TWI499671B - 細胞移植物之製備 - Google Patents

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Description

細胞移植物之製備 【相關申請案】
本申請案主張美國臨時專利申請案第61/583,367號(申請日：101年1月5日)，茲將上述申請案的全部內容作為參考資料併入本文。
本發明關於一種供製備「異體細胞-製備-組織工程(allogeneic cell-preparing-tissue-engineering)」移植物的方法及藉由該方法所製備的產物。
間葉幹細胞(MSCs)，亦稱為多能性基質細胞，該等細胞已知可自我再生且分化成各種不同的間葉及非間葉組織，且於臨床應用上已成為前景可期之工具，例如成骨不全症之細胞療法(Horwitzet al .,Nat Med 5,309-313,1999)；軟骨及骨骼之組織工程(Caplan，Tissue Eng 11，1198-1211，2005)；以及預防有害的心臟重塑及改善恢復率之心臟療法(Pittenger and Martin，Circ Res 95，9-20，2004)。
使用一源自單一健康的供給細胞之MSCs所製備之「現成」產品，於患有移植物對抗宿主疾病及克隆氏症之病患中，已於兩個第III期研究中被證實其安全性(http：//www.clinicaltrails.gov/)。再者，對急性心肌梗塞病患施予異體MSCs亦被報導可改善射出率(EFs)(Hare JM，et al .，J Am Coll Cardiol. 54(24)：2277-2286，2009)。因此，於治療患有心血管疾病之病患時，源自健康供給者之異體MSCs，可作為一「廣用之供給細胞」。人類、狒狒、及鼠類之MSCs的免疫抑制特性亦於活體外及活體內被報導，其中於具免疫力之狒狒，將異體MSCs應用於延長皮膚異體移植物之存活率(Bartholomewet al. ，Exp Hematol. 30(1)：42-48，2002)，以及於人類應用於減緩移植物對抗宿主疾病(Le Blancet al. ，Lancet. 363 (9419)：1439-1441，2004)。然而，許多研究證實MSCs本質上並非免疫豁免的，且於具免疫力之MHC不匹配之接受者會對於異體MSCs產生排斥反應(Nautaet al ，Blood 108(6)：2114-2120，2006；Spaggiariet al. ，Blood. 107(4)：1484-1490，2006；Eliopouloset al. ，Blood 106(13)：4057-4065，2005)。因此，使用MSCs進行異體移植仍充滿爭議性。
將MSCs於低氧環境下培養，稱作低氧MSCs。相較於培養於正常氧環境下(約為20-21%O2 )之MSCs(稱作含氧正常的MSCs)，低氧MSCs會分泌更多的血管新生細胞激素及生長因子(Hunget al. ，Stem Cells 25(9)：2363-2370，2007)，且該源自低氧MSCs之條件培養基可被用於刺激傷口的治癒(Yewet al. ，Cell Transplant. ，2011)及骨折的治癒(Wanget al. ，J Tissue Eng Regen Med. ，2011)。
此外，Savant-Bhonsale及Smita揭露一種以低氧環境(介於約2.5%至約5%的氧氣(O2 ))促進神經幹細胞(NSCs)生長之方法及組合物，該低氧環境較傳統細胞培養技術之培養環境的含氧量低(US20070264712 A1)。據Hung等人報導，MSCs於含0.05%至15%O2 的低密度及低氧環境下培養(較佳介於約1%至約7%的氧氣)，於此被稱做為低氧及低密度之MSCs(10至4000 MSCs/cm2 )。相較於含氧正常的MSCs，低氧及低密度之MSCs可降低複製性衰老、增加增生率及分化潛能(US20110129918A1)。再者，當將該低氧MSCs移植入免疫缺陷小鼠之顱蓋缺陷處，該等低氧MSCs可促進缺陷之修復。經移殖後，低氧及低密度MSCs亦可促進細胞之遷移及移植至遠端(Hunget al. ，PLoS One. 25)：e416，2007)。然而，對於如何解決排斥的問題仍尚未被提及。
本發明關於一種藉由將細胞培養於低氧或缺氧環境下以降低異體細胞的排斥反應的新穎方法。
在一方面，本發明提供一種適合移植至個體的細胞移植物，其為包含具有NK配體表現量減少的非天然生成的細胞。
另一方面，本發明提供一種製備當移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應的細胞移植物的方法，其包含將至少一種自捐贈者 分離的細胞培養於介於0%至約7%氧氣的低氧環境下。
在本發明的一較佳具體實施例中，該低氧環境介於0%至約2.5%的氧氣。在本發明的一實例中，該低氧環境為約1%的氧氣。
又一方面，本發明提供一種藉由上述方法所製備的細胞移植物。根據本發明，所得的細胞移植物仍保留早期幹細胞特性、維持正常的核型、且經移植後不會形成腫瘤。
閱讀本發明時搭配圖示將可更加明瞭本發明之摘要，以及之後的詳細說明。於圖示中所呈現的具體實施例為較佳之示例，僅用於闡述本發明目的。應被理解的是，本發明不受所述之具體實施例所侷限。
圖示中：
圖1提供正常含氧(Nor)及低氧(Hyp)間葉幹細胞(MSCs)之特性，其中源自B6(A)及Balb/c(B)之MSCs係以表面標記物的表現情形以特徵化；及(C)顯示源自兩種老鼠品系之MSCs對於成骨性細胞系之誘導(21天)、脂肪形成細胞系之誘導(21天)及軟骨細胞系之誘導(21天)的分化能力，該分析係分別以茜素紅S、油紅O、及愛爾新藍染色法分析之(比例尺=50 μm)。茜素紅S、油紅O、及愛爾新藍染色之定量分析係分別於550 nm、510 nm波長以光學密度測量及陽性區域測量之。
