TWI477605B - 使體外繼代培養增生之軟骨細胞再度表現軟骨性表型之方法 - Google Patents

Description

使體外繼代培養增生之軟骨細胞再度表現軟骨性表型之方法

本發明係一種使去分化軟骨細胞重新表現軟骨性表型之方法。特定言之，由本發明產生之軟骨細胞適用於臨床骨科治療，軟骨組織工程，與其相關應用。

關節軟骨係由包埋於軟骨性細胞間質內的軟骨細胞所構成。此細胞間質之獨特生物化學組成，使膝關節之關節表面能夠平滑、無摩擦地運動。隨著年齡增加，人類關節軟骨組織之機械性質由於老化而產生生物化學上之變化。30歲以後，關節軟骨之彈性與機械強度顯著降低，由外傷或風濕病及骨關節炎之疾病，可導致嚴重之軟骨損傷與關節疾病。最近，已藉由移植自體軟骨細胞，或異體軟骨細胞，或者藉由使用間葉幹細胞以修復產生缺陷之軟骨組織。^1-4

美國專利第6,623,963號揭示了一種基於第二型膠原蛋白的生物相容型基質材料，其係取自動物軟骨組織，且可應用於細胞之體外培養，諸如軟骨細胞。然而，正常組織或細胞之有限來源限制了此等細胞療法的發展及臨床應用，因在體外單層培養增生之軟骨細胞，其最終將失去其軟骨性表型特徵，諸如第二型膠原蛋白產量的減少，以及蛋白聚糖之沉積量減少。^5,6

此等細胞變化可能由軟骨細胞之正常生理功能在體外之變化，或此等細胞在連續單層培養期間，維持正常蛋白合 成能力之降低所造成。在此等細胞中，觀察到蛋白聚糖之表現量降低，且對諸如轉化生長因子β1(TGF-β1)及胰島素樣生長因子I(IGF-I)之反應性改變。^7-9 膠原蛋白類型鑑定顯示，在快速增殖至活性靜止期間，第二型膠原蛋白變成第一型膠原蛋白。^5,6 經連續增生之軟骨細胞失去其圓形或多邊形生理外觀，逐漸變成纖維母細胞樣細胞。此種軟骨細胞由於不再具備正常軟骨細胞的一般軟骨性表型、特徵及功能，而被稱為「去分化」之軟骨細胞。^5,6 許多因素包括體外細胞培養密度、使用之培養基，以及細胞捐贈者之年齡，均會影響此去分化過程發生之程度及速率。^10,11 因此，軟骨細胞於體外之培養與增生時，其失去軟骨細胞表型及功能之去分化現象，係軟骨修復於臨床使用及/或商業化使用之侷限性所在。

關節軟骨之兩種主要細胞外間質組成成分為蛋白聚糖及第二型膠原蛋白。第二型膠原蛋白及蛋白聚糖形成軟骨之骨架，為軟骨提供穩定性及彈性強度。除了作為組織之結構性骨架以外，細胞外基質(ECM)亦藉由細胞之訊息傳導機制調節軟骨細胞。^15-17 此等複雜的交互作用在mRNA以及蛋白質表現之層面影響軟骨細胞之基因表現，從而改變細胞之內部狀態。¹⁷ 此外，細胞外間質之降解通常與軟骨之病理狀態相關，此時，第二型膠原蛋白表現量減少，且基質金屬蛋白酶(MMP)之活性增強。^8,9 此外，TGF-β1及IGF-I等生長因子與關節軟骨細胞之細胞外基質之分泌與維持有關。^4,18-21

在體外連續增生培養軟骨細胞時，為了避免軟骨細胞去分化之現象，以往研究將軟骨細胞懸浮於三維環境中培養，諸如利用凝膠(例如瓊脂糖或海藻酸鹽)法、藻膠顆粒培養法，或利用三維支架培養。一些研究顯示，當在瓊脂糖、膠原蛋白或海藻酸鹽之凝膠中進行三維培養時，「去分化」軟骨細胞可能會「再分化」。^8,12-14 然而，使用此方法時，僅能使繼代培養至多4次(P4)之軟骨細胞恢復軟骨性表型。亦即，增生軟骨細胞之數目僅能至多達到原始細胞數目的2^3,8 倍，不足以供商業及/或臨床使用。此外，海藻酸鹽顆粒之三維培養程序較為複雜，除需要至少兩週來誘導軟骨細胞恢復軟骨性表型，在培養後亦需要自海藻酸鹽顆粒中再度分離軟骨細胞，以供進一步應用。上述缺點使得三維培養方法無法有效率的被應用。

美國專利第7,273,756號揭示了一種在連續增生期間藉由共價連接之玻尿酸之間質上培養軟骨細胞，並在培養基中添加生長因子，以維持軟骨細胞表型的方法。美國專利7,189,567號亦提供一種快速培養大量人類軟骨細胞以獲得正常軟骨細胞的方法，該方法包含在軟骨形成階段共同培養人類軟骨細胞與軟骨膜細胞，作為可支持軟骨細胞之增殖能力的餵養細胞。Yaeger P.C.等人亦證明，TGF-β1及IGF-I之協同作用可用於誘導軟骨細胞中第二型膠原蛋白及蛋白聚糖基因之表現。³⁰ 然而，上述之添加玻尿酸或生長因子於軟骨細胞之培養過程，以恢復軟骨細胞之軟骨性表型之方法，相較之下成本效益為差。此外，僅繼代培養 至多4次(P4)之軟骨細胞可恢復軟骨性表型，因此再分化之軟骨細胞之數目僅達到原始細胞數目之2^3,8 倍，不足以供商業或臨床使用。鑒於上文，一個可以有效並方便的恢復大量繼代增生後之去分化軟骨細胞之軟骨性表型之方法，是為亟待開發的。

本發明提供一種使體外繼代培養後所造成之去分化軟骨細胞重新表現軟骨性表型及生理功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中第二型膠原蛋白與蛋白聚糖表現量，以及糖胺聚醣沉積量的方法。該方法包含使用第二型膠原蛋白，或其生物活性胜肽片段，或其類似物之培養基，於體外培養該等去分化軟骨細胞，以恢復其軟骨性表型及生理功能，及/或增加去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與蛋白聚醣表現量，以及糖胺聚醣沉積量。

本發明發現，大量增生後之去分化軟骨細胞的軟骨性表型可，藉由於第二型膠原蛋白之培養基中培養而恢復。據發現，第二型膠原蛋白(或併用生長因子)可恢復已在體外繼代培養若干代之去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能。

定義

除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語將具有一般技術者通常所理解之含義。該等術語之含義及範疇應為清楚的；然而，為防止任何潛在歧義，本 文中所提供之定義優先於任何詞典定義或外來定義。

