TWI488624B - 鐵螯合劑、其製造方法及鐵離子之定量、捕捉方法 - Google Patents

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Katsuya Ikuta
Katsunori Sasaki
Yuzo Nishida
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Nat University Corp Asahikawa Medical College
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Description

鐵螯合劑、其製造方法及鐵離子之定量、捕捉方法 技術領域
本發明係關於一種鐵螯合劑(例如，可對非轉鐵蛋白結合鐵螯合之鐵螯合劑)、鐵離子之定量方法及鐵離子之捕捉方法。
本申請案係以業已在2008年9月22日於日本提出申請之日本特願2008-243095號為基礎來主張優先權，並於此援用其內容。
 背景技術
近年來，稱為慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease：CKD)之新型疾病概念被指出，而在全世界受到矚目。該慢性腎臟病之治療係以第II型血管收縮素抑制劑之使用、利用低蛋白質米之飲食管理及各種危險因子之管理等來進行，但每年高達4萬人因洗腎、合併心血管障礙導致死亡，而需求嶄新之治療方法。作為慢性腎臟病之治療方法，將位在慢性腎臟病之原因之最上游的非轉鐵蛋白結合鐵(NTBI；non-transferrin-bound iron)、羰基化合物去除的治療方法甚為有效。
作為將活體內之鐵(特別是非轉鐵蛋白結合鐵(NTBI))去除至體外的治療方法，有(1)放血療法、(2)限制鐵之飲食方法、(3)鐵螯合劑之藥物療法及(4)體外血液循環淨化療法等。放血療法對患者之QOL(生活品質；Quality of Life)甚 佳，但有貧血及低蛋白血症等之副作用，而僅可適用在不具貧血之患者上。限制鐵之飲食方法則有營養不均衡等之副作用，而僅可適用在部分肝病上。鐵螯合劑之藥物療法雖說鐵螯合劑之效果顯著而主要利用在輸血後鐵過剩症之患者上，但輕度之鐵過剩或鐵代謝異常所導致之部分臟器的鐵相關障礙，據稱過度螯合所引起的副作用之頻度甚高。此外，體外血液循環淨化療法為一種利用血液之體外循環來去除鐵(鐵離子等)之方法，其具有施行時可使對活體具毒性之非轉鐵蛋白結合鐵不會產生因過度螯合而引起之臟器毒性的特性。
因此，現今正在探討藉由體外血液循環淨化療法來去除非轉鐵蛋白結合鐵的方法，而需要開發出可專一性且有效地吸附非轉鐵蛋白結合鐵的配位子(鐵螯合劑)。特別是，需要開發出一種對活體內有用之轉鐵蛋白結合鐵不具螯合能力(即，不會捕捉轉鐵蛋白結合鐵)而僅可捕捉非轉鐵蛋白結合鐵的鐵螯合劑。
此外，慢性腎臟病一旦進入第4期之階段，則因已荒廢之腎元增加，對殘存腎元造成負擔而更為荒廢，陷入惡性循環而變得必須洗腎。另一方面，於第3期之階段中，心血管病變之風險將大幅增加。洗腎治療每週需要3次，且洗腎所需時間可達4小時，在損及患者之QOL之同時，亦會損失工作機會。因此，若能在第3期之階段進行治療來防止洗腎及合併心血管疾病，可隨之減少鉅額之醫療費用(據稱日本之洗腎醫療費用超過1.2兆日幣)。
另一方面，目前已提出各種可螯合鐵離子之鐵螯合劑(例如，參照專利文獻1~8)。
此外，活體內不安定鐵(特別是非轉鐵蛋白結合鐵)之使用高速液體層析法(High-Performance Liquid Chlomatography)的定量方法中，正常人血中之NTBI值常會標記為負值，而有可靠性不足的問題。爰此，藉由使利用該HPLC之NTBI測定系統的問題點明朗化並予以改善，將可建構出安定且高感度之NTBI測定系統，可以想見的是，其結果將可正確求出正常人血中NTBI值。
先行技術文獻 專利文獻
【專利文獻1】日本特表2007-532509號公報
【專利文獻2】日本特表2006-504748號公報
【專利文獻3】日本特表2005-509649號公報
【專利文獻4】日本特表2000-507601號公報
【專利文獻5】日本特表2008-520669號公報
【專利文獻6】日本特表2002-502816號公報
【專利文獻7】日本特表2000-506546號公報
【專利文獻8】日本特開2004-203820號公報
 發明概要
本發明之目的在於提供一種可對鐵離子(特別是非轉鐵蛋白結合鐵)作選擇性螯合的鐵螯合劑以及其製造方 法。此外，本發明之另一目的在於提供一種使用本發明之鐵螯合劑的鐵離子定量方法以及使用本發明之鐵螯合劑的鐵離子捕捉方法。此外，本發明之目的在於提供一種安定且高感度之NTBI測定系統。
本案發明人為達成前述目的而精心探討，結果發現：導入有特定胺基酸之結構的苯酚系螯合劑除了可對鐵離子作選擇性螯合之外，並可將非轉鐵蛋白結合鐵等之鐵離子予以有效定量、捕捉；以及，藉由使用螯合劑或離子交換樹脂等，來進行用在試料之前處理等之試劑或溶劑的除鐵，或是藉由採用去除背景值(Background)之減量(Substraction)法，將可提供安定且高感度之NTBI測定系統，而終至完成本發明。
亦即，本發明係關於：[1]一種鐵螯合劑，係對鐵離子具有螯合能力之鐵螯合劑，其特徵在於：係下述式(1)所示之化合物或其鹽；
於式(1)中，環Z表示芳香族烴環或芳香族雜環；R1 表 示伸烷基；R2 及R3 分別獨立表示氫原子、烴基或具有螯合能力之基，且R2 及R3 所示之基的配位數合計為1或2；[2]如前述[1]之鐵螯合劑，其中式(1)中之環Z為6員環之芳香族烴環或芳香族雜環；[3]如前述[2]之鐵螯合劑，其中式(1)中之環Z為苯環；[4]如前述[1]~[3]中任一項之鐵螯合劑，其中式(1)中之R1 為亞甲基；[5]如前述[1]~[4]中任一項之鐵螯合劑，其中式(1)中之R2 的具有螯合能力之基為具有1或2個官能基之基，且該官能基係選自羥基、羧基、胺甲醯基、胺基、胍基、甲脒基及含有氮原子之雜環基；[6]如前述[5]之鐵螯合劑，其中式(1)中之R2 的具有螯合能力之基為羧烷基、羥烷基、胺甲醯烷基、吡啶烷基、吡烷基、嘧啶烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、苯并咪唑烷基或吡唑烷基；[7]如前述[1]~[6]中任一項之鐵螯合劑，其中式(1)中之R3 的具有螯合能力之基為羥甲基、1-羥乙基、(對羥苯基)甲基、吲哚甲基、胺甲醯基甲基、2-胺甲醯基乙基、羧甲基、2-羧乙基、4-胺基丁基、(1H-咪唑-4-基)甲基、3-胍基丙基、巰甲基或2-甲基硫代乙基，且R3 之烴基為甲基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、1-甲基丙基或苯甲基；[8]如前述[7]之鐵螯合劑，其中式(1)中之R3 為羥甲基、1-羥乙基、(對羥苯基)甲基、吲哚甲基、胺甲醯基甲基、2-胺甲醯基乙基、羧甲基、2-羧乙基、4-胺基丁基、(1H-咪唑 -4-基)甲基或3-胍基丙基，且式(1)中之R2 為氫原子；[9]如前述[7]之鐵螯合劑，其中式(1)中之R3 為甲基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、1-甲基丙基或苯甲基，且式(1)中之R2 