TWI478902B - Ｇｌｐ－１增效劑及其應用 - Google Patents

Description

GLP-1增效劑及其應用

本發明係關於一種化合物之新用途，特別是關於雙萜類高良薑萜醛(Galanal)B用於調節血糖濃度之用途。

類昇糖素肽-1(GLP-1)類似物為新一類降血糖劑。GLP-1屬於增泌素(incretin)家族的一員，該蛋白家族包含能在進食後協助調控血糖濃度之胃腸道激素。GLP-1是藉由與GLP-1受體專一性結合來發揮其功能。GLP-1受體(GLP-1R)在體內的分布很廣泛，除了存在胰臟組織外，還分佈於腦、肺臟、心臟，腎臟等。此受體蛋白之廣泛分佈造就其具有許多功能。

GLP-1專一地與位於胰臟β細胞上的GLP-1受體結合。活化GLP-1R會促使腺苷醯基環化酶路徑受到刺激，而最終造成胰島素之合成及釋出增加。除了增加胰島素合成及釋出之外，GLP-1與其受體結合也會抑制昇糖素製造，而使血糖濃度在進食後仍保持恆定值。而且，GLP-1亦具有神經細胞調節功能，可延遲胃部排空並降低食慾。同時，GLP-1之降血糖作用是自我限制的，而不會導致低血糖(亦即，不會造成血糖濃度過度降低)。此等特性對於糖尿病的血糖控制很有助益。因此，具有類似GLP-1活性之藥物可視為用於糖尿病控制與治療的理想藥物。於是，搜尋GLP-1類似物已經成為新藥開發之焦點策略之一。

然而，GLP-1是一種肽類，在活體內會很快被DPP-IV(二肽基肽酶IV)分解，而導致其生物活性喪失。GLP-1 的活體內半衰期少於2分鐘，必需施予持續性靜脈輸液或連續的皮下注射來維持其功效。而此性質往往使GLP-1之臨床應用受到限制。因此，最近幾年已針對尋找及研發出長效性GLP-1類似物及DPP-IV抑制劑投注相當的努力。

目前可用的GLP-1類似物，包括Byetta®(艾塞納肽(Exenatide)；Amylin製藥公司，聖地牙哥，CA)及Victoza®(利拉魯肽(liraglutide)；Novo Nordisk公司，丹麥)能用在對其他口服降血糖藥劑不產生反應之第II型糖尿病患者有效控制血糖濃度，而不會造成低血糖。研究發現，此等GLP-1類似物能減輕患者體重，並使血糖控制在更穩定的程度。此外，此等GLP-1類似物能維持(甚至可能增進)第II型糖尿病患者之基礎代謝，及糖類刺激後的β細胞功能，而延遲疾病的進展。

截至目前，對於GLP-1類似物之研究主要聚焦在胜肽類似物或調節劑。因為胜肽藥物無法經由口服投藥而且很容易被分解，故有需要尋求其他類型具有與GLP-1類似物活性相似的藥物。

於是，本發明之一方面係關於一種用於控制血糖濃度之化合物或組成物。於某些具體實施態樣，本發明之化合物為具有如式I所式結構之高良薑萜醛(galanal)類似物：

其中R₈ 為H、-OH或烷氧基(-O-R’)，較佳地，R₈ 為H或-OH，且更佳地，R₈ 為H。

R₅ 為烷基(較佳為C₁ -C₁₀ 烷基；更佳地為C₃ -C₇ 烷基)，或為 含有一或多個雙鍵之烯基(較佳為C₂ -C₁₀ 烯基；更佳地為C₃ -C₇ 烯基)，其中該烷基或烯基為直鏈或支鏈，且視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，其中R’及R”獨立地為H、C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、C₃ -C₁₀ 環烷基或C₆ -C₁₀ 芳基；或者R₅ 含有一5-、6-或7-員環，其為含有一或多個選自N、O或S之雜原子的雜環，或者，其中該5-、6-或7-員環視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，其中R’及R”係如上所定義；且R₆ 及R₇ 係獨立地選自H(其條件為兩者不同時為H)、烷基(較佳為C₁ -C₁₀ 烷基；更佳地為C₁ -C₃ 烷基)，或為含有一或多個雙鍵之烯基(較佳為C₂ -C₁₀ 烯基；更佳地為C₃ -C₅ 烯基)，其中該烷基或烯基為直鏈或支鏈，且視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，其中R’及R”係如上所定義；或者R₆ 與R₇ 結合而形成一烯基(較佳為具有一個連接到位於該環之共同碳原子上的雙鍵之C₁ -C₃ 烯基；更佳地為=CH₂ )；或其中R₈ 為H、-OH或烷氧基(-O-R’)，較佳地，R₈ 為H或-OH，且更佳地，R₈ 為H；R₇ 為甲醯基(-CHO)，且R₅ 與R₆ 結合而形成一環，其為由C、O、N或S原子或其組合所組成的5-、6-或7-員環，其中該環含有0或1個雙鍵，且其中該環視需要地經一或多個具有1-10個碳(C₁ -C₁₀ )，較佳地1-5個碳(C₁ -C₅ )之烷基側鏈取代，且其中該環及/或該一或多個烷基側鏈視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，其中R’及R”係如上所定義。

於某些較佳具體實施態樣，所述之化合物可具有 如式II所示之結構(亦即，R₆ 與R₇ 結合而形成如式I中之=CH₂ )：

其中R₅ 及R₈ 係如上所定義。

於某些較佳具體實施態樣，所述之化合物可具有如式(A)或(B)所示之結構：

其中R¹ 為-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH；R² 為-OR’或-NR’R”；R³ 為-CHO、-CH₂ OR’或-CO₂ R’；R⁴ 二者皆為-H或共同形成=O；X為-O-或NR’，其中R’及R”係如上所定義。