術語「軟骨細胞」表示在各種類型之軟骨，例如透明軟骨、彈性軟骨及纖維軟骨中發現之細胞。軟骨細胞為產生特定之軟骨性細胞間質，並具有軟骨性表型的源自中胚層之細胞。其前驅細胞產生大量第一型膠原蛋白，但當其分化為成熟軟骨細胞時，其第一型膠原蛋白合成量減少，並開始合成第二型膠原蛋白，此第二型膠原蛋白構成細胞間質之一部分。此外，成熟之軟骨細胞可分泌蛋白聚糖，其組成亦包括了高度硫酸鹽化之糖胺聚糖。該細胞係指能夠表現軟骨細胞之生物化學特性之標記(包括/但不限於第二型膠原蛋白、硫酸軟骨素、硫酸角質素)，表現軟骨組織中之形態特徵(包括/但不限於在三維培養物中所觀察到之圓球形形態)，以及能夠分泌第二型膠原蛋白(包括/但不限於於源自體外培養之軟骨性組織或其前趨細胞)之細胞。

術語「軟骨性表型」係指具有(i)在三維培養下呈現球形形態且能夠合成及分泌顯著量的(ii)蛋白聚糖及(iii)第二型膠原蛋白，而不會(iv)分泌過高量的第一型膠原蛋白的細胞。亦即，該細胞保持天然軟骨細胞之分化狀態及生理功能、三維下之球形形態及軟骨性基因表現等等。

如本文中所使用，術語「去分化」用於描述缺乏成熟軟骨性表型之軟骨細胞。舉例而言，當軟骨組織之軟骨細胞自軟骨性間質釋放、置於單層培養物中繼代培養大量增生時，其將停止分泌將其定義為成熟軟骨細胞之特徵性標記。成熟軟骨細胞之兩個此種標記為兩種分泌型蛋白：蛋 白聚糖及第二型膠原蛋白。

如本文中所使用，術語「增生」係指藉由體外繼代培養以大量生長細胞的過程。

使去分化軟骨細胞重新表現天然軟骨性表型及生理功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之蛋白聚糖與第二型膠原蛋白表現量，以及糖胺聚糖沉積量

本發明提供一種使體外繼代培養後所造成之去分化軟骨細胞重新表現軟骨性表型及生理功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中第二型膠原蛋白與蛋白聚糖表現量，以及糖胺聚醣沉積量的方法。該方法包含使用含有第二型膠原蛋白，或其活性胜肽片段，或其類似物之培養基(含或不含生長因子)於體外培養該等去分化軟骨細胞。根據本發明，其中該第二型膠原蛋白，或其活性胜肽片段，或其類似物，可有效恢復該等去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與蛋白聚糖表現量，以及糖胺聚醣沉積量。

在實例上，施用之培養基可包含一或多種生長因子。根據本發明，添加生長因子可進一步提高該等去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能的恢復程度，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白及醣胺聚醣表現量。

在體外大量增生細胞過程中，軟骨細胞將產生去分化現象。該等去分化軟骨細胞在形態上類似於纖維母細胞。第二型膠原蛋白及蛋白聚糖之合成逐漸減少，而纖維軟骨所特有之第一型膠原蛋白之合成增加。使去分化之軟骨細胞 重新表現軟骨性表型，對利用此等細胞於軟骨修復應用之成功至關重要，因為具纖維母細胞表型之去分化軟骨細胞所產生之組織，在替代關節軟骨時不能有效發揮作用。

糖胺聚糖及第二型膠原蛋白為用於定義成熟軟骨細胞表型的兩種標誌分子。本發明發現第二型膠原蛋白在有或無添加生長因子時，可恢復去分化軟骨細胞之軟骨性表型，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之醣胺聚醣及第二型膠原蛋白表現量。第二型膠原蛋白與生長因子在恢復去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能，及/或增加去分化軟骨細胞中的蛋白聚糖與第二型膠原蛋白表現量，以及醣胺聚醣沉積量之效果，展現出協同效應。

根據本發明，軟骨細胞可自青少年或成人之軟骨組織分離。軟骨祖細胞之其他來源包括(但不限於)間葉幹細胞、臍帶血幹細胞、骨髓間質細胞、脂肪間質細胞或來源於骨膜或滑膜的軟骨性祖細胞。軟骨細胞可分離自患者之軟骨的自體健康部分、其他人類之同種異體軟骨，或任何其他哺乳動物之異種軟骨，包括(但不限於)家畜(諸如牛、豬、綿羊及馬等等)、猩猩、黑猩猩、猴、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等等。軟骨細胞亦可源於經遺傳工程改造的轉殖基因動物。軟骨亦可獲自含有透明軟骨、彈性軟骨或纖維軟骨的任何組織。

根據本發明，能夠在組織培養物中支持細胞的任何培養基均可用於繼代培養及增生軟骨細胞。將會支持纖維母細胞及/或軟骨細胞生長的培養基調配物包括(但不限於)杜爾 貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、杜爾貝科改良伊格爾培養基/哈姆營養混合物F12(Ham's Nutrient Mixture F12)、杜爾貝科改良伊格爾培養基/F12(DMEM/F12)、α改良最低必需培養基(α-MEM)，及羅斯威爾派克紀念研究所培養基1640(Roswell Park Memorial Institute Media 1640；RPMI培養基1640)及其類似物。通常，向上述培養基中添加0至20%胎牛血清(FBS)或1%至20%馬血清以支持軟骨細胞之生長。然而，若鑑別出FBS中基質細胞及軟骨細胞之必需生長因子、細胞因子及激素且可以適當濃度在生長培養基中提供，則可使用確定成分培養基。適用於本發明方法之培養基可含有一或多種添加物，包括(但不限於)抗生素，及可使細胞增生或分化之生長因子。細胞將在適當溫度(諸如37℃)下在含濕氣CO₂ 培育箱中生長。二氧化碳含量將維持在2%至10%之間，且氧含量將維持在1%與22%之間。軟骨細胞經若干繼代培養之後，其逐漸失去其生理活性；其軟骨性表型將逐漸消失，而成為去分化之軟骨細胞。

