TWI491877B

TWI491877B - 液晶感測器及用於檢測生物分子的方法

Info

Publication number: TWI491877B
Application number: TW103121206A
Authority: TW
Inventors: Wei Lee; Mon Joan Lee; Shih Hung Sun; hui wen Su
Original assignee: Univ Nat Chiao Tung
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2015-07-11
Also published as: TW201600854A

Description

液晶感測器及用於檢測生物分子的方法

本發明是有關於一種用於偵測生物分子的液晶感測器及液晶感測技術，特別是指一種使用具有親水性的配向膜及雙折射率範圍高的向列型液晶組分之液晶感測器及液晶感測技術。

液晶感測器(liquid crystal-based biosensor)是將液晶盒技術運用在生物感測，原理是利用液晶分子與生物分子之間的交互作用，使得液晶盒的配向膜上的液晶分子位向(orientation)發生改變，並因為液晶分子具有雙折射率的光學特性，而能於偏光顯微鏡下觀察到正交偏光光學紋理圖，由此判斷待測物中是否含有生物分子。

其中，如何提昇液晶感測器的靈敏度是一大研究開發的重點。例如：S.Yang等人於2012年在Chemical communications 發表的「Gold nanoparticle based signal enhancement liquid crystal biosensors for DNA hybridization assays」，揭露在液晶感測器中加入金奈米粒子，使得DNA生物分子吸附於較大的表面積上，因此增強液晶分子位向上的變化，且不同濃度的DNA造成不同的光學紋理，藉此有效地提昇液晶感測器的靈敏度至偵測莫耳濃度為0.1pM。

在液晶感測器領域中，如何提昇液晶感測器的偵測靈敏度，一直是各研究團隊致力研究的課題，因此若能提供另一種新穎並有效提昇液晶感測器的偵測靈敏度的技術，定能有助於液晶感測器領域的發展。

因此，本發明第一目的，即在提供一種液晶感測器，該液晶感測器具有很高的偵測靈敏度。

於是本發明液晶感測器，包含：一第一單元、一第二單元、一液晶層及一待測物。

該第一單元包括一第一基板，及一形成於該第一基板一表面的第一配向膜；該第二單元與該第一單元間隔且相對應設置並包括一第二基板，及一與該第一配向膜間隔且相對應設置並形成於該第二基板一表面的第二配向膜，其中，該第二配向膜的一表面具有親水性；該液晶層形成於該第一配向膜與該第二配向膜之間且包括一向列型液晶組份，其中，該向列型液晶組份於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4；其中，該第二配向膜能與該待測物結合而使該待測物固定於該第二配向膜具有親水性的表面，以及當該待測物中含有生物分子時，與該生物分子接觸的向列型液晶組份的位向會異於與該生物分子未接觸的向列型液晶組份的位向。

因此，本發明第二目的，即在提供一種用於檢測生物分子的方法。

於是本發明用於檢測生物分子的方法，包含以下步驟：(a)提供一第一單元及一第二單元，其中，該第一單元包括一第一基板以及一形成於第一基板一表面上的第一配向膜，該第二單元包括一第二基板以及一形成於第二基板一表面上的第二配向膜，以及該第二配向膜的一表面具有親水性；(b)使一待測物結合至該第二配向膜具有親水性的表面，以固定於該第二配向膜具有親水性的表面上；(c)以該第二基板與該第一基板間隔且相對應，以及該第二配向膜與該第一配向膜間隔且相對應的方式設置該第一單元及第二單元，其中，該第一配向膜與該第二配向膜共同界定出一空間；(d)將一向列型液晶組份注入且充滿該空間，再封閉該空間，而獲得一液晶感測器，其中，該向列型液晶組份於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4；及(e)以一偏光顯微鏡觀測該液晶感測器，得到一正交偏光光學紋理圖，由正交偏光光學紋理圖的光學紋理變化評斷該待測物中是否含有生物分子。

本發明之功效在於：因為該第二配向膜面向該第一配向膜的表面具有親水性，使得該待測物能更牢固地固定於該第二配向膜面向該第一配向膜的表面，所以能大幅提昇偵測靈敏度。同時，該向列型液晶組份的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4也有助於提昇偵測靈敏度。

