CN103194426B - 细胞移植物的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种适合供移植或细胞治疗的细胞移植物及其供治疗疾病的用途。具体而言，此处所提供的移植物能克服当移植至一病患时所伴随的排斥反应，其对于使用异体细胞的情况由于有益。本发明还进一步提供一种通过在低氧或无氧环境下培养至少一种细胞而制备所述移植物的方法。

Description

细胞移植物的制备
技术领域
本发明关于一种供制备“异体细胞-制备-组织工程”移植物的方法及通过该方法所制备的产物。
背景技术
间叶干细胞(MSCs)，亦称为多能性基质细胞，此类细胞已知可自我再生并分化成各种不同的间叶及非间叶组织，并且于临床应用上已成为前景可期的工具，例如成骨不全症的细胞疗法(Horwitzetal.,NatMed5,309-313,1999)；软骨及骨骼的组织工程(Caplan，TissueEng11，1198-1211，2005)；以及预防有害的心脏重塑及改善恢复率的心脏疗法(PittengerandMartin，CircRes95，9-20，2004)。
使用源自单一健康的供给细胞的MSCs所制备的“现成”产品，在患有移植物对抗宿主疾病及克隆氏症的病患中，已在两个第III期研究中证实了其安全性(http://www.clinicaltrails.gov/)。再者，对于急性心肌梗塞病患施予异体MSCs也被报导可改善射出率(EFs)(HareJM，etal.，JAmCollCardiol.54(24)：2277-2286，2009)。因此，在治疗患有心血管疾病的病患时，源自健康供给者的异体MSCs，可作为一“广用的供给细胞”。人类、狒狒、及鼠类的MSCs的免疫抑制特性也在活体外及活体内被报导，其中对于具免疫力的狒狒，将异体MSCs应用于延长皮肤异体移植物的存活率(Bartholomewetal.，ExpHematol.30(1)：42-48，2002)，以及对于人类应用于减缓移植物对抗宿主疾病(LeBlancetal.，Lancet.363(9419)：1439-1441，2004)。然而，许多研究证实MSCs本质上并非免疫豁免的，且于具免疫力的MHC不匹配的接受者会对于异体MSCs产生排斥反应(Nautaetal，Blood108(6)：2114-2120，2006；Spaggiarietal.，Blood.107(4):1484-1490，2006；Eliopoulosetal.，Blood106(13)：4057-4065，2005)。因此，使用MSCs进行异体移植仍充满争议性。
将MSCs于低氧环境下培养，称作低氧MSCs。相较于培养于正常氧环境下(约为20-21％O2)的MSCs(称作正常氧的MSCs)，低氧MSCs会分泌更多的血管新生细胞激素及生长因子(Hungetal.，StemCells25(9)：2363-2370，2007)，并且该源自低氧MSCs的条件培养基可被用于刺激伤口的治愈(Yewetal.，CellTransplant.，011)及骨折的治愈(Wangetal.，JTissueEngRegenMed.，2011)。
此外，Savant-Bhonsale及Smita揭露一种以低氧环境(介于约2.5％至约5％的氧气(O2))促进神经干细胞(NSCs)生长的方法及组合物，该低氧环境较传统细胞培养技术培养环境的含氧量低(US20070264712A1)。据Hung等人报导，MSCs于含0.05％至15％O2的低密度及低氧环境下培养(较佳介于约1％至约7％的氧气)，在此被称为低氧及低密度的MSCs(10至4000MSCs/cm2)。相较于正常氧的MSCs，低氧及低密度的MSCs可降低复制性衰老、增加增生率及分化潜能(US20110129918A1)。再者，当将该低氧MSCs移植入免疫缺陷小鼠的颅盖缺陷处，该等低氧MSCs可促进缺陷的修复。经移植后，低氧及低密度MSCs也可促进细胞的迁移及移植至远程(Hungetal.，PLoSOne.25)：e416，2007)。然而，对于如何解决排斥的问题仍尚未被提及。
发明内容
本发明关于一种通过将细胞培养于低氧或缺氧环境下降低异体细胞的排斥反应的新颖方法。
在一方面，本发明提供一种适合移植至个体的细胞移植物，其为包含具有NK配体表达量减少的非天然生成的细胞。
另一方面，本发明提供一种制备当移植至个体时引发低排斥反应或不引发排斥反应的细胞移植物的方法，其包含将至少一种自捐赠者分离的细胞培养于介于0％至约7％氧气的低氧环境下。
于本发明一优选具体实施例中，该低氧环境介于0％至约2.5％的氧气。在本发明的一实施例中，该低氧环境为约1％的氧气。
另一方面，本发明也提供一种通过上述方法所制备的细胞移植物。根据本发明，所得细胞移植物仍保留早期干细胞特性、维持正常的核型、且经移植后不会形成肿瘤。
附图说明
阅读本发明时参考所附附图以及具体实施方式将可更加了解前述的内容。在附图中所呈现的具体实施例为优选的示例，仅供说明本发明的目的。应该理解的是，本发明不受所述的具体实施例所局限。
附图：
图1A-图1C提供正常氧(Nor)及低氧(Hyp)间叶干细胞(MSCs)的特性，其中源自B6(图1A)及Balb/c(图1B)的MSCs以表面标记物的表达现象特征化；及(图1C)显示源自两种老鼠品系的MSCs对于成骨性细胞系的诱导(21天)、脂肪形成细胞系的诱导(21天)及软骨细胞系的诱导(21天)的分化能力，该分析是分别以茜素红S、油红O、及爱尔新蓝染色法分析(比例尺＝50μm)。茜素红S、油红O、及爱尔新蓝染色的定量分析分别于550nm、510nm波长以光学密度测量及阳性区域测量。