根據本發明，發現該等去分化軟骨細胞之軟骨表型及生理功能、第二型膠原蛋白及聚醣蛋白表現量，以及醣胺聚醣沉積量，可借由第二型膠原蛋白，或其生物活性胜肽片段，或其類似物，來培養該等去分化軟骨細胞而恢復。根據本發明，術語第二型膠原蛋白之「活性片段」描述，含有第二型膠原蛋白之一個或多個部分胺基酸序列，且能夠恢復去分化軟骨細胞之軟骨表型及生理功能，及/或增加 該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與聚醣蛋白表現量，以及醣胺聚醣沉積量的任何合成胜肽或多胜肽。術語第二型膠原蛋白之「活性類似物」包括結構上與第二型膠原蛋白或其活性片段相關的化合物。因而，該術語包括但不限於其能夠恢復該等去分化軟骨細胞之天然軟骨性表型及生理功能的合成胜肽，多胜肽或其片段的任何組合。術語「類似物」亦涵蓋不同於第二型膠原蛋白之胺基酸序列，而仍能夠實質上等效地恢復去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能的任何多胜肽。根據本發明，第二型膠原蛋白、其活性胜肽片段或其類似物之濃度在50至1,000μg/ml範圍內，較佳為50至800μg/ml、50至600μg/ml、50至400μg/ml、50至200μg/ml；100至800μg/ml、100至600μg/ml、100至400μg/ml、100至200μg/ml；200至600μg/ml或200至400μg/ml，且最佳為200至400μg/ml。

根據本發明，去分化軟骨細胞為在已經大量繼代培養超過三次繼代之後失去其軟骨性表型及生理功能而去分化之軟骨細胞。其較佳經繼代培養及增生超過四次繼代，更佳為五、六、七或八次繼代。其最佳經繼代培養及增生至少八次繼代。軟骨細胞之繼代培養將獲得足夠隨後臨床應用的細胞。在各繼代培養過程中，細胞增生三至四倍。然而，其在廣泛繼代培養之後將失去其軟骨性表型及生理功能。

在實例中，可於該含第二型膠原蛋白之培養基添加生長因子，以進一步改良去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理 功能的恢復，及/或增加去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與聚醣蛋白表現量，以及醣胺聚醣沉積量。此外，第二型膠原蛋白與生長因子，在恢復去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能，及/或增加去分化軟骨細胞中的第二型膠原蛋白及聚醣蛋白表現量，以及醣胺聚醣沉積量方面，可展現協同效應。生長因子為能夠刺激細胞生長、增殖及促進細胞分化的物質。用於本發明之生長因子較佳為(但不限於)骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、生長/分化因子(GDF)、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)或其組合。生長因子更佳為轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、骨形態發生蛋白(BMP)或其組合。最佳為胰島素樣生長因子(IGF)與轉化生長因子(TGF)之組合或與纖維母細胞生長因子(FGF)之組合；或IGF、TGF與FGF之組合。最佳為胰島素樣生長因子1(IGF-1)與轉化生長因子β-1(TGF-β1)之組合或與纖維母細胞生長因子2(FGF-2)之組合；或IGF-1、TGF-β1與FGF-2之組合。

在一實例中，可進一步使用第一型膠原蛋白增加去分化軟骨細胞之醣胺聚醣表現量。藉由添加第一型膠原蛋白，可增加細胞增生速率，從而增加總醣胺聚醣表現量。在另一實例中，可進一步添加此項技術中已知有益於恢復軟骨細胞軟骨性表型的其他成分。該等成分之實例包括(但不 限於)生長激素及玻尿酸。

根據本發明，去分化軟骨細胞係以二維(2D)或三維(3D)細胞培養法以第二型膠原蛋白培養。2D細胞培養法為用於大部分細胞培養之慣用方法。其使用填充有培養基，且置於具有溫度與濕度控制閥之CO₂ 培育箱內的培養皿(petri dish)或培養瓶內來進行。在2D細胞培養法中，細胞通常在容器底部或培養基之表面上生長。

3D細胞培養系統適用於增殖細胞及形成組織。在培養過程中，其使用包含正常細胞，與形成細胞間質所必需之培養基質。3D培養法之細胞培養基質可為任何物質，自ECM蛋白至天然來源之基底膜、天然生物聚合物、半合成或合成水凝膠、聚苯乙烯、電紡纖維(electrospum fiber)等等。

去分化軟骨細胞之增生與繼代培養

本發明方法可進一步包含向培養基中添加第一型膠原蛋白，以增加軟骨細胞之增殖的步驟。據發現，第一型膠原蛋白可增加軟骨細胞之增殖。藉由添加第一型膠原蛋白以增加軟骨細胞之細胞數目，可減少用於恢復軟骨性表型的第二型膠原蛋白之需要量。第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例較佳在1：1至0.1：9.9範圍內。第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例更佳在1：2至0.1：9.9範圍內。第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例最佳為1：2至1：6、1：2至1：5、1：2至1：4或1：2至1：3。

效用

本發明提供一種改良先前技術缺陷之方法。特定言之， 本發明方法避免了使用海藻酸鹽珠粒及連續添加細胞因子或玻尿酸之複雜且昂貴之繼代培養程序。根據本發明方法，軟骨細胞可在二維培養盤中進行培養，且不經分離即直接進一步應用。此外，根據本發明方法，在細胞增生期間不需向細胞培養物中添加昂貴的細胞因子或玻尿酸。本發明於實例中，分析生長因子及膠原蛋白對經過七次繼代(P7)及九次繼代(P9)後之去分化軟骨細胞之細胞形態、增殖速率、糖胺聚糖沉積量，及膠原蛋白及蛋白聚糖基因表現量的影響。此外亦評估在三維培養環境中，第二型膠原蛋白恢復人類P7軟骨細胞軟骨性表型之能力，以及其是否優於第一型膠原蛋白之功效。

將藉由本發明獲得之人類軟骨細胞，可利用於混合其他種類之生物材料，以作為軟骨修復之療法或其它之移植之應用。可整合人類軟骨細胞之生物材料之實例包括：膠原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、海藻酸鹽、聚環氧乙烷、纖維蛋白黏接劑、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、蛋白聚糖、糖胺聚糖及人類真皮，該等材料可獨立使用或混合使用。此外，蛋白聚糖及糖胺聚糖等生物材料，可使軟骨細胞與周圍分離，且防止移植之軟骨細胞擴散或被快速吸收，且可充當所移植之軟骨細胞的支架。該等生物材料可呈任何形式，例如薄膜(諸如薄片)、多孔體(諸如海綿)、網狀物(諸如針織物、紡織品、不織布、棉花)及其類似物。其結構以多孔性結構為佳，如此可使軟骨細胞更易於黏附至生物材料，並向內滲透以促進軟骨組織之形成。

本發明之另一目標，為利用藉由上述方法所產生之軟骨細胞或上述組合物，以製備用於人類之軟骨細胞移植、尤其用於治療軟骨性缺陷之組合物。術語「治療軟骨性缺陷」特別指恢復或補償軟骨性缺陷，亦即，至少部分地復原缺陷區域中的軟骨。此情況為自體移植之利用為佳，亦即，用於產生軟骨細胞之生物樣本係來自於所產生之軟骨細胞將投與之個體。

