órgãos perfundidos, com maior separação do tecido, menos ilhotas capturadas e maior rendimento e pureza das ilhotas. Os efeitos salutares de HMP por 24 h também se manifestaram depois de 30 min de isquemia quente prévia. Nós concluímos que 24 h de HMP são bem toleradas, levando a edema moderado, mas sem perda da função das ilhotas coletadas. O edema parece auxiliar na digestão enzimática, produzindo um maior rendimento e pureza das ilhotas, comparadas com pâncreas submetidos a 24 h de armazenamento estático frio.

[00150] Os pâncreas recuperados de porco jovem, canulados e perfundidos usando os métodos acima mencionados são conservados com sucesso por até 24 horas no transportador LifePort®. Como mostrado na Tabela 5, a perfusão hipotérmica prolongada resulta em acúmulo de fluido uniforme dentro do órgão (136±12%, n=19) mesmo em baixa pressão de perfusão (10 mmHg). O edema prova ser vantajoso para o isolamento da ilhota. Ele fornece um espaço extracelular rompido que auxilia a liberação das ilhotas mais rapidamente, subsequente a digestão enzimática e gera um digesto mais homogêneo, com menos ilhotas escondidas e capturadas, em comparação com pâncreas frescos e com armazenamento estático (veja a Figura 7 e a Tabela 5). A perfusão hipotérmica também conserva a função e a viabilidade da ilhota (Tabela 5). Tabela 5. Rendimento de Ilhotas e Índices de Função

*p<0,05 versus Grupo de Armazenamento Estático Frio (SCS)

[00151] A perfusão hipotérmica de pâncreas humanos pode ser realizada seguindo as etapas do método de perfusão de pâncreas intacto de porco jovem discutido acima, com a exceção do sítio de canulação e do tipo de cânula. Sob os protocolos normais de recuperação clínica, os pâncreas humanos são procurados sem patch aórtico, mas com o segmento duodenal acoplado e com a vascularização intacta. Nesse caso, SMA e a artéria esplênica são individualmente canuladas diretamente (como discutido abaixo) e simultaneamente perfundidas durante a conservação do pâncreas na máquina (Figura 10). O cassete transportador de órgão sem modificação pode acomodar o pâncreas humano. Entretanto, em comparação com o pâncreas de porco, o pâncreas humano pode estar altamente fibrosado, o que precisa ser considerado junto com a história médica do doador para a otimização da pressão de perfusão de pâncreas humano.

Claims (22)

1. Método ex vivo para isolamento de ilhotas pancreáticas de tecido pancreático, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um tecido doador que tem células desejadas e células indesejadas; conectar um aparelho de perfusão ao tecido doador para permitir comunicação fluida entre o tecido doador e o aparelho de perfusão; realizar perfusão de máquina hipotérmica através da perfusão do tecido doador com uma solução de perfusão sob condições hipotérmicas, em que um conteúdo de O2 na solução de perfusão é reabastecido durante a perfusão, e a solução de perfusão é um substituto sanguíneo hipotérmico, compreendendo um ou mais membros selecionados do grupo composto por agentes citoprotetores e perfluoroquímicos; desenvolver edema durante a perfusão do tecido doador para formar um tecido inchado via aumento de uma primeira pressão de perfusão aplicada pelo aparelho de perfusão ao tecido para alcançar uma segunda pressão de perfusão, em que a segunda pressão de perfusão está na faixa de 20 mmHg a 50 mmHg; tratar o tecido inchado com uma enzima digestiva; monitorar o espaço extracelular no tecido doador através de microdiálise; e separar as células desejadas do material celular indesejável para obter um produto celular; em que o tecido é um pâncreas, a taxa de consumo de oxigênio do tecido doador é avaliada antes do aparelho de perfusão ser ligado ao tecido doador e a taxa de consumo de oxigênio do tecido doador é avaliada e monitorada depois do aparelho de perfusão ser ligado ao tecido doador, e uma demanda de O2 do tecido doador é satisfeita durante um intervalo/processo de preservação que decorre desde o momento em que o aparelho de perfusão é ligado ao tecido doador até ao momento em que o aparelho de perfusão é desligado do tecido doador.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: monitorar a flutuabilidade do tecido doador para avaliar a extensão do edema; monitorar a área superficial do tecido doador para avaliar a extensão do edema; monitorar a circunferência do tecido doador para avaliar a extensão do edema; monitorar a massa do tecido doador para avaliar a extensão do edema; e/ou monitorar o volume do tecido doador para avaliar a extensão do edema.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda dividir o pâncreas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda introduzir agentes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para evitar morte celular induzida por frio do tecido doador.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda introduzir agentes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para evitar que as células de um pâncreas doador entrem em vias de destruição.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda introduzir agentes citoprotetores durante a perfusão do tecido doador para inibir a disfunção mitocondrial em células de um pâncreas doador.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda evitar glicólise anaeróbica no tecido doador.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a prevenção da glicólise anaeróbia no tecido doador compreende a introdução de perfluoroquímicos na solução de perfusão.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda evitar privação/depleção de oxigênio no tecido doador.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a prevenção da privação/depleção de oxigênio no tecido doador compreende a introdução de perfluoroquímicos na solução de perfusão.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda desconectar o aparelho de perfusão do tecido doador.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reabastecer o conteúdo de O2 na solução de perfusão durante a perfusão.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido doador é de um doador com coração batendo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido doador é de um doador com coração parado.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o monitoramento do espaço extracelular no tecido doador por microdiálise compreende implantar uma sonda de diálise no tecido doador e avaliar a concentração de componentes de fluidos intersticiais.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a concentração de componentes de fluidos intersticiais é avaliada periodicamente.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os componentes de fluidos intersticiais são selecionados dentre o grupo composto por glicose, lactato, piruvato, glicerol, ATP, O2 e CO2.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido doador é de um mamífero.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um porco.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a perfusão de máquina hipotérmica é realizada com uma solução de perfusão a uma temperatura de 5-7° C.

22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sonda de diálise compreende uma membrana biocompatível semipermeável como uma parte ativa.

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