圖2提供於異體的及自體的移植中，低氧MSCs於改善肢幹缺血之效用，其中將帶有左側股動脈阻斷之Balb/c小鼠以i.m.注射方式，於股薄肌中無注入(No cell)或注入1×106 正常含氧B6 MSCs(Nor B6；異體的)、低氧B6 MSCs(Hyp B6；異體的)、正常含氧Balb/c MSCs(Nor Balb/c；自體的)、低氧Balb/c MSCs(Hyp Balb/c；自體的)、或Balb/c小鼠胚胎的纖維母細胞(MEF Balb/c)。圖2A摘要於第28天該等動物之肢幹狀況；以及圖2B顯示不同時間週期之血液灌流指標(**p<0.01 vs.No cell，##p<0.01 vs.Nor B6)。
圖3提供低氧MSCs於減少肌肉退化及纖維化，以及增加缺血肢幹之血液灌流量之功效，其中圖3A顯示，藉由HE染色所測量之肌肉損失區域之定量分析；圖3B顯示，藉由梅生三色染色之肌肉纖維化區域之 定量測量；以及圖3C顯示，以抗CD31抗體進行之免疫組織化學法，測量第28天缺血性肢幹樣本的CD31+微管密度之定量分析(*p<0.05及**p<0.01 vs.No cell，#p<0.05及##p<0.01 vs.Nor B6)。
圖4顯示經移植後之28天，低氧MSCs存活情形，其中將帶有左側股動脈阻斷之Balb/c小鼠以i.m.注射方式，於股薄肌中無注入(No cell)或注入1×106 與BrdU結合之正常含氧B6 MSCs(Nor B6；異體的)、低氧B6 MSCs(Hyp B6；異體的)、正常含氧Balb/c MSCs(Nor Balb/c)、或低氧Balb/c MSCs(Hyp Balb/c；自體的)；於28天後採收缺血性肢幹的樣本，其中圖4A顯示使用抗BrdU抗體之免疫螢光染色；以及圖4B-4D分別顯示使用抗BrdU及CD31(圖4B)、α-平滑肌肌動蛋白(圖4C)、及肌間線蛋白(圖4D)之雙重免疫螢光染色。
圖5顯示低氧MsCs降低供NK活化及NK所媒介之裂解的配體表現，其中圖5A顯示以抗NKp46抗體分析第28天(左圖)及以抗DX5抗體分析第7天缺血性肢幹樣本(右圖)之免疫螢光染色的統計結果，其中該缺血性肢幹樣本係源自將小鼠注入106 B6正常含氧MSCs(Nor B6)、B6低氧(Hyp B6)、Balb/c正常含氧MSCs(Nor Balb/c)、或Balb/c低氧MSCs(HypBalb/c)(**p<0.01 vs.Nor B6)；圖5B顯示以抗CD4、CD8、CD14、CD86、或TCRαβ抗體分析第7天缺血性肢幹樣本之免疫螢光染色的統計結果，其中該缺血性肢幹樣本係源自將小鼠注入106 B6正常含氧MSCs(Nor B6)、B6低氧(Hyp B6)、Balb/c正常含氧MSCs(Nor Balb/c)、或Balb/c低氧MSCs(Hyp Balb/c)(**p<0.01 vs.Nor B6)；圖5C顯示肢幹狀況(上圖)及所指時間週期之血液灌流比率(下圖)，其中之帶有阻斷的左側股動脈的Balb/c小鼠，係於第28天經以106 B6正常含氧MSCs及左圖所指之抗體一同注入小鼠中，以及帶有阻斷的左側股動脈的B6小鼠，係於第28天經以106 Balb/c正常含氧MSCs及右圖所指之抗體一同注入小鼠中；圖5D顯示於所指細胞中H60c相對於GAPDH(10-4 )、nectin-2相對於GAPDH(10-4 )、Pvr相對於GAPDH(10-3 )、及Rae1相對於GAPDH(10-4 )之mRNA量的定量RT-PCR分析結果(**p<0.01 vs.Nor B6、##p<0.01 vs.Nor Balb/c)；以及圖5E顯示於B6及Balb/c MSCs中 H60c、nectin-2、Pvr、及Rae1之mRNA量的定量RT-PCR分析結果，其中該等細胞係以104 /cm2 密度培養並接觸低氧環境(1%O2 )48小時(**p<0.01 vs.0 h)；以及圖5F顯示經共同培養4小時後，NK細胞對於不同E：T比率之MSCs的細胞毒性活性，其中在將NK細胞與MSCs共同培養前，先將NK細胞擴增5天且未與(左圖)或與(右圖)IL-2處理。
圖6顯示正常含氧的B6 MSCs及抗NK配體抗體之抗體的中和反應，以抑制NK媒介之裂解及改善其增強血液灌流之效果，以及恢復缺血性肢幹的肌肉結構，其中圖6A顯示NK細胞的細胞毒性活性，其中先將之與IL-2培養擴增5天，再與不同E：T比率之MSCs一同培養4小時；圖6B及6C顯示將帶有左側股動脈阻斷的Balb/c小鼠，以i.m.注射方式，注入106 B6正常含氧的MSCs，該MSCs先與同型抗體或抗所指配體之抗體進行前處理30分鐘；其中圖6B提供於所指時間週期之血液灌流指標，以及圖6C提供藉由H.E.及梅生三色染色之肌肉損失區域及肌肉纖維化區域的定量測量結果；圖6D-6F提供以抗NKp46(D)、H2Kb(E)抗體之免疫螢光的統計結果、及抗H2Kb及CD31、H2Kb及α-SMA或H2Kb及肌間線蛋白(F)之雙重免疫螢光的統計結果(所示為經免疫染色之細胞密度，*p<0.05，**p<0.01 vs.同型IgG)。
圖7顯示人類MSCs培養於低氧環境下時，會降低人類NK配體之表現情形。於本發明中，將人類MSCs以5×103 MSCs/cm2 密度種入，並將一半之細胞分別於正常含氧環境或暴露在低氧環境下(1%O2 )連續培養48小時。以定量RT-PCR分析兩個NK配體(PVR及ULBP3)之mRNA量(**p<0.01 vs.同型Nor)。
圖8顯示相較於正常含氧(Nor)MSCs，缺氧及低氧MSCs(0%、1%、2.5%、7%氧環境)於異體接受小鼠中會降低NK累積情形，其中圖8A顯示H60c相較於GAPDH(10-4 )之相對表現情形；圖8B顯示nectin-2相較於GAPDH(10-4 )之相對表現情形；圖8C顯示Pvr相較於GAPDH(10-3 )之相對表現情形；圖8D顯示PVR相較於GAPDH(10-2 )之相對表現情形；及圖8E顯示ULBP3相較於GAPDH(10-3 )之相對表現情形(*p<0.05，**p<0.01 vs.Nor B6)。
除非另有定義，於本文中所使用之所有技術性及科學性術語，對於屬於本發明領域中具有通常技藝者而言與習知者具有相同意義。
除非文中有清楚指出，否則本文中所使用的「一(a)」、「一(an)」；「該(the)」單數形式包含複數形式。因此，例如當提及「一樣本」時，對於該領域具有通常技藝者可推知包含複數個該等樣本及其同等物。