提供以下實例以有助於熟習此項技術者實施本發明。雖然如此，但該等實例不應視為不當限制本發明，因為一般技術者，在不背離本發明發現之精神及範疇的情況下，可對所論述之實例進行修改及改變。

實例 材料及方法 軟骨細胞分離、培養及儲存

根據美國獸醫醫學協會(American Veterinary Medical Association；AVMA)關於安樂死之準則，在CO₂ 室中將3日齡之紐西蘭大白兔(New Zealand white rabbit)無痛犧牲。其後，自兔之髖關節、膝關節、肘關節及肩關節收集關節軟骨。使用CO₂ 室犧牲紐西蘭大白兔或小鼠以獲得關節軟骨細胞之方法亦已描述於文獻中。^27,28 實驗動物使用許可證(The Institutional Approval Certificate for Experimental Animal Usage)亦已註冊於臺北醫學大學(Taipei Medical University)，編號為LAC-92-0036。

人類軟骨細胞之取得方面，可自關節置換手術過程中收 集之關節軟骨碎片取得人類軟骨細胞。將所收集之軟骨置於含有3倍濃度之抗生素的冷藏漢克氏溶液(Hank's solution)中，該等抗生素包括青黴素、鏈黴素及兩性黴素B(fungizone)(P/S/F)。洗滌數次以後，組織在無菌條件下切成小片，且在37℃用含膠原酶(1mg/ml)、透明質酸酶(1mg/ml)及胰蛋白酶(12.5%)之酶溶液(Sigma，St.Louis，MO)消化，搖動1小時，並重複此步驟3至4次。最後離心取得釋出之細胞，將其培養於含10%胎牛血清(FBS，Gibco，Grand island，NY，USA)、40mM L-脯胺酸及3×P/S/F之杜爾貝科改良伊格爾培養基/F12(DMEM/F12，Hyclone，Logan，UT，USA)中。細胞以5×10⁵ 個細胞/10公分培養皿之密度，培養於10ml培養基中。接著，在37℃下、在5% CO₂ 及90%之濕度培育箱中培養細胞。

為大量增生細胞，在培養皿中之細胞可經胰蛋白酶處理後進行繼代。細胞亦可在含10% DMSO之培養基中冷凍保藏，且儲存在液氮中供稍後使用。若須解凍經冷凍之細胞，可將冷凍管置於37℃水浴中解凍，並將細胞立即懸浮在10毫升培養基中培養。

在新培養皿中，軟骨細胞經重複繼代培養，直至細胞達到繼代8次或8次以上。在培養期間並使用倒立式光學顯微鏡(Olympus)觀察細胞形態。在各次繼代之第一、第三及第六天使用數位相機(Nikon coolpix 4500)以160×及400×放大倍數記錄形態變化，諸如細胞形狀、大小、細胞數目。細胞數則以三重複之方式用血球計數器(Burker， Marienfeld，Germany)在光學顯微鏡(Olympus)下以400×放大倍數進行計數。為了精確評估總活細胞數目，在用血球計進行細胞計數之前進行錐蟲藍(trypan-blue)染色排除死細胞。對該組之三重複分別進行計數，以將標準差降至最小。

分離第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白

本發明實例利用源自牛皮之第一型膠原蛋白用於P9大白兔軟骨細胞之單層培養實驗。牛皮膠原蛋白之粗萃取物係獲自台鹽(TaiSalt Incorporation,Taiwan)，且在37℃用於0.5M乙酸中之3mg/ml胃蛋白酶消化3小時，接著在0.9M NaCl-0.5M乙酸中鹽析以獲得經純化之牛第一型膠原蛋白。沈澱之牛第一型膠原蛋白以於PBS中之70%乙醇洗滌數次以移除過量鹽及酸並且滅菌。另一方面，來自鼠尾腱之第一型膠原蛋白亦以類似於先前描述之方式^17,18 加以純化，且應用於人類軟骨細胞之3D培養研究。

為獲得足量膠原蛋白來建立3D培養系統，如先前所描述自豬胸骨軟骨分離及純化用於單層及3D培養研究中之第二型膠原蛋白。^17,18 切碎之軟骨片依序用4M鹽酸胍及4.5M NaCl-50mM Tris(pH 7.5)預處理。接著，以於0.5M乙酸中之3mg/ml胃蛋白酶萃取組織，接著在0.9M NaCl-0.5M乙酸中鹽析。第二型膠原蛋白用於PBS中之70%乙醇洗滌3次以移除過量鹽及酸，亦進行滅菌。最終，膠原蛋白溶解於5mM乙酸中，定量且在4℃儲存直至使用。

微環境因素對軟骨細胞之影響

繼代8中三個培養盤之P8軟骨細胞經胰蛋白酶處理，彙集在一起，且使用血球計計數。接著，將細胞懸浮液等分成6等分試樣，離心，且移除剩餘培養基。將細胞再懸浮於含有0、50、100、200、400或600μg/ml以下膠原蛋白之培養基中：第一型膠原蛋白(COL I，來自牛皮)、第二型膠原蛋白(COL II，來自豬軟骨)，或COL I與COL II膠原蛋白以1：1或1：2之比例的各種組合物。

此外，類似於上述相同方案，將部分細胞再懸浮於含與2ng/ml TGF-β1或2ng/ml TGF-β1加100ng/ml IGF-I預混合之200μg/ml COL II的培養基(R & D Systems,Inc.Minneapolis，MN，USA)中。在對應組中，將彼等細胞再懸浮於不含外源COL II之各別培養基中。在此例中，TGF-β1及IGF-I所採用之濃度，等同於研究TGF-β1及IGF-I在單層培養中對軟骨細胞之影響的相關文獻中所描述之彼等濃度。^13,19 最終，將2×10⁴ 個細胞之等分試樣培養在6孔細胞培養皿中，並且培養6天，每3天更換培養基。

藉由艾爾遜藍(alcian blue)染色進行糖胺聚糖(GAG)分析

藉由艾爾遜藍染色量測總醣胺聚醣積累量。簡言之，細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)澈底沖洗，且用10%甲醛固定至少30分鐘。用蒸餾水沖洗之後，細胞用0.018M H₂ SO₄ 洗滌30分鐘且完全排乾，添加艾爾遜藍溶液(1%艾爾遜藍8GX於0.018M H₂ SO₄ 中)以對醣胺聚醣進行染色，歷時3小時。接著，細胞立即用0.018M H₂ SO₄ 再培育3小時以移除多餘染料。最終，用解離緩衝液(含33%正丙醇之4M鹽酸 胍，Sigma，St.Louis，MO)溶離結合之染料。使用解離緩衝液作為空白組，使用光譜光度計(Hitachi，U2000)在600nm下量測所有樣本之吸光度。

