TWI478101B - 評估影像聚焦品質的方法 - Google Patents

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Description

評估影像聚焦品質的方法
本發明之領域一般係關於電子成像系統領域，且更特定言之係關於電腦控制顯微成像系統及用於其中之聚焦系統。
病理學領域中，經常需要針對潛在病理或疾病狀態檢查組織樣本。某些情形下，組織或其他生物材料之樣本係嵌入一嵌入介質中並切割成很薄片斷。接著將該等片斷放置於樣本固持器上，例如用於隨後成像及分析之載玻片。其他應用中，將細胞或其他生物材料轉移至基於液體之製備液內的載玻片。例如，可將細胞從目標位置(例如組織)刮去，並視需要在液體溶液內清洗。或者，可直接從體液(例如尿液)獲得細胞。可將細胞直接轉移至載玻片，例如可將血液樣本直接塗抹於載玻片上。亦已開發自動化器件以獲得並在載玻片上沈積細胞。例如，ThinPrep系統(馬薩諸塞州Marlborough市Cytyc Corporation公司)過濾包含細胞懸浮液之液體。接著將過濾器上之累積細胞的薄層轉移至用於隨後處理及檢視之載玻片上。
自動化成像或掃描系統越來越多地用於捕捉樣本之數位影像。接著可藉由病理學家或其他經訓練的技術人員針對組織內潛在病理或疾病狀態分析數位影像。自動化成像系統通常使用電腦控制顯微鏡，其使用自動控制平台及光學組件以獲取樣本之一或多個聚焦影像。例如，系統可用於獲得在載玻片上製備的整個樣本之影像。或者(或結合地)，系統可獲得所關注特定區域或區段地一或多個放大影像。為獲得樣本或其放大區域之高品質影像，系統必須能夠迅速聚焦於樣本或區域上。
此要求引起數個技術挑戰。檢視影像後，吾人可立即識別其係對焦還是失焦。電腦化系統在此任務上具有困難。假設相同物件在不同聚焦高度下的兩個影像，電腦操作之聚焦系統能夠識別較佳地聚焦之影像。然而，假設僅有一單一影像，電腦難以自動評估聚焦品質。另外，電腦難以決定成像之聚焦平面與理想或最佳聚焦高度相隔多遠。
許多估算單一影像之聚焦品質的現有方法使用傅立葉(Fourier)轉換。若無雜訊，弱聚焦影像將不包含高於特定頻率之傅立葉信號。此截止頻率之位置將給出紋理比例。不幸的是，真實影像包含雜訊，此會限制傅立葉轉換之有用性。基於傅立葉轉換之方法對具有較低信號對雜訊(SNR)比之影像執行效果較差。使用之傅立葉轉換方法計算量亦較大，需要強固之計算硬體及軟體。
自動化顯微鏡中，電腦一般藉由變更聚焦高度為樣本內之給定位置找到最佳聚焦平面，從而獲取各高度下之影像。使用各種"自動聚焦函數"之一計算用於各獲取影像之分數，最高得分影像對應於理想聚焦高度。由於自動聚焦函數價值取決於視野內物件，該等函數僅可用於判斷一影像相對於相同物件之另一影像的品質，而不能作出絕對品質評估。一類別之自動聚焦函數根據影像區別運作。未聚焦影像通常在彼此靠近之像素間僅具有略微差異，因為點展開函數(PSF)在數個像素間分配各像素強度，使其模糊並將灰階平均化。不同類型之影像區別已用作影像之相對聚焦品質的測量。例如，布藍儂(Brenner)提出使用所有像素與距其兩點外之相鄰像素間平方差異之總和。例如，請參見Brenner等人之"An Automated Microscope For Cytological Research"，J. Histochem. Cytochem出版，24，100-111(1971)。
電腦控制成像系統在獲得載玻片影像的同時變更聚焦高度時，布藍儂函數已用作聚焦品質之準則。先前方法針對在多個聚焦高度獲取之影像比較布藍儂函數分數。決定用於影像之聚焦品質取決於比較在一聚焦高度下用於一視野之布藍儂函數分數與在一不同聚焦高度下用於相同視野之布藍儂函數分數。布藍儂函數分數係影像內紋理之測量。對焦影像具有較高布藍儂函數分數，並包含比例小於失焦影像之紋理。相反，失焦影像具有較低布藍儂函數分數，並不包含小比例紋理。隨著聚焦高度從高於理想高度變更至低於理想高度，布藍儂函數從較低值開始，隨著影像在理想聚焦高度下聚焦到達峰值，並隨失去聚焦而降低。當相對於聚焦高度描繪時布藍儂函數之形狀係最佳形狀曲線。