於某些具體實施態樣，所述之高良薑萜醛類似物可包含一或多種下列化合物，其可經合成或從野薑花萃取物單離出：

其中化合物1A 為高良薑萜醛A；化合物1B 為高良薑萜醛B；化合物2 為11-羥基-8(17),12(E)-半日花二烯-15,16-二醛11,15-半縮醛；化合物3 為姜花素(Coronarin)B；化合物4 為7 β-羥基姜花素B；化合物5 為(E)-半日花-8(17),12-二烯-15-醇-16醛；且化合物6 為(E)-15,15-二乙氧基半日花-8(17),12-二烯-16醛。

本發明之一方面係關於控制血糖濃度之方法。一種根據本發明具體實施態樣之方法包括將具式I或II之化合物投藥予有需要的個體。該化合物可為高良薑萜醛A或高良薑萜醛B。該方法可進一步包括將一種GLP-1受體配體投藥予個體。所述之GLP-1受體配體可為GLP-1或毒蜥外泌肽(exendin-4)。所述之化合物與GLP-1受體配體可依序或同時進行投藥。

本發明之有些具體實施態樣可包括式(A)或(B)化合物投藥予有需要的個體。該方法可進一步包括將一種GLP-1受體配體投藥予個體。所述之GLP-1受體配體可為GLP-1或毒蜥外泌肽(exendin-4)。所述之化合物與GLP-1受體配體可依序或同時進行投藥。

本發明之其他方面及優點將於下列敘述及申請專利範圍中被進一步彰顯出來。

圖1列示從野薑花萃取物單離出之高良薑萜醛類似物的化合物結構。

圖2為使用高良薑萜醛B做為起始物料進行本發明化合物之半合成的反應流程圖。

圖3顯示本發明化合物之功效及其EC₅₀ 值。

圖4顯示根據本發明具體實施態樣之化合物1、2及3之GLP-1增效劑功效。

圖5顯示於活體試驗(小鼠IPGTT)中本發明化合物可增加葡萄糖耐受度。

定義

用於本文，術語“高良薑萜醛類似物”係指具有可做為GLP-1增效劑之活性的高良薑萜醛B的雙萜類似物。術語“高良薑萜醛類似物”包括天然存在的高良薑萜醛類，例如高良薑萜醛A及高良薑萜醛B。“高良薑萜醛類似物”之實例如化合物1-6所示，以及包括下述之具有通式(A)與(B)之化合物。

用於本文，術語“GLP-1增效劑”係指能夠增進GLP-1或GLP-1類似物功能之藥劑。如本文所述，GLP-1是藉由專一 性結合至GLP-1受體，接著引發會導致包括胰島素合成及釋出等生物功能之特定傳訊途徑，而執行其功能。任何能增進此類GLP-1或GLP-1類似物功能之藥劑即為“GLP-1增效劑”，而不論其作用機制為何。

用於本文，術語“類昇糖素肽-1(GLP-1)配體”係指任何能活化GLP-1受體(GLP-1R)而具有與GLP-1類似的功能之試劑。此等配體或可指“GLP-1類似物”。亦即，此二術語在本說明書中可相互替換使用。用於本文，術語“GLP-1類似物”包括GLP-1本身。於該項技術領域，已有許多已知的GLP-1類似物，包括GLP-1、毒蜥外泌肽、艾塞納肽、利拉魯肽、他司魯肽(taspoglutide)、阿必魯肽(albiglutide)及利希拉來(lixisenatide)。此等類似物有些為市售可得，已於臨床上使用，並以其商品名稱販售。例如，Byetta®及Bydureon®為由Amylin製藥公司(聖地牙哥，CA)出廠販售之艾塞納肽化合物的商品名稱，而Victoza®為由Novo Nordisk公司(丹麥)出廠販售之利拉魯肽的商品名稱。

用於本文，術語“有效量”係指能夠產生所希望生物功效或治療效果的量。例如，對於GLP-1增效劑而言，其係指能夠產生對於因GLP-1與GLP-1R結合而造成之功效具有實質上增進效果的量。實質上增進效果意指相較於無GLP-1增效劑存在時之對照組，可增加約10%或以上，較佳地約20%或以上，更佳地約30%或以上，且最佳地約50%或以上的功效。發現此有效量僅僅涉及慣常的最適化操作程序，而且熟悉該項技術領域者無需經創作努力或過度實驗，即能夠決定此一有效量。

用於本文，術語“烷基”係指分支或無分支的碳氫部分。較佳地，所述之烷基包含1至14個碳原子(C₁ -C₁₄ )，更佳地1至12個碳原子(C₁ -C₁₂ )、1至10個碳原子(C₁ -C₁₀ )、1至6個碳原子(C₁ -C₆ )或1至4個碳原子(C₁ -C₄ )。烷基之代表性實例包括(但不限定於)甲基、乙基、n -丙基、iso -丙基、n -丁基、sec -丁 基、iso -丁基、tert -丁基、戊基、異戊基、新戊基、n -己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、n -庚基、n -辛基、n -壬基、n -癸基等類。當烷基包括一或多個不飽和鍵時，其可稱作烯基(雙鍵)或炔基(叁鍵)基團。而且，當一烷基與一烷基鍵連時(參見如下定義)，可稱之為“烷基烷基”。

用於本文，術語“環烷基”係指其形成至少一個環之如上所定義的烷基。所述之環烷基較佳具有3-8個碳原子(例如，C₃ -C₈ 環烷基)，較佳地4-7個碳原子(例如，C₄ -C₇ 環烷基)，更佳地5-7個碳原子(例如，C₅ -C₇ 環烷基)。