樣品RNA之分離及半定量RT-PCR

藉由使用TRIzol試劑(Life Technologies Ltd.，Paisley，UK)萃取RNA，且儲存在-80℃直至分析使用。接著，RNA(500ng)在含有1×Bca緩衝液、5mM MgSO₄ 、0.5mM dNTPs、2.5μM oligo(dT)引子、2.5μM 9-mer引子、20單位核糖核酸酶抑制劑及22單位BcaBEST聚合酶的20μl反應混合物(Takara Shuzo Co.Ltd.，Tokyo，Japan)中進行逆轉錄反映。逆轉錄係根據製造商所描述之方案進行。為了減少實驗差異，同一實驗組之所有RNA樣本均同時在相同條件下進行逆轉錄。

RNA產物逆轉錄之後，藉由PCR使用特定引子集同時進一步擴增各組中cDNA試樣之等分試樣。藉由PCR使用表1中所列出之特定引子擴增特定cDNA片段。PCR條件參考相應文獻。^20,21 PCR產物利用1.6%瓊脂糖凝膠，在含溴化乙錠之TAE緩衝液中以100V/cm電泳分離。各cDNA之表現強度係藉由影像分析系統(Kodak 1D 3.5)評估，並使用GADPH cDNA產物作為內對照組加以校正。各組中經定量之相同體積cDNA樣本經PCR擴增以便測定各樣本中之相對含量，並用各別GADPH cDNA含量進行校正。

軟骨細胞在三維軟骨性基質中之再分化

為了測定第一型膠原蛋白及第二型膠原蛋白在3D(三維) 軟骨性基質中，其恢復去分化軟骨細胞之軟骨性表型的效果，1×10⁶ 個P7人類軟骨細胞以每毫升2倍濃度之培養基懸浮，並且與等體積溶於10mM乙酸中之2mg/ml第一型膠原蛋白(COL I，來自鼠尾腱)或第二型膠原蛋白(COL II，來自豬軟骨)溶液混合。細胞-膠原蛋白基質在37℃聚合24至48小時之後形成細胞-基質構築體。將此細胞-基質構築體轉移至25-T培養瓶(Falcon，BD Bioscience^TM )中，且用35ml含10%胎牛血清、40mM L-脯胺酸、3×P/S/F之DMEM/F12培養基培養。每5天更新培養基。所有樣本在第28天用福馬林固定，切片後用蘇木精(hematoxylin)/曙紅(eosin)(H & E)染色以供組織型態評估，且用番紅O(Safranin O)染色，以用於蛋白聚糖沉積量之評估。

統計分析

對細胞增殖速率、醣胺聚糖沉積量及半定量RT-PCR分析之資料進行變異數分析(單因子ANOVA)，且評估為平均值±標準偏差(SD)。各實驗以三重複方式進行，且重複至少二次。藉由鄧肯多重差距檢定(Duncan multiple range test)，並使用在無任何補充劑之情況下培養之軟骨細胞作為對照組確定統計顯著性。機率值p<0.05視為顯著，且用各種連續字母指示。

實例1 軟骨細胞形態及對各種生長因子的反應

圖1A展示P1軟骨細胞之形狀呈多邊形且尺寸較小。在外源之第二型膠原蛋白(COL II)存在下，經COL II處理之組別中，培養皿中之細胞因複雜的細胞-基質相互作用而 形成層理。值得注意的是，在含有外源COL II之培養基中所培養的P9兔軟骨細胞主要呈多邊形或纖維母細胞樣形狀(圖1B)。然而，無COL II補充之P9細胞在尺寸上大幅擴大，在培養皿上平鋪並增生，在一般外觀上為延展之不規則狀(圖1C)。

在本實例中，首先篩檢各種生長因子對誘導兔軟骨細胞中醣胺聚醣沉積量之影響，結果概述於圖2中。在不存在第二型膠原蛋白(無COL II補充組)時，僅用IGF-I加FGF-2處理細胞，略微增加了細胞醣胺聚糖含量。然而，在存在第二型膠原蛋白(COL補充組)時，與未經處理之對照組相比，所有組之醣胺聚醣表現量均上升。在補充COL II之細胞組中，與未經處理之對照組相比，用IGF-I加bFGF或IGF-I加TGF-β1處理之組別，其醣胺聚醣沉積量增加多達2倍，且顯著高於僅用COL II之組別。

如圖2中所示，TGF-β1與IGF-I之組合，在存在與不存在COL II之間，展現出最顯著的醣胺聚醣表現差異。此結果顯示COL II與共用兩種生長因子對增加軟骨細胞之軟骨性表型之協同效應。因而，在隨後研究中，選擇在基本培養基中加入TGF-β1及IGF-I，作為研究COL II對去分化P9軟骨細胞之軟骨性表型之效果。

實例2 第二型膠原蛋白對軟骨細胞增殖之影響

在觀察不同間質處理之P9軟骨細胞時，除了在600μg/ml時稍有刺激細胞增生之效果，單獨使用第一型膠原蛋白(COL I)對細胞增殖速率之影響差異極微。然而，以 1：1比例之COL II與COL I處理P9軟骨細胞時，其對細胞增殖之影響，在三個不同濃度下皆能刺激細胞增生，且呈現劑量依賴性。在600μg/ml濃度下，P9軟骨細胞增殖速率高達2.2倍。在COL II與COL I以2：1比例組合之組別中，當存在高濃度膠原蛋白時，未觀察到對總細胞數目的顯著影響。相反地，在單獨存在COL II之組別中，COL II在所有添加濃度下大幅抑制細胞增殖速率。當外源COL II濃度自200μg/ml上升至600μg/ml時，細胞數目分別降至對照組之60%及46%(圖3a)。

另一方面，在補充或未補充COL II時所培養之P9軟骨細胞中，其增殖速率顯示完全不同的生長模式。在存在COL II時，軟骨細胞增殖比不存在COL II時慢(圖3b)。無外源COL II補充時，軟骨細胞在培養皿中之第5天達到100%滿盤，而在存在COL II時，在第5天織培養皿中未達到100%滿盤。此外，不論存在或不存在COL II，與各別對照組相比，單獨TGF-β1或TGF-β1與IGF-I之添加，均略微降低細胞增殖速率(圖3b)。

實例3 第二型膠原蛋白對軟骨細胞糖胺聚糖沉積量之影響

在單獨存在COL II或COL II：COL I(比例為2：1)的組別中，在200μg/ml至600μg/ml之三個膠原蛋白濃度下，P9軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量均大幅增加至數倍(分別為3.7至4.4倍或2.2至3.8倍)(圖4)。儘管如此，在單獨存在COL I時，P9軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量僅增加約1.8至2.6倍， 且具有反劑量效應。各種濃度的COL II：COL I(比例為1：1)亦使軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量增加至約1.8至2.3倍(圖4)。

