TWI468176B - 診斷及治療α－異烯醇酶（α－ｅｎｏｌａｓｅ）相關疾病之抗－α－異烯醇酶抗體 - Google Patents

診斷及治療α－異烯醇酶（α－ｅｎｏｌａｓｅ）相關疾病之抗－α－異烯醇酶抗體

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Description

診斷及治療α-異烯醇酶(α-enolase)相關疾病之抗-α-異烯醇酶抗體
本發明係關於抗α-異烯醇酶I(或稱為α-異烯醇酶)之抗體、其醫藥組合物以及其診斷及治療用途。特定言之，本發明提供多株抗α-異烯醇酶I抗體及單株單鏈可變區片段(scFv)抗α-異烯醇酶抗體、含其之醫藥組合物以及其用於診斷及治療癌症、自體免疫病症、局部缺血及細菌感染之用途。
癌症之特徵在於源自正常組織之異常或贅生性細胞數目增加，該等細胞增殖形成腫瘤塊，此等贅生性腫瘤細胞侵入相鄰組織，以及產生惡性細胞，該等惡性細胞最終經由血液或淋巴系統擴散至局部淋巴結且經由稱作轉移之過程擴散至遠處部位。對該等腫瘤相關細胞表面抗原多肽之鑑別已產生特異性靶向癌細胞之能力以經由基於抗體之療法進行破壞。在發現癌症療法或偵測之有效細胞標靶之嘗試中，研究人員已設法鑑別出相較於一或多種正常非癌細胞而特異性過度表現於特定類型之癌細胞表面上的多肽。在發現癌症療法之有效細胞標靶之其他嘗試中，研究人員已設法鑑別出由特定類型之癌細胞產生且分泌之多肽，其表現量高於由一或多種正常非癌細胞產生且分泌之多肽。儘管在哺乳動物癌症療法中已取得上述確認之進展，但非常需要分別能夠偵測哺乳動物體內腫瘤之存在及用於治療癌症之其他診斷劑及治療劑。
異烯醇酶原先被描述的特性為涉及糖解代謝、催化2-磷酸甘油酸酯轉化為磷酸烯醇丙酮酸酯的酶。在哺乳動物中，異烯醇酶存在三種同功異型物，稱作α-ENO1、β-ENO3及γ-ENO2。α-異烯醇酶為異烯醇酶的主要形式，其存在於胚胎發育之早期階段，普遍表現於各類型組織中，而γ-ENO2及β-ENO3僅發現於神經元及肌肉細胞中(Antikainen等人，2007,FEMS Immunol Med Microbiol 51,526-534；Chang等人，2006,Clin Cancer Res 12,5746-5754)。關於α-異烯醇酶之核酸及胺基酸序列的資訊可自NCBI網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi?ORG=Hs＆CID=517145獲得。據報導α-異烯醇酶為一種展現酶催化、結構及受體功能之多功能蛋白(Chang等人，2006,Clin Cancer Res 12,5746-5754；Lee等人，2003,Arthritis Rheum 48,2025-2035)。除了其糖解功能之外，已發現α-異烯醇酶在多種生物學及病理生理學過程中扮演重要作用。特定言之，α-異烯醇酶被認為在腫瘤形成中扮演重要作用。該蛋白質發現於細胞表面上，充當一種可在腫瘤侵入中發揮作用的纖維蛋白溶酶原受體(Redlitz等人，1995,Eur J Biochem 227,407-415)。已報導在多種高致瘤性或轉移性細胞株中α-異烯醇酶受到上游調控(Chang等人，2006,Clin Cancer Res 12,5746-5754；Peebles等人，2003,Carcinogenesis 24,651-657；Satoshi Ito,2007,Cancer Science 98,499-505；Wu等人，2002,Clin Exp Metastasis 19,319-326；Zhang等人，2000,J Surg Res 93,108-119)。α-異烯醇酶過度表現與導致多類型癌症的致瘤性相關，表明其在癌症形成中之病理生理學作用(Altenberg及Greulich,2004,Genomics 84,1014-1020)。此外，在非小細胞肺癌中鑑別出α-異烯醇酶之自體抗原，且其過度表現與不良存活結果高度相關(Chang等人，2006,Clin Cancer Res 12,5746-5754)。除了在癌症中之作用之外，α-異烯醇酶已涉及眾多疾病，包括自體免疫病症、局部缺血及細菌感染。(Antikainen等人，2007,FEMS Immunol Med Microbiol 51,526-534；Bogdanos等人，2004,J Autoimmune Dis 1,4；Gitlits等人，2001,J Investig Med 49,138-145；Jiang等人，1997,Cancer Res 57,5328-5335；Kinloch等人，2005,Arthritis Res Ther 7,R1421-1429；Saulot等人，2002,Arthritis Rheum 46,1196-1201)。