為具有螯合能力之基；[10]如前述[1]~[9]中任一項之鐵螯合劑，其中式(1)中之環Z及R1 ~R3 不含硫原子；[11]如前述[1]~[10]中任一項之鐵螯合劑，其係4牙或5牙配位子；[12]如前述[1]~[11]中任一項之鐵螯合劑，其具有對於非轉鐵蛋白結合鐵之螯合能力；[13]一種如前述[1]~[12]中任一項之鐵螯合劑之製造方法，其特徵在於該鐵螯合劑之製造方法具有：使芳香族化合物或雜環化合物(結構係結合至羥基與甲醯基或甲醯基烷基所鄰接之碳原子)、與對應於式(1)中之胺基酸殘基的胺基酸或其鹽發生反應的步驟；[14]如前述[13]之鐵螯合劑之製造方法，其中與式(1)中之胺基酸殘基相對應的胺基酸為絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺、天門冬胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸或精胺酸；[15]一種鐵離子之定量方法，其特徵在於：使用如前述[1]~[12]中任一項之鐵螯合劑將鐵離子予以定量；[16]如前述[15]之鐵離子之定量方法，其係以吸光分析法進行定量；[17]如前述[15]或[16]之鐵離子之定量方法，其中鐵離 子為非轉鐵蛋白結合鐵；[18]如前述[15]~[17]中任一項之鐵離子之定量方法，其更包含：將定量所使用之試劑、器具及/或溶劑進行除鐵的過程；[19]如前述[18]項之鐵離子之定量方法，其中除鐵係藉螯合劑來進行；[20]如前述[15]~[19]中任一項之鐵離子之定量方法，其係從定量對象之試料中分取出2個部分，並將其中一者作為全鐵濃度測定用試料，將另一者作為測定定量對象之試料以外的鐵濃度測定用試料，再分別求出鐵濃度，而藉由從全鐵濃度扣除定量對象之試料以外的鐵濃度，求出真正的鐵濃度；[21]一種鐵離子之捕捉方法，其特徵在於：使用如前述[1]~[12]中任一項之鐵螯合劑來捕捉鐵離子；[22]如前述[21]之鐵離子之捕捉方法，其中鐵離子為非轉鐵蛋白結合鐵。
本發明之鐵螯合劑可對鐵離子作選擇性螯合，特別是對非轉鐵蛋白結合鐵可有效作用。
 本發明之實施型態 [鐵螯合劑]
本發明之鐵螯合劑係前述式(1)所示之化合物。前述式(1)所示之化合物中，與環Z鄰接之碳原子係與羥基(-OH 基)、胺基酸殘基-伸烷基(-R1 -NR2 -CHR3 -COOH基)結合。即，本發明之鐵螯合劑具有：羥基與胺基酸殘基-伸烷基係以鄰位之位置關係結合至環Z之碳原子的結構(三角形)。
舉例來說，即使是在專利文獻1等亦有載述之螯合劑中，係於苯酚之羥基與鄰位之位置上具有特定結構的點上採取三角形結構，相對來說，本案發明人作各種探討後發現，本案發明之螯合劑係使該羥基及鄰位之位置與含有上述特定之胺基酸殘基-伸烷基的取代基結合，藉此，可成為不捕捉轉鐵蛋白結合鐵而僅選擇性地捕捉非轉鐵蛋白結合鐵的螯合劑。
本案發明之螯合劑之特徵除了苯酚系螯合劑之羥基與設於鄰位之位置的取代基具有(-R1 -NR2 -CHR3 -COOH)之結構之外，該取代基內可與鐵離子配位之配位原子數為3~4。這是本案發明人於苯酚系螯合劑中探索可選擇性地捕捉非轉鐵蛋白結合鐵的結果而發現者，藉由令羥基與設在鄰位之位置的取代基內之配位數為3~4，與同樣可與鐵離子配位之羥基相互影響下，可提高捕捉非轉鐵蛋白結合鐵時之選擇性。即，本發明之鐵螯合劑係合計配位數為4之4牙配位子或配位數為5之5牙配位子。
於上述取代基中，胺基酸殘基之N與羧基中之O將成為鐵離子之配位原子，藉由將其他1~2處之配位原子適當設在上述取代基內之R2 與R3 所示之基中，可製出可選擇性地捕捉非轉鐵蛋白結合鐵之螯合劑。
R2 與R3 所示之基若如上所述為合計配位數係1~2的組 合，則可適當地從氫原子、烴、具有螯合能力之基選出並使用。
若使用含有N之胺基酸殘基作為含有上述R2 之基，從該N對於鐵離子將成為適宜之配位原子的觀點來看，甚為理想。此外，藉由選擇與構成活體之蛋白質相對應之胺基酸來作為該胺基酸殘基，可將應用於人體時所表現出之毒性抑制到極低，而可製成對人體之安全性極高的螯合劑。
此外，R1 所示之基宜使用不具有與鐵離子相關之配位原子的伸烷基。此時，若伸烷基為碳數1~10程度者，將可選擇性地與非轉鐵蛋白結合鐵螯合。R1 所示之伸烷基的大小(特別是與R1 相連之胺基酸殘基的氮)將會影響對鐵離子顯示之配位力的強弱，這是經由本案發明人之探討而明朗化者，特別是，為了提高非轉鐵蛋白結合鐵之選擇性，碳數宜為1~4程度，尤其是使用亞甲基，將可提高非轉鐵蛋白結合鐵之選擇性。
若依據上述構成之本發明螯合劑，為了捕捉非轉鐵蛋白結合鐵，而使適當數量之配位原子配置在螯合劑中之適當位置，藉此，除了可選擇性地捕捉非轉鐵蛋白結合鐵之外，因該螯合劑係配位成包入鐵離子而形成安定之錯合物，將可防止鐵離子再度解離。
於上述取代基所結合之苯酚系螯合劑中，若可將取代基與羥基保持在適切之位置，則前述式(1)中構成苯酚部分之環Z可為芳香族烴環及芳香族雜環中之任一者，但仍以芳香族烴環更為適宜。
環Z宜為5員以上之環，且更宜為5~8員環，尤宜為6員環。即，環Z以6員環之芳香族烴環(苯環)最佳。此外，環Z之芳香族雜環中，作為構成環之原子(環構成原子)，以含有選自碳原子、氮原子及氧原子中之至少2種原子者為佳，且以僅含碳原子及氮原子者尤佳。環構成原子中，僅含碳原子及氮原子之芳香族雜環可列舉如、吡啶環、嗒環、嘧啶環、吡環等之6員環芳香族雜環等。
環Z之芳香族烴環及芳香族雜環亦可具有取代基。即，與羥基或胺基酸殘基-伸烷基結合之碳原子以外的環構成原子亦可結合有取代基。作為取代基，取代基亦可彼此相互結合而形成環[芳香族環(芳香族烴環或芳香族雜環等)、非芳香族性環(非芳香族烴環或非芳香族雜環等)等]。此種取代基只要是不會阻礙羥基或胺基酸殘基-伸烷基的螯合能力之基即可，並未特別受限，例如，環Z為苯環時，可適宜地例示如5-Cl，3-OH等之取代基。此外，取代基宜為不具有螯合能力之基，具體來說，可例示如烷基等之烴基。
R1 之伸烷基可例示如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、伸丙基及四亞甲基等之碳數1~10的伸烷基，且以碳數1~4之伸烷基為宜。具體來說，宜為亞甲基或伸乙基，而以亞甲基尤佳。
R2 及R3 分別獨立表示氫原子、烴基或具有螯合能力之基。
R2 及R3 之烴基為不具螯合能力之基，舉例來說，可例示如烷基、芳基、芳烷基及環烷基。烷基可例示如甲基、 乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基、庚基及辛基等之直鏈狀/分枝狀烷基。芳基可例示如苯基及萘基。芳烷基可例示如苯基甲基。環烷基則可例示如環己基、環庚基及環辛基。
R3 之烴基宜為與構成活體蛋白質之胺基酸相對應的甲基(「-CH3 」)、1-甲基乙基(「-CH(CH3 )CH3 」)、2-甲基丙基(「-CH2 CH(CH3 )CH3 」)、1-甲基丙基(「-CH(CH3 )CH2 CH3 」)或苯基甲基(「下述式(2a)所示之基」)。