如圖5中所示，TGF-β1及TGF-β1加IGF-I之組別，在不存在COL II時，影響P9軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量。另一方面，與單獨添加TGF-β1組別或單獨存在COL II組相比，在存在COL II時，單獨添加TGF-β1之組別顯著地降低醣胺聚醣沉積量，而IGF-I加TGF-β1大幅增加醣胺聚醣沉積量。資料明顯表明，在單獨COL II組中，COL II有效促進P9軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量，達到對照組之3.3倍。TGF-β1加IGF-I，而非單獨TGF-β1(僅為對照組之2.7倍)，進一步增強COL II之作用，總醣胺聚醣沉積量高達各別對照組之4.4倍(圖5)。

實例4 外源第二型膠原蛋白及生長因子對軟骨細胞基因表現之影響

本實例藉由半定量RT-PCR，以分析去分化P9兔軟骨細胞在各種處理條件下的第一型膠原蛋白(COL1A1)、第二型膠原蛋白(COL2A1)及蛋白聚糖(AGN)之mRNA含量。為了測定COL II在調節軟骨細胞分化狀態方面的獨特作用，本實例比較存在或不存在COL II情況下，培養之P9軟骨細胞其此等基因的相對表現量。與未補充COL II之各別對照組(COL II-)相比，除補充COL II並添加TGF-β1處理之組別以外，所有COL II補充組(COL II+)之COL2A1 mRNA表現量均顯著增加。未經任何處理之對照組則幾乎不表現此等 標誌基因(圖6)。

此外，在添加生長因子之組別(TGF-β1及TGF-β1+IGF-I)中，P9之去分化兔軟骨細胞在無COL II存在的情況下，其COL2A1 mRNA表現量明顯增加(圖6)。單獨補充COL II，或同時添加TGF-β1與IGF-I，其亦可使P9細胞重新表現COL1A1。然而，僅補充COL II並同時添加TGF-β1及IGF-I之組別，可使細胞再度表現AGN mRNA至與P1對照組相似之表現量(圖6 )。

本實例亦展示第二型膠原蛋白對人類P7軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量，以及其他軟骨性標記(包括Sox9、第二型膠原蛋白及聚集蛋白聚糖)之mRNA表現量的影響。P7人類軟骨細胞中之Sox9、第二型膠原蛋白、及蛋白聚糖的mRNA表現量，在單獨添加第二型膠原蛋白之後顯著增加(圖7)。此外，P7人類軟骨細胞中之第一型膠原蛋白的mRNA表現量，在添加第二型膠原蛋白的情況下降低。第二型膠原蛋白亦增加P7人類軟骨細胞之醣胺聚醣含量(圖8)。

實例5 軟骨細胞在三維軟骨性基質中之再分化

在培養28天之3D細胞-基質構築體中評估COL I及COL II基質對P7人類軟骨細胞之軟骨性表型表現的影響。與COL I細胞-基質構築體中之P7人類軟骨細胞(圖9A)相比，COL II細胞-基質構築體中之彼等細胞(圖9B)展現更加成熟之軟骨性特徵。在P7人類軟骨細胞-COL II構築體之H/E染色組織切片中，觀察到更圓且叢集之軟骨細胞表型。與COL I細胞-基質構築體相比，在由COL II構成之3D細胞-基質構 築體中觀察到更多具有腔隙樣結構(箭頭)的細胞，該等腔隙結構代表了由軟骨細胞分泌的軟骨性基質。此外，與COL I細胞-基質構築體(圖9C)中相比，在P7人類軟骨細胞-COL II構築體(圖9D)切片中經番紅O染色之切片，展現更多且更濃密之蛋白聚糖纖維。此等資料表明，與包埋在COL I中之P7人類軟骨細胞相比，包埋在COL II中之P7人類軟骨細胞，具有更佳之蛋白聚糖分泌及基質沈積。

參考文獻

1. Worster A.A., Brent D. Brower-Toland, Lisa A. Fortier, Stephen J. Bent, Janice Williams, Alan J. Nixon, 2001. Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cells sequentially exposed to TGF-1 in monolayer and IGF-I in a three-dimensional matrix. J Orthopaedic Res. 19:738-749.

2. Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L, 1994. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. New Eng J Med. 331:889-941 。

3. Convery FR, Akeson Wh, Amiel D, Meyers MH, Monosov A, 1996. Long term survival of chondrocytes in an osteochondral articular cartilage allograft. J Bone Joint Surg. 78-A:1082-1088.

4. Ghazavi MT, Pritzker KP, Davis AM, Gross AE, 1997. Fresh osteochondral allografts for post-traumatic osteochondral defects of the knee. J Bone Joint Surg. 79-B:1008-1013.

5. Benya PD, Padilla SR, Nimmi ME, 1978. Independent regulation of collagen types by chondrocytes during the loss of differentiated function in culture. Cell 15: 1313-1321.

6. Benya, PD，及Shaffer, J. D, 1982. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell 30: 215-224.

7. Martin JA, Buckwalter JA. 1997. Age-related decline in chondrocyte response to insulin-like growth factor-1: the role of growth factor binding proteins. J Orthopaedic Res. 15:491-498.

8. Buckwalter JA, Mankin HJ, 2000. The role of chondrocyte-matrix interactions in maintaining and repairing articular cartilage. Biorheology. 37:129-140.

9. Martin JA, Buckwalter JA, 2003. The role of chondrocyte senescence in the pathogenesis of osteoarthritis and in limiting cartilage repair. J Bone Joint Surg. 85：增刊2 106-110.

10. Loeser RF, 2000. Chondrocyte integrin expression and function. Biorheology. 37: 109-116.

11. Tarone G, Hirsch E, Brancaccio M, De Acetis M, Barberis L, Balzac F.等人，2000. Integrin function and regulation in development. Int J Dev Biol. 44: 725-731.

12. Qi WN, Sean P S, 2003. Type II collagen modulates the composition of extracellular matrix synthesized by articular chondrocytes. J Orthop Res. 21:282-289.

13. Fortier LA, Lust G, Mohammed HO, Nixon AJ, 1999. Coordinate upregulation of cartilage matrix synthesis in fibrin cultures supplemented with exogenous insulin-like growth factor-I. J Orthop Res. 17:467-474.

14. Fosang AJ, Tyler JA, Hardingham TE, 1991. The effect of interleukin-1 and insulin like growth factor-I on the release of proteoglycan components and hyaluronan from pig articular cartilage in explant culture. Matrix. 11:17-24.

15. Nixon AJ, Lillich JT, Burton-Wurster N, Lust G, Mohammed O, 1998. Differentiated cellular function in fetal chondrocytes cultured with insulin-like growth factor-I and transforming growth factor-B. J Orthop Res. 16:531-551.