用於本文，術語“烯基”係指具有2至20個碳原子(C₂ -C₂₀ )，且含有至少一個雙鍵之直鏈或支鏈碳氫基團。所述之烯基較佳具有2-8個碳原子(C₂ -C₈ 環烷基)，更佳地2-4個碳原子(C₂ -C₄ 環烷基)。

術語“芳基”係指於其環部分中具有6-16個碳原子之單環或雙環芳香族碳氫基團。較佳地，所述之芳基為(C₆ -C₁₀ )芳基。非限制性實例包括苯基、聯苯基、萘基或四氫萘基，其個別可視需要地經1-4個取代基，例如視需要地經取代之烷基、三氟甲基、環烷基、鹵基、羥基、烷氧基、醯基、烷基-C(O)-O-、芳基-O-、雜芳基-O-、視需要地經取代之胺基、硫醇、烷硫基、芳硫基、硝基、氰基、羧基、烷基-O-C(O)--、胺甲醯基、硫代烷基、磺醯基、磺醯胺基、雜環烷基等取代。

再者，術語“芳基”用於本文亦指，其可為單芳族環或相互稠合、共價鍵連或連接至共同基團(例如亞甲基或伸乙基部分)之多芳族環的芳族取代基。所述之共同連接基團亦可為如二苯甲酮中之羰基，或如二苯乙醚中之氧，或者如二苯胺中之氮原子。

發明說明

本發明之具體實施態樣係關於GLP-1增效劑，及此等增效劑做為用於糖尿病患者血糖濃度控制之醫療劑的用途。GLP-1增效劑為能夠增進GLP-1或GLP-1類似物功能之藥劑。 GLP-1或GLP-1類似物執行其功能，是藉由結合至GLP-1受體，而引發其導致包括胰島素合成及釋出等生物功能之特定傳訊途徑。任何能增進此類GLP-1或GLP-1類似物功能之藥劑即為“GLP-1增效劑”，而不論其作用機制為何。

本發明之有些具體實施態樣係關於使用高良薑萜醛類似物做為GLP-1增效劑。此等高良薑萜醛類似物可從天然來源分離得，例如分離自野薑花，或可經化學方法合成得。經化學方法合成之高良薑萜醛類似物可為半合成產物，可使用天然產品做為起始物料。本發明之有些具體實施態樣係關於自天然高良薑萜醛類似物(例如，高良薑萜醛B)，經由化學修飾而衍生得之新穎化合物。

本發明之具體實施態樣係關於用於控制血糖濃度之化合物，具有式I所示之結構：

其中R₅ -R₈ 係如上述所定義者。

本發明之有些具體實施態樣係關於控制血糖濃度之方法，包括將具式I之化合物投藥予有需要的個體。該方法進一步包括將一種GLP-1受體配體投藥予該個體。所述之化合物與GLP-1受體配體可同時進行投藥。該化合物可為高良薑萜醛A或高良薑萜醛B。該GLP-1受體配體可為GLP-1或毒蜥外泌肽。

如上所述，GLP-1係屬於能調控血糖濃度之胰泌素(secretin)家族的成員之一。GLP-1係衍生自胰昇糖素原(proglucagon)。迴腸L細胞分泌GLP-1之作用是取決於小腸乳糜管中是否有營養物存在。GLP-1之有效降血糖作用包括葡萄糖 依賴性刺激胰島素分泌，同時壓制昇糖素分泌。由於當血漿的葡萄糖濃度落在正常飯前血糖濃度範圍內時，GLP-1不會刺激胰島素分泌而造成低血糖(血糖過度降低)，故此類葡萄糖-依賴性相當受到注意。

GLP-1專一性結合到GLP-1受體，其為一種與G-蛋白偶合之受體(G-protein-coupled receptor,GPCR)，具有七個穿膜區。GLP-1與GLP-1受體(GLP-1R)之結合會刺激腺苷醯基環化酶路徑，而最終導致胰島素合成及釋出增加。因此，GLP-1R已經暗示可做為糖尿病治療的可能標靶物。

本發明之具體實施態樣係基於，使用GLP-1R做為研發降血糖新藥的標靶物。基於此策略，本案發明人已發現野薑花萃取物含有能增進經由GLP-1/GLP-1R介導之生物活性的分子。此等分子於本發明即稱作“GLP-1增效劑”。

薑類已廣泛使用做為辛香料與食品成份。薑類植物含有雙萜類，例如高良薑萜醛A、高良薑萜醛B。此等萜類似物已發現具有各種生物活性，包括抗微生物功效(Abe等人，“，得自Myoga(Zingiber mioga Roscoe) 的組成分雙萜雙醛類之抗微生物活性及其定量分析”,Bioscie.Biotechnol.Biochem.,68(7),1601-1604(2004))。此外，高良薑萜醛A及B已發現具有抗腫瘤功效(Miyoshi等人，“食用薑類組成分高良薑萜醛A及B為人類T淋巴細胞瘤Jurkat 細胞之有效細胞凋亡誘導劑”,Cancer Lett.,199(2),113-9(2003))。然而，尚無報導指出薑類有助於糖尿病患者的血糖控制。

本案發明人已意外發現，野薑花萃取物含有能增進GLP-1功效之有效成分。特別是野薑花萃取物中的類高良薑萜醛，例如高良薑萜醛A、高良薑萜醛B及類似物(於本發明通稱為“高良薑萜醛類似物”)，已經發現能夠增進經由GLP-1與其受體專一性結合所介導之生物功能。