图2A-图2B提供在异体的及自体的移植中，低氧MSCs对于改善肢干缺血的效用，其中将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠以i.m.注射方式，在股薄肌中无注入(无细胞)或注入1×106正常氧B6MSCs(NorB6；异体的)、低氧B6MSCs(HypB6；异体的)、正常氧Balb/cMSCs(NorBalb/c；自体的)、低氧Balb/cMSCs(HypBalb/c；自体的)、或Balb/c小鼠胚胎的纤维母细胞(MEFBalb/c)。图2A摘要在第28天所述动物的肢干状况；以及图2B显示不同时间周期的血液灌流指针(**p<0.01vs.Nocell，##p<0.01vs.NorB6)。
图3A-图3C提供低氧MSCs对于减少肌肉退化及纤维化，以及增加缺血肢干的血液灌流量的功效，其中图3A显示，通过HE染色所测量的肌肉损失区域的定量分析；图3B显示，通过梅生三色染色的肌肉纤维化区域的定量测量；以及图3C显示，以抗CD31抗体进行的免疫组织化学法，测量第28天缺血性肢干样本的CD31+微管密度的定量分析(*p<0.05及**p<0.01vs.Nocell，#p<0.05及##p<0.01vs.NorB6)。
图4A-图4D显示经移植后的28天，低氧MSCs存活情形，其中将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠以i.m.注射方式，在股薄肌中无注入(Nocell)或注入1×106与BrdU结合的正常氧B6MSCs(NorB6；异体的)、低氧B6MSCs(HypB6；异体的)、正常氧Balb/cMSCs(NorBalb/c)、或低氧Balb/cMSCs(HypBalb/c；自体的)；在28天后采收缺血性肢干的样本，其中图4A显示使用抗BrdU抗体的免疫荧光染色；以及图4B-4D分别显示使用抗BrdU及CD31(图4B)、α-平滑肌肌动蛋白(图4C)、及肌间线蛋白(desmin)(图4D)的双重免疫荧光染色。
图5A-图5F显示低氧MSCs降低供NK活化及NK所媒介的裂解的配体表达，其中图5A显示以抗NKp46抗体分析第28天(左图)及以抗DX5抗体分析第7天缺血性肢干样本(右图)的免疫荧光染色的统计结果，其中该缺血性肢干样本是源自将小鼠注入106B6正常氧MSCs(NorB6)、B6低氧(HypB6)、Balb/c正常氧MSCs(NorBalb/c)、或Balb/c低氧MSCs(HypBalb/c)(**p<0.01vs.NorB6)；图5B显示以抗CD4、CD8、CD14、CD86、或TCRαβ抗体分析第7天缺血性肢干样本的免疫荧光染色的统计结果，其中该缺血性肢干样本是源自将小鼠注入106B6正常氧MSCs(NorB6)、B6低氧(HypB6)、Balb/c正常氧MSCs(NorBalb/c)、或Balb/c低氧MSCs(HypBalb/c)(**p<0.01vs.NorB6)；图5C显示肢干状况(上图)及所指时间周期的血液灌流比率(下图)，其中带有阻断的左侧股动脉的Balb/c小鼠，在第28天经以106B6正常氧MSCs及左图所指的抗体一同注入小鼠中，以及带有阻断的左侧股动脉的B6小鼠，于第28天经以106Balb/c正常氧MSCs及右图所指的抗体一同注入小鼠中；图5D显示于所指细胞中H60c相对于GAPDH(10-4)、nectin-2相对于GAPDH(10-4)、Pvr相对于GAPDH(10-3)、及Rae1相对于GAPDH(10-4)的mRNA量的定量RT-PCR分析结果(**p<0.01vs.NorB6、##p<0.01vs.NorBalb/c)；以及图5E显示于B6及Balb/cMSCs中H60c、nectin-2、Pvr、及Rae1的mRNA量的定量RT-PCR分析结果，其中该等细胞是以104/cm2密度培养并接触低氧环境(1％O2)48小时(**p<0.01vs.0h)；以及图5F显示经共同培养4小时后，NK细胞对于不同E:T比率的MSCs的细胞毒性活性，其中在将NK细胞与MSCs共同培养前，先将NK细胞扩增5天且未与(左图)或与(右图)IL-2处理。
图6A-图6F显示正常氧的B6MSCs及抗NK配体抗体的抗体中和反应，以抑制NK媒介的裂解及改善其增强血液灌流的效果，以及恢复缺血性肢干的肌肉结构，其中图6A显示NK细胞的细胞毒性活性，其中先将其与IL-2培养扩增5天，再与不同E:T比率的MSCs一同培养4小时；图6B及6C显示将带有左侧股动脉阻断的Balb/c小鼠，以i.m.注射方式，注入106B6正常氧的MSCs，该MSCs先与同型抗体或抗所指配体的抗体进行前处理30分钟；其中图6B提供于所指时间周期的血液灌流指针，以及图6C提供通过H.E.及梅生三色染色的肌肉损失区域及肌肉纤维化区域的定量测量结果；图6D-6F提供以抗NKp46(D)、H2Kb(E)抗体的免疫荧光的统计结果、及抗H2Kb及CD31、H2Kb及α-SMA或H2Kb及肌间线蛋白(F)的双重免疫荧光的统计结果(所示为经免疫染色的细胞密度，*p<0.05，**p<0.01vs.同型IgG)。
图7A-图7C显示人类MSCs培养于低氧环境下时，会降低人类NK配体的表达现象。在本发明中，将人类MSCs以5×103MSCs/cm2密度种入，并将一半的细胞分别于正常氧环境或暴露在低氧环境下(1％O2)连续培养48小时。以定量RT-PCR分析两个NK配体(PVR及ULBP3)的mRNA量(**p<0.01vs.同型Nor)。