1‧‧‧液晶感測器

2‧‧‧第一單元

21‧‧‧第一基板

22‧‧‧第一配向膜

3‧‧‧第二單元

31‧‧‧第二基板

32‧‧‧第二配向膜

321‧‧‧表面

4‧‧‧液晶層

41‧‧‧向列型液晶組份

5‧‧‧待測物

51‧‧‧抗體

52‧‧‧抗原

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是一示意圖，說明本發明液晶感測器的一實施例；圖2(a)至(h)是一組照片，說明本發明實施例1至8的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(h)分別表示實施例1至8的光學紋理測試結果；圖3(a)至(c)是一組照片，說明本發明實施例9至11的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(c)分別表示實施例9至11的光學紋理測試結果；圖4(a)至(c)是一組照片，說明本發明實施例12至14的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(c)分別表示實施例12至14的光學紋理測試結果；圖5(a)至(c)是一組照片，說明本發明比較例1至3的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(c)分別表示比較例1至3的光學紋理測試結果；圖6(a)至(e)是一組照片，說明本發明探討例1的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(e)分別表示向列型液晶組份 5CB在溫度為22℃、23℃、25℃、34℃及35℃的光學紋理測試結果；圖7(a)至(e)是一組照片，說明本發明探討例1的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(e)分別表示向列型液晶組份HDN在溫度為-39℃、-30℃、25℃、50℃及95℃的光學紋理測試結果；圖8(a)至(e)是一組照片，說明本發明探討例1的正交偏光光學紋理圖，其中，(a)至(e)分別表示向列型液晶組份E7在溫度為-20℃、-10℃、25℃、57℃及58℃的光學紋理測試結果；及圖9是一照片，說明本發明探討例2的正交偏光光學紋理圖。

在本發明被詳細描述之前，應當注意在以下的說明內容中，類似的元件是以相同的編號來表示。

本發明用於檢測生物分子的方法，包含以下步驟：

(a)提供一第一單元及一第二單元。該第一單元包括一第一基板以及一形成於第一基板一表面上的第一配向膜。該第二單元包括一第二基板以及一形成於第二基板一表面上的第二配向膜，以及該第二配向膜的一表面具親水性。

(b)使一待測物結合至該第二配向膜具有親水性的表面，以固定於該第二配向膜具有親水性的表面上。

(c)以該第二基板與該第一基板間隔且相對應，以及該第二配向膜與該第一配向膜間隔且相對應的方式設置該第一單元及第二單元，其中，該第一配向膜與該第二配向膜共同界定出一空間。

(d)將一向列型液晶組份注入且充滿該空間，再封閉該空間，而獲得一液晶感測器。其中，該向列型液晶組份於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4。

(e)以一偏光顯微鏡觀測該液晶感測器，得到一正交偏光光學紋理圖，由正交偏光光學紋理圖的光學紋理的變化評斷該待測物中是否含有生物分子。

在本發明用於檢測生物分子的方法中，該待測物包含一蛋白質，更具體地說，於該步驟(b)中是使該待測物中的蛋白質結合至該第二配向膜具有親水性的表面，以固定於該第二配向膜具有親水性的表面上，所以進而使得該步驟(d)中所製得的液晶感測器中的向列型液晶組份不完全是以垂直配向排列，因此在步驟(e)中會觀察到液晶感測器的正交偏光光學紋理圖有亮點或亮圈產生。而當該待測物中含有一生物分子時，該生物分子會與該蛋白質結合，並使得向列型液晶組份非垂直配向排列的比例更多，因而相較於待測物中只有該蛋白質的情況，會在步驟(e)中觀察到液晶感測器的正交偏光光學紋理圖有更多更明顯的亮點或亮圈產生，且亮點或亮圈會隨待測物中的生物分子數量越多而增多，因此本發明用於檢測生物分子的方法能用於檢測一待測物是否含有生物分子。

在本發明中，待測物中的「蛋白質」例如但不限於：抗體。「生物分子(biomolecules)」是指可與待測物中的「蛋白質」結合並擾動向列型液晶組份排列者，例如但不限於蛋白質(如抗原)、脂類(磷脂、糖脂、固醇等)、碳水化合物(單糖、雙糖、寡糖、多糖等)、核酸(DNA、RNA)、胜肽(寡肽、多肽等)、維生素、激素、神經遞質等。