所述之萃取物可為醇類或有機溶劑萃取物。適用於此類萃取之溶劑例如可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙 醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷類(例如氯乙烷)。於較佳實施態樣，所述之萃取物醇類萃取物。此類萃取物可經乾燥後使用，或可以乾燥萃取物之形式使用。

而且，該等存在野薑花萃取物中之活性成分可經過純化及特徵化。特別地，已經從野薑花萃取物單離出下列化合物1-6 ，並已經過特徵化而具有如下所示之結構：

其中化合物1A 為高良薑萜醛A；化合物1B 為高良薑萜醛B；化合物2 為11-羥基-8(17),12(E)-半日花二烯-15,16-二醛11,15-半縮醛；化合物3 為姜花素(Coronarin)B；化合物4 為7 β-羥基姜花素B；化合物5 為(E)-半日花-8(17),12-二烯-15-醇-16醛；且化合物6 為(E)-15,15-二乙氧基半日花-8(17),12-二烯-16醛。

本發明之類雙萜化合物可研發成為GLP-1受體正面調節劑，其可用於增進(增強)GLP-1/GLP-1R相互作用的反應。如圖4所示，此等化合物為GLP-1類似物(例如，毒蜥外泌肽)之有效增效劑。尤其，如圖4所示之實施例，化合物1、2及3可增強毒蜥外泌肽功能，而促使胰島素釋放增加。

因此，本發明之化合物可用於增進GLP-1在增加胰島素分泌及降低血糖方面的功效。於是，彼等可用於製備用於與GLP-1或GLP-1類似物一起使用的抗糖尿病治療劑。根據本發明之具體實施態樣，此等GLP-1類似物可與任何GLP-1受體配體共同使用。GLP-1受體之配體將包括GLP-1及其他GLP-1類似物，例如，毒蜥外泌肽、艾塞納肽、利拉魯肽、他司魯肽(taspoglutide)、阿必魯肽(albiglutide)及利希拉來(lixisenatide)。此等GLP-1類似物有些為市售可得，已於臨床上使用，及以其商品名稱販售。例如，Byetta®及Bydureon®為由Amylin製藥公司(聖地牙哥，CA)出廠販售之艾塞納肽化合物的商品名稱，而Victoza®為由Novo Nordisk公司(丹麥)出廠販售之利拉魯肽的商品名稱。

本發明之有些具體實施態樣係關於上述化合物在降低血糖濃度，增加胰島素濃度，降低胰島素抗性，與治療及/或預防糖尿病方面的應用。因為此等化合物為GLP-1增效劑，彼等會增強GLP-1及類似物之功能。已發現，GLP-1功能為葡萄糖-依賴性，而因此GLP-1及其類似物具有少許會降低飯前血糖濃度的危險。因此，本發明化合物之功效也是葡萄糖-依賴性。此等化合物與傳統磺醯基脲化合物不同，且彼等 不會降低患者的飯前血糖濃度，且將具有較少副作用。

一種根據本發明之有些具體實施態樣之控制血糖濃度的方法可包含，將有效量之本發明化合物(例如，高良薑萜醛類似物)與GLP-1受體，共同投藥予有需要的個體。

除了上述化合物(亦即，高良薑萜醛類似物)為單離自野薑花萃取物之外，本發明之有些具體實施態樣係關於經化學方法合成得之新穎化合物。此等化合物可為，從天然化合物(例如，高良薑萜醛B)，經由化學修飾而得之半合成化合物。此等經化學方法合成之化合物亦為GLP-1增效劑。

例如，吾等可從化合物1 (高良薑萜醛B)開始設計及合成新的GLP-1受體正面調節劑。圖2例舉說明合成某些經修飾化合物的合成程序。本發明之具體實施態樣亦關於此等新穎治療化合物，及其用於控制血糖濃度之用途。

此等新穎化合物可經由合成性修飾作用而從高良薑萜醛B衍生得。此等化合物可以通式(A)及(B)代表。如圖2所示，式(A)及式(B)化合物可經由一般化學反應，使用高良薑萜醛B做為起始物而合成得。

其中R¹ 為-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH；R² 為-OR’或-NR’R”；R³ 為-CHO、-CH₂ OR’或-CO₂ R’；R⁴ 二者皆為-H或共同形成=O；X為-O-或NR’，其中R’及R”係獨立地選自H、烷基、烯基、環烷基或芳基。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施範例

實施例1. 高良薑萜醛B與類似物之純化及特徵化

一般程序。 使用適當溶劑於JASCO-370偏光計記錄旋光度。以MeOH於JASCO 7800型UV-Vis分光光度計測量UV光譜。IR光譜係於日立260-30分光光度計進行測量。¹ H(400MHz)與¹³ C NMR(100MHz)光譜，以及¹ H-¹ H COSY、NOESY、HMQC與HMBC實驗係使用Varian Unity-400NMR分光光度計進行記錄。質譜(MS)係於JMS-HX100質譜儀進行測量。使用粒徑15-40μ M之矽石凝膠(Merck)進行管柱層析術。使用預先塗覆鋁薄板(0.2mm,Merck)之矽石凝膠60 F254進行TLC。所有使用的溶劑皆為HPLC等級。

植物原料。 野薑花(Hedychium coronarium Koenig之葉與假莖係於2009年在台灣屏東縣收集得。將新鮮的野薑花於60℃之熱氣流下乾燥5至8小時。

萃取及單離。 將經過乾燥之物料切碎及研磨成適合的大小(例如20網目)，之後以適當溶劑(例如每公斤乾燥植物使用10升乙醇)進行萃取。將活性植物之乙醇萃取物以蒸餾水(dH₂ O)、乙酸乙酯、丁醇及己烷進行分配(partition)。測量得自各部分(fraction)之回收重量與活性，並計算比活性及總體活性。