图8A-E显示相较于正常氧(Nor)MSCs，缺氧及低氧MSCs(0％、1％、2.5％、7％氧环境)于异体接受小鼠中会降低NK累积现象，其中图8A显示H60c相较于GAPDH(10-4)的相对表达现象；图8B显示nectin-2相较于GAPDH(10-4)的相对表达现象；图8C显示Pvr相较于GAPDH(10-3)的相对表达现象；图8D显示PVR相较于GAPDH(10-2)的相对表达现象；及图8E显示ULBP3相较于GAPDH(10-3)的相对表达现象(*p<0.05，**p<0.01vs.NorB6)。
具体实施方式
除非另有定义，在说明书中所使用的所有技术性及科学性术语，对于本技术领域技术人员具有相同意义。
除非文中有清楚指出，否则本文中所使用的“一”；“该”单数形式包含复数形式。因此，例如当提及“一样本”时，对于所属领域技术人员可推知包含复数个该等样本及其同等物。
本发明所使用的“间叶干细胞”或“MSCs”乙词，也可称作“多能性基质细胞”或“多能性干细胞”，是指该等干细胞可分化成各种不同的细胞类型，包含间叶组织的细胞及非间叶组织的细胞，像是成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)、及脂肪细胞(脂肪细胞)。该间叶干细胞或MSCs可衍生自骨髓、或其它非骨髓组织，像是脐带血、脂肪组织、成体的肌肉、脐带或羊膜、脱落的婴儿牙齿的牙髓等。在本发明中，该MSCs源自哺乳动物，优选为分离自人类。
本文所使用的“低氧”一词是指一种低氧环境，其氧气量低于周遭氧气环境或低于传统用于细胞培养技术的氧气环境(约20％-21％氧气)。在本发明的一具体实施例中，该“低氧环境”是低于7％氧气，优选介于0％至约7％氧气，更优选介于0％至约2.5％氧气，以及进一步优选约为1％氧气。此外，本文所使用的“缺氧”一词是指一种完全将氧气排除(0％O2)的含氧环境系，其为一种低氧环境或少氧环境的极端环境。
本发明所使用的“正常氧”一词是指周遭氧气环境约为20％-21％氧气，其传统上常用于细胞培养技术中。
本发明所使用的“个体”一词是指人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包含但不限于灵长类、有蹄类、犬类及猫类。
本发明意外地发现相较于培养于正常氧环境下(例如介于20％至20％)的MSCs，培养于低氧环境下的MSCs能表达相对较低的NK配体。更意外的是，此种细胞成功地在小鼠模式中修复了肢干缺血症且未引发移植的排斥反应，其对于使用异体细胞于细胞或移植的治疗方法所引起的长久以来的问题提供了一种具有潜力的解决方案。
因此，本发明提供一种适合移植至个体的细胞移植物，其为包含具有NK配体表达量减少的非天然生成的细胞。此处所提供的细胞移植物移植至个体时可产生低排斥反应或不产生排斥反应。
“自然杀手细胞”或“NK细胞”为一种对于先天免疫系统十分重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞的角色类似于脊椎动物中后天免疫反应的细胞毒性T细胞。NK细胞对于病毒感染的细胞提供快速反应，且对于肿瘤形成也有反应。免疫细胞典型地会侦测受感染细表面所呈现的MHC，并引起细胞激素的释放以造成细胞裂解或细胞凋亡。NK细胞则有别于典型的免疫细胞，因其具有在无抗体或MHC存在下辨识受压细胞的能力，而能提供较为快速的免疫反应。
本文所使用的“NK配体”一词是指任何可与NK激活受体交互作用的分子或物质，且其一旦交互作用，即可引发细胞毒性及淋巴激因子的释放。根据本发明，NK激活受体的例子为DNAM1及NKG2D。可与该受体交互作用并用于本发明的NK配体包括，但不限于，H60c、nectin-2PVR、ULBP3、其类似物及其组合。
H60c是一种具有二个细胞外区域的MHCI类分子，且其为NKG2D受体的配体。
Nectin-2或PVRL2(脊髓灰质炎病毒受体相关分子-2)，又称为CD112(分化群112)，是一种具有两个Ig类C2型区域及一个Ig类V型区域的第I型单次跨膜醣蛋白。该蛋白为黏合连接(adherensjunctions)的一种细胞膜成分。该蛋白也作为某些突变株的疱疹病毒和伪狂犬病毒的入口，且参与此类病毒在细胞间的传播。
PVR(或小鼠的Pvr)，又称为CD155(分化群155)，是一种在免疫球蛋白超家族的人类第I型跨膜醣蛋白。由于其在灵长类中，参与细胞的脊髓灰质炎病毒的感染，故常称为脊髓灰质炎病毒受体(PoliovirusReceptor，PVR)。CD155正常的细胞功能是在上皮细胞间建立细胞间的黏合连接。
ULBP3，又称为NKG2D配体3(相对于NK细胞激活受体NKG2D)，是一种在人类中受压力而引发的配体。
根据本发明，“表达量减少”用于NK配体的表达时将包含下列情况：非天然生成的细胞所表达的标记(NK配体)少于天然生成的细胞或于传统培养技术下培养的细胞所表达者。举例而言，“表达量减少”可能指人体内一细胞或培养于正常环境下的细胞的表达量的80％，较佳为60％，还要更佳为50％，甚至更佳为20％。应可理解的是，该标记的表达可由任何本发明所属技术领域中具有通常技艺者所知的任一技术而抑制。举例而言，该表达可通过基因干扰或删除而抑制或消除。在本发明的一具体实施例中，细胞被培养于低氧环境下(例如，介于0％至约7％氧气)并于细胞密度达到一半或全满时回复，使得其与正常氧量环境下(例如，含有20％至21％氧气)培养的细胞相较，NK配体的表达量减少。在本发明优选的具体实施例中，该低氧环境为1％O2。