本文所使用的「間葉幹細胞」或「MSCs」乙詞，亦可稱作「多能性基質細胞」或「多能性幹細胞」，係指該等幹細胞可分化成各種不同之細胞類型，包含間葉組織的細胞及非間葉組織的細胞，像是成骨細胞(骨細胞)、軟骨細胞、及脂肪細胞。該間葉幹細胞或MSCs可衍生自骨髓、或其他非骨髓組織，像是臍帶血、脂肪組織、成體的肌肉、臍帶或羊膜、脫落的嬰兒牙齒之牙髓等。於本發明中，該MSCs源自哺乳動物，較佳者單離自人類。
本文所使用的「低氧」乙詞係指一種低氧環境，其氧氣量低於周遭氧氣環境或低於傳統用於細胞培養技術之約20%-21%氧氣的氧氣環境。於本發明之一具體實施例中，該「低氧環境」係低於7%氧氣，較佳介於0%至約7%氧氣，更佳介於0%至約2.5%氧氣，以及尤佳約為1%氧氣。此外，本文所使用的「缺氧」乙詞係指一種氧環境係完全將氧氣排除(0%O2 )，其為一種低氧環境或少氧環境之極端環境。
本文所使用的「正常含氧」乙詞係指周遭氧氣環境約為20%-21%氧氣，其傳統上常用於細胞培養技術中。
本文所使用的「個體」乙詞係指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包含但不限於靈長類、有蹄類、犬類及貓類。
本發明意外地發現相較於培養在正常氧環境下(例如20%至21%)的MSCs，培養於低氧環境下的MSCs表現相對較低的NK配體。更意外的是，此種細胞成功地在小鼠模式中修復了肢幹缺血症且未引發移植的排斥反應，其對於使用異體細胞在細胞或移植的治療方法中長久以來的問題提供了一具潛力的解决方案。
因此，本發明提供一種適合移植至個體的細胞移植物，其為包含具有NK配體表現量減少的非天然生成的細胞。此處所提供的細胞移植物移植至個體時僅產生低排斥反應或不產生排斥反應。
「自然殺手細胞」或「NK細胞」為一種對於先天免疫系統十分重要的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞的角色類似於脊椎動物中後天免疫反應的細胞毒性T細胞。NK細胞對於病毒感染的細胞提供快速反應，且對於腫瘤形成亦有反應。免疫細胞典型地會偵測受感染細表面所呈現的MHC，並引起細胞激素的釋放以造成細胞裂解或細胞凋亡。NK細胞則有別於典型的免疫細胞，因其具有在無抗體或MHC存在下辨識處於壓力下的細胞(stressed cells)的能力，而能提供較為快速的免應反應。
本文所使用的「NK配體」乙詞是指任何可與NK激活受體交互作用的分子或物質，且其一旦交互作用，即可引發細胞毒性及淋巴因子(lymphokine)的釋放。根據本發明，NK激活受體的例子為DNAM1及NKG2D。可與該受體交互作用並用於本發明的NK配體包括，但不限於，H60c、nectin-2、PVR、ULBP3、其類似物及其組合。
H60c是一種具有二個細胞外區域的MHCI類分子，且其為NKG2D受體的配體。
Nectin-2或PVRL2(脊髓灰質炎病毒受體相關分子-2)，又稱為CD112(分化群112)，是一種具有兩個Ig類C2型區域及一個Ig類V型區域的第I型單次跨膜醣蛋白。該蛋白為黏附接界(adherens junctions)的一種細胞膜成分。該蛋白也作為某些突變株的疱疹病毒和偽狂犬病毒的入口，且參與該等病毒于細胞間的傳播。
PVR(或小鼠的Pvr)，又稱為CD155(分化群155)，是一種在免疫球蛋白超家族的人類第I型跨膜醣蛋白。由於其在靈長類中，參與細胞的脊髓灰質炎病毒的感染，故常稱為脊髓灰質炎病毒受體(Poliovirus Receptor，PVR)。CD155正常的細胞功能是在上皮細胞間建立細胞間的黏附接界。
ULBP3，又稱為NKG2D配體3(相對於NK細胞激活受體NKG2D)，是一種在人類中受壓力而引發的配體。
根據本發明，「表現量減少」用於NK配體的表現時將包含下列情况：非天然生成的細胞所表現的標記(NK配體)少於天然生成的細胞或在傳統培養技術下培養的細胞所表現者。舉例而言，「表現量減少」可能指人體內一細胞或培養於正常環境下的細胞的表現量的80%，較佳為60%，更佳為50%，再更佳為20%。應理解的是，該標記的表現可由任何本發明所屬技術領域中具有通常技藝者所知的任一技術而抑制。舉例而言，該表現可藉由基因干擾或删除而抑制或消除。在本發明的一具體實施例中，細胞被培養於低氧環境下(例如，介於0%至約7%氧氣)並於細胞密度達到一半或全滿時回復，使得其與正常氧量環境下(例如，含有20%至21%氧氣)培養的細胞相較，NK配體的表現量減少。在一本發明較佳的具體實施例中，該低氧環境為1%O2 。
本發明中不可預期地發現MSCs於任何密度下，無論是高密度或低密度皆可用於本發明的方法，此與揭露於US20110129918A1發明中所述的具可專利的特徵在於低密度10至4000 MSCs/cm2 不同。本發明的一實例中採用50細胞/cm2 密度。在另一實例中採用5×103 至104 細胞/cm2 。
本發明之實例中證實，相較於異體正常含氧之MSCs，異體低氧MSCs可改善於弱化的肢幹缺血之治療效果，以及該效果與自體低氧MSCs效果相似。根據本發明之異體低氧MSCs於具免疫力之接受小鼠中可增加移植能力，係藉由抑制NK配體之表現，像是於NK細胞上與DNAM1及NKG2D有關的配體，以及降低NK補充之誘發及細胞毒性。該等細胞成長為CD31+ 之內皮細胞及αSMA+ 及desmin+ 肌肉細胞，因而促進血管新生及抑制肌肉纖維化，此意指本發明之低氧MSCs係為本質上免疫豁免的，且可作為一「廣用之供給細胞」用於治療心血管疾病。
與造血幹細胞(HSCs)或其他骨髓移植物相似，已知MSCs在異體接受者體內亦會被NK所媒介的裂解反應所排斥；然而，本發明的低氧MSCs(其藉由將MSCs培養於低氧環境中而得)可降低NK配體的表現，以及抑制NK細胞的補充及細胞毒性，因而可增强存活的能力以及增强移植入異體接受者的組織中的能力。
於本發明中，用於細胞療法之本發明的異體低氧MSCs已於 一具免疫力動物模式中被測試過(可作為一臨床前研究)，結果顯示該異體低氧MSCs之治療潛力及免疫優點，像是用於治療嚴重的缺血性疾病。結果顯示本發明異體的缺氧MSCs仍保留早期幹細胞特性，維持正常的核型，且經移植後將不會形成腫瘤。因此，根據本發明將MSCs培養於低氧環境中，可被用於異體移植。