因此，α-異烯醇酶為用於治療或預防癌症發展之治療劑或用於偵測癌症之潛在標靶。仍需要偵測、治療、預防及逆轉癌症之發展。
本發明之一目的在於提供一種特異性結合α-異烯醇酶I之禽類抗α-異烯醇酶I多株抗體。
本發明之另一目的在於提供一種純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含結合α-異烯醇酶I之重鏈免疫球蛋白可變域及輕鏈免疫球蛋白可變域，其中該輕鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SGGSGSYG(SEQ ID NO: 1)、SGGSSSYGYG(SEQ ID NO: 2)、SGSSGSYG(SEQ ID NO: 3)、SGGSSSYGYS(SEQ ID NO: 4)或SGSSGYGYG(SEQ ID NO: 5)；(ii)CDR2中之ANTNRPS(SEQ ID NO: 6)、NDNQRPS(SEQ ID NO: 7)、RDDKRPS(SEQ ID NO: 8)、SNNQRPS(SEQ ID NO: 9)或SNDKRPS(SEQ ID NO: 10)；及(iii)CDR3中之GGYDSSAGI(SEQ ID NO: 11)、GSGDSSTGM(SEQ ID NO: 12)、GSGESSTNNGI(SEQ ID NO: 13)、GSMDSSNSGV(SEQ ID NO: 14)或GGYDSSASYVGI(SEQ ID NO: 15)；且其中該重鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SFNMF(SEQ ID NO: 16)、SHDMG(SEQ ID NO: 17)、DYCVQ(SEQ ID NO: 18)、SFYMF(SEQ ID NO: 19)或SYAMH(SEQ ID NO: 20)；(ii)CDR2中之GINNAGSTTNHGAAVKG(SEQ ID NO: 21)、GIENAAGIGTFYGAAVKG(SEQ ID NO: 22)、AISNTGRYTGYGSAVKG(SEQ ID NO: 23)、GISGDGRYTGYGAAVDG(SEQ ID NO: 24)或GISRDGGSSTRYYGAAVKG(SEQ ID NO: 25)；及(iii)CDR3中之SPGGIDGIDG(SEQ ID NO: 26)、GADTGGWPAANIDA(SEQ ID NO: 27)、DGCAGCCGSYYIDG(SEQ ID NO: 28)、ESGSGCCNGDNIDA(SEQ ID NO: 29)或DSDNGGYYCDDIDA(SEQ ID NO: 30)。
本發明之另一目的在於提供一種醫藥組合物，其包含本發明之多株抗體及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之另一目的在於提供一種治療或預防α-異烯醇酶I相關病症之方法，其包含投與治療有效量之本發明之多株抗體或單株抗體。
本發明之另一目的在於提供一種用於偵測樣品中α-異烯醇酶I之存在的活體外診斷方法，其包含：(i)使樣品與本發明之抗α-異烯醇酶I抗體接觸；及(ii)偵測該α-異烯醇酶I抗體與該樣品之間的複合物的形成。
本發明之另一目的在於提供一種用於偵測樣品中α-異烯醇酶I之存在的套組，其包含本發明之抗α-異烯醇酶I抗體或其片段，及視情況存在之資訊材料。
本發明藉由噬菌體呈現系統產生且表徵免疫雞的多株抗α-異烯醇酶I抗體及單株單鏈可變區片段(scFv)抗α-異烯醇酶I抗體。此等抗體可有助於開發用於癌症、自體免疫病症、局部缺血及細菌感染之分子診斷劑及治療劑。
定義
應注意到，術語「一」係指一或多個；舉例而言，「一個抗異烯醇酶抗體」應理解為表示一或多個抗異烯醇酶抗體。因而，術語「一」、「一或多」及「至少一」在本文中可互換使用。
如本文中所用，術語「分離」或「純化」意謂多肽已自其自然環境之組份中鑑別及分離及/或回收。其自然環境之污染組份為通常會干擾多肽之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。
如本文中所用，術語「抗體」係指能夠結合所選標靶的完整抗體或抗體片段。包括Fv、scFv、Fab'及F(ab')2 、單株及多株抗體、經工程改造抗體(包括嵌合抗體、CDR移植及人類化抗體、完全人類抗體，及人工選擇抗體)，及使用噬菌體呈現或替代技術產生之合成或半合成抗體。諸如Fv及scFv之小片段因其小尺寸及隨之產生之優良組織分布而具有用於診斷及治療應用之有利特性。