[方法1]將活性植物成分之乙醇萃取物(16.9克)以dH₂ O、乙酸乙酯、丁醇及己烷進行分配。將己烷部分於減壓下濃縮而得到棕色殘餘物(6.47克)。將該殘餘物通過矽石凝膠進行層析術，並解析成10個餾分。回收存在餾分E-2-L中之活性物質。將餾分E-2-L經過矽石凝膠進行重複層析術，並以己烷-EtOAc(7：3)溶析而產生化合物1 (5毫克)。

[方法2]將活性植物成分之乙醇萃取物(72.58克)以90% EtOH/H₂ O及己烷進行分配。將90% EtOH/H₂ O部分以乙酸乙酯與dH₂ O進行分配。將所得之乙酸乙酯部分進行乾燥 (9.71克)，並通過矽石凝膠進行層析術，以含有漸增量EtOAc之n-己烷溶析，隨後再使用MeOH進行最後沖洗而產生13個餾分。將餾分2進一步經過矽石凝膠進行純化，並以己烷-EtOAc(8：2)溶析而產生化合物2 (8毫克)。將餾分3進一步經過矽石凝膠進行純化，並以己烷-EtOAc(7：3)溶析而產生化合物5 (18毫克)與化合物6 (35毫克)。將含有大部分活性之乙酸乙酯部分經過矽石凝膠進行重複層析術。將該管柱以諸如己烷等非極性溶劑進行一般沖洗，然後藉由將漸增量之乙酸乙酯與己烷混合得之溶液(5、10、20、30、40、50、75及100%)進行漸增極性溶析步驟，隨後再以20%及50%溶於乙酸乙酯之甲醇溶液進行溶析。將活性餾分經過RP18進行重複層析術，並以己烷-EtOAc(7：3)溶析而產生化合物3 (15毫克)。收集固定體積之餾分，並進行內化作用(internalization)分析。測量專一性並計算出總體活性。

結果

化合物1、2、3、4、5及6之鑑定：高良薑萜醛B (化合物1 )：無色針狀，mp 134-136℃；UV_max λ(EtOH)nm(ε)236(8900)；IR_max ν(CHCl₃ 於NaCl)cm^-1 ：3610(OH),1711(C=O),1680(C=O),1646(C=C)；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.81(3H,s,H-18),0.79(3H,s,H-20),0.90(3H,s,H-19),1.52(1H,d,J =10.0Hz,H-9),2.58(1H,m,H-11),2.70(1H,m,H-14),2.94(1H,m,H-14),3.15(1H,m,H-11),3.57(1H,dd,J =1.8,9.0Hz,H-15),7.06(1H,dd,J =4.5,8.5Hz,H-12),9.43(1H,s,H-16),10.43(1H,s,H-17)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：38.8(C-1),18.9(C-2),41.6(C-3),33.3(C-4),55.5(C-5),18.5(C-6),34.4(C-7),55.3(C-8),55.4(C-9),38.9(C-10),24.1(C-11),157.6(C-12),140.7(C-13),28.7(C-14),78.7(C-15),193.4(C-16),208.1(C-17),33.2(C-18),21.3(C-19),16.6(C-20)；ESI-MS m/z：341(M+Na)。

11-羥基-8(17),12(E)-半日花二烯-15,16-二醛 11,15-半縮醛 (化合物2 )：無色膠狀物質，[α]²⁵ _D -40.0°(c 0.43,CHCl₃ )；UV_max λ(MeOH)nm(log ε)233.5nm(4.13)；IR_max ν(KBr)cm^-1 ：3396(-OH),2933,2873,2842,1682(共軛-CHO),1645,1643,1462,14421214,1167,1083,1049,898,667；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.83(3H,s,H-18),0.87(3H,s,H-19),0.97(3H,s,H-20),1.09(1H,dd,J =2.9,12.7Hz,H-5),2.20(1H,br d,J =2.6Hz,H-9),2.69(1H,dd,J =8.6,15.6Hz,H-14),3.33(1H,dd,J =5.3,15.6Hz,H-14),4.79(1H,br s,H-17),4.83(1H,br s,H-17),5.45(1H,dd,J =5.3,8.6Hz,H-15),5.52(1H,dd,J =2.6,2.6Hz,H-11),6.45(1H,t,J =2.6Hz,H-12),9.39(1H,s,H-16)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：39.1(C-1),19.2(C-2),42.0(C-3),33.7(C-4),55.9(C-5),23.9(C-6),37.9(C-7),144.9(C-8),62.2(C-9),40.1(C-10),85.8(C-11),155.9(C-12),136.4(C-13),28.0(C-14),101.9(C-15),192.5(C-16),109.2(C-17),33.5(C-18),21.6(C-19),16.7(C-20)；ESI-MS m/z：341(M+Na)。