因此，另一方面，本發明提供一種製備當移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應的細胞移植物的方法，其包含將至少一種自捐贈者分離的細胞培養於介於0%至15%氧氣的低氧環境中，較佳介於0%至約7%氧氣，更佳介於0%至約2.5%氧氣。在本發明的一實例中，該低氧環境約為1%氧氣。
可理解的是，根據本發明用於細胞移植物的至少一種細胞可依據目標移植位置而決定。適合用於本發明的細胞包含，例如，各種可自我更新及分化的幹細胞。本發明的一較佳具體實施例是使用間質幹細胞(MSC)。根據本發明，至少基於下述的理由，低氧MSCs可作為其中一種用於治療性血管新生的細胞來源，以治療缺血性疾病：
(1)相較於成體骨髓或周邊血液之內皮前驅細胞之有限數量，本發明之細胞可提供無限量之具功能的內皮及肌肉細胞以用於臨床應用中。再者，該內皮細胞或前驅細胞通常具有有限的增生能力，因此，要增殖至足以進行移植的細胞數量仍是一難題；相反的，本發明之低氧MSCs具有可延伸的自我再生活性，且可無限制地增殖。
(2)相較於正常含氧之MSCs，本發明之低氧MSCs於活體內顯示低免疫原性，且對於免疫排斥反應之感受性較低。因此，本發明之低氧MSCs及其衍生物適於異體移植。目前試驗證實於低氧環境增殖之MSCs可降低NK配體之表現情形，以及抑制NK細胞的補充及細胞毒性，因而促進存活能力及增強移植入異體接受者之組織中的能力。
又一方面，本發明亦提供藉由上述方法所製備的細胞移植物。
實例
材料及方法
MSC單離、特徵及培養
MSCs係取自兩近交品系的小鼠：C57BL/6J(B6)及Balb/c。4-6週齡之公鼠係以頸椎脫臼法犧牲之。將股骨及脛骨移除，將所有結締組織清除乾淨，並將之置於5 mL之添加有1×青黴素/鏈黴素之α-MEM中，並置於冰上。將所有的脛骨及股骨末端處剪斷以暴露出骨髓，將之插入準備好之離心管，並於400g 離心1分鐘以收集骨髓。將沈澱物於3 mL完全培養基(CM：添加16.6%胎牛血清(FBS)之α-MEM、100U/mL青黴素、100 g/mL鏈黴素)中重新懸浮，並以一21號注射針，透過一70-μm之尼龍篩網進行過濾。將源自每一長骨之細胞置於10cm培養皿中內含40 mL CM。經24小時後，無貼附之細胞係以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)移除之，再加入10 mL之新鮮CM。經約2週培養後，附著細胞達到接近長滿狀況(第0代)，並以PBS清洗，接著以4 mL之0.25%胰蛋白酶/1 mM乙二胺四乙酸(EDTA；Invitrogen，Carlsbad，CA)於37℃作用2分鐘以分離之。接著將細胞以50 cells/cm2 密度種入CM中進行增殖，並每10天進行繼代一次(第1至4代)。用於本研究之細胞為第2至4代。進行低氧培養時，將細胞培養於一混合氣體中，該混合氣體係由94%N2 、5%CO2 及1%O2 所組成。為了維持低氧的混合氣體，使用帶有2個空氣感測器之培養箱，一個測量CO2 以及另一個測量O2 ；使用氮氣(N2 )輸送系統以達到及維持氧氣濃度，該氮氣係由一液體的氮氣桶或含有純氮氣之桶子生成之。若氧氣百分比升至高於所欲之程度，則氮氣會自動地注入系統中以替換掉過多的氧氣。
MSCs的特徵
為了分析細胞表面之典型的標記蛋白表現情形，以含有5 mM EDTA之PBS收穫MSCs。將細胞與FITC共軛結合的抗鼠Sca-1、CD11b、CD31、CD34及CD45、與PE共軛結合的抗鼠CD29、CD44、及CD105作用。匹配的同型抗體係作為控制組(Becton Dickinson,San Jose,CA)。準備10,000個被標記之細胞，以及使用FACScan流式細胞儀，及使用CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析之。為了進行活體外之成骨細胞分化及脂肪細胞分化，將細胞以104 /cm2 密度種入，並以成骨細胞誘導培養 基(OIM由添加10%FBS(Gibco)之α-MEM(Gibco,Carlsbad,CA)、10-8 M地塞米松(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10 mM β-磷酸甘油(Sigma-Aldrich)及50 μM抗壞血酯-2-磷酸鹽(Sigma-Aldrich)所組成)，及脂肪細胞誘導培養基(AIM由添加10%FBS之α-MEM、10-7 M地塞米松、50 μM引朵美洒辛(Sigma-Aldrich)、0.45 mM 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(Sigma-Aldrich)及10 μg/mL胰島素(Sigma-Aldrich)所組成)分別進行誘導3週。待分化之型態特徵出現後，將以OIM及AIM處理之細胞，分別以茜素紅S(ARS)及油紅O染色。為了將分化進行量化，分別將ARS及油紅O染劑萃取以進行於OD 550 nm及510 nm之光學測量。為了進行活體外之軟骨細胞分化，將2.5×105 細胞沈澱收集，並於軟骨細胞誘導培養基(CIM由添加10-7 M地塞米松之無血清α-MEM、1%(vol/vol)ITS、50 μM抗壞血酯-2-磷酸鹽、1 mM丙酮酸鈉、40 μg/mL(wt/vol)脯氨酸及10 ng/mL(wt/vol)TGF-β1(R&D systems，Minneapolis，MN)所組成)中連續培養3週。將以CIM誘導之細胞進行愛爾新藍染色。
缺血性肢幹模式
動物研究計畫係經國立陽明大學之動物中心委員會審閱及同意。於本試驗中係使用6週齡之Balb/c公鼠。使用麻醉劑(xylazine)及麻醉劑(ketamine)進行常規之麻醉，從膝蓋朝向大腿內側造成一皮膚切口，接著將皮下脂肪組織移除以顯現其下位於靠近腹股溝近端的股動脈。接著將股動脈於股中段進行雙重打結，並摘除長度5 mm之股動脈。經切除後立即將於100 μL PBS中之106 培養增殖後的MSCs注入(i.m.)後肢之股薄肌中。
肢幹灌流的評估