本发明中不可预期地发现MSCs在任何密度下，无论是高密度或低密度皆可用于本发明的方法，此点与公开于US20110129918A1发明中所述的具可专利的特征在于低密度10至4000MSCs/cm2不同。本发明的一实例中采用50细胞/cm2密度。于另一实例中采用5×103至104细胞/cm2。
本发明的实例中证实，相较于异体正常氧的MSCs，异体低氧MSCs可改善在弱化的肢干缺血的治疗效果，以及该效果与自体低氧MSCs效果相似。根据本发明的异体低氧MSCs于具免疫力的接受小鼠中，可透过抑制NK配体的表达，像是在NK细胞上与DNAM1及NKG2D有关的配体，以及降低NK补充的诱发及细胞毒性而增加移植能力。该细胞成长为CD31+的内皮细胞及αSMA+及desmin+肌肉细胞，因而促进血管新生及抑制肌肉纤维化，此意指本发明的低氧MSCs为本质上免疫豁免的，且可作为“广用的供给细胞”用于治疗心血管疾病。
与造血干细胞(HSCs)或其它骨髓移植物相似，已知MSCs于异体接受者体内也会被NK所媒介的裂解反应所排斥；然而，本发明的低氧MSCs(其通过将MSCs培养于低氧环境中而得)可降低NK配体的表达，以及抑制NK细胞的补充及细胞毒性，因而可增强存活的能力以及增强移植入异体接受者的组织中的能力。
在本发明中，用于细胞疗法的本发明的异体低氧MSCs已在具免疫力动物模式中测试过(可作为临床前研究)，结果显示该异体低氧MSCs的治疗潜力及免疫优点，像是用于治疗严重的缺血性疾病。结果显示本发明异体的缺氧MSCs仍保留早期干细胞特性，维持正常的核型，且经移植后将不会形成肿瘤。因此，根据本发明将MSCs培养于低氧环境中，可用于异体移植。
因此，另一方面，本发明提供一种制备当移植至个体时引发低排斥反应或不引发排斥反应的细胞移植物的方法，其包含将至少一种自捐赠者分离的细胞培养于介于0％至15％氧气的低氧环境中，优选为介于0％至约7％氧气，进一步优选为介于0％至约2.5％氧气。在本发明的一实例中，该低氧环境约为1％氧气。
可理解的是，根据本发明用于细胞移植物的至少一种细胞可依据目标移植位置而决定。适合用于本发明的细胞包含，例如，各种可自我更新及分化的干细胞。本发明的一优选具体实施例是使用间充质干细胞(MSC)。根据本发明，至少基于下述的理由，低氧MSCs可作为其中一种用于治疗性血管新生的细胞来源，以治疗缺血性疾病：
(1)相较于成体骨髓或周边血液的内皮前驱细胞的有限数量，本发明的细胞可提供无限量的具功能的内皮及肌肉细胞以用于临床应用中。再者，该内皮细胞或前驱细胞通常具有有限的增生能力，因此，要增殖至足以进行移植的细胞数量仍是一难题；相反的，本发明的低氧MSCs具有可延伸的自我再生活性，且可无限制地增殖。
(2)相较于正常氧的MSCs，本发明的低氧MSCs于活体内显示低免疫原性，且对于免疫排斥反应的感受性较低。因此，本发明的低氧MSCs及其衍生物适于异体移植。目前试验证实于低氧环境增殖的MSCs可降低NK配体的表达现象，以及抑制NK细胞的补充及细胞毒性，因而促进存活能力及增强移植入异体接受者的组织中的能力。
本发明还进一步提供通过上述方法所制备的细胞移植物。
实例
材料及方法
MSC单离、特征及培养
MSCs是取自两近交品系的小鼠：C57BL/6J(B6)及Balb/c。以颈椎脱臼法牺牲4-6周龄的公鼠。将股骨及胫骨移除，将所有结缔组织清除干净，并将其置于5mL添加有1×青霉素/链霉素的α-MEM中，并置于冰上。将所有的胫骨及股骨末端处剪断以暴露出骨髓，将其插入准备好的离心管，并于400g离心1分钟以收集骨髓。将沉淀物于3mL完全培养基(CM：添加16.6％胎牛血清(FBS)的α-MEM、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素)中重新悬浮，并以21号注射针，透过70-μm的尼龙筛网进行过滤。将源自每一长骨的细胞置于10cm培养皿中内含40mLCM。经24小时后，以磷酸缓冲生理食盐水(PBS)移除无贴附的细胞，再加入10mL的新鲜CM。经约2周培养后，附着细胞达到接近长满状况(第0代)，并以PBS清洗，接着以4mL的0.25％胰蛋白酶/1mM乙二胺四乙酸(EDTA；Invitrogen，Carlsbad，CA)于37℃作用2分钟来分离细胞。接着将细胞以50cells/cm2密度种入CM中进行增殖，并每10天进行继代一次(第1至4代)。用于本研究的细胞为第2至4代。进行低氧培养时，将细胞培养于混合气体中，该混合气体是由94％N2、5％CO2及1％O2所组成。为了维持低氧的混合气体，使用带有2个空气传感器的培养箱，一个测量CO2以及另一个测量O2；使用氮气(N2)输送系统以达到及维持氧气浓度，该氮气是由一液体的氮气桶或含有纯氮气的桶生成。若氧气百分比升至高于所需要的程度，则氮气会自动地注入系统中以替换掉过多的氧气。
MSCs的特征