當該待測物中的蛋白質為一抗體，及該生物分子為一抗原時，可採用先將該抗體固定至該第二配向膜具有親水性的表面上，再使該抗原與該抗體結合形成一免疫複合物(immunocomplex)的方式。或較佳的，先混合該抗體與抗原形成該免疫複合物，再使該免疫複合物結合至該第二配向膜具有親水性的表面並固定於該第二配向膜具有親水性的表面上，此方式因為不會產生多餘的抗體或抗原，可以免去潤洗移除非專一性鍵結的抗體與抗原的步驟，所以能簡化檢測流程。

參閱圖1，一液晶感測器1的一實施例包含：一第一單元2、一第二單元3、一液晶層4及一待測物5。

該第一單元2包括一第一基板21，及一形成於該第一基板21表面的第一配向膜22。

該第二單元3與該第一單元2間隔且相對應設置並包括一第二基板31，及一與該第一配向膜22間隔且相對應設置並形成於該第二基板31表面的第二配向膜32。其中，該第二配向膜32面向該第一配向膜31的表面321具有親水性，該第二配向膜32的表面321能與該待測物5結合而使該待測物5固定(immobilize)於該第二配向膜32的表面321。且該第二配向膜32的表面321同時具有使液晶垂質配向排列的作用。

較佳的，該第二配向膜32是由N,N-二甲基-正十八烷基-3-胺基丙基三甲氧基氯矽烷(N,N-Dimethyl-n-octadecyl-3-aminopropyltrimethoxysilylchloride，簡稱DMOAP)經水解反應形成後，再經一改質反應使該第二配向膜32面向該第一配向膜31的表面321具有親水性區。更佳的，該改質反應是氧化反應。具體的方式例如但不限於：以紫外光照射該第二配向膜32的表面321，藉由紫外光所引發的臭氧反應產生的單態氧進行氧化反應，使該第二配向膜32的表面321具有親水性基團(例如但不限於：羥基、醛基、羧基)，所以該第二配向膜32的表面321能與該待測物5以較強的共價鍵結合，使得該待測物5更牢固地固定於該第二配向膜32的表面321，從而提高液晶感測器1的靈敏度。較佳地，該親水性基團為羧基。

該液晶層4形成於該第一配向膜22與該第二配向膜32之間且包括一向列型液晶組份41。較佳的，該向列型液晶組份41於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4。當該雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4時，偵測靈敏度會較高。更佳的，該向列型液晶組份41於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n 範圍為0.23至小於0.4。該向列型液晶41的種類於此並無特別限制，只要雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4即可。

該待測物5、生物分子及液晶感測器1偵測生物分子的原理是如上所述，故不再贅述。以圖1來說，該待測物中的蛋白質為抗體51，及該生物分子為抗原52，且抗體51與抗原52會形成免疫複合物，因為與該免疫複合物接觸的向列型液晶組份41的位向會異於與該生物分子未接觸的向列型液晶組份41的位向，因此能在偏光顯微鏡下觀察到正交偏光光學紋理圖有光學紋理。而與該待測物中只有抗體51時相比，該待測物含有由抗體51與抗原52形成的免疫複合物會使得向列型液晶組份41的位向排列變化更大，因此液晶感測器1在偏光顯微鏡下觀察到正交偏光光學紋理圖會有較多較明顯的亮點或亮圈，從而能判斷該待測物5中是否含有抗原52。

該液晶感測器1中的第一基板21及第二基板31的材質只要具有透明性而不會影響觀察即可。第一配向膜22的材質只要能使該向列型液晶組份41垂直配向排列即可。並可視需要或待測物中的蛋白質、生物分子的不同自由選擇該第一基板21、第二基板31及第一配向膜22的材質。於本發明一實施例中，該第一基板21及第二基板31的材質為玻璃，該第一配向膜22是由N,N-二甲基-正十八烷基-3-胺基丙基三甲氧基氯矽烷(DMOAP)經水解反應形成。此外，在本發明中所使用的間隙物(spacer)及封閉該第一配向膜22與該第二配向膜32共同界定出的空間的膠也並無特別限制，可使用一般用於液晶盒的間隙物及膠即可。