姜花素(Coronarin)B (化合物3 )：無色油體，mp 134-136℃；[α]²⁵ _D -43.1°(c 0.14,CHCl₃ )；UV_max λ(EtOH)nm(ε)235(7800),205(4700)；IR_max ν(KBr)cm^-1 ：3620(-OH),3090,1650,895(exo -亞甲基鍵)，1780,1755(C=O)；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.84(3H,s,H-18),0.88(3H,s,H-19),0.98(3H,s,H-20),2.20(1H,dd,J =1.2,2.5Hz,,H-9),2.68(1H,m,H-14),3.33(1H,dd,J =5.4,15.5Hz,H-14),4.80(1H,d,J =1.2Hz,H-17),4.84(1H,s,H-17),5.48(1H,ddd,J =5.4,5.6,8.5Hz,H-15),5.55(1H,ddd,J =2.3,2.5,4.1Hz,,H-11),6.44(1H,s,H-12),9.40(1H,s,H-16)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：39.1(C-1),19.2(C-2),42.1(C-3),33.6(C-4),55.9(C-5),24.0(C-6),38.0(C-7),145.0(C-8),62.2(C-9),40.2(C-10),85.8(C-11),155.9(C-12),136.5(C-13),28.1(C-14),101.9(C-15),192.4(C-16),109.2(C-17),33.7(C-18),21.6(C-19),16.7(C-20)；ESI-MS m/z：341(M+Na)。

7 β-羥基姜花素B (化合物4 )：油體；[α]²⁵ _D -26.5° (c 0.79,CHCl₃ )；IR_max ν(KBr)cm^-1 ：3580,3020,1684,1650,950；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.84(3H,s,H-18),0.97(3H,s,H-19),0.91(3H,s,H-20),2.06(1H,d,J =3Hz,H-9),2.74(1H,m,H-14),3.35(1H,dd,J =16,6Hz,H-14),3.98(1H,dd,J =12,6Hz,H-7),4.80(1H,d,J =1.2Hz,H-17),4.84(1H,s,H-17),5.49(1H,dd,J =5,9Hz,H-15),5.55(1H,ddd,J =4,3,2Hz,H-11),6.40(1H,s,H-12),9.38(1H,s,H-16)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：39.1(C-1),19.2(C-2),41.8(C-3),33.7(C-4),53.6(C-5),33.5(C-6),73.5(C-7),146.7(C-8),60.2(C-9),39.8(C-10),85.6(C-11),155.1(C-12),136.8(C-13),28.1(C-14),102.0(C-15),192.3(C-16),106.1(C-17),33.8(C-18),21.5(C-19),16.7(C-20)；ESI-MS m/z：357(M+Na)。

(E)-半日花-8(17),12-二烯-15-醇-16醛 (化合物5 )：白色，非晶形固體；[α]²⁵ _D +15.5°(c 0.15,CHC13)；IR(film)î max 3430,3100,2929,1685,1639,1460,1023,889cm-1；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.83(3H,s,H-18),0.89(3H,s,H-19),0.97(3H,s,H-20),1.16(1H,dd,J =13,3Hz,H-5),1.91(brd,H-9),2.47(1H,ddd,J =17,11,7Hz,H-11),2.60(2H,H-14),2.64(1H,ddd,J =17,6,3Hz,H-11),3.68(2H,H-15),4.40(1H,brd,H-17),4.86(1H,brd,H-17),6.58(1H,dd,J =7,6Hz,,H-12),9.35(1H,s,H-16)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：39.2(C-1),19.3(C-2),41.9(C-3),33.5(C-4),55.4(C-5),24.3(C-6),37.8(C-7),148.1(C-8),56.5(C-9),40.1(C-10),24.1(C-11),159.3(C-12),140.1(C-13),28.1(C-14),61.3(C-15),195.9(C-16),107.8(C-17),33.5(C-18),21.7(C-19),16.7(C-20)；ESI-MS m/z：327(M+Na)。

(E)-15,15-二乙氧基半日花-8(17),12-二烯-16醛 (化合物6 )：非晶形油體；[α]²⁵ _D +13°(c 0.2,CHCl3)；¹ HNMR(CDCl₃ )δ：0.74(3H,s,H-20),0.82(3H,s,H-18),0.89(3H,s,H-19),1.16(6H,t,J =6.9Hz，乙氧基CH3),1.89(1H,brd,J =9.9Hz,H-9),2.53(1H,m,H-11A),2.58(2H,m,H-14),2.63 (1H,dm,H-11B),3.48及3.76(各為2H,m，乙氧基CH2),4.41(1H,d,J =1.2Hz,H-17),4.53(1H,t,J =5.4Hz,H-15),4.82(1H,d,J =1.2Hz,H-17),6.54(1H,t,J =6.2Hz,,H-12),9.33(1H,s,H-16)；¹³ C NMR(CDCl3)δ：39.1(C-1),19.1(C-2),41.1(C-3),33.4(C-4),55.3(C-5),24.0(C-6),37.7(C-7),148.3(C-8),56.4(C-9),39.4(C-10),24.5(C-11),160.3(C-12),138.4(C-13),30.1(C-14),102.1(C-15),195.2(C-16),108.1(C-17),33.4(C-18),21.5(C-19),14.2(C-20),62.7(C-1’),62.8(C-1”),15.1(C-2’),15.2(C-2”)；ESI-MS m/z：399(M+Na)。

實施例2. GLP-1增效劑之半合成作用

實例

實施例3. 受體視紫紅質抑制蛋白(arrestin)易位作用(translocation)分析

實驗設計

將U2OS細胞(人類骨肉瘤，購自Sigma-Aldrich)以GLP-1受體基因進行轉感染，該GLP-1受體係高度表現於該細胞膜上。經活化作用後，該等細胞表面GLP-1受體會進行胞吞作用，其可用於具生理活性細胞之定量分析。舉例而言，可將此等細胞平佈於測試平板(例如，384-孔平盤)上形成單層。該等細胞之分布密度(例如)可為每孔中含4000個細胞。測試樣本濃度可為0.2-0.000002mg/ml。測試體積可為25毫升，且測試時間可為1小時。