为了分析细胞表面的典型的标记蛋白表达现象，以含有5mMEDTA的PBS收获MSCs。将细胞与FITC共轭结合的抗鼠Sca-1、CD11b、CD31、CD34及CD45、与PE共轭结合的抗鼠CD29、CD44、及CD105作用。匹配的同型抗体作为控制组(BectonDickinson,SanJose,CA)。准备10,000个被标记的细胞，以及使用FACScan流式细胞仪，及使用CellQuest软件(BectonDickinson)分析。为了进行活体外的成骨细胞分化及脂肪细胞分化，将细胞以104/cm2密度种入，并以成骨细胞诱导培养基(OIM由添加10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco,Carlsbad,CA)、10-8M地塞米松(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10mMβ-磷酸甘油(Sigma-Aldrich)及50μM抗坏血酯-2-磷酸盐(Sigma-Aldrich)所组成)，及脂肪细胞诱导培养基(AIM由添加10％FBS的α-MEM、10-7M地塞米松、50μM引朵美洒辛(Sigma-Aldrich)、0.45mM3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤(Sigma-Aldrich)及10μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)所组成)分别进行诱导3周。待分化的型态特征出现后，将以OIM及AIM处理的细胞，分别以茜素红S(ARS)及油红O染色。为了将分化进行量化，分别将ARS及油红O染剂萃取以进行于OD550nm及510nm的光学测量。为了进行活体外的软骨细胞分化，将2.5×105细胞沉淀收集，并于软骨细胞诱导培养基(CIM由添加10-7M地塞米松的无血清α-MEM、1％(vol/vol)ITS、50μM抗坏血酯-2-磷酸盐、1mM丙酮酸钠、40μg/mL(wt/vol)脯氨酸及10ng/mL(wt/vol)TGF-β1(R&Dsystems，Minneapolis，MN)所组成)中连续培养3周。将以CIM诱导的细胞进行爱尔新蓝染色。
缺血性肢干模式
动物研究计划经国立阳明大学的动物中心委员会审阅及同意。在本试验中使用6周龄的Balb/c公鼠。使用麻醉剂(xylazine)及麻醉剂(ketamine)进行常规的麻醉，从膝盖朝向大腿内侧造成一皮肤切口，接着将皮下脂肪组织移除以显现其下位于靠近腹股沟近端的股动脉。接着将股动脉于股中段进行双重打结，并摘除长度5mm的股动脉。经切除后立即将在100μLPBS中的106培养增殖后的MSCs注入(i.m.)后肢的股薄肌中。
肢干灌流的评估
遂进行如先前研究所述的激光多普勒成像分析(Choietal.，JBiolChem.2004；279(47)，49430-49438)。使用激光多普勒灌流成像(MoorInstruments,Devon,UK)以进行一连串非侵入性的新血管形成的生理评估。小鼠于治疗后第0、3、7、14、21、及28天，通过一连串扫描以监测后肢的表面血流。分析该数字彩色编码的影像以量化从膝关节至脚指间区域的血流量，计算平均灌流值。
免疫组织化学法及免疫荧光法
为了进行免疫组织化学法，将石蜡包埋的切片进行脱蜡，复水及通过将切片置于Declere作用溶液(CellMarque，Austin，TX)中，并置于微波炉中20分钟，以使抗原复性。以3％过氧化氢阻断内生性过氧化酶活性。以PBS清洗以移除残留的酵素活性，并以UltraVBlock(ThermoFisherScientific，Fremont，CA)作用5分钟将非专一性染色阻断。接着将切片以一级抗体(抗CD31，SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)于4℃进行隔夜反应，以PBS大量冲洗，再以相对应的生物素化的二级抗体(VectorLaboratories，Burlingame，CA)在室温反应15分钟，接着以卵白素-过氧化酶(LSABKit；Dako，Carpinteria，CA)处理，接着进行二氨基联苯胺染色。以Mayer's苏木素进行对比染色。为了进行免疫荧光法，将切片以4％三聚甲醛固定，并以一级抗体进行反应，再以含有0.1％TritonX-100的PBS大量冲洗，再以相对应的DyLightTM488或DyLightTM594共轭结合的二级抗体(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA)作用，接着以DAPI进行对比染色。使用荧光显微镜观察免疫荧光。
定量RT-PCR
使用TRIzol作用剂(Invitrogen)单离细胞的总RNA，并将2μg的总RNA在20μL溶液中进行反转录，其中使用了3μg的随机引子及200U的SuperscriptIIIRT(Invitrogen)。于总体积为25μL溶液中进行增幅反应，该溶液中含有0.5μM的引子、12.5μL的LightCyclerTM–FastStartDNAMasterSYBRgreenI(RocheIndianapolis,IN)及10μL1：20稀释的cDNA。以LightCycler480实时PCR系统进行PCR反应。使用LightCycler480软件版本1.5.0(Roche)进行每个mRNA表达现象的量化，并经常态性基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正规化。引子对的序列列于表1中。
表1.用于定量PCR的引子对
NK细胞毒性试验