本發明液晶感測器及用於檢測生物分子的方法因為第二配向膜32面向該第一配向膜22的表面321具有親水性，所以待測物5中的蛋白質能更牢固地與該第二配向膜32的表面321結合，而當該待測物5中含有生物分子時，該生物分子會與待測物5中的蛋白質結合，因此間接使得該生物分子能更牢固地與該第二配向膜32的表面321結合，從而使得偵測靈敏度增加。同時，本發明中的該向列型液晶組份41的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4也有助於提昇偵測靈敏度。

本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。

<實施例> [實施例1]液晶感測器及用於檢測生物分子的方法

(a)將一第一基板(材質：玻璃)使用去離子水噴洗去除第一基板表面的灰塵後，再置於去離子水與些許肥皂粉的混合液中，並以超音波震盪器震盪15分鐘，以去除第一基板表面的油脂。接著，將第一基板置於去離子水中，並以超音波震盪器震盪15分鐘，再用去離子水重覆清洗第一基板兩次。接著，將第一基板置於酒精中，並用超音波震盪器震盪15分鐘，去除第一基板表面的有機物。最後以高壓氮氣吹乾第一基板上的酒精，放入烤箱中以74℃烘烤15分鐘，去除第一基板上殘留的酒精。將上述清洗後的第一基板置於一容器中，並於容器中倒入濃度為1wt%的N,N-二甲基-N-十八烷基-3-胺基丙基三甲氧基氯矽烷溶液[以下簡稱DMOAP溶液，以DMOAP的甲醇溶液(購於Sigma-Aldrich)以水稀釋至1wt%]，使第一基板的一表面完全浸泡於DMOAP溶液中，利用超音波震盪器震盪15分鐘後，再以去離子水沖洗第一基板的該表面上多餘的DMOAP溶液，隨之用高壓氮氣吹乾後，放入烘箱中以100℃烘烤15分鐘，即製得一第一單元。

(b)以第一單元的相同製備方式先製備一第二單元的第二基板，並於第二基板的一表面上形成一第二配向膜。接著，以紫外光照射第二配向膜之一表面，藉由紫外光所引發的臭氧反應氧化該表面，使得該第二配向膜表面具有親水性基團。

針對第二配向膜表面的親水性質進行以下檢測：

1. 接觸角測試：在25℃及環境濕度50%下採用靜置液滴法(sessile drop method)量測：以注射針筒輕沾一乾淨的去離子水滴(液滴體積為5μl)在第二配向膜，並以接觸角量測儀(contact angle meter，型號FTÅ200)的攝影鏡頭拍攝去離子水滴的影像並量測接觸角。接觸角的測量結果整理於表1。

2. 紅外線光譜：將DMOAP溶液(溶劑：甲醇；濃度：60wt%)滴於一不會因加熱或紫外光照射而發生變化的樣品測試卡(廠商：3M；型號：disposable IR Card Type 61)上，以加熱平台(廠牌：IKAMAG^® ；型號：C-MAG HS 7)於60℃加熱1小時，使DMOAP溶液中的溶劑完全揮發。接著，將含DMOAP的樣品測試卡分別以紫外光照射0、1、3及5分鐘後，使用傅立葉紅外線光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer，型號：Nicolet iS10 FT-IR spectrometer，廠商：Thermo Scientific)檢測(掃描次數：32，掃描範圍：4000至400cm^-1 ，解析度：0.964cm^-1 )光譜，並比較紅外線光譜中代表O-H(3200至3500cm^-1 )及C-O伸縮的振動(1000至1300cm^-1 )的頻寬帶峰值強度。結果整理於表1。

(c)將一包含水及CA-125抗體(monoclonal mouse anti-human CA-125 antibodies，購於Santa Cruz Biotechnology)的CA-125抗體溶液滴於(液滴大小為1μl)該第二配向膜具有親水性的表面上，待該CA-125抗體溶液的水分蒸發後，再將一包含水及CA-125抗原(recombinant human CA-125，購於R&D Systems)的CA-125抗原溶液滴於(液滴大小為20μl)該第二配向膜上具有親水性的表面，再於第二配向膜上蓋上一蓋玻片，待CA-125抗體與CA-125抗原進行免疫反應1.5小時後，移除蓋玻片，並用去離子水潤洗，移除非專一性鍵結的CA-125抗體與CA-125抗原。