16. Van Beuningen HM, Arntz O, van den Berg WB, 1993. Insulin-like growth factor stimulation of articular chondrocyte proteoglycan synthesis. Availability and responses at different ages. Br J Rheum.32:1037-1043.

17. Tsai YH, Tang JR, Leu B, Liou YJ,Yeh SD, Mao SJT及Lai WF T, 2000. Preparation, characterization and application of purified rabbit type I collagen, type II collagen and their antibodies. Y2K ROC-Japan Joint Symposium on Biomaterials and Controlled Release. 377-380.

18. C. W. Chen, Y. H. Tsai, W. P. Deng, S. N. Shih, C. L. Fang, J. G. Burch, W. H. Chen，及W. F. Lai, 2005. Type I and II collagen regulation of chondrogenic differentiation by mesenchymal progenitor cells. J Orthop Res. 23:446-453.

19. Worster AA, Nixon AJ, Brower-Toland BD, Williams J, 2000. Effect of transforming growth factor β1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61:1003-1010.

20. Hellio Le Graverand MP, Reno C, Hart DA, 2000. Heterogenous response of knee cartilage to pregnancy in the rabbit: assessment of specific mRNA levels. Osteoarthritis Cartilage. 8:53-62.

21. Majima T, Lo IK, Randle JA, Marchuk LL, Shrive NG, Frank CB, Hart DA, 2002. ACL transection influences mRNA levels for collagen type I and TNF-alpha in MCL scar. J Orthop Res. 20:520-525.

22. Watt FM, 1988. Effect of seeding density on stability of the differentiated phenotype of pig articular chondrocytes in culture. J Cell Sci. 89:373-378.

23. Lefebvre V, Peeters-Joris C, Vaes G, 1990. Production of collagens, collagenase and collagenase inhibitor during the dedifferentiation of articular chondrocytes by serial subcultures. Biochim Biophys Acta. 1051:266-275.

24. Thenet S, Benya PD, Demignot S, Feunteun J, Adolphe M, 1992. SV40-immortalization of rabbit articular chondrocytes: alteration of differentiated functions. J Cell Physiol. 150:158-167.

25. Bonaventure J, Kadhom N, Cohen-Solal L, Ng KH, Bourguignon J, Lasselin C, Freisinger P, 1994. Reexpression of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular chondrocytes cultured in alginate beads. Exp Cell Res. 212:97-104.

26. Lemare F, Steimberg N, Le Griel C, Demignot S, Adolphe M, 1998, Dedifferentiated chondrocytes cultured in alginate beads: restoration of the differentiated phenotype and of the metabolic responses to interleukin-1beta. J Cell Physiol. 176:303-313.

27. Wakitani S, Goto T, Young RG, Mansour JM, Goldberg VM, Caplan AI, 1998, Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4:429-444.

28. Talwar RM, Wong BS, Svoboda K, Harper RP, 2006, Effects of estrogen on chondrocyte proliferation and collagen synthesis in skeletally mature articular cartilage. J Oral Maxillofac Surg. 64:600-609.

29. O'Leary JM, Hamilton JM, Deane CM, Valeyev NV, Sandell LJ, Downing AK, 2004, Solution structure and dynamics of a prototypical chordin-like cysteine-rich repeat (von Willebrand Factor type C module) from collagen IIA. J Biol Chem. 279:53857-53866.

30. Yaeger PC, Masi TL, de Ortiz JL, Binette F, Tubo R, McPherson JM, 1997. Synergistic action of transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor-I induces expression of type II collagen and aggrecan genes in adult human articular chondrocytes. Exp Cell Res. 237:318-325.

31. Aszodi A, Hunziker EB, Brakebusch C, Fassler R, 2003. Betal integrins regulate chondrocyte rotation, G1 progression, and cytokinesis. Genes Dev.17:2465-2479.

32. Segat D, Comai R, Di Marco E, Strangio A, Cancedda R, Franzi AT, Tacchetti C, 2002. Integrins alpha(6A)beta 1 and alpha(6B)beta 1 promote different stages of chondrogenic cell differentiation. J Biol Chem. 277:31612-31622.

33. Knight CG, Morton LF, Onley DJ, Peachey AR, Messent AJ, Smethurst PA, Tuckwell DS, Farndale RW, Barnes MJ, 1998. Identification in collagen type I of an integrin alpha2 beta1-binding site containing an essential GER sequence. J Biol Chem. 273:33287-33294.

圖1展示兔軟骨細胞在不同培養條件下的形態變化。P1兔軟骨細胞之形態主要為多邊形(A)。與未經處理之組相比，用COL II處理之P9兔軟骨細胞顯示更多多邊形(B)，該等P9兔軟骨細胞在培養基(C)上充分增生並平鋪。

圖2展示經各種生長因子(含第二型膠原蛋白及不含第二型膠原蛋白)處理7天的P4兔軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量。數值資料以平均值±SD(n=3)表示，並以單因子ANOVA及鄧肯多重差距檢定分析。各組合以不同字母標在在P<0.05時的差異顯著性。

圖3展示外源膠原蛋白及生長因子對培養6天後的P9兔軟骨細胞之細胞增殖速率的影響。在6孔培養盤中培養之P9兔軟骨細胞，在有或無外源膠原蛋白的情況下，或有或無生長因子的存在下處理6天。(a)：在特定比例之膠原蛋白存在下，以不同濃度培養細胞。(b)：在有或無TGF-β1或TGF-β1加IGF-I情況下、或在有或無COL II(200μg/ml)存 在下培養P9軟骨細胞。數值資料以平均值±SD(n=3)表示，並以單因子ANOVA及鄧肯多重差距檢定分析。各組合以不同字母標在在P<0.05時的差異顯著性。

圖4展示各種膠原蛋白對P9兔軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量的影響。在6孔培養盤中培養之P9兔軟骨細胞在有或無各種外源COL I及/或COL II組合的情況下處理6天。濃度組別包括以200μg/ml、400μg/ml或600μg/ml，膠原蛋白組成包括單獨COL I、1：1或2：1之COL II：COL I，或單獨COL II之組別。數值資料以平均值±SD(n=3)表示，並以單因子ANOVA及鄧肯多重差距檢定分析。各組合以不同字母標在在P<0.05時的差異顯著性。

圖5展示以第二型膠原蛋白及生長因子處理後之P9兔軟骨細胞的醣胺聚醣含量。P9兔軟骨細胞在6孔培養盤中在200μg/ml COL II存在下進行培養。細胞在有或無TGF-β1(2ng/ml)或TGF-β1(2ng/ml)加IGF-I(100ng/ml)存在下處理6天。所有組別中之P9軟骨細胞均用艾爾遜藍染色並分析醣胺聚醣沉積量。數值資料以平均值±SD(n=3)表示，並以單因子ANOVA及鄧肯多重差距檢定分析。各組合以不同字母標在在P<0.05時的差異顯著性。