为了通过MACS纯化NK细胞，将脾细胞培养于NK细胞单离套组中(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)，并通过自动MACS(MiltenyiBiotec)筛选细胞。NK细胞培养基是由含有10％FBS及青霉素/链霉素的RPMI1640所组成。将NK细胞置于含有或不含有1000U/mLIL-2的NK细胞培养基中进行增殖5天。NK细胞对于MSC的细胞毒性活性是以PromegaCytoTox96非放射性细胞毒性试验套组测量，该套组是通过测量乳酸脱氢酶(LDH)以测定细胞毒性，其中该LDH为一种稳定的胞内酵素，会在细胞裂解时释放出来。将5×103目标(T)细胞(MSC)与作用子(E)细胞(NK)以不同的E：T比率(12：1，6：1，3：1，1.5：1)作用4小时；经作用后，收集上清液并与受质混合物作用30分钟。接着加入1M醋酸以停止反应。进行每一个E：T比率的三重复试验以测量实验性的LDH释放。作用子细胞于不存在目标细胞时，测量作用子的自发性LDH释放程度。目标细胞于不存在作用子细胞时，测量目标自发性LDH释放程度。通过加入裂解溶液(0.9％(v/v)TritonX-100)以测定目标最大化的LDH释放程度。LDH释放的量就以读盘机(Bio-RadModel3550-UV)测量，并且对于每一种E：T比率的细胞毒性百分比是根据公式：细胞毒性(％)＝100％×[(实验性–作用子自发性-目标自发性)/(目标最大化–目标自发性)]计算。
统计分析
所有的数值是以平均值±SD表示。两组间的比较以学生t-检定分析。p<0.05被认为具统计上的显着性。
结果
间叶干细胞培养在低氧及缺氧环境下的特征
单离自B6及Balb/c小鼠的MSCs，并在低氧(1％O2)及正常含氧环境(空气，等同20-21％O2)培养，再以流式细胞分析其特征，并于第3代进行分化试验。无论源自B6或Balb/c的低氧及正常氧的MSCs，皆会表达MSCs标记物包含Sca1、CD29、CD44、CD105，但不会表达造血细胞的标记物，像是CD11b、CD34及CD45，以及不会表达内脾细胞标记物，像是CD31(图1A及1B)。再者，无论源自B6或Balb/c的低氧及正常氧的MSCs皆持有相似的分化能力，可分化为成骨细胞系、脂肪生成细胞系及软骨生成细胞系(图1C)。该数据显示在早期代次的低氧及正常氧的MSCs之间，在表面蛋白表达图谱及分化潜力上并无明显不同。
相较于正常氧MSCs，异体移植低氧MSCs可增加肢干缺血性的改善程度
在后肢缺血的Balb/c老鼠模式评估MSCs的血管新生潜力。为了证明异体MSCs对于缺血性肢干疗法的潜力，将Balb/c小鼠的右侧股动脉打结，并切断5mm，接着以肌肉注射方式，无注入细胞(控制组，仅有PBS)、注入低氧B6或正常氧MSCs(异体的)、注入Balb/c低氧或正常氧MSCs(自体的)或注入Balb/c低氧的老鼠胚胎纤维母细胞(non-MSC)。经注射治疗后的第1-2周，控制组显示于缺血性后肢出现广泛的细胞坏死，其导致因自动截断的后肢损失。于第4周时显示，控制组8只动物中有七只肢干损失(87.5％)及一只肢干坏死(12.5％)(图2A)。相似地，该非MSC组(MEFBalb/c)于6只小鼠中有5只肢干损失(83.3％)及1只肢干坏死(16.7％)(图2A)。所有接受源自B6的低氧MSCs或源自Balb/c的低氧或正常氧MSCs的小鼠，展现出肢干修复(70％，10只Balb/c中的7只；70％，10只B6中的7只)或肢干坏死(30％，10只Balb/c中的3只；30％，10只B6中的3只)，而仅有两只接受源自B6的正常氧MSCs的小鼠展现肢干修复(20％，10只中有2只)、三只有肢干坏死(30％，10只中有3只)以及五只损失其肢干(50％，10只中有5只)(图2A)。
通过激光多普勒灌流成像分析以评估血液灌流，进一步显示，相较于无细胞控制组或接受非MSCs的小鼠而言，接受源自无论是Balb/c或B6低氧或正常氧MSCs的小鼠，可于移植后1周增加灌流(图2B)。相较于该接受源自B6正常氧MSCs的小鼠而言，接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常氧MSCs的小鼠，可在移植2周后增加灌流(图2B)。另外，经移植后第4周，对于接受源自B6低氧MSCs、及源自Balb/c低氧或正常氧MSCs的小鼠，其受伤肢干相较于正常肢干的相对血液流速比率分别为0.926±0.076、0.972±0.021及0.927±0.059；而接受源自B6正常氧MSCs、非MSC及无细胞移植的小鼠，该比率分别为0.602±0.080、0.294±0.029及0.370±0.012(图2B)。该等数据显示以源自异体供给者的低氧MSCs或源自自体供给者的低氧及正常氧MSCs进行缺血性肢干的移植，可恢复至接近正常的灌流，然而该以源自异体供给者的正常氧MSCs进行移植者，仍然具有显着地肢干灌流缺损。
低氧MSCs降低肌肉退化及纤维化，并增加缺血性肢干的血管新生
以苏木素及伊红(H&E)进行股薄肌染色的组织分析，该经创造肢干缺血的股薄肌，于第4周恢复，显示了接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常氧MSCs的小鼠可维持正常肌肉的图像而无肌纤维的损失，然而该等接受源自B6正常氧MSCs的小鼠仍经历带有部分纤维损失的肌肉萎缩。然而，接受无细胞移植或非MSC移植的小鼠，具有明显地肌肉纤维损失及伴随脂肪退化的萎缩。于试验样本中，测量非肌肉区域相对于总区域的比例以量化肌肉的损失，发明人发现肌肉损失的比率，对于接受源自B6低氧MSCs或源自Balb/c低氧或正常氧MSCs的小鼠，分别为3.32±1.36％、3.62±1.01％及3.35±3.04％；然而，对于接受源自B6正常氧MSCs、非MSC及无细胞移植的小鼠而言，则比率分别为44.91±1.16％、53.68±5.95％及62.33±2.73％(图3A)。