(d)接著將一包含間隙物(尺寸：5.1μm)與乙醇的溶液點在第二基板的四個角，待乙醇完全揮發後，以第一配向膜與第二配向膜相對應的方式蓋上第一單元，再以AB膠封邊並留下一可灌入液晶的孔，接著灌入2至5μl的向列型液晶組份(液晶種類：HCCH公司生產之HDN，其雙折射率在20℃及波長589nm下為△n =0.333)後，以AB膠封閉該洞，即製得一液晶感測器。

(e)以偏光顯微鏡(polarized microscopy，廠牌型號：OLYMPUS^® 公司BX51)得到實施例1液晶感測器的正交偏光光學紋理圖，結果如圖2(a)。

[實施例2至14]液晶感測器及用於檢測生物分子的方法

實施例2至14與實施例1的差別在於：步驟(b)中，紫外光照射第二配向膜之一表面的時間、CA-125抗體溶液的濃度以及CA-125抗原溶液的濃度不同，如表1所示。

[比較例1至3]液晶感測器及用於生物分子的方法

比較例1至3與實施例1的差別在於：在步驟(b)中，未以紫外光照射第二配向膜之表面。比較例1至3的CA-125抗體溶液的濃度以及CA-125抗原溶液的濃度如表1所示。

由表1的結果可知，相較於比較例1至3，實施例1至14在O-H(3200至3500cm^-1 )及C-O伸縮的振動(1000至1300cm^-1 )的頻寬帶峰值的強度較大，並具有較小的接觸角，證明了實施例1至14的第二配向膜面向該第一配向膜的表面確實具有親水性基團。

接著，比較實施例4至6與比較例1至3的正交偏光光學紋理圖，實施例4至6的正交偏光光學紋理圖的光學紋理較亮較明顯，證實當第二配向膜表面具親水性時能提高偵測靈敏度。

而且將第二配向膜表面未具有親水性的比較例1至3視為第一組時，比較例1的正交偏光光學紋理圖的紋理幾乎為全暗，代表第一組的最低偵測濃度為1×10^-2 μg/ml。將第二配向膜表面具有親水性的實施例1至14視為第二組時，實施例9的正交偏光光學紋理圖的光學紋理最不明顯，代表該第二組的最低偵測濃度為1×10^-5 μg/ml(相當於0.01ng/ml)，也就是說第二配向膜的表面具有親水性時能大幅降低可偵測的最低濃度。

[探討例1]

為探討向列型液晶組份的種類對偵測靈敏度影響，在固定待測物的種類(CA125抗原)、濃度(1μg/ml)及液滴大小(2μl)的情況下，使用不同的向列型液晶組份進行實驗。其中，以比較例1的相同製備方式製備探討例1液晶感測器，差別在於：向列型液晶組份的種類。探討例1中所使用的向列型液晶組份的相關參數及實驗結果如下表2所示：

由圖6(a)~(e)至8(a)~(e)可發現，相較於使用5CB，使用HDN及E7作為向列型液晶組份時，正交偏光光學紋理圖具有較亮較明顯的光學紋理，證明使用於20~25℃及波長589nm下所測得的雙折射率△n範圍為大於0.2至小於0.4的向列型液晶組份可以具有較佳的偵測靈敏度。

[探討例2]

以比較例1的相同製備方式製備探討例2液晶感測器，差別在於：是先混合一5×10^-3 μg/ml的CA125抗體溶液與一5×10^-3 μg/ml的CA125抗原溶液形成一免疫複合物溶液(總濃度為1×10^-2 μg/ml)，再使該免疫複合物溶液固定於該第二配向膜的表面。實驗結果如圖9所示。

比較探討例2的圖9及比較例1的圖5(a)，探討例2中所使用的總濃度為1×10^-2 μg/ml，比較例1中所使用的總濃度為2×10^-2 μg/ml，但相較於圖5(a)，圖9的正交偏光光學紋理圖具有較亮較明顯的光學紋理，也就是說藉由探討例2中直接使用免疫複合物溶液固定於該第二配向膜的表面能提昇偵測靈敏度。

綜上所述，本發明液晶感測器及用於檢測生物分子的方法因為該第二配向膜面向該第一配向膜的表面具有親水性，使得該待測物能更牢固地固定於該第二配向膜面向該第一配向膜的表面，所以能大幅提昇偵測靈敏度。同時，該向列型液晶組份的雙折射率△n 範圍為大於0.2至小於0.4也有助於提昇偵測靈敏度。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。