遂進行如先前研究所述之激光多普勒成像分析(Choi et al.，J Biol Chem. 2004；279(47)，49430-49438)。使用激光多普勒灌流成像(Moor Instruments,Devon,UK)以進行一連串之非侵入性之新血管形成之生理評估。小鼠係於治療後第0、3、7、14、21、及28天，藉由一連串之掃瞄以監測後肢之表面血流。該數位彩色編碼之影像係被進行分析以量化從膝關節至腳指間區域之血流量，計算平均灌流值。
免疫組織化學法及免疫螢光法
為了進行免疫組織化學法，將石蠟包埋之切片進行脫蠟，復水及藉由將切片置於Declere作用溶液(Cell Marque，Austin，TX)中，並置於微波爐中20分鐘，以使抗原復性。以3%過氧化氫阻斷內生性過氧化酶活性。殘留之酵素活性係以PBS清洗以移除之，並以Ultra V Block(Thermo Fisher Scientific，Fremont，CA)作用5分鐘將非專一性染色阻斷。接著將切片以一級抗體(抗CD31，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)於4℃進行隔夜反應，以PBS大量沖洗，再以相對應之生物素化的二級抗體(Vector Laboratories，Burlingame，CA)於室溫反應15分鐘，接著以卵白素-過氧化酶(LSAB Kit；Dako，Carpinteria，CA)處理之，接著進行二氨基聯苯胺染色。以Mayer's蘇木素進行對比染色。為了進行免疫螢光法，將切片以4%三聚甲醛固定之，並以一級抗體進行反應，再以含有0.1% Triton X-100之PBS大量沖洗之，再以相對應之DyLightTM 488或DyLightTM 594共軛結合的二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)作用之，接著以DAPI進行對比染色。使用螢光顯微鏡觀察免疫螢光。
定量RT-PCR
使用TRIzol作用劑(Invitrogen)單離細胞之總RNA，並將2 μg之總RNA於20 μL溶液中進行反轉錄，其中使用了3 μg之隨機引子及200 U之Superscript III RT(Invitrogen)。增幅反應係於總體積為25μL溶液中進行，該溶液中含有0.5 μM之引子、12.5 μL之LightCyclerTM -FastStart DNA Master SYBR green I(Roche Indianapolis,IN)及10 μL 1：20稀釋之cDNA。PCR反應係以LightCycler 480即時PCR系統進行之。每個mRNA表現情形係使用LightCycler 480軟體版本1.5.0(Roche)以進行量化，且該表現情形係經常態性基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正規化。引子對之序列係列於表1中。
NK細胞毒性試驗
為了藉由MACS純化NK細胞，將脾細胞培養於NK細胞單離套組中(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，並藉由自動MACS(Miltenyi Biotec)篩選細胞。NK細胞培養基係由含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI 1640所組成。將NK細胞置於含有或不含有1000 U/mL IL-2之NK細胞培養基中進行增殖5天。NK細胞對於MSC之細胞毒性活性係以Promega CytoTox 96非放射性細胞毒性試驗套組測量之，該套組係藉由測量乳酸脫氫酶(LDH)以測定細胞毒性，其中該LDH為一種穩定的胞內酵素，會於細胞裂解時釋放出來。將5×103 標的(T)細胞(MSC)與作用子(E)細胞(NK)以不同之E：T比率(12：1，6：1，3：1，1.5：1)作用4小時；經作用後，收集上清液並與受質混合物作用30分鐘。接著加入1 M醋酸以停止反應。進行每一個E：T之比率之三重複試驗以測量實驗性之LDH的釋放。作用子細胞於不存在標的細胞時，測量作用子之自發性LDH釋放程度。標的細胞於不存在作用子細胞時，測量標的自發性LDH釋放程度。藉由加入裂解溶液(0.9%(v/v)Triton X-100)以測定標的最大化之LDH釋放程度。LDH釋放的量遂以讀盤機(Bio-Rad Model 3550-UV) 測量之，以及對於每一種E：T比率之細胞毒性百分比係根據公式：細胞毒性(%)=100%×[(實驗性-作用子自發性-標的自發性)/(標的最大化-標的自發性)]以計算之。
統計分析
所有之數值係以平均值±SD表示之。兩組間之比較遂以學生t -檢定分析之。p<0.05被認為具統計上之顯著性。
結果
間葉幹細胞培養於低氧及缺氧環境下之特徵
單離自B6及Balb/c小鼠之MSCs，並於低氧(1%O2 )及正常含氧環境(空氣，等同20-21%O2 )培養，再以流式細胞分析其特徵，並於第3代進行分化試驗。無論源自B6或Balb/c之低氧及正常含氧之MSCs，皆會表現MSCs標記物包含Sca1、CD29、CD44、CD105，但不會表現造血細胞之標記物，像是CD11b、CD34及CD45，以及不會表現內脾細胞標記物，像是CD31(圖1A及1B)。再者，無論源自B6或Balb/c之低氧及正常含氧之MSCs皆持有相似的分化能力，可分化為成骨細胞系、脂肪生成細胞系及軟骨生成細胞系(圖1C)。該等資料顯示於早期代次之低氧及正常含氧之MSCs之間，於表面蛋白表現圖譜及分化潛力上並無明顯不同。
相較於正常含氧之MSCs，異體移植低氧MSCs可增加肢幹缺血性的改善程度