一更簡單自動聚焦方法可如此實施：最初將聚焦高度設定成正好高於平台，並將成像光學元件逐步向樣本靠近，例如以數微米遞增量。此程序繼續至布藍儂分數到達最大值。找到峰值聚焦高度需要比較在連續聚焦高度下取得之影像的布藍儂分數。然而許多醫學成像應用中，其中必須處理大批樣本，頻繁地執行此種自動聚焦將需要更多時間。理想中，自動化成像系統會僅獲取各視野之一影像，但系統必須仍具有確保影像品質之某一方式。檢查單一影像之聚焦品質的有效及準確方法將使此一成像系統可僅在決定給定影像之聚焦品質不可接受時獲取額外自動聚焦影像，從而最大化效率而不引入準確性減小之風險。
一項具體實施例中，一種用於決定生物樣品之數位影像的聚焦品質之方法包括使用樣品成像裝置獲得樣品之一數位影像。數位影像包含複數個像素。計算該影像內小比例紋理之一測量。例如，可藉由將橫跨整個數位影像之相鄰像素對的平均值差異平方來測量影像內之小比例紋理。接下來，計算該影像內較大比例紋理之一測量。可藉由將橫跨整個數位影像之相鄰三重像素的平均值差異平方來測量較大比例紋理。接著根據小比例及較大比例紋理測量之一比較建立影像聚焦品質之一估計。
一項具體實施例中，一種用於決定生物樣品之數位影像的聚焦品質之方法包括使用樣品成像裝置獲得樣品之一數位影像的步驟，該數位影像包含複數個像素。藉由將相鄰像素對之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一高解析度布藍儂分數。藉由將相鄰三重像素之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一低解析度布藍儂分數。接著計算高解析度布藍儂分數除以低解析度布藍儂分數或低解析度布藍儂分數除以高解析度布藍儂分數之比率。本文所使用之比率可用於指示將高解析度紋理分數除以低解析度紋理分數，或者將低解析度紋理分數除以高解析度紋理分數。接著根據計算之比率建立指示聚焦品質之聚焦分數。例如，聚焦分數可包括自理想聚焦高度之估計位移。
另一具體實施例中，聚焦樣品成像裝置之方法包括使用樣品成像裝置獲得樣品之數位影像的步驟，該數位影像包含複數個像素。藉由將相鄰像素對之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一高解析度布藍儂分數。藉由將相鄰三重像素之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一低解析度布藍儂分數。計算高解析度布藍儂分數對低解析度布藍儂分數之比率。接著根據該比率調整該樣品成像裝置之焦距。
聚焦方法可包括獲取樣品之一或多個數位影像以及重新計算布藍儂分數或布藍儂比率的額外步驟，以評估聚焦改良。可獲得及分析額外數位影像，直至聚焦平面位於或接近最佳或真實聚焦高度。由於與聚焦高度成一函數關係的布藍儂分數係鐘形曲線(指數二次函數)，可對聚焦分數之對數使用反相拋物線內插法從三或更多點估計其峰值位置。
另一具體實施例中，對包含於樣品固持器上之樣品的數位影像執行品質檢查之方法包括獲得樣品之數位影像的步驟，該數位影像包含複數個像素。藉由將相鄰像素對之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一高解析度布藍儂分數。藉由將相鄰三重像素之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一低解析度布藍儂分數。接下來，計算低解析度布藍儂分數對高解析度布藍儂分數之比率。根據計算之比率接受或拒絕數位影像。自動化成像系統可在決定聚焦品質不滿意時立即調整聚焦並獲取新影像，或者可繼續成像，但在弱聚焦影像數目越過給定臨限值時重新處理整個樣本。