GLP-1受體為具有七個穿膜區之與G-蛋白偶合的受體。於受到激素或神經刺激物質活化後，許多與G-蛋白偶合的細胞表面受體會進行內化作用，而於胞吞反應中從細胞表面進入細胞質。因此，位於U2OS細胞表面之GLP-1受體，會在受到測試樣本活化後進行胞吞作用。受體胞吞作用之程度與測試樣本的濃度密切相關--樣本濃度越高，胞吞作用反應越強。因為細胞表面受體之密度固定，故當樣本濃度到達高量時，胞吞作用反應不會再隨著樣本濃度增加而增加，亦即該反應已達飽和。基於濃度與飽和度之測定，吾等可決定測試樣本的受體結合親和性。

與G-蛋白偶合的受體經活化後，該等受體會代表性地被退敏化或去活化。視紫紅質抑制蛋白(arrestin)即涉及此類退敏化或去活化過程。換言之，視紫紅質抑制蛋白可用於GPCR來使該受體退敏化或去活化。因此，偵測GFP-引發之視紫紅質抑制蛋白從細胞質移動到位於細胞膜上之受活化GPCR的易位作用，可使吾等能測量受測試化合物與受體標靶物之結合(等人，“藉由視紫紅質抑制蛋白易位作用進行已知G-蛋白偶合受體的高量篩選 ”,Methods Enzymol.,414：63-78(2006))。

因此，使用受體視紫紅質抑制蛋白易位作用分析，可偵測到GLP-1與GLP-1受體之結合。而且，此分析可適用於偵測GLP-1增效劑活性，例如藉由將GLP-1與GLP-1受體之濃度維持恆定，而改變欲受測試之增效劑的濃度。使用此分析，已針對下列樣本進行分析：(a)化合物1 (MW 318)、(b)化合物2 (MW 318)、(c)化合物3 (MW 334)、(d)化合物5 (MW 304)、(e)化合物6 (MW 376)。於此等分析，GLP-1濃度為4-8nM，且測試樣本之濃度範圍介於0.001mg/ml至1mg/ml。當受到GLP-1活化時，在有測試樣本(GLP-1增效劑)存在下，位於U2OS細胞表面之GLP-1/GLP-1受體複合物會進行胞飲作用；測試樣本濃度越高會引發越強的GLP-1/GLP-1R反應-因此，造成越強的胞飲作用反應。當樣本濃度達到特定之高濃度時，胞飲作用反應之程度將不再隨著樣本濃度增加而增加，因為該反應已達到飽和。圖3顯示此等分析之結果。

基於該等隨著樣本濃度變化之結合曲線及飽和度測量結果，可測定得測試樣本的受體親和性。基於圖3所示之結果，測試化合物的親和性如下所示：(a)化合物1 ，EC₅₀ =6.603μg/ml；(b)化合物2 ，EC₅₀ =4.438μg/ml；(c)化合物3 ，EC₅₀ =0.06569μg/ml；(d)化合物5 ，EC₅₀ =2.477μg/ml；(e)化合物6 ，EC₅₀ =4.350μg/ml。

此等結果顯示，此系列類雙萜類係經由受GLP-1/GLP-1R傳訊介導之調節機制，來達到其血糖降低功效。此等結果亦顯示，所有此等測試化合物皆為有效的GLP-1增效劑，其中以化合物3為最有效。

實施例4. 於大鼠胰臟beta細胞RINm5F進行之胰島素分泌試驗

細胞培養

大鼠胰臟beta細胞株RINm5F係購自食品工業研究及發展中心(新竹，台灣)，編號BCRC 60410；來源：ATCC CRL-11 605。將細胞於10% FBS RPMI-1640培養基中，於恆溫 CO₂ 培養箱，5% CO₂ 、37℃及95%溼度下進行培養，用於進行後續的實驗。

操作步驟：

將RINm5F細胞(8x10⁵ 細胞/孔)加入每一96-孔平盤中，並於實驗前先將細胞培養2天。在進行試驗之前，先將培養基清除。將100微升KRPH緩衝液(136mM NaCl,4.8mM KCl,1.2mM CaCl₂ ,1.2mM KH₂ PO₄ ,1.2mM MgSO₄ ,5mM NaHCO₃ ,10mM HEPES)、2.8mM D-葡萄糖、0.2%胎牛血清白蛋白，pH 7.4加入96-孔平盤之各孔中，置於CO₂ 培養箱中，於37℃下靜置30分鐘，以使胰島細胞能適應培養基改變(從RPMI 1640轉變成KRPH緩衝液)。將96-孔平盤從培養箱取出。待培養基清除後，將細胞以KRPH緩衝液+0.2% BSA沖洗，將不同濃度之測試樣本，以及GLP-1類似物(毒蜥外泌肽，exendin-4)加入。將細胞於含有培養基之KRPH緩衝液與葡萄糖(KRPH+0.2% BSA，16mM葡萄糖)中培育2小時，以使胰島beta細胞在能葡萄糖刺激下分泌胰島素。將培養物上清液收集，並使用ELISA分析各孔中所釋出的胰島素濃度。可由市面上購得各種胰島素ELISA套組，例如Calbiotech(Spring Valley,CA)、Crystal化學公司(Downers Grove,IL)及Mercodia (Uppsala，瑞典)。

實驗結果：

於接種RINm5F細胞(96-孔平盤約8x10⁵ 細胞/孔)兩天後，將活性成分(得自野薑花95%乙醇萃取物之化合物1 、2 及3 )加至細胞。將毒蜥外泌肽(對於化合物1為2nM，或對於化合物2及3為5nM)加入做為GLP-1之替代物。經2小時後，使用胰島素ELISA套組分析上清液中的胰島素濃度含量。