MSCs之血管新生潛力係於後肢缺血的Balb/c老鼠模式評估之。為了證明異體MSCs對於缺血性肢幹療法之潛力，將Balb/c小鼠之右側股動脈打結，並切斷5 mm，接著以肌肉注射方式，無注入細胞(控制組，僅有PBS)、注入低氧B6或正常含氧MSCs(異體的)、注入Balb/c低氧或正常含氧MSCs(自體的)或注入Balb/c低氧的老鼠胚胎纖維母細胞(non-MSC)。經注射治療後之第1-2週，控制組顯示於缺血性後肢出現廣泛的細胞壞死，係導致由於自動截斷之後肢損失。於第4週時顯示，控制組8隻動物中有七隻肢幹損失(87.5%)及一隻肢幹壞死(12.5%)(圖2A)。相似地，該非MSC組(MEF Balb/c)於6隻小鼠中有5隻肢幹損失(83.3%) 及1隻肢幹壞死(16.7%)(圖2A)。所有接受源自B6之低氧MSCs或源自Balb/c之低氧或正常含氧MSCs之小鼠，展現出肢幹修復(70%，10隻Balb/c中之7隻；70%，10隻B6中之7隻)或肢幹壞死(30%，10隻Balb/c中之3隻；30%，10隻B6中之3隻)，而僅有兩隻接受源自B6的正常含氧MSCs之小鼠展現肢幹修復(20%，10隻中有2隻)、三隻有肢幹壞死(30%，10隻中有3隻)以及五隻損失其肢幹(50%，10隻中有5隻)(圖2A)。
藉由激光多普勒灌流成像分析以評估血液灌流，進一步顯示，相較於無細胞控制組或接受非MSCs之小鼠而言，接受源自無論是Balb/c或B6低氧或正常含氧MSCs之小鼠，可於移植後1週增加灌流(圖2B)。相較於該等接受源自B6正常含氧MSCs之小鼠而言，接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常含氧MSCs之小鼠，可於移植2週後增加灌流(圖2B)。再者，經移植後第4週，對於接受源自B6低氧MSCs、及源自Balb/c低氧或正常含氧MSCs之小鼠，其受傷肢幹相較於正常肢幹之相對血液流速比率分別為0.926±0.076、0.972±0.021及0.927±0.059；而接受源自B6正常含氧MSCs、非MSC及無細胞移植之小鼠，該比率分別為0.602±0.080、0.294±0.029及0.370±0.012(圖2B)。該等數據顯示以源自異體供給者之低氧MSCs或源自自體供給者之低氧及正常含氧MSCs進行缺血性肢幹的移植，可恢復至接近正常的灌流，然而該等以源自異體供給者之正常含氧MSCs進行移植者，仍然具有顯著地肢幹灌流缺損。
低氧MSCs可降低肌肉退化及纖維化，且增加缺血性肢幹的血管新生
以蘇木素及伊紅(H&E)進行股薄肌染色的組織分析，該經創造肢幹缺血之股薄肌，於第4週恢復，顯示了接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常含氧MSCs之小鼠可維持正常肌肉的圖像而無肌纖維之損失，然而該等接受源自B6正常含氧MSCs之小鼠仍經歷帶有部分纖維損失之肌肉萎縮。然而，接受無細胞移植或非MSC移植之小鼠，具有明顯地肌肉纖維損失及伴隨脂肪退化之萎縮。於試驗樣本中，測量非肌肉區域相對於總區域之比例以量化肌肉之損失，吾人發現肌肉損失之比率，對於接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常含氧MSCs之小鼠， 分別為3.32±1.36%、3.62±1.01%及3.35±3.04%；然而，對於接受源自B6正常含氧MSCs、非MSC及無細胞移植之小鼠而言，則比率分別為44.91±1.16%、53.68±5.95%及62.33±2.73%(圖3A)。相似地，梅生三色染色法顯示接受源自B6低氧MSCs(0.016±0.006%)、源自Balb/c低氧(0.029±0.014%)或正常含氧(0.28±0.14%)MSCs之小鼠，顯示無肌肉纖維化；然而，該等接受源自B6正常含氧MSCs之小鼠(9.39±1.07%)仍經歷部分肌肉纖維化(圖3B)。然而，接受非MSC(22.93±3.99%)或無細胞移植(30.14±11.59%)之小鼠顯示顯著地肌肉纖維化(圖3B)。以抗CD31之抗體進行之免疫組織化學染色顯示，相較於該等接受源自B6正常含氧MSCs(84±11/mm2 )、非MSC(56±10/mm2 )、或無細胞移植(60±9/mm2 )之小鼠，接受源自B6低氧MSCs(173±12/mm2 )、或源自Balb/c低氧(189±28/mm2 )或正常含氧(158±12/mm2 )MSCs之小鼠，具顯著地增強的CD31+之微管密度(圖3C)。該等數據證實異體MSC移植對於肌肉再生之療效，以及於低氧環境培養之MSCs，對於血管新生形成亦顯著地增強。
經移植後之低氧MSCs存活及移植
BrdU追蹤系統係用於長期移植之追蹤，經移植後第4週之缺血性組織顯示，相較於源自B6正常含氧MSCs(66±45/mm2 )，源自B6低氧MSCs(633±72/mm2 )、源自Balb/c低氧(566±71/mm2 )或正常含氧(620±37/mm2 )之MSCs大幅度增加存在量(圖4A)。BrdU及CD31之雙重免疫螢光顯示部分BrdU+細胞可於帶有紅血球之CD31+血管內腔中被觀察到(圖4B)，指出部分移植細胞係被整合入新生血管中，且確實具功能且幫助血液灌流。BrdU及α-平滑肌之肌動蛋白(α-SMA)或肌間線蛋白(圖4C及4D)之雙重免疫螢光顯示於缺血性區域，部分BrdU+細胞同時也是α-SMA或肌間線蛋白陽性，暗示部分移植的細胞分化成肌肉組織。BrdU+/CD31+細胞之密度，對於Hyp B6為95±5/mm2 、對於Hyp Balb/c為95±17/mm2 、對於Nor Balb/c為100±9/mm2 以及對於Nor B6為5±1/mm2 ；BrdU+/α-SMA+之密度，對於Hyp B6為205±40/mm2 、對於Hyp Balb/c為215±34/mm2 、對於Nor Balb/c為210±35/mm2 以及對於Nor B6為6±5/mm2 ；而BrdU+/肌間線蛋白+細胞之密度，對於Hyp B6為180±24/mm2 、對於Hyp Balb/c為175±11/mm2 、對於Nor Balb/c為185±21/mm2 以及對於Nor B6為10±6/mm2 。該等結果顯示經移植後之低氧MSCs可存活，並移植入老鼠組織內，並接著於缺血性肌肉中誘導出血管及肌肉網絡。
於異體接受者體內，低氧MSCs可降低NK累積