另一具體實施例中，使用自動成像裝置聚焦於樣品上之方法包括使用成像裝置在不同聚焦高度下獲得樣品之三個數位影像的步驟。數位影像由複數個像素形成。針對三個數位影像之各者計算一布藍儂自動聚焦分數。將一指數二次函數擬合藉由三個聚焦高度及對應布藍儂分數形成的(x,y)點。根據擬合資料之函數在新聚焦高度下獲取新影像。針對新影像計算新布藍儂分數。在不同新(或修改之)聚焦高度下獲取額外影像，直至到達理想聚焦高度。當然，該程序可在成像裝置感測到其緊密接近理想聚焦高度(例如+/-位移值)時停止。
圖1說明依據本發明之一項具體實施例之示範性樣品成像裝置32。樣品處理裝置32包括第一光學系統38以及相對於其可移動之載玻片平台40。提供一檢視台36，其包括第二光學系統44，並經由伺服器34連接至影像處理系統32。內部電腦系統46控制第一光學系統38並與伺服器34通信。
第一光學系統38包括電子相機48，例如CCD相機48，以及顯微鏡50。顯微鏡50較佳的係一自動化顯微鏡。自動化顯微鏡50可包括用以提供位於顯微鏡50之光學路徑51中的載玻片10之一區域的快速、精確成像之特徵，例如自動聚焦機制54。第一光學系統38可包括一或多個透鏡系統52。照明器42可為沈積於載玻片10上之樣品14提供照明，並且一般可從平台40下方照射載玻片10。
平台40回應來自內部電腦系統46之適當命令而將樣品載玻片10運輸進入至顯微鏡50之光學路徑51內。一項具體實施例中，機器人載玻片處置器64可在來自電腦系統46之適當命令下將樣品載玻片10從載玻片固持盒移動至用於將樣品內細胞成像之可移動平台40，且成像後再移動回至盒子。載玻片固持器65以固定及可移除方式重複以平台40上之精確位置及方位定位載玻片10。可藉由一或多個平台馬達56將平台40電動化並為其供電。可將平台40黏著於軸承58上，其依次被黏著於顯微鏡50之基座59。一項具體實施例中，平台40可在x-y平面內移動。
一項具體實施例中，與可移動平台40通信之介面控制器60可提供載玻片10相對於顯微鏡50之光學路徑51及檢視區域的精確控制移動。介面控制器60藉由將來自電腦系統46之命令轉換為使馬達56將平台40移動至規定位置的適當信號來控制平台馬達56。位置編碼器62可偵測平台40之精確位置，對電腦系統46產生代表平台之移動或位置的脈衝。如本技術中所熟知的，該等脈衝可由電腦系統46解碼，以便識別平台40在成像台座標系統內之位置。
影像處理系統32可包括可選條碼讀取器66，其係定位成一旦已藉由機器人載玻片處置器64將載玻片10運輸至可移動平台40或已手動將其載入，檢視包含條碼之載玻片區域。影像處理系統32可包括標記器68，其自動將點、標記或其他可視符號放置於樣品內可能存在潛在異常細胞的所關注區域內。
檢視台36係經由伺服器34連接至影像處理系統32，並可位於遠端。檢視台36包括第二光學系統44。第二光學系統44可包括第一光學系統38之任何及全部特徵。一項具體實施例中，第二光學系統44包括顯微鏡50，該顯微鏡50連接至可移動平台並且調適成供操作人視覺檢查藉由影像處理系統32識別之所關注區域。
操作中，影像處理系統32執行初始檢視及篩選置放細胞學樣品14之載玻片10，以便對樣品14作出初步評估。影像處理系統32針對細胞學家或病理學家之隨後檢視識別載玻片上可能最為相關之該等所關注區域之位置。為防止Pap塗抹篩選內之錯誤負讀數，此初步篩選中藉由影像處理系統32識別之區域的位置必須準確至可接受誤差幅度內。掃描程序期間載玻片之錯誤處置或定位可導致識別區域之位置內的誤差以及檢視台36上的隨後誤讀。
關於影像處理系統32之操作的額外細節可在美國專利第7,006,674號中找到。本文所述方法可與用於將生物樣品成像的其他影像處理系統一起使用。