R2 之具有螯合能力之基可例示如具有羥基、羧基、胺甲醯基、胺基、胍基、甲脒基及含有氮原子之雜環基等官能基之基，且宜為具有1或2個官能基(選自羥基、羧基、胺甲醯基及含有氮原子之雜環基)的基，更宜為具有1或2個官能基(選自羥基、羧基、胺甲醯基及含有氮原子之雜環基)的烷基。烷基可例示如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基、庚基及辛基等之直鏈狀/分枝狀烷基。具體來說，可例示如羧烷基、羥烷基、胺甲醯烷基、吡啶烷基、吡烷基、嘧啶烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、苯并咪唑烷基及吡唑烷基。含有氮原子之雜環則可例示如吡啶環、嗒環、嘧啶環、吡環、吡咯環、咪唑環、苯并咪唑環、吡唑環、呋喃環、唑環、異唑環等之芳香族雜環等。
R3 之具有螯合能力之基可與上述R2 之具有螯合能力之基相同，宜為與構成活體之蛋白質的胺基酸相對應之羥甲基(「-CH2 OH)」)、1-羥乙基(「-CH(OH)CH3 )」)、(對羥苯 基)甲基(「下述式(2b)所示之基」)、吲哚甲基(「下述式(2c)所示之基」)、胺甲醯基甲基(「-CH2 CONH2 」)、2-胺甲醯基乙基(「-CH2 CH2 CONH2 」)、羧甲基(「-CH2 COOH」)、2-羧乙基(「-CH2 CH2 COOH」)、4-胺基丁基(「-CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 」)、(1H-咪唑-4-基)甲基(「下述式(2d)所示之基」)或是3-胍基丙基(「-CH2 CH2 CH2 NHC(=NH)NH2 」)、巰基甲基(「-CH2 SH」)或2-甲基硫代乙基(「-CH2 CH2 SCH3 」)。藉此，本發明之鐵螯合劑成為導入有對人體無害之胺基酸的結構，對人體的安全性極高。
【化2】
於本發明中，R2 及R3 所示之基的配位數(實際上與鐵離子配位之配位數)合計為1或2是很重要的。即，若以R3 為基準來說明，當R3 為不具螯合能力之基(氫原子或烴基)時，R2 為配位數1或2之具有螯合能力之基。R3 為配位數1之具有螯合能力之基時，R2 則為不具有螯合能力之基或是配位數1之具有螯合能力之基。R3 為配位數2之具有螯合能力之基時，R2 為不具有螯合能力之基。舉例來說，使用構成活體之蛋白質的胺基酸作為原料時，當相當於R3 之基具有螯合能力時，R2 維持氫原子而無須導入其他基，當R3 為不具螯合能力之基時，則須導入具有螯合能力之基以作為R2 。
具體來說，R3 為羥甲基、1-羥乙基、(對羥苯基)甲基、吲哚甲基、胺甲醯基甲基、2-胺甲醯基乙基、羧甲基、2-羧乙基、4-胺基丁基、(1H-咪唑-4-基)甲基、3-胍基丙基等之具有螯合能力之基時，R2 為不具螯合能力之氫原子或烴基，且宜為氫原子。
此外，R3 為氫原子、甲基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、1-甲基丙基、苯基甲基等之不具有螯合能力之基時，R2 為具有螯合能力之基，更具體來說，宜為羧烷基、羥烷基、胺甲醯烷基、吡啶烷基、吡烷基、嘧啶烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、苯并咪唑烷基及吡唑烷基等之配位數(實際上配位之配位數)為1的螯合基。
本發明之鐵螯合劑中，環Z及R1 ~R3 宜不含硫原子。這是因為，螯合劑所含之硫原子除了對鐵離子以外，對金屬離子之親和性亦甚高，若硫原子含於螯合劑之一部分中，特別是對於非轉鐵蛋白結合鐵之選擇性將有降低之虞。
本發明之鐵螯合劑為式(1)所示之化合物或其鹽，且舉例來說，鹽之形態為前述式(1)所示之化合物的鈉鹽、鉀鹽等之鹼金屬鹽或銨鹽等。此外，本發明之鐵螯合劑具有鹽之形態時，通常是苯酚性羥基成為鹽之形態，但其他部位亦可成為鹽之形態。
此外，本發明之鐵螯合劑亦可呈水合物或溶劑合物之形態。再者，本發明之鐵螯合劑會有存在光學異構物等之立體異構物的情況。鐵螯合劑存在有立體異構物時，鐵螯合劑可為任一立體異構物，亦可為任意立體異構物的混合 物或消旋體。
本發明之鐵螯合劑至使用前為止，羥基或羧基等之各種官能基亦可被保護基所保護。但重要的是，在使用鐵螯合劑時，須將此種保護基去除並恢復為遊離之羥基或羧基等之各種官能基。
本發明之鐵螯合劑係配位數為4之4牙配位子或配位數為5之5牙配位子。又，本發明之鐵螯合劑係呈環Z中鄰接之碳原子分別結合有羥基與胺基酸殘基-伸烷基之結構。即，具有下述結構：相對於與環Z之碳原子結合的羥基，在鄰位上結合有胺基酸殘基-伸烷基(「三角形」)。
本發明之鐵螯合劑因鐵螯合劑為4牙或5牙配位子且呈三角形，而可對1個鐵離子配位1個鐵螯合劑。即，本發明之鐵螯合劑可以對1個鐵離子配位有1個鐵螯合劑之形態的單核配位(錯合物)形態來對鐵離子進行配位。因此，本發明之鐵螯合劑與鐵離子配位之錯合物中，鐵離子會被納入內部而無法輕易解離(無法移動)。因此，應用至人體時，對於人體(特別是腎臟)的毒性非常低，對人體之安全性極高。又，本發明之鐵螯合劑可藉由構成活體之蛋白質之胺基酸(絲胺酸、組胺酸、麩醯胺等)的殘基來構成其中一部分，因此對人體之毒性非常低，對人體之安全性極高。
此外，可藉本發明之鐵螯合劑而螯合的鐵離子可為任何鐵離子，又，鐵離子之價數為2價或3價均可，但較宜為3價。再者，鐵離子可為非轉鐵蛋白結合鐵，該非轉鐵蛋白結合鐵為3價之鐵離子。
本發明中，非轉鐵蛋白結合鐵係指，不與轉鐵蛋白結合且對可能會對人體造成有害作用之鐵離子。因此，舉例來說，非轉鐵蛋白結合鐵不包含：與轉鐵蛋白結合之鐵(轉鐵蛋白鐵錯合物中之鐵離子；轉鐵蛋白結合鐵)、作為鐵蛋白(ferritin)而存在於肝臟/脾臟/骨髓之儲藏鐵、紅血球所含之原血紅素(具有鐵之紫質(porphyrin)錯化合物)4分子與血球蛋白(globin)(4條多胜肽鏈)1分子所構成的血紅素、以及含有1個原血紅素之肌紅素(位於肌肉中且至代謝氧分子而有所需要之時以前會儲藏下來的色素蛋白質)等。為此種非轉鐵蛋白結合鐵之鐵離子在活體中通常不會呈完全之遊離狀態，而被認為具有與陰離子成對之形態。此種陰離子可例示如羥離子(OH- )等。即，可想見的是，非轉鐵蛋白結合鐵係以如Fe3+ ‧3(OH- )、a hydroxy-citrate-(Cit)complex(FeCitOH- )等之形態存在於活體中。
本發明之鐵螯合劑可如上述般用於醫療用途上。例如，投藥予人體時，可經口或非經口投藥。非經口投藥可例示如對靜脈內、肌肉內、皮內及皮下作注射投藥。此外，除醫療用途之外，亦可使用在工業用途上。
[鐵螯合劑之製造方法]
本發明之鐵螯合劑之製造方法只要是可製造出上述式(1)所示之本發明鐵螯合劑的方法即可，可採用任意之製造方法。舉例來說，宜為具有下述步驟的製造方法：使芳香族烴環化合物或芳香族雜環化合物(其等具有結合至羥基與甲醯基或甲醯基烷基所鄰接之碳原子的結構)、及與式(1) 中之胺基酸殘基相對應之胺基酸或其鹽發生反應的步驟。依此種製造方法，將可於溫和條件下，高效率且低成本地製出本發明之鐵螯合劑。
製造式(1)中環Z為苯環且R1 為亞甲基之鐵螯合劑時，基質(結構係與羥基與甲醯基或甲醯基烷基所鄰接之碳原子結合的芳香族烴環化合物或芳香族雜環化合物)可使用水楊醛。