相似地，梅生三色染色法显示接受源自B6低氧MSCs(0.016±0.006％)、源自Balb/c低氧(0.029±0.014％)或正常氧(0.28±0.14％)MSCs的小鼠，显示无肌肉纤维化；然而，该接受源自B6正常氧MSCs的小鼠(9.39±1.07％)仍经历部分肌肉纤维化(图3B)。然而，接受非MSC(22.93±3.99％)或无细胞移植(30.14±11.59％)的小鼠显示显着地肌肉纤维化(图3B)。以抗CD31的抗体进行的免疫组织化学染色显示，相较于该接受源自B6正常氧MSCs(84±11/mm2)、非MSC(56±10/mm2)、或无细胞移植(60±9/mm2)的小鼠，接受源自B6低氧MSCs(173±12/mm2)、或源自Balb/c低氧(189±28/mm2)或正常氧(158±12/mm2)MSCs的小鼠，具显着地增强的CD31+的微管密度(图3C)。该数据证实异体MSC移植对于肌肉再生的疗效，以及于低氧环境培养的MSCs，对于血管新生形成也显着地增强。
经移植后的低氧MSCs存活及移植
供长期移植的BrdU追踪系统显示，经移植后第4周的缺血性组织，相较于源自B6正常氧MSCs(66±45/mm2)，源自B6低氧MSCs(633±72/mm2)、源自Balb/c低氧(566±71/mm2)或正常氧(620±37/mm2)的MSCs大幅度增加存在量(图4A)。BrdU及CD31的双重免疫荧光显示部分BrdU+细胞可于带有红血球的CD31+血管内腔中被观察到(图4B)，指出部分移植细胞被整合入新生血管中，且确实具功能且帮助血液灌流。BrdU及α-平滑肌的肌动蛋白(α-SMA)或肌间线蛋白(图4C及4D)的双重免疫荧光显示于缺血性区域，部分BrdU+细胞同时也是α-SMA或肌间线蛋白阳性，暗示部分移植的细胞分化成肌肉组织。BrdU+/CD31+细胞的密度，对于HypB6为95±5/mm2、对于HypBalb/c为95±17/mm2、对于NorBalb/c为100±9/mm2以及对于NorB6为5±1/mm2；BrdU+/α-SMA+的密度，对于HypB6为205±40/mm2、对于HypBalb/c为215±34/mm2、对于NorBalb/c为210±35/mm2以及对于NorB6为6±5/mm2；而BrdU+/desmin+细胞的密度，对于HypB6为180±24/mm2、对于HypBalb/c为175±11/mm2、对于NorBalb/c为185±21/mm2以及对于NorB6为10±6/mm2。该结果显示经移植后的低氧MSCs可存活，并移植入老鼠组织内，并接着在缺血性肌肉中诱导出血管及肌肉网络。
低氧MSCs在异体接受者体内降低NK的累积
在移植后第28天及第7天，分别使用抗NKp46及抗DX5抗体以辨识NK细胞。当该缺血性肌肉组织以培养于正常含氧环境的异体MSCs(NorB6)注入后，会累积NKp46+及DX5+NK细胞；而该注入无论是自体的MSCs(NorBalb/c及HypBalb/c)或在低氧环境培养的异体的MSCs(HypB6)皆显着地降低NKp46+或DX5+NK细胞的累积(图5A)。然而，以抗CD8、CD4、CD14、CD86或TCRαβ抗体的免疫荧光显示，无论源自B6或Balb/c低氧及正常氧MSCs不会累积CD8+或CD4+T细胞、CD14+巨噬细胞、CD86+树突细胞或NKT细胞(图5B)，表明在异体接受者体内，NK累积可能参与消灭正常氧MSCs的机制。为了证明此点，发明人评估在伴随有及没有NK耗尽的异体接受者体内，移植后的正常氧MSCs于改善肢干缺血的效果。在异体接受者体内，NK耗尽可通过将抗NK1.1或asialoGM1的中和抗体一同注入，以大幅度改善正常氧MSCs所媒介的肢干缺血现象(图5C)。该数据显示经移植后，NK媒介的裂解与异体MSCs的排斥有关。
低氧MSCs降低供NK活化及NK裂解的配体的表达
定量RT-PCR分析显示低氧MSCs可降低NK配体的表达现象，如H60c、nectin-2、Pvr及Rae1(图5D)，该配体对于NK累积及活化相当重要，或已知为抗造血前驱细胞的NK，尽管Rae1的量在低氧及缺氧MSCs中都很低。另外，对于源自长期低氧环境的MSCs，其降低该配体表达的现象，也可在经低氧培养48小时的MSCs中观察到(图5E)。低氧培养不仅抑制该等配体的表达，亦抑制NK媒介的裂解。如图5F所示，NK仅诱导0.25％及0.44％的低氧MSCs的裂解，相较于分别于没有/有IL-2存在时，可诱导52.84％及84.15％的正常氧MSCs的裂解。
以抗NK配体的抗体前处理正常氧MSCs可阻断NK裂解及增加改善肢干缺血的能力
发明人的数据强烈地支持NK配体涉及异体正常氧MSCs的NK裂解。若能了解对于MSCs将NK配体阻断或耗尽NK配体的宿主受体，是否可阻断NK媒介的异体正常氧MSCs的裂解，接连促进异体正常氧MSCs在增强血管新生及于缺血性肢干预防截肢的能力，将会十分有趣。因此，发明人将正常氧的B6MSCs先以抗H60c、nectin-2、Pvr或Rae1的抗体进行中和30分钟，或以DNAM1或NKG2D阻断抗体前处理NK，接着分析MSCs对于NK媒介的裂解的反应。相较于以同型IgG前处理或抗Rae1抗体前处理者，以抗H60c、nectin-2、或Pvr中和抗体前处理正常氧的MSCs，可降低NK裂解反应(图6A)。同样地，将NK细胞以抗DNAM1或抗NKG2D的抗体前处理，也会降低裂解能力(图6A)。