本發明之一項具體實施例中，提供用於決定使用影像處理系統32獲得之數位影像的聚焦品質之方法。該方法涉及首先獲得樣品14之數位影像。可使用相機48獲取數位影像。藉由像素100之陣列形成樣品14之數位影像。圖2A及2B說明數位影像內之相鄰像素100的一部分。影像內之各像素100可以8位元(例如位元組)數字代表，其代表用於特定像素之強度或亮度。各像素值可與在開啟快門時撞擊相機48之對應光箱(bin)的光子數目成線性比例。例如，八位元系統中，可給各像素100指派256個可能值之一，其代表像素之亮度或強度。關於此點，成像系統分析8位元灰階影像。依據本發明之一項具體實施例，藉由計算高解析度布藍儂分數(BRHR )獲得數位影像之高解析度紋理。藉由將相鄰像素對之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素100上加總該等平方差異計算一高解析度布藍儂分數。可使用等式1計算高解析度布藍儂分數，其中rows及cols係影像內像素之列及行數目，而P i , j 係列I及行j內之像素值。此等式在圖2A中以視覺說明方式提出。
除數位影像之高解析度紋理外，藉由計算低解析度布藍儂分數(BRLR )獲得影像之低解析度紋理。藉由將相鄰三重像素之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異計算一低解析度布藍儂分數。可使用以下提出之等式2計算低解析度布藍儂分數，其亦在圖2B以視覺方式說明：
藉由將平均化窗口之寬度從兩個像素增加至三個像素獲得低解析度布藍儂分數。較寬平均化窗口有效地減小影像解析度。
本發明之一項具體實施例中，藉由比較高解析度布藍儂分數與低解析度布藍儂分數估計數位影像之聚焦品質。例如，可將高解析度分數除以低解析度分數(BRHR /BRLR )。或者，可將低解析度分數除以高解析度分數(BRLR /BRHR )。可藉由內部電腦系統46或藉由可操作地連接至樣品成像裝置32之某一其他電腦器件完成分數計算及比較。
根據計算之比率，則建立聚焦分數。本發明之一項具體實施例中，使用以實驗方式獲得之資料獲得聚焦分數，其係關於與高解析度布藍儂分數對低解析度布藍儂分數之比率成一函數關係的距最佳或真實聚焦之位移度。針對此資料計算最佳擬合函數。此函數之倒數接著可用於將測定比率映射至估計位移。例如，.45(BRHR /BRLR )之比率可對應於指示成像裝置32之聚焦距真實聚焦+/-12.5μm的聚焦分數。聚焦分數可為實際位移值(即距離)。或者，聚焦分數可為百分比值。
在不同載玻片上之不同位置按不同聚焦高度以實驗方式獲得一組數位影像。在四十個不同聚焦高度取得12,000個影像。影像係在三十個不同載玻片上的十個不同位置取得。接著決定高解析度布藍儂分數對低解析度布藍儂分數之比率。圖3係按自理想聚焦之位移之一函數描繪的用於12,000個影像之各者的比率之散佈圖。圖3內曲線圖之y軸代表(BRHR /BRLR )，曲線圖之x軸說明自最佳聚焦之位移度(以正及負位移表達)。從圖3可看出，資料自然形成鐘形曲線，曲線峰值對應於最佳聚焦高度。從散佈圖可看出，比例在不同載玻片上係一致的，而不論各位置上物件數目及類型的廣泛變更。布藍儂比率(高解析度/低解析度及低解析度/高解析度)因此為取自不同載玻片之影像提供用以測量聚焦品質的相對恆定度量。
最緊密擬合圖3所示資料之等式係鐘形曲線。等式3給出用於以y軸為中心之鐘形曲線的等式，其中參數a及c控制峰值之寬度及高度，而d係自理想聚焦高度之位移：
對於圖3所示之資料，產生最佳擬合之參數a及c係a=-.0015459及c=-.58835。可藉由最小化實際比率與使用等式3從位移預測之比率間的平方誤差總和來決定該等參數。令y等於測定比率之自然對數(BRHR /BRLR )，令係預測比率之自然對數：
對於樣本組內之各影像，可計算用於y及之值。對於第i個影像，令y i 及為對應值，且d i 為該影像之位移。參數a及c之理想值係最小化橫跨樣本組內所有影像的平方誤差總和之值：
藉由將相對於a及c之偏導數設定為零，可決定用於a及c之值：