此外，作為與式(1)中之胺基酸殘基相對應的胺基酸，舉例來說，可使用構成活體之蛋白質的胺基酸，如甘胺酸(Glycine)、丙胺酸(Alanine)、纈胺酸(Valine)、白胺酸(Leucine)、異白胺酸(Isoleucine)、苯基丙胺酸(Phenylalanine)、絲胺酸(Serine)、蘇胺酸(Threonine)、酪胺酸(Tyrosine)、色胺酸(Tryptophan)、天門冬醯胺酸(Asparagine)、麩醯胺(Glutamine)、天門冬胺酸(Aspartic acid)、麩醯胺酸(Glutamic acid)、離胺酸(Lysine)、組胺酸(Histidine)、精胺酸(Arginine)、半胱胺酸(Cysteine)、甲硫胺酸(Methionine)等，於該等之中，宜使用相當於R3 之位置具有具螯合能力之基的絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺、天門冬胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、精胺酸、半胱胺酸及甲硫胺酸，且尤宜使用不含硫原子之絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺、天門冬胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸及精胺酸。亦即，藉由使用具有具螯合能力之基的該等胺基酸，可毋須另行導入具有螯合能力之基，而可極簡便地製 出本發明之鐵螯合劑。再者，使用此等構成活體之蛋白質的胺基酸所製出之鐵螯合劑對人體的安全性極高。此外，亦可將該等胺基酸之相當於R3 之基的官能基進行適當取代(追加/削除等)後再行使用。
具體來說，例如，製造前述式(1)中環Z為苯環且R1 為亞甲基、R2 為氫原子、R3 為羥甲基(胺基酸殘基將成為絲胺酸之殘基)時，可藉由具有使水楊醛與絲胺酸或其鹽發生反應之步驟的製造方法來製造鐵螯合劑。
更具體來說，例如，於燒杯中裝入氫氧化鈉水溶液(2N之氫氧化鈉水溶液)，並在攪拌狀態下，於室溫(10~30℃程度)下將D,L-絲胺酸(粉末狀)直接以粉末狀態少量逐步裝入其中，攪拌約30分鐘以使絲胺酸溶解於氫氧化鈉水溶液後，使用蒸發器，於40~50℃之溫度下將水分去除。之後，使用燒杯，將殘留之白色殘渣於攪拌下且在室溫(10~30℃程度)下放入甲醇中，攪拌30分鐘使其溶解，並於攪拌下且於室溫(10~30℃程度)下於該溶液中直接加入與D,L-絲胺酸相同莫耳數之水楊醛。此時，溶液立即變成黃色。之後，再次使用蒸發器，於30~40℃之溫度下將甲醇完全去除，使用燒杯，於攪拌下且於室溫(10~30℃程度)下使殘留之黃色固體溶解於甲醇中。於攪拌下且於室溫(10~30℃程度)下，將氫化硼鈉(NaBH4 )直接以固體狀態少量逐步加入該甲醇溶液中。此時，溶液逐漸變白。於黃色成分全部消失的時間點(約60分鐘)停止添加氫化硼鈉，於室溫(10~30℃程度)下攪拌1小時後，於室溫(10~30℃程度)下加入少量之水，之 後，使不溶物以自然過濾法過濾並去除。之後，使用蒸發器，於40~50℃之溫度下使溶劑從濾液去除，使用燒杯，於攪拌下及室溫(10~30℃程度)下少量逐步添加水，使殘留之白色殘渣溶解於水後，將鹽酸水溶液(2N鹽酸水溶液)於攪拌下且於室溫(10~30℃程度)下徐徐添加至該水溶液中。此時，隨著溶液之pH降低，將析出白色結晶(此外，此時需使pH不致降到1以下)。之後，於室溫(10~30℃程度)下放置(靜置)1天後，吸引並過濾結晶，以甲醇洗淨後，利用乾燥器並耗費24小時使其乾燥，即可製得前述式(1)中環Z為苯環且R1 為亞甲基、R2 為氫原子、R3 為羥甲基之本發明鐵螯合劑。關於其他鐵螯合劑，可以此一具體製造方法為準來進行製造。
如前述，結構係結合至羥基與甲醯基或甲醯烷基所鄰接之碳原子的芳香族烴環化合物或芳香族雜環化合物、與對應於式(1)中之胺基酸殘基的胺基酸或其鹽之反應可在室溫(10~30℃程度)下進行，而可在非常溫和之條件下進行反應。此外，各步驟之反應時間亦通常在1小時以內，可迅速地進行反應。再者，可於空氣環境下進行反應，無需利用惰性氣體(氮氣等)進行取代等。此外，溶劑亦可使用水性溶劑或親水性有機溶劑等，且用作親水性有機溶劑之甲醇等可透過回收而再利用，從環保觀點來看可謂亦甚良好。再者，原材料等可使用較為價廉之物，從成本面上可說亦是有利。此外，若依此種製造方法，可以高達50%以上之收率來製得鐵螯合劑，且可製得純度幾達100%之鐵螯合劑。
又，可在與環Z側之基質發生反應前或後進行對R2 導入所需之基，但在合成上，宜在與環Z側之基質反應後進行。即，可採用具有下述步驟A及步驟B之製造方法。
步驟A：使結構係結合至羥基與甲醯基或甲醯烷基所鄰接之碳原子的芳香族烴環化合物或芳香族雜環化合物、與對應於式(1)中之胺基酸殘基的胺基酸或其鹽發生反應的步驟。
步驟B：使對應於R2 之化合物與步驟A所得之螯合劑反應的步驟。
[鐵離子之定量方法]
本發明之鐵離子之定量方法的特徵在於：使用上述本發明之鐵螯合劑來定量鐵離子。本發明之定量方法即使以非轉鐵蛋白結合鐵作為鐵離子，亦可有效進行定量。因此，舉例來說，將採取自活體之血液的非轉鐵蛋白結合鐵予以定量，即可評估活體之鐵過剩狀態等。
本發明鐵螯合劑之與鐵離子配位的錯合物(鐵錯合物或鐵螯合物)具有與鐵離子或鐵螯合劑之吸光波長不同的特徵吸收波長(吸光波長)。因此，可利用對應於鐵錯合物之光吸收波長的所需波長之光(例如，波長466nm之光(紫外線))來進行吸光分析。且，鐵錯合物之吸光度與鐵錯合物之濃度相關，強度與鐵錯合物之濃度增加成比例地增加，而可利用吸光分析法(吸光光度分析法)進行鐵離子之定量。
具體來說，本發明之鐵離子之定量方法例如，於含有鐵離子之溶液中添加本發明之鐵螯合劑溶液，於反應(螯合 化反應)結束後，使用分光光度計並照射特定波長之光(例如波長466nm之光)，藉由測定所照射之光通過試料(即，含有鐵錯合物之溶液)時受到吸光之量，即可定量出鐵錯合物之量(即，鐵離子之量)。此外，於定量鐵離子時，需事先把握鐵錯合物之吸光度與鐵錯合物之濃度間的關係，並預先獲得檢量線數據。
鐵離子定量時所使用之含有鐵離子之溶液及鐵螯合劑溶液的溶劑可使用Dulbecco's磷酸緩衝生理食鹽水(D-PBS)、純水(如密理博(MILLIPORE)社製之超純水製造裝置「密理Q(Milli-Q)」所製作之純水等；所謂的「密理Q水」)等。溶劑可組合1種或2種以上使用。
此外，鐵離子定量時，較鐵離子之莫耳數過剩地添加鐵螯合劑以使所有鐵離子均確實螯合化，此點在正確定量鐵離子上甚為重要。
此外，本發明之鐵離子之定量方法可使用在醫療用途及工業用途上。
[鐵離子之捕捉方法]
本發明之鐵離子之捕捉方法的特徵在於：使用上述本發明之鐵螯合劑來捕捉鐵離子。本發明之鐵螯合劑對於鐵離子(特別是3價鐵離子)之螯合能力非常高，可選擇性地捕捉鐵離子，有效減低系統內之鐵離子量。此外，亦可有效捕捉作為鐵離子之非轉鐵蛋白結合鐵，因此，可有效捕捉活體內之過剩鐵(即非轉鐵蛋白結合鐵)，減低過剩鐵對活體造成的不良影響。此外，捕捉活體內之過剩鐵後，亦可於 活體外將其去除。
具體而言，捕捉鐵離子之方法可為：例如，將本發明之鐵螯合劑(或含有物)導入至鐵離子含有物的方法；或是，將鐵離子含有物導入至本發明之鐵螯合劑(或含有物)的方法。此外，鐵離子含有物可列舉如含有鐵離子之液態物，且宜為水性液態物。此外，鐵螯合劑含有物並未特別受限，可依使用形態加以適當設定，可例示如：溶解或分散有鐵螯合劑之液態物、混合有鐵螯合劑之水溶性或水分解性之固態物、於內部含有鐵螯合劑之水溶性或水分解性之膠囊狀物、固定有鐵螯合劑之固態物(濾件等)等。