圖6展示用各種生長因子與第二型膠原蛋白處理後，P9兔軟骨細胞中之第一型膠原蛋白及第二型膠原蛋白、蛋白聚糖及GAPDH的mRNA表現量。在6孔培養盤中培養之P9兔軟骨細胞在有或無外源COL II或與指定生長因子組合的情況下處理6天。COL1A1、COL2A1、AGN及GADPH之引 子序列列於表1中。在存在COL II時，軟骨細胞特異性分化標記COL2A1在P9對照組(COL II+，P9對照組)或用TGF-β1加IGF-I組處理之P9細胞(COL II+，T+IGF-I)中顯著表現。然而，COL2A1表現在用COL II加TGF-β1處理之P9細胞(COL II+，TGF-β1)中降低。相反地，在不存在COL II(COL II-)時，在P9對照組(COL II-，P9對照組)中未偵測到COL2A1表現。然而，儘管不存在外源COL II，COL2A1在TGF-β1或TGF-β1加IGF-I處理之組別中表現。此外，存在COL II下，僅有TGF-β1加IGF-I處理的P9細胞組別中中可表現AGN，且其表現量上升同P1對照細胞。

圖7展示以各種濃度之第二型膠原蛋白處理12天後，P7人類軟骨細胞中的mRNA表現量(包括Sox9、第二型膠原蛋白、第一型膠原蛋白及蛋白聚糖)。

圖8展示外源第二型膠原蛋白以各種濃度處理12天對P7人類軟骨細胞之醣胺聚醣沉積量的影響。

圖9展示P7人類軟骨細胞在第一型膠原蛋白及第二型膠原蛋白基質中之三維組織培養。P7人類軟骨細胞在三維膠原蛋白凝膠中培養28天。與COL I 3D軟骨細胞-基質構築體(A)相比，COL II製造之3D軟骨細胞-基質構築體(B)的組織特徵展現更多腔隙樣軟骨性特徵(箭頭)及叢集型軟骨細胞。此外，與COL I製造之細胞-基質構築體(C)相比，COL II製造之細胞-基質構築體(D)的番紅O染色顯示更多且更密之紅褐色軟骨性蛋白聚糖纖維。

Claims (20)

1. 一種方法，其係使體外繼代培養後所造成之去分化軟骨細胞重新表現軟骨性表型及生理功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中第二型膠原蛋白與蛋白聚醣(Aggrecan；AGN)表現量以及糖胺聚醣(Glycosaminoglycan；GAG)蓄積量，該方法包含使用含有第二型膠原蛋白之培養基於體外培養該等去分化軟骨細胞，其中該等去分化軟骨細胞為在已經繼代培養超過三、四、五、六及至多八次或八次以上繼代之後已失去其軟骨細胞表型而變成去分化軟骨細胞的軟骨細胞。
2. 如請求項1之方法，其中可向該含第二型膠原蛋白及第一型膠原蛋白之培養基中進一步添加一或多種生長因子，以提高該等去分化軟骨細胞之軟骨性表型及生理功能的恢復程度，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白及蛋白聚醣表現量以及醣胺聚醣沉積量。
3. 如請求項2之方法，其中該生長因子係選自由以下組成之組合：骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、生長/分化因子(GDF)、血管內皮生長因子(VEGF)及其組合。
4. 如請求項3之方法，其中該生長因子係選自由以下組成之組合：轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、骨形態發生蛋白(BMP)或其組合。
5. 如請求項3之方法，其中該生長因子係選自由以下組成之組合：胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子(TGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、IGF與TGF及/或與FGF之組合，及IGF-1與TGF-β1及/或FGF-2之組合。
6. 如請求項1之方法，其中培養基中另包括第一型膠原蛋白以增加軟骨細胞之增殖及去分化軟骨細胞之總蛋白聚醣之表現量。
7. 如請求項6之方法，其中該第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例在1：1至0.1：9.9範圍內。
8. 如請求項6之方法，其中該第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例為1：2至0.1：9.9。
9. 如請求項6之方法，該第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白之比例為1：2至1：6、1：2至1：5、1：2至1：4、或1：2至1：3。
10. 如請求項1之方法，其中用第二型膠原蛋白以二維(2D)或三維(3D)細胞培養法培養該等去分化軟骨細胞。
11. 如請求項1之方法，其中該等去分化軟骨細胞由可分離自人類、猩猩、猴、黑猩猩、狗、貓、大鼠、兔、小鼠、馬、牛、豬、綿羊或轉殖基因動物的軟骨細胞體外繼代培養及增生。
12. 如請求項1之方法，其中該培養基係選自由以下組成之群：杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、杜爾貝科改良伊格爾培養基/哈姆營養混合物F12(Ham's Nutrient Mixture F12) (DMEM/F12)、α改良最低必需培養基(α-MEM)，及羅斯威爾派克紀念研究所培養基1640(Roswell Park Memorial Institute Media 1640；RPMI培養基1640)。
13. 如請求項1之方法，其中該方法產生再分化之軟骨細胞，其具有包括下列之原軟骨細胞之表型：(i)球狀形態及(ii)增加表現量之蛋白聚醣、糖胺聚醣及第二膠原蛋白及降低表現量之第一型膠原蛋白，且可用於軟骨修復或治療軟骨性缺陷。
14. 如請求項1之方法，其中該第二型膠原蛋白之濃度在50至1,000μg/ml範圍內。
15. 如請求項1之方法，其中該第二型膠原蛋白之濃度在50至400μg/ml之範圍內。
16. 如請求項15之方法，其中該第二型膠原蛋白之濃度為200至400μg/ml。
17. 一種培養基，其係用於恢復已經體外繼代培養及增生之去分化軟骨細胞之軟骨性表型及功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與蛋白聚醣表現量以及醣胺聚醣蓄積量，該培養基包含用於繼代培養及增生軟骨細胞之培養基及第二型膠原蛋白；其中該第二型膠原蛋白之濃度為50至400μg/ml。。
18. 如請求項17之培養基，其中該第二型膠原蛋白之濃度為200至400μg/ml。
19. 如請求項17之培養基，其中該培養基可進一步包含一或多種如請求項3中所定義之生長因子及/或第一型膠原蛋 白。
20. 一種套組，其係用於恢復已經體外繼代培養及增生之去分化軟骨細胞之軟骨性表型及功能，及/或增加該等去分化軟骨細胞中之第二型膠原蛋白與蛋白聚醣表現量以及醣胺聚醣沉積量，該套組包含如請求項17之培養基。