此等式系統可藉由轉換其為矩陣形式而容易地解出：
對於圖3內之資料，接著得出a=-.0015459及c=-.58835。
與高/低布藍儂比率成一函數關係的距理想聚焦之預測位移接著可表達為：
此等式中可將假想預測位移映射為零。圖4說明與用於12,000影像之實際位移值相比的使用等式9之預測位移之均方根(RMS)誤差。RMS值係顯示於y軸上，而位移係在x軸上說明。從圖4可看出，在小於5 μm之位移下，存在極少視覺效應並且偏差難以分辨。然而，在5 μm與12 μm之間，誤差接近或低於1 μm。偏差變得大於12 μm。此點亦可從圖3看出，其顯示高於此限制之資料點的顯著分散。
因此可能從單一數位影像決定聚焦品質。藉由計算BRHR /BRLR 比率(或低解析度至高解析度比率)，則可決定距理想聚焦之位移。可根據如上文等式3之模型公式從特定比率估計距理想聚焦高度之位移。應注意，給定比率提供一正及一負兩個可能位移值。
以上述方式獲得之聚焦分數或讀數可用許多方式來使用。首先，該方法可用於決定接受還是拒絕單一數位影像。例如，若位移超出預定臨限值，則可拒絕影像。此可意謂著必須從不同聚焦高度下之相同位置獲取新影像。可從載入樣品成像裝置32之複數個樣品獲得用於影像之聚焦分數。例如，可測量來自給定載玻片之所有影像的聚焦分數之平均值，或者其標準偏差。或者，可測量用於得分高於特定臨限值的給定載玻片之影像數目。若發現特定載玻片聚焦分數不可接受，可接著重新處理一批次內之特定載玻片。或者，可對一批次內之多個載玻片給出滾動或累積分數。若滾動或累積分數越過預定臨限值，則該等載玻片可視為可疑，因此可能需要重新掃描。該臨限值可為預設位移值、標準偏差值、百分比或其他度量。
本發明之一項具體實施例中，自動化成像器件可追蹤來自超出可接受分數之給定範圍的給定載玻片之影像數目。若不遵循該等準則之影像數目高於特定數目，可重新處理載玻片。例如，成像器件可能重新處理從載玻片獲取之2000個影像中100個以上超出可接受範圍的任何載玻片。或者，若個別聚焦分數超過預定臨限值或範圍，可用旗標標記個別載玻片或載玻片批次。使用者接著可接受載玻片或選擇透過樣品成像裝置32再次運行。本發明之另一具體實施例中，若依此方式拒絕超過一特定百分比的載玻片，樣品成像裝置可嘗試重新校準本身或通知使用者需要維修。
本發明之另一具體實施例中，自動化成像器件可針對獲取之各影像計算布藍儂比率分數，並且只要分數不可接受，便獲取相同位置上的新影像。當發現誤差時，器件可立即移動回至該位置，或者可記住影像不可接受的所有位置並在掃描剩餘載玻片後返回該等位置以獲取新影像。
本發明之另一具體實施例中，自動化成像器件可識別比率分數之趨勢並根據該趨勢嘗試修正未來聚焦移動。例如，若估計所有影像具有4 μm之位移，器件可在高於原先所在位置的一1 μm高度獲取下一影像。若減小下一影像之估計位移，器件可繼續以1 μm增量遞增高度偏移，直至如此不會再增加聚焦品質。若相反下一影像之估計位移變大，器件可沿相反方向遞增偏移。
自動化成像中一般做法係藉由以固定間隔或以二進制搜尋模式變更高度並比較各高度下之自動聚焦分數搜尋理想聚焦高度。本發明之一項具體實施例中，此程序藉由將曲線擬合自動聚焦分數並根據該曲線調整聚焦高度變得更有效及準確。採用在不同聚焦高度獲取之各數位影像獲取多個數位影像。接著針對各影像計算布藍儂分數，並產生擬合分數及可估計布藍儂函數(最佳或理想聚焦高度)之峰值的函數(例如曲線)。然後可使用針對資料產生之曲線調整焦距。
本發明之另一具體實施例中，獲取樣品14之數位影像。接下來，藉由將相鄰像素對之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素100上加總該等平方差異，計算一高解析度布藍儂分數。藉由將相鄰三重像素之平均值差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異，計算一低解析度布藍儂分數。接著藉由將高解析度布藍儂分數除以低解析度布藍儂分數計算比率。或者，藉由將低解析度布藍儂分數除以高解析度布藍儂分數計算比率。根據前述比率之一，接著調整焦距。藉由實驗資料或透過如等式3之模型化等式決定調整度，其將比率與自最佳聚焦之位移度相關。