本發明之鐵離子之捕捉方法中，以利用本發明之鐵螯合劑直接捕捉鐵離子最為適宜，但亦可先使鐵離子暫時藉氮基三乙酸(氮基三乙酸；NTA)、N-(2-羥乙基)伸乙基二胺-N,N′,N′-三乙酸(HEDTA)、伸乙基二胺-N,N,N′,N′-四乙酸(EDTA)等之其他螯合劑而錯合物化(螯合化)後，再以本發明之鐵螯合劑來奪取該錯合物中(螯合物中)之鐵離子，藉此來捕捉鐵離子。
此外，本發明之鐵螯合劑對已結合有轉鐵蛋白之鐵(轉鐵蛋白結合鐵)之螯合能力甚低，幾乎或完全不會從轉鐵蛋白結合鐵奪取(取代)鐵離子。因此，於本發明中，欲使其捕捉活體中之過剩鐵時，幾乎或完全不會從活體所必須的轉鐵蛋白結合鐵中奪取鐵離子，而可僅捕捉對活體不必要之非轉鐵蛋白結合鐵，可有效圖謀減低活體中之過剩鐵。
此外，本發明之鐵離子之捕捉方法可使用在醫療用途 及工業用途上。
茲顯示實施例如下，俾更詳盡地說明本發明，但本發明不受相關實施例的任何限制。
實施例1
於燒杯中裝入2N之氫氧化鈉水溶液，於攪拌下且於室溫(25℃程度)下，將D,L-絲胺酸(東京化成工業株式會社製；粉末狀)直接以粉末狀少量逐步加入其中，攪拌約30分鐘，藉此使絲胺酸溶解於氫氧化鈉水溶液。之後，使用蒸發器，於40~50℃溫度下去除水分。之後，更使用燒杯，將殘留之白色殘渣於攪拌下且於室溫(25℃程度)下加入甲醇中，攪拌30分鐘使其溶解，並於攪拌下且室溫(25℃程度)下，將與D,L-絲胺酸相同莫耳數之水楊醛直接加入該溶液中，溶液立即變為黃色。
之後，再次使用蒸發器，於30~40℃溫度下完全去除甲醇，使用燒杯，於攪拌下且室溫(25℃程度)下，使殘留之黃色固體溶解於甲醇中。於攪拌下且室溫(25℃程度)下，將氫化硼鈉(NaBH4 )直接以固體狀態少量逐步加入該甲醇溶液中。此時，溶液之顏色轉白，於黃色成分全部消失之時間點(約60分鐘)停止添加氫化硼鈉，於室溫(25℃程度)下攪拌1小時後，於室溫(25℃程度)下加入少量水，之後以自然過濾法過濾並去除不溶物。
之後，使用蒸發器，於40~50℃溫度下從濾液去除溶劑，使用燒杯並於攪拌下且室溫(25℃程度)下，將殘留之白色殘渣少量逐步添加至水中，使其溶解於水後，於攪拌下 且室溫(25℃程度)下，將2N鹽酸水溶液徐徐添加至該水溶液中。此時，隨著溶液之pH降低而析出白色結晶。此時之pH為1以上。
之後，於室溫(25℃程度)下放置(靜置)1天後，吸引並過濾結晶，更以甲醇將其洗淨後，利用乾燥器耗費24小時使其乾燥，而製得下數式(3a)所式之鐵螯合劑(使用絲胺酸之鐵螯合劑；o-[(1-羧基-2-羥乙基)-胺基-甲基]-苯基)。
實施例2
與實施例1相同地製得下述式(3b)所示之鐵螯合劑(使用組胺酸之鐵螯合劑；o-[(1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)乙基)-胺基-甲基]-苯基)。
【化4】
實施例3
與實施例1相同地製得下述式(3c)所示之鐵螯合劑(使用麩醯胺之鐵螯合劑；o-[(1-羧基-2-胺甲醯基甲基乙基)-胺基-甲基]-苯基)。
【化5】
[比較例1]
使用氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid；NTA)之游離鹽(商品名「24501-42」(NTA))及鈉鹽(商品名「245-02」(NTA Disodium Salt：NTA2Na)及「24503-22」(NTA Trisodium Salt：NTA3Na)nacalai tesque社製)作為鐵螯合劑。
[比較例2]
鐵螯合劑使用檸檬酸(citrate)。此外，鐵螯合劑之評估過程中，檸檬酸與鐵螯合之檸檬酸鐵錯合物的銨鹽已有市售，作為其市售品，使用商品名「F5879-100G」(Sigma社製；Ammnonium iron(III)citrate)。
[比較例3]
使用N-(2-羥乙基)-伸乙基二胺三乙酸 [N-(2-hydroxyethyl)-ethylenediaminetriacetic acid；HEDTA]之鈉鹽(商品名「H2378-100G」Sigma社製；HEDTA trisodium salt hydrate)作為鐵螯合劑。
[鐵螯合劑之評估A]
關於實施例1之鐵螯合劑，就其對鐵有無螯合能力一事，以下述評估方法A進行評估。
(鐵螯合劑溶液之調製方法)
以50ml之錐型管(Conical tube)量取實施例1之鐵螯合劑(MW：209.2)：335mg後，添加Dulbecco's磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.2；1×D-PBS)15ml，更添加氫氧化鈉(MW：40.0)結晶70mg，激烈攪拌(shake)10分鐘，在打開蓋子前先稍作遠心分離(1000rpm，flashing)。之後，添加1×D-PBS(pH7.2)16.75ml，使全量為31.75ml，調製出鐵螯合劑溶液。該鐵螯合劑溶液(「Fe-Ser‧Na(50mM)」)之鐵螯合劑濃度為50mM(mmol/l)，pH為9.27。
(檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液之調製方法)
分取檸檬酸鐵錯合物銨鹽(商品名「F5879-100G」Sigma社製；Ammnonium iron(III)citrate)220mg，添加1×D-PBS(pH7.2)41.5ml使其溶解，調製出檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液(茶褐色)。該檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液(「FAC溶液(20mM)」)之鐵離子濃度為20mM。
再者，於FAC溶液(20mM)中添加1×D-PBS(pH7.2)，調製出鐵離子濃度為2mM之檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液(「FAC溶液(2mM)」)。
(評估方法A)
將檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液[FAC溶液(20mM)、FAC溶液(2mM)]與1×D-PBS(pH7.2)以表1~2所示比例混合，使用分光光度計(商品名「NanoDrop ND-1000 Full-spectrum UV/Vis Spectrophotometer」SCRUM社製)測定吸光度(波長470nm)(「UV-Vis Module，Measure」)，求出空白下之吸光度(表1~2中之[A])。之後，於前述混合液中添加Fe-Ser‧Na(50mM)158μl，與前述者相同地測定吸光度(波長470nm)，求出實施例之鐵螯合劑添加後的吸光度(表1~2中之[B])。將測定結果示於表1~2。
已從表1~2確認，實施例1之鐵螯合劑對鐵具有螯合能力。特別是，已確認可從檸檬酸鐵錯合物奪取鐵離子。
[鐵螯合劑之評估B]
關於實施例1之鐵螯合劑，就其有無對鐵之螯合能力一事，以下述評估方法B進行評估。
(鐵螯合劑溶液之調製方法)
與前述鐵螯合劑之評估A中的鐵螯合劑溶液之調製方法相同地，調製出鐵螯合劑濃度為50mM之鐵螯合劑溶液(Fe-Ser‧Na(50mM))。
(氮基三乙酸鐵錯合物溶液之調製方法)