於移植後第28天及第7天，分別使用抗NKp46及抗DX5抗體以辨識NK細胞。當該缺血性肌肉組織以培養於正常含氧環境之異體MSCs(Nor B6)注入後，會累積NKp46+及DX5+NK細胞；而該等注入無論是自體的MSCs(Nor Balb/c及Hyp Balb/c)或於低氧環境培養之異體的MSCs(Hyp B6)皆顯著地降低NKp46+或DX5+NK細胞之累積(圖5A)。然而，以抗CD8、CD4、CD14、CD86或TCRαβ抗體之免疫螢光顯示，無論源自B6或Balb/c低氧及正常含氧MSCs不會累積CD8+或CD4+T細胞、CD14+巨噬細胞、CD86+樹突細胞或NKT細胞(圖5B)，指出於異體接受者體內，NK累積可能參與消滅正常含氧MSCs之機制。為了證明此點，吾人評估於伴隨有及沒有NK排空之異體接受者體內，移植後之正常含氧MSCs於改善肢幹缺血之效果。於異體接受者體內，NK排空可藉由將抗NK1.1或asialo GM1之中和抗體一同注入，以大幅度改善正常含氧MSCs所媒介之肢幹缺血情形(圖5C)。該等數據顯示經移植後，NK媒介之裂解與異體MSCs之排斥有關。
低氧MSCs降低NK活化及NK裂解之配體的表現情形
定量RT-PCR分析顯示低氧MSCs可降低NK配體之表現情形，如H60c、nectin-2、Pvr及Rae1(圖5D)，該等配體對於NK累積及活化相當重要，或已知為抗造血前驅細胞之NK，儘管Rae1的量於低氧及缺氧MSCs中皆很低。再者，於源自長期低氧環境之MSCs，其降低該等配體表現情形，亦可於經低氧培養48小時之MSCs中觀察到(圖5E)。低氧培養不僅抑制該等配體之表現，亦抑制NK媒介之裂解。如圖5F所示，NK僅誘導0.25%及0.44%之低氧MSCs的裂解，相較於分別於沒有/有IL-2存在時，可誘導52.84%及84.15%之正常含氧MSCs之裂解。
將正常含氧MSCs以抗NK配體之抗體前處理，可阻斷NK裂解及增加改善肢幹缺血之能力
以上數據可有力支持NK配體涉及異體正常含氧MSCs之NK裂解的過程。若能瞭解於MSCs將NK配體阻斷或排空供NK配體之宿主受體，是否可阻斷NK媒介之異體正常含氧MSCs之裂解，而藉此促進異體正常含氧MSCs於增強血管新生及於缺血性肢幹預防截肢之能力，將會十分有趣。因此，吾人將正常含氧之B6 MSCs先以抗H60c、nectin-2、Pvr或Rae1之抗體進行中和30分鐘，或以DNAM1或NKG2D阻斷抗體前處理NK，接著分析MSCs對於NK媒介之裂解的反應。相較於以同型IgG前處理或抗Rae1抗體前處理者，以抗H60c、nectin-2、或Pvr中和抗體前處理正常含氧之MSCs，可降低NK裂解反應(圖6A)。同樣地，將NK細胞以抗DNAM1或抗NKG2D之抗體前處理，亦會降低裂解能力(圖6A)。相較於該等以同型IgG進行前處理者，將正常含氧MSCs以抗H60c、nectin-2、Pvr之中和抗體前處理，或與抗DNAM1或NKG2D之中和抗體一同注入，可提高增強的血液灌流之能力(圖6B)及恢復肢幹結構的能力(圖6C)。相反的，將低氧MSCs以該等阻斷抗體前處理或一同注入，則不會進一步提高增強的血液灌流能力(圖6B)。有趣的是，吾人發現相較於以同型IgG進行前處理，以正常含氧MSCs進行異體移植所誘導之NK累積，會藉由以抗H60c、nectin-2或Pvr之中和抗體前處理，或以抗DNAM1或NKG2D之抗體一同注入以抑制該NK之累積(圖6D)。再者，吾人發現相較於以同型IgG進行前處理者，於異體接受者中，若能以抗H60c、nectin-2、或Pvr之中和抗體前處理，或以抗DNAM1或NKG2D之抗體一同注入，可增強正常含氧MSCs移植入CD31+ 、α-SMA+ 及肌間線蛋白+ 細胞的能力(圖6E及6F)。該等數據顯示NK配體大幅度涉入MSCs之NK媒介的裂解反應，且經異體移植正常含氧MSCs後會使得血液灌流增強失敗。
為了將目前老鼠之發現應用至將來人類的臨床使用上，吾人比較了，於無伴隨及伴隨暴露於低氧環境之人類MSCs的人類NK配體表現。吾人發現人類MSCs培養於正常含氧環境下，會顯著表現NK配體之mRNA量，該配體像是PVR(人類DNAM-1配體)及ULBP3(人類NKG2D配體)，當人類MSCs短期暴露於低氧(1%O2 )會抑制該等配體之表現(圖7A)。相同地，異體NK細胞媒介之裂解僅於人類正常含氧MSCs中觀察到， 而沒有於人類低氧MSCs中觀察到，該裂解可以抗PVR或ULBP3之抗體將MSCs進行前處理，或以抗DNAM1及NKG2D之抗體前處理NK細胞以阻斷之(圖7B及7C)。以上數據顯示於老鼠模式所觀察到之發現可於將來應用於人類之臨床應用上。
於人類MSCs及老鼠MSCs短期暴露至低氧環境可降低NK配體之表現
人類及B6老鼠之MSCs被用於此試驗中。將人類及老鼠之MSCs於正常含氧環境(21%O2 )下增殖數週。將該等細胞重新以之5×103 至104 cells/cm2 密度種下，並移至低氧環境，其氧濃度為0%、1%、2.5%、及7%(相較於US20110129918A1所使用者為10至4000 MSCs/cm2 之低密度)。為了要維持低氧氣體混合物，係使用帶有2個氣體感測器之培養箱，其中之一用於感測CO2 ，另一個用於感測O2 ；使用氮氣(N2 )輸送系統以達到及維持氧氣濃度，該氮氣係由一液體的氮氣桶或含有純氮氣之桶子生成之。若氧氣百分比升至高於所欲之程度，則氮氣會自動地注入系統中以替換掉過多的氧氣。將細胞培養2天後。使用TRIzol作用劑(Invitrogen)單離細胞之總RNA，並將2 μg之總RNA於20 μL溶液中進行反轉錄，其中使用了3 μg之隨機引子及200 U之Superscript III RT(Invitrogen)。增幅反應係於總體積為25μL溶液中進行，該溶液中含有0.5 μM之引子、12.5 μL之LightCyclerTM -FastStart DNA Master SYBR green I(Roche Indianapolis，IN)及10 μL 1：20稀釋之cDNA。PCR反應係以LightCycler 480即時PCR系統進行之。每個mRNA表現情形係使用LightCycler 480軟體版本1.5.0(Roche)以進行量化，且該表現情形係經常態性基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正規化。