如圖4所示，當添加毒蜥外泌肽時，化合物1、2及3可刺激較多的胰島素分泌。然而，當此等化合物在無毒蜥外泌肽存在下使用時，其功能實質上被消除。此等結果暗示，受化合物1、2及3刺激的胰島素分泌，係經由毒蜥外泌肽 /GLP-1R結合作用所介導。此等結果與此等化合物為GLP-1(及毒蜥外泌肽)增效劑的主張相符合，且彼等本身並非用於誘導降血糖作用之有效GLP-1R配體。

實施例5. 化合物1(純度70%)於正常小鼠腹膜內之葡萄糖耐受度試驗(IPGTT)

於本實施例，係使用活體內IPGTT來確定化合物1 (純度70%)之降血糖活性。將24隻六週齡之C57BL/6J小鼠於12/12光照-黑暗週期及恆溫控制於之環境下，以正常飲食餵食並且無限制供給水與食物。將小鼠分成四組每組六隻，包括一組對照組及三組化合物1 (純度70%)實驗組。該三組化合物1 實驗組係分別口服給予劑量為40mg/Kg、60mg/Kg及80mg/Kg之化合物1 。將小鼠斷食過夜，隨後再餵食1小時。於餵食後，再等1小時之後給予測試藥物。經投藥30分鐘後以腹膜內注射方式給予劑量為1.5g/kg體重之葡萄糖。在注射葡萄糖之前先測量一次血糖濃度(0分鐘)，在分別於葡萄糖注射之後30、60與90分鐘測量血糖濃度，以觀察得到血糖濃度變化曲線。

如圖5及下表所示，所得數據係以平均值±標準偏差(SEM)表示。P值係使用試驗以Sigma統計軟體計算得，其中p<0.05即認為具有顯著差異且標記為*；p<0.01認為具有高度顯著差異且標記為**；而p0.001認為具有非常的顯著差異且標記為***。

於0分鐘、30分鐘、60分鐘及90分鐘之間隔時間，收集血液樣本來測量葡萄糖濃度(以mg/DL為單位表示)(參見下述)，以觀察得到血糖濃度變化曲線。結果顯示，於野薑花乙醇萃取物中，經單離之化合物(HC E2-L)能夠顯著降低血糖濃度，且其降血糖功效顯示具有劑量依賴性：41%(40mg/Kg實驗組)，45%(60mg/Kg實驗組)及71%(80mg/Kg實驗組)。此等結果顯示，本發明之化合物能增進患者體內的血糖耐受度(在受挑戰後呈現較低的血糖濃度尖峰值)。

本發明具體實施態樣之優點可包括下列一或多項。本發明化合物為GLP-1增效劑。此等增效劑係透過正常的GLP-1/GLP-1R機制來執行其功能。因為GLP-1功能具有葡萄糖依賴性且不會過度降低飯前血糖濃度，故本發明之一系列化合物的功能亦具有相同特質一即，具有葡萄糖依賴性。於是，彼等與傳統磺醯基脲化合物不同，且不會造成低血糖一即，彼等不會降低個體的飯前血糖濃度，而具有較少副作用。此外，此等化合物並非肽類。此等小分子可具有較佳的藥物動力學及較長的活體內半衰期。

雖然本發明已描述關於其有限數量之較佳具體 實施例，習於該項技藝人士(已從本發明之揭示獲得助益)應了解，在未偏離本發明所揭示之範圍下，可創作出其他具體態 樣。因此，本發明之範圍應僅由後附之申請專利範圍所界定。

Claims (6)

1. 一種具式I之化合物用於製備控制血糖濃度之組成物的用途，其中該化合物具有如式I所示之結構： 其中R₈ 為H、-OH或-O-R’；R₅ 為C₁ -C₁₀ 烷基或C₂ -C₁₀ 烯基，其為直鏈或支鏈且視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代；或者R₅ 為一5-、6-或7-員環，其為環烷基或環烯基環或為含有一或多個選自N、O或S之雜原子之雜環，其中該5-、6-或7-員環視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代；且R₆ 及R₇ 係獨立地選自H(其條件為兩者不同時為H)、C₁ -C₁₀ 烷基或C₂ -C₁₀ 烯基，其為直鏈或支鏈且視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，或者R₆ 與R₇ 結合而形成=CH₂ ； 其中R’及R”獨立地為H、C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、C₃ -C₁₀ 環烷基或C₆ -C₁₀ 芳基；或其中R₈ 為H、-OH或-O-R’；R₇ 為-CHO，且R₅ 與R₆ 結合而形成一由C、O、N或S原子或其組合所組成的5-、6-或7-員環，其中該環含有0或1個雙鍵，且其中該環視需要地經一或多個具有1-10個碳(C₁ -C₁₀ )之烷基側鏈取代，且其中該環及/或該烷基側鏈視需要地經一或多個選自-OR’、-NR’R”、-SR’、氧基(=O)、硫基(=S)、-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH之取代基取代，其中R’及R”係如上所定義。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中R₆ 與R₇ 結合而形成=CH₂ ，且該化合物具有如式II所示之結構：
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物具有如式(A)或(B)所示之結構： 其中R¹ 為-CONR’R”、-CN、-CO₂ R’或-CR’R”OH；R² 為-OR’或-NR’R”；R³ 為-CHO、-CH₂ OR’或-CO₂ R’；R⁴ 二者皆為-H或共同形成=O；X為-O-或NR’，其中R’及R”獨立地為H、C₁ -C₆ 烷基、C₂ -C₆ 烯基、C₃ -C₁₀ 環烷基或C₆ -C₁₀ 芳基。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係選自化合物1A、1B、2、3、4、5或6： 。 。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該化合物為化合物1A。
6. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該化合物為化合物1B。