將氯化鐵(III)六水合物FeCl3 ‧6H2 O(MW270.30)之結晶溶解於密理Q水，調製出80mM溶液(A液)。另一方面，將氮基三乙酸之游離鹽的NTA(191.14)結晶溶解於6N鹽酸，調製出160mM溶液(B液)。將A液10ml與B液10ml分取至燒杯中，一邊徐徐攪拌一邊少量逐步添加碳酸氫鈉NaHCO3 結晶。於氣體停止產生且溶液變為暗綠色之時間點，停止添加NaHCO3 。最後，稀釋至40ml，調製出鐵離子濃度為20mM之氮基三乙酸鐵錯合物溶液(「Fe-NTA溶液(20mM)」)。
更於Fe-NTA溶液(20mM)添加1×D-PBS(pH7.2)，而調製出鐵離子濃度為2mM之氮基三乙酸鐵錯合物溶液(「Fe-NTA溶液(2mM)」)。
(評估方法B)
將氮基三乙酸鐵錯合物溶液[Fe-NTA溶液(20mM)、Fe-NTA溶液(2mM)]與1×D-PBS(pH7.2)以表3~4所示比例混合，使用分光光度計(商品名「NanoDrop ND-1000 Full-spectrum UV/Vis Spectrophotometer」SCRUM社製)，測定吸光度(波長470nm)(「UV-Vis Module，Measure」)，求出空白下之吸光度(表3~4中之[A])。之後，於前述混合液中添加Fe-Ser‧Na(50mM)158μl，與前述者相同地測定吸光度(波長470nm)，求出實施例之鐵螯合劑添加後之吸光度(表3~4中之[B])。將測定結果示於表3~4。
已從表3~4確認實施例1之鐵螯合劑對鐵具有螯合能力。特別是，已確認可從氮基三乙酸鐵錯合物奪取鐵離子。
[鐵螯合劑之評估C]
關於實施例1~3之鐵螯合劑，就高速液體層析法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)所使用之溶劑，即啉丙磺酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid，C7 H15 NO4 S；MOPS)及乙腈溶液對鐵有無螯合能力一事，以下述評估方法C進行評估。
(MOPS溶液之調製方法)
於100ml之三角燒瓶中，量取口末啉丙磺酸(C7 H15 NO4 S，FW=209.26，Code 341-01801，Lot PX013，Dojindo/Wako社製)2.09g，添加超純水(密理博社製之超純水製造裝置(密理Q)所製作之純水；「密理Q水」)：80ml並使其溶解[pH4.15(24.4℃)]。於該溶液中逐步添加1N氫氧化鈉溶液(1mol/l Sodium Hydroxide Solution，Code 192-02175，Lot SEP7274，Wako社製)100μl，將pH調整至7.0，更使用量筒，以密理Q水調整至100ml，而調製出100mM之MOPS溶液(pH6.99)。
(鐵螯合劑溶液之調製方法)
與前述鐵螯合劑之評估A中之鐵螯合劑溶液之調製方法相同地，有關實施例1~3之各鐵螯合劑，調製出鐵螯合劑濃度為50mM之鐵螯合劑溶液。
此外，使用前述MOPS溶液之調製方法所調製出之MOPS溶液(pH6.99)100mM。
此外，乙腈(C2 H3 N，FW=41.05，Code 347-06641，Lot WPI96，Dojindo/Wako社製)係使用原液。
將密理Q水：13.8ml分取至50ml之錐型管後，分別添加實施例1~3之各鐵螯合劑所製成的鐵螯合劑溶液(Fe-Ser‧Na(50mM)、Fe-His‧Na(50mM)、Fe-Glu‧Na(50mM))各1.2ml後，添加100mM之MOPS溶液1.0ml，更添加乙腈溶液4.0ml，分別調製出使用MOPS之鐵螯合劑溶液。此外，將實施例1~3之各鐵螯合劑所製成之使用MOPS的鐵螯合劑溶液分別稱為「Fe-Ser‧Na(MOPS溶液)」(實施例1之鐵螯合劑)、「Fe-His‧Na(MOPS溶液)」(實施例2之鐵螯合劑)、「Fe-Glu‧Na(MOPS溶液)」(實施例3之鐵螯合劑)。
(鐵錯合物溶液之調製方法)
與前述鐵螯合劑之評估A中之檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液之調製方法相同地，調製出鐵離子濃度為20mM之檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液(FAC溶液(20mM))與鐵離子濃度為2mM 之檸檬酸鐵錯合物銨鹽溶液(FAC溶液(2mM))。
此外，與前述鐵螯合劑之評估B中之氮基三乙酸鐵錯合物溶液之調製方法相同，鐵離子濃度為20mM之氮基三乙酸鐵錯合物溶液(Fe-NTA溶液(20mM))與鐵離子濃度為2mM之氮基三乙酸鐵錯合物溶液(Fe-NTA溶液(2mM))。
(評估方法C)
於使用MOPS之鐵螯合劑溶液[Fe-Ser‧Na(MOPS溶液)、Fe-His‧Na(MOPS溶液)、Fe-Glu‧Na(MOPS溶液)]中，分別添加FAC溶液(20mM)並使其混合，而發色為茶褐色。此外，相同地，添加FAC溶液(2mM)並使其混合，而發色為茶褐色。
另，於使用MOPS之鐵螯合劑溶液[Fe-Ser‧Na(MOPS溶液)、Fe-His‧Na(MOPS溶液)、Fe-Glu‧Na(MOPS溶液)]中，分別添加Fe-NTA溶液(20mM)並使其混合，而發色為茶褐色。
此外，相同地添加Fe-NTA溶液(2mM)並使其混合，結果，發色為茶褐色。
因此，已確認即使是在該溶劑系統中，實施例1~3之鐵螯合劑仍具有鐵螯合能力，且可從檸檬酸鐵錯合物銨鹽(FAC)及氮基三乙酸鐵錯合物(Fe-NTA)奪取鐵離子。
(鐵螯合劑之評估D)
有關實施例1~2之鐵螯合劑，就其從轉鐵蛋白鐵錯合物(轉鐵蛋白已與鐵離子螯合之轉鐵蛋白鐵錯合物)奪取鐵離子之特性，以下述評估方法D進行評估。
(鐵螯合劑溶液之調製方法)
與前述鐵螯合劑之評估A中之鐵螯合劑溶液的調製方法相同地，使實施例1之鐵螯合劑溶解於1×D-PBS(pH7.2)，調製出鐵螯合劑濃度為5mM之鐵螯合劑溶液(「Fe-Ser‧Na(5mM)」)。
此外，與前述者相同地，將實施例2之鐵螯合劑溶解於1×D-PBS(pH7.2)，調製出鐵螯合劑濃度為5mM之鐵螯合劑溶液(「Fe-His‧Na(5mM)」)。
再者，與前述者相同地，調製出將比較例3之鐵螯合劑(HEDTA)之800mM溶液。將結晶13.76g分取至50ml之錐型管，加入密理Q水25ml溶解後，使用濃鹽酸(35~37%)調整至pH7.0，以密理Q水使全量為50ml(「HEDTA溶液(800mM)」)。使用1×D-PBS(pH7.2)，調製出HEDTA濃度為5mM之HEDTA溶液(「HEDTA溶液(5mM)」)。
(氮基三乙酸溶液之調製方法)
此外，與前述者相同，使用比較例1之鐵螯合劑(NTA2Na及NTA3Na)，調製出800mM溶液(pH7.0)。將NTA2Na 9.4g溶解於密理Q水，使全量為50ml(有時稱為「NTA2Na溶液(800mM)」)。另一方面，將NTA3Na 11.0g溶解於密理Q水，使全量為50ml(「NTA3Na溶液(800mM)」)。混合NTA2Na溶液(800mM)(pH6.3)與NTA3Na溶液(800mM)(pH11.3)，調製出pH7.0之800mMNTA溶液。使用1×D-PBS(pH7.2)，調製出NTA濃度為5mM之NTA溶液(「NTA溶液(5mM)」)。
(轉鐵蛋白鐵錯合物之調製方法)