由於對於任何給定比率，存在兩個位移值(一正及一負)，樣品成像裝置32可隨機拾取兩個選項之一並相應地移動。接著可獲得第二(或額外)影像以檢查是否已到達最佳聚焦。或者，可將系統設定成預測初始影像位於聚焦平面之一已知側上。例如，可在一位置取得初始影像，以便合理地估計樣本需要移動至更靠近光學元件。關於此點，系統可執行第二調整或額外調整，以將焦距減小至到達光學聚焦位置。
樣品成像裝置32之電腦系統46可包括查詢表或資料庫，其包括與計算之比率成一函數關係的位移值。關於此點，可就自真實聚焦之估計位移作出快速決定。一旦從資料庫或查詢表獲得估計位移值，可將樣品14(經由可移動平台40)移向或遠離器件光學元件。或者，用於等式(例如等式9)之係數可根據資料集來計算，並且等式之倒數可用於預測與計算之比率成一函數關係的位移。
一旦移動樣品14(及/或光學元件)以調整至預測正確聚焦平面，可經由樣品成像裝置32獲得樣品之另一影像。第二影像可用於確認新位置是否位於或足夠靠近光學聚焦位置。此可藉由再次計算本文所述之布藍儂分數或比率來決定。例如，若第二新位置仍與最佳聚焦位置相隔某一距離，樣品14及/或光學元件可移動如新分數或比率所指示的一特定數量(即位移)。此程序可重複任何次數，直至器件32已到達最佳(或接近最佳)聚焦平面。
本發明之一項具體實施例中，可修改使用在不同聚焦高度下獲取多個影像之標準自動聚焦方法的器件，以將鐘形曲線等式擬合來自該等多個影像之分數並從該等資料內插鐘形曲線之峰值。使用此方法，可在相對較大偏移(例如4 μm)下收集資料點，但可採用更精細之解析度估計理想聚焦高度。圖5說明與位移成一函數關係的布藍儂分數(y軸)之曲線圖。三個實心菱形代表使用4 μm步進增量收集之資料點。虛線代表使用三個(實心菱形)資料點之最佳擬合。最佳擬合係可使用指數函數(如等式3之函數)模型化或近似的鐘形曲線。假設擬合在多個高度下用於相同欄位之聚焦分數，可找到聚焦分數曲線之峰值(或光學聚焦位置)。此給出解析度比個別框架間之步進高度更精細的估計。圖5亦採用中空菱形說明藉由以較小1 μm步進聚焦平面獲得的實際資料。從圖5可看出，最佳擬合曲線顯示與從1 μm逐步聚焦平面調整獲得的資料之接近完美的對準。此顯示從間隔較寬之填充點估計峰值將產生與藉由以較小間隔獲取更多影像而得到者同樣的準確度改良，但無獲取該等影像所需的額外時間。
藉由使用多個資料點之最佳曲線擬合估計鐘形曲線之峰值，可增加樣品成像器件內聚焦操作之速度及準確度。除以固定增量或以用於最佳聚焦高度之二進制搜尋移動外，聚焦演算法可將曲線擬合現有點集，然後在曲線之估計峰值下獲取下一影像，從而使其可更快地會聚於峰值上。
具體實施例說明使用布藍儂分數來計算及測量數位影像內之小比例及較大比例紋理。然而應瞭解，亦可使用熟習此項技術人士所熟知的其他自動聚焦得分方法，以量化小比例及較大比例紋理解析度。
10．．．載玻片
14．．．樣品
32．．．樣品成像裝置/影像處理系統
34．．．伺服器
36．．．檢視台
38．．．第一光學系統
40．．．載玻片平台
42．．．照明器
44．．．第二光學系統
46．．．內部電腦系統
48．．．電子相機
50．．．顯微鏡
51．．．光學路徑
52．．．透鏡系統
54．．．自動聚焦機制
56．．．平台馬達
58．．．軸承
59．．．基座
60．．．介面控制器
62．．．位置編碼器
64．．．機器人載玻片處置器
65．．．載玻片固持器
66．．．條碼讀取器
68．．．標記器
70．．．影像處理器
以上已透過使用附圖更明確及詳細地說明及解釋本發明之具體實施例，其中：