相较于该以同型IgG进行前处理者，将正常氧MSCs以抗H60c、nectin-2、Pvr的中和抗体前处理，或与抗DNAM1或NKG2D的中和抗体一同注入，可提高增强的血液灌流的能力(图6B)及恢复肢干结构的能力(图6C)。相反的，将低氧MSCs以该等阻断抗体前处理或一同注入，则不会进一步提高增强的血液灌流能力(图6B)。有趣的是，发明人发现相较于以同型IgG进行前处理，以正常氧MSCs进行异体移植所诱导的NK累积，会通过以抗H60c、nectin-2或Pvr的中和抗体前处理，或以抗DNAM1或NKG2D的抗体一同注入以抑制该NK的累积(图6D)。另外，发明人发现相较于以同型IgG进行前处理者，在异体接受者中，若能以抗H60c、nectin-2、或Pvr的中和抗体前处理，或以抗DNAM1或NKG2D的抗体一同注入，可增强正常氧MSCs移植入CD31+、α-SMA+及Desmin+细胞的能力(图6E及6F)。该数据显示NK配体大幅度涉入MSCs的NK媒介的裂解反应，且经异体移植正常氧MSCs后会使得血液灌流增强失败。
为了将目前老鼠的发现应用至将来人类的临床使用上，发明人比较了，在无伴随及伴随暴露于低氧环境中的人类MSCs的人类NK配体表达。发明人发现人类MSCs培养于正常含氧环境下，会显著表达NK配体的mRNA量，该配体像是PVR(人类DNAM-1配体)及ULBP3(人类NKG2D配体)，当人类MSCs短期暴露于低氧(1％O2)会抑制该配体的表达(图7A)。相同地，异体NK细胞媒介的裂解仅于人类正常氧MSCs中观察到，而没有于人类低氧MSCs中观察到，该裂解可以抗PVR或ULBP3的抗体将MSCs进行前处理，或以抗DNAM1及NKG2D的抗体前处理NK细胞以将其阻断(图7B及7C)。以上数据显示在老鼠模式所观察到的发现可于将来应用于人类的临床应用上。
短期暴露于低氧环境可降低于人类及老鼠MSCs中NK配体的表达
人类及B6老鼠的MSCs用于此试验中。将人类及老鼠的MSCs在正常含氧环境(21％O2)下增殖数周。将该细胞重新以5×103至104cells/cm2密度种下，并移至低氧环境，其氧浓度为0％、1％、2.5％、及7％(相较于US20110129918A1所使用者为10至4000MSCs/cm2的低密度)。为了要维持低氧气体混合物，使用带有2个气体传感器的培养箱，其中之一用于感测CO2，另一个用于感测O2；使用氮气(N2)输送系统以达到及维持氧气浓度，该氮气是由一液体的氮气桶或含有纯氮气的桶生成。若氧气百分比升至高于所欲程度，则氮气会自动地注入系统中以替换掉过多的氧气。将细胞培养2天后。使用TRIzol作用剂(Invitrogen)单离细胞的总RNA，并将2μg的总RNA于20μL溶液中进行反转录，其中使用了3μg的随机引子及200U的SuperscriptIIIRT(Invitrogen)。于总体积为25μL溶液中进行增幅反应，该溶液中含有0.5μM的引子、12.5μL的LightCyclerTM–FastStartDNAMasterSYBRgreenI(RocheIndianapolis，IN)及10μL1∶20稀释的cDNA。以LightCycler480实时PCR系统进行PCR反应。使用LightCycler480软件版本1.5.0(Roche)进行每个mRNA表达现象的量化，并将该表达现象经常态性基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正规化。
在正常含氧环境下增殖老鼠MSCs，会表达高度的NKDNAM-1配体、Pvr及nectin-2、及NKG2D配体、H60c。此外，结果也显示短期暴露于低氧环境2天，其中氧气浓度约为0至7％，可显著降低H60c、nectin-2及Pvr的表达(图8A、8B及8C)。相似地，于正常含氧环境下增殖人类MSCs，会表达高度的NKDNAM-1配体、PVR及NKG2D配体、ULBP3；当短期暴露于低氧环境2天，其中氧气浓度约为0至7％，可显著降低PVR及ULBP3的表达(图8D、及8E)。该结果显示短期暴露MSCs于低氧环境可降低NK配体的表达现象。
总结，本发明的异体低氧MSC疗法已在具免疫力的动物模式中测试过，可作为一前临床研究，且证实其医疗潜力及免疫优点，如用于治疗严重的缺血性疾病。结果显示将MSCs培养于低氧环境可用于异体的移植。

Claims (6)

1.一种降低以间充质干细胞(MSC)所制备的细胞移植物的NK配体表达量的方法，其特征在于，将间充质干细胞培养于介于0％至7％氧气的低氧环境下，其中所述NK配体是选自由H60c、nectin-2、PVR、ULBP3及其组合所组成的群组中的一个。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述细胞移植物移植至个体时可引发低排斥反应或不引发排斥反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低氧环境介于0％至2.5％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述低氧环境为1％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞移植物是异体细胞移植物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的间充质干细胞保留早期干细胞特性、维持正常的核型、且于移植后不会形成肿瘤。
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