使市售之轉鐵蛋白鐵錯合物(holo-Transferrin(hTf)，human，Code T0665-50MG，Lot 095K1633，Sigma社製)溶解於1×D-PBS(pH7.2)，調製出鐵離子(轉鐵蛋白結合鐵之鐵離子)濃度為50μM之轉鐵蛋白鐵錯合物溶液。
(評估方法D)
將50μM之轉鐵蛋白鐵錯合物溶液分取50μl至1.5ml之樣本管，於其中分別添加各鐵螯合劑溶液(Fe-Ser‧Na(5mM)，Fe-His‧Na(5mM)，NTA溶液(5mM)，HEDTA溶液(5mM))50μl，於室溫且遮光下靜置24小時。將各種反應液50μl分取至離心式超過濾單元(商品名「Amicon Ultra-4 Ultracel-30k」UFC8030 Millipore社製)，於其中添加1×D-PBS(pH7.2)450μl，於20℃下以3,500rpm進行離心30分鐘，分離出轉鐵蛋白與低分子之各鐵螯合劑(第1次)。離心後，將濾液廢棄。於經單元濃縮之含有轉鐵蛋白之溶液(殘留約50μl)中再次添加1×D-PBS(pH7.2)450μl，以相同條件進行離心分離(第2次)。第2次離心處理後，將單元內業經濃縮之含有轉鐵蛋白之溶液回收，使用分光光度計(商品名「Spectrophotometer DU 640」Beckman Coulter社製)，測定波長466nm之吸光度。將評估結果示於表5。
從表5可知，實施例之鐵螯合劑即使添加至轉鐵蛋白鐵錯合物溶液中，吸光度(波長466nm)之變化亦少，而確認幾乎甚或完全未從轉鐵蛋白鐵錯合物奪取到鐵離子。此外，實施例1之鐵螯合劑的情況下，添加至轉鐵蛋白鐵錯合物溶液後之吸光度(波長466nm)上昇。這被認為是因為實施例1之鐵螯合劑奪取存在於系統中之背景鐵離子，而非是奪取轉鐵蛋白鐵錯合物之鐵離子。
實施例4
使用螯合劑及離子交換樹脂，嚐試將試料(血清)前處理所使用之試劑及溶劑予以除鐵。另一方面，超過濾單元則使用已除鐵完成之蒸餾水洗淨。
蒸餾水、PBS：
蒸餾水(和光純藥)及PBS(Gibco)係相對各溶液3liter直接將Chelex®100 Resin(Analytical Grade、100-200Mesh、Bio-Rad Labo.)(以下，略稱為Chelex100)100g添加至試藥瓶，全體攪拌後，靜置並使用其上清液(批次法)。
NTA溶液：
準備各批(lot)的NTA試劑，預先比較探討鐵之混有狀態。之後，選擇最少混有鐵的一批。原本，NTA溶液之調製方法係混合NTA‧2Na溶液(pH6.30)與NTA‧3Na溶液(pH11.30)，再調控混合比以達到目的之pH。例如，於NTA‧2Na溶液5.0ml中添加NTA‧3Na溶液0.1ml時，其NTA溶液之pH顯示為7.21。然而，一旦使用強酸性陽離子交換樹脂，則難以調整溶液之pH。爰此，單獨以NTA‧3Na調製NTA溶液，於除鐵處理後，以MOPS Buffer予以稀釋，可將NTA溶液之pH調整至中性領域。於此，以Chelex100處理完畢之蒸餾水將NTA‧3Na結晶(和光純藥)溶解，調製出800mM溶液(pH11.42)。對該800mM NTA‧3Na溶液1ml添加強酸性陽離子交換樹脂(SK1BH，三菱化學)1g，攪拌1小時後回收上清液。接著，以Chelex100樹脂處理完畢之100mM MOPS Buffer(同仁化學)稀釋10倍，製成80mM NTA‧3Na溶液(pH7.08)。
[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O：
該溶液係以鈷離子為中心的錯合物試劑，無法僅去除混於溶液中之鐵離子。於是，調製該溶液時，為了使鐵離子之混入抑制在最小限度，試劑瓶及滴管全部使用塑膠製拋棄式器具。用以溶解試藥之蒸餾水則已預先施加Chelex100處理。
精密過濾單元：
調製[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O溶液及調製HPLC移動相溶 液時所使用之吸引式過濾單元：Stericup-HV(Millipore)係於使用瞬前以Chelex100處理完畢之蒸餾水50ml洗淨2次，將混入透膜之鐵予以洗淨去除處理。
超過濾單元：
Amicon® Ultra-4/Ultracel-30K及Amicon® Ultra-0.5/Ultracel-10K(Millipore)係於使用瞬前以Chelex100處理完畢之蒸餾水0.5~1.0ml洗淨2次，將混入透膜之鐵予以洗淨除去處理。
評估方法：
測定裝置：於使用Nonmetallic PEEK(polyether-ethylketone)管之2796BioSeparation Module、2998Photodiode Array檢測器(Waters)中，安裝OmniSpher5C18玻璃管柱(G100×3 Repl)、ChromSep保護管柱(Varian)的Non-metal HPLC系統，或是以原子吸光法來評估混有鐵離子的狀態。
蒸餾水：
使用Non-metal HPLC，評估Chelex100之除鐵效果。結果，Chelex100處理後之蒸餾水中的鐵離子濃度可抑制到檢測界限以下。
PBS：
使用Non-metal HPLC，評估Chelex100之除鐵效果。結果，Chelex100處理後之PBS中之鐵離子濃度可抑制到檢測 界限以下。
NTA：
使用Non-metal HPLC，比較評估各批之間的鐵之混有量。
結果得知，因試劑之製造商而在品質上有所差異。
接著，使用各種螯合劑及離子交換樹脂來比較探討除鐵效果。
明確得知於4種樹脂之中，以SK1BH樹脂最為有效。但，慮及樹脂處理後之NTA溶液之pH，採用上述之NTA溶液調製方法。
[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O：
鈷濃度係以ICP質量分析法、鐵濃度則以電加熱原子吸 光法分別測得。第1次之調製係使用玻璃製試劑瓶及定性用濾紙調製而得之[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O溶液的鈷濃度及鐵濃度。相對於1mM鈷濃度，混有0.820μM之鐵。另一方面，第2次調製則是使用塑膠製拋棄式器具(試劑瓶、滴管)，並使用預先已藉Chelex 100處理完畢之蒸餾水洗淨的吸引式過濾器來取代濾紙，所調製成之[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O溶液相對於1mM鈷濃度，鐵濃度可抑制到0.014μM。於第1次調製與第2次調製之間，混入之鐵量可減輕58.5倍。
實施例5
使用經除鐵處理之試劑及溶液來測定正常人血中之NTBI。測定方法則是想出將習知方法改良而成之「Subtraction法」。可去除混入NTA試藥(將血清中之非轉鐵蛋白結合鐵清除(螯合)者)中之鐵，而不會完全去除[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O溶液中所混有之鐵，並藉由將試料分成2個，將其中一者作為含有Background之全鐵濃度測定用試料，將另一者則作為Background之鐵濃度測定用試料，分別求出鐵濃度，從全鐵濃度扣除Background之鐵濃度，即可求出真正的鐵濃度(NTBI)。茲將習知測定方法顯示如下。
試料之前處置：