於正常含氧環境下增殖老鼠MSCs，會表現高度的NK DNAM-1配體、Pvr及nectin-2、及NKG2D配體、H60c。此外，結果亦顯示短期暴露於低氧環境2天，其中氧氣濃度約為0 to 7%，可顯著降低H60c、nectin-2及Pvr之表現(圖8A、8B及8C)。相似地，於正常含氧環境下增殖人類MSCs，會表現高度的NK DNAM-1配體、PVR及NKG2D配體、ULBP3；當短期暴露於低氧環境2天，其中氧氣濃度約為0 to 7%， 可顯著降低PVR及ULBP3之表現(圖8D、及8E)。該等結果顯示短期暴露MSCs於低氧環境可降低NK配體之表現情形。
總結言之，本發明之異體低氧MSC療法已於具免疫力之動物模式中測試過，可作為一前臨床研究，且證實其醫療潛力及免疫優點，像是用於治療嚴重的缺血性疾病。結果顯示將MSCs培養於低氧環境可用於異體的移植。
<110> 台北榮民總醫院
<120> 異體細胞移植物之製備
<130> IV0188/HSC0001TW
<150> 61/583,367
<151> 2012-01-05
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
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<223> GAPDH R
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Claims (7)

  1. 一種降低以間質幹細胞(MSC)所製備的細胞移植物之NK配體表現量的方法，其包含將間質幹細胞培養於介於0%至約7%氧氣的低氧環境下，其中該NK配體是選自由H60c、nectin-2、PVR、ULBP3、Rae1及其組合所組成的群組中的一者。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞移植物當其移植至個體時引發低排斥反應或不引發排斥反應。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該低氧環境介於0%至約2.5%。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該低氧環境為約1%。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞移植物為異體細胞移植物。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述的間質幹細胞保留早期幹細胞特性、維持正常之核型且於移植後不會形成腫瘤。
  7. 一種如申請專利範圍第1-6項中任一項方法所製備之細胞移植物用於製備治療肢幹缺血症藥物之用途。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI723977B (zh) * 2015-02-20 2021-04-11 國立陽明大學 間質幹細胞於治療骨關節炎之用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201118172A (en) * 2009-11-30 2011-06-01 Univ Nat Yang Ming Method for expanding mesenchymal stem cells in low-density and hypoxic culture

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2244554A1 (en) * 1998-07-30 2000-01-30 Vasogen Inc. Inhibition of graft versus host disease
CA2465672A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-27 Henry Ford Health System Cardiac transplantation of stem cells for the treatment of heart failure
JPWO2005097204A1 (ja) * 2004-04-09 2008-02-28 武田薬品工業株式会社 癌の予防・治療剤
WO2005104766A2 (en) * 2004-04-28 2005-11-10 Myocardial Therapeutics, Inc. Injection of bone marrow-derived conditioned medium for angiogenesis
US20070264712A1 (en) 2006-01-10 2007-11-15 Theradigm, Inc. Expansion and differentiation of neural stem cells under low oxygen conditions
WO2010150094A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-29 Life & Light Limited Mesenchymal stem cells grown under hypoxic conditions: compositions, methods and uses therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201118172A (en) * 2009-11-30 2011-06-01 Univ Nat Yang Ming Method for expanding mesenchymal stem cells in low-density and hypoxic culture

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
洪士杰，在低氧環境下增殖骨髓間葉幹細胞以作為臨床治療-醫療技術創新獎得獎內容，台北榮總學訊，第8-13頁，2011年1月 *

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