術語「抗體」進一步意欲涵蓋抗體、其消化片段、特定部分及變異體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其特定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括結合α-異烯醇酶之抗原結合片段。舉例而言，本發明涵蓋能夠結合α-異烯醇酶或其部分之抗體片段，包括(但不限於)Fab(例如，藉由木瓜酶消化所產生)、Fab'(例如，藉由胃蛋白酶消化及部分還原所產生)及F(ab')2 (例如，藉由胃蛋白酶消化所產生)、facb(例如，藉由纖維蛋白溶酶消化所產生)、pFc'(例如，藉由胃蛋白酶或纖維蛋白溶酶消化所產生)、Fd(例如，藉由胃蛋白酶消化、部分還原及再聚集所產生)、Fv或scFv(例如，藉由分子生物學技術所產生)片段(參見例如Colligan,Immunology，同上)。
如本文中所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質抗體獲得的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除了可能少量存在之可能的天然存在突變之外均相同。單株抗體具有針對單一抗原位點的高特異性。此外，與通常包括針對不同決定基(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同，各單株抗體係針對抗原上之單一決定基。
因此，修飾語「單株」指示自一群由實質上同源族群之抗體獲得之抗體的特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可由此項技術中已知之融合瘤方法製備，或可由重組DNA方法(諸如美國專利第4,816,567號中所述者)製備。舉例而言，「單株抗體」亦可自例如使用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中所述之技術產生的噬菌體文庫分離。
術語「特異性結合」一般意謂抗體經由其抗原結合域結合抗原決定基，且結合要求抗原結合域與抗原決定基之間有一些互補性。根據此定義，當抗體經由其抗原結合域結合抗原決定基比抗體結合隨機無關抗原決定基更容易時，稱抗體「特異性結合」該抗原決定基。術語「特異性」在本文中用於限定某種抗體結合某種抗原決定基之相對親和性。
如本文中所用之術語「治療」及「療法」係指治癒性療法及預防性療法。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述特徵通常為細胞生長失調之哺乳動物生理學病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、母細胞瘤、胃腸癌、腎癌、胰癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌。
術語「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意謂需要診斷或治療之任何個體，尤其哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、家畜、農畜，及動物園、競技或寵物動物，諸如犬、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
抗體
本發明係關於特異性結合α-異烯醇酶I多肽之抗體、其抗原結合抗體片段以及抗體變異體及片段。此等抗體可為例如多株或單株抗體。更佳為單株抗體。仍更佳為嵌合或人類化抗體，且仍更佳為人類抗體。
多株抗體
在一態樣中，本發明提供一種特異性結合α-異烯醇酶I之禽類抗α-異烯醇酶多株抗體。在本發明之一實施例中，該禽為雞且多株抗體為多株抗α-異烯醇酶I IgY抗體。多株抗體較佳為抗α-異烯醇酶I雞IgY抗體。
此項技術中已知多株抗體之產生。首先，利用人類α-異烯醇酶I多肽之多次注射使禽物種(例如雞、鴨、火雞及其類似物)免疫以在該禽中引起免疫原性反應。在經歷適合時間以在禽體內形成高力價之抗α-異烯醇酶I抗體後，自經α-異烯醇酶I免疫之禽採集血清或卵。
免疫禽之血清及卵黃含有對許多天然暴露抗原具特異性的多種抗體。該方法之下一步驟為自血清或卵黃中分離免疫球蛋白之IgY溶離份(已知該溶離份含有α-異烯醇酶特異性抗體)。此可藉由利用例如Promega Corporation之EGGstractIgY純化系統(Promega Corporation,Madison,Wis. U.S.A.)及HiTrapTM IgY純化HP管柱(GE Healthcare,U.S.A.)之商業產品用卵黃來達成。亦存在自卵黃中分離免疫球