將試料之前處置方法示於第1圖。將冷凍保存之試料 (血清)快速解凍，至使用時之前冷藏保存於冰中。從已解凍之試料分取450μl至1.5-mL樣本管，於其中添加5mM[Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O 50μl。靜置於37℃之恒溫槽，於apotransferrin之鐵結合側導入鈷離子。1小時後，將試料自37℃之恒溫槽取出，分別於重新準備之1.5-mL樣本管2根中各分注225μl之經鈷離子處理之試料。於一根樣本管中添加80mM NTA‧3Na溶液25μl(試料A)，於另一根樣本管則添加調製80mM NTA‧3Na溶液時之溶劑25μl(試料B)。於室溫下靜置30分鐘，將非轉鐵蛋白結合鐵(Non-transferrin-bound iron：NTBI)視為Fe-NTA錯合物予以清除。接著，於自試料中之鐵結合蛋白質(轉鐵蛋白、鐵蛋白及發色蛋白質之膽紅素)分離出Fe-NTA的目的下，於分液分子量10,000之超過濾單元中添加試料，於20℃下以14,000xg離心分離1小時，並回收超濾液。分別將試料A及試料B之超濾液20μl注入non-metal HPLC。
HPLC之NTBI定量：
裝置：於使用Nonmetallic PEEK(polyether-ethylketone)管之2796BioSeparation Module、2998Photodiode Array檢測器(Waters)中，安裝OmniSpher5C18玻璃管柱(G100×3 Repl)、ChromSep保護管柱(Varian)，建構Non-metal HPLC。
移動相：調製5mM MOPS(同仁化學)、3mM CP-22(Biochemical Pharmacology 57：1305-1310,1999所刊載之發色性螯合劑，依賴合成)、20% acetonitrile(和光純藥)溶液，以過濾單元進行過濾與脫氣處理。
定量：用以算出鐵濃度之標準曲線係使用電加熱原子吸光法而決定鐵濃度之Fe-NTA溶液，獲得鐵濃度在0-10μM範圍的標準曲線。注入20μl之試料A及試料B的各個超濾液，利用相當於求標準曲線時所使用之Fe-NTA作為Fe-CP22檢測出之位置(令檢測器波長為450nm)的尖峰來求出鐵濃度，並以自試料A之鐵濃度(含background之全鐵濃度)扣除試料B之鐵濃度(作為background之鐵濃度)所得之值作為試料中之NTBI予以算出。
結果：
選擇採血時間點上未抱有必須特別接收治療之疾病的正常人作為對象。分類為男性20名(平均年齡33.4歲、平均Hb值15.6g/dl)、女性16名(平均年齡33.8歲、平均Hb值13.2g/dl)。各自之NTBI平均值為男性0.206±0.091μM、女性0.212±0.095μM。
相對於習知已有報告之使用HPLC的測定系統，使用各種螯合劑等可使各階段內混入之鐵的汙染(Contamination)降低，且，藉由在測定過程中將檢體分為兩者，最後再將Background(背景值)予以Subtraction(減量)，而可實施非常低濃度之NTBI測定。透過此次確立之方法，亦可確認正常人之血清NTBI的存在，更可安定地獲得測定值。
[比較例4]
習知HPLC測定方法之問題點被認為是以下所示試料 (血清)之前處置所使用之試劑及溶液中混有的鐵離子所造成的。作為用以溶解試劑之溶劑來使用的蒸餾水、用於稀釋試料之磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、用以捕捉NTBI之氮基三乙酸(NTA)、將元轉鐵蛋白(apotransferrin)之鐵結合側予以封鎖之三碳酸鈷溶液([Na3 (Co(CO3 )3 ]‧3H2 O)中混有鐵離子。第2圖顯示習知之測定方法。
茲顯示第2圖之方法所測定的血中NTBI值結果。
檢體2及檢體3若減去Background值則顯示為負。
產業上之可利用性
本發明之鐵螯合劑可對鐵離子作選擇性地螯合，特別是對非轉鐵蛋白結合鐵可有效作用，因此在產業上極為有用。
第1圖係顯示本發明之鐵濃度測定用試料之前處置方法的說明圖。
第2圖為顯示習知之鐵濃度測定方法的說明圖。

Claims (14)

  1. 一種鐵螯合劑，係對鐵離子具有螯合能力之鐵螯合劑，其特徵在於：係下述式(1)所示之化合物或其鹽； (於式(1)中，環Z表示苯環；R1 表示亞甲基；R2 及R3 分別獨立表示具有螯合能力之基，且R2 及R3 所示之基的配位數合計為2；R2 為具有螯合能力之基，且表示羧烷基、羥烷基、胺甲醯烷基、吡啶烷基、吡烷基、嘧啶烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、苯并咪唑烷基或吡唑烷基；R3 為具有螯合能力之基，且表示羥甲基、1-羥乙基、(對羥苯基)甲基、吲哚甲基、胺甲醯基甲基、2-胺甲醯基乙基、羧甲基、2-羧乙基、4-胺基丁基、(1H-咪唑-4-基)甲基、或3-胍基丙基、巰甲基、或2-甲基硫代乙基。)
  2. 如申請專利範圍第1項之鐵螯合劑，其中式(1)中之環Z及R1 ~R3 不含硫原子。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之鐵螯合劑，其係5牙配位子。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之鐵螯合劑，其具有對於非轉鐵蛋白結合鐵(Non-transferrin bound iron)之螯合能力。
  5. 一種如申請專利範圍第1~4項中任一項之鐵螯合劑之製造方法，其特徵在於該鐵螯合劑之製造方法具有：使芳香族化合物或雜環化合物(結構係結合至羥基與甲醯基或甲醯基烷基所鄰接之碳原子)、與對應於式(1)中之胺基酸殘基的胺基酸或其鹽發生反應的步驟。
  6. 如申請專利範圍第5項之鐵螯合劑之製造方法，其中與式(1)中之胺基酸殘基相對應的胺基酸為絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺、天門冬胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸或精胺酸。
  7. 一種鐵離子之定量方法，其特徵在於：使用如申請專利範圍第1~4項中任一項之鐵螯合劑將鐵離子予以定量。
  8. 如申請專利範圍第7項之鐵離子之定量方法，其係以吸光分析法進行定量。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之鐵離子之定量方法，其中鐵離子為非轉鐵蛋白結合鐵。
  10. 如申請專利範圍第7或8項之鐵離子之定量方法，其更包含：將定量所使用之試劑、器具及/或溶劑進行除鐵的過程。
  11. 如申請專利範圍第10項之鐵離子之定量方法，其中除鐵係藉螯合劑來進行。
  12. 如申請專利範圍第7或8項之鐵離子之定量方法，其係從定量對象之試料中分取出2個部分，並將其中一者作為 全鐵濃度測定用試料，將另一者作為測定定量對象之試料以外的鐵濃度測定用試料，再分別求出鐵濃度，而藉由從全鐵濃度扣除定量對象之試料以外的鐵濃度，求出真正的鐵濃度。
  13. 一種鐵離子之捕捉方法，其特徵在於：使用如申請專利範圍第1~4項中任一項之鐵螯合劑，在活體外來捕捉鐵離子。
  14. 如申請專利範圍第13項之鐵離子之捕捉方法，其中在活體外被捕捉的前述鐵離子為非轉鐵蛋白結合鐵。
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