圖1示意性地說明一示範性樣品成像裝置。
圖2A係用於小比例紋理(例如兩個像素之區塊)之布藍儂分數計算的圖形表示。
圖2B係用於較大比例紋理(例如三個像素區塊)之布藍儂分數計算的圖形表示。
圖3係小比例(高解析度)布藍儂分數對較大比例(低解析度)布藍儂分數之比率的散佈圖，其與自理想聚焦高度之位移成一函數關係。散佈圖資料係獲得自橫跨三十個載玻片之一測試組取得的12,000個影像。
圖4係曲線圖，其說明與用於圖3之12,000個影像的實際位移相比，預測位移之均方根誤差。
圖5係曲線圖，其說明在距初始高度(實心資料點)0、-4、及-8微米之偏移下獲得的布藍儂分數。虛線係僅使用三個資料點計算的最佳擬合。中空資料點代表在一微米遞增移動下獲得的額外布藍儂分數。
10．．．載玻片
14．．．樣品
32．．．樣品成像裝置/影像處理系統
34．．．伺服器
36．．．檢視台
38．．．第一光學系統
40．．．載玻片平台
42．．．照明器
44．．．第二光學系統
46．．．內部電腦系統
48．．．電子相機
50．．．顯微鏡
51．．．光學路徑
52．．．透鏡系統
54．．．自動聚焦機制
56．．．平台馬達
58．．．軸承
59．．．基座
60．．．介面控制器
62．．．位置編碼器
64．．．機器人載玻片處置器
65．．．載玻片固持器
66．．．條碼讀取器
68．．．標記器
70．．．影像處理器

Claims (9)

  1. 一種使用一自動成像裝置聚焦於一樣品上之方法，該方法包含：(a)使用該成像裝置獲得該樣品在不同聚焦高度下之三個數位影像，該數位影像包含複數個像素；(b)針對該三個數位影像之各者計算一布藍儂分數，其係藉由以下方法：取樣相鄰像素對，將相鄰像素對或相鄰三重像素之各自的平均之差異平方，且將橫跨該三個數位影像之各者之該等平方差異加總；(c)將一指數二次函數擬合於藉由該所計算聚焦高度及該等對應影像布藍儂分數形成的(x,y)點；(d)根據步驟(c)之該函數移動至一新聚焦高度，獲取一新影像，以及計算用於該新影像之布藍儂分數，以及(e)重複(c)及(d)直至到達一理想聚焦高度。
  2. 如請求項1之方法，其中在從該等先前資料點計算之該擬合函數的峰值下獲取各新影像。
  3. 如請求項2之方法，其中當擬合函數高度於將該最新資料點併入至該擬合時估計而到達的該理想聚焦高度係處於該先前函數高度估計之一特定臨限值內。
  4. 如請求項1之方法，其中僅使用具有迄今找到之最高分數的一資料點、具有最接近但低於具有迄今找到之最高 分數之該資料點的該聚焦高度之一資料點以及具有最接近但高於具有迄今找到之最高分數之該資料點的該聚焦高度之一資料點計算該擬合函數。
  5. 如請求項4之方法，其中運用各步驟，該聚焦高度被調整至儘可能接近該擬合函數之該峰值的高度，同時與迄今檢查之所有聚焦高度保持至少一特定距離。
  6. 如請求項4之方法，其中當在該擬合內使用該三個點時到達之該理想聚焦高度全部彼此於一特定距離內。
  7. 一種聚焦一樣品成像裝置之方法，其包含：(a)使用該樣品成像裝置獲得一樣品之一數位影像，該數位影像包含複數個像素；(b)藉由將相鄰像素對之平均值的差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異，計算一高解析度布藍儂分數；(c)藉由將相鄰三重像素之平均值的差異平方並在該數位影像內之一組像素上加總該等平方差異，計算一低解析度布藍儂分數；(d)計算一比率，其包含將該高解析度布藍儂分數除以該低解析度布藍儂分數；以及(e)根據該比率調整該樣品成像裝置之焦距。
  8. 如請求項7之方法，其進一步包含在該調整之焦距下獲得該樣品之一數位影像並重複(b)至(e)。
  9. 如請求項8之方法，其中關於不同影像在該調整之焦距下重複(b)至(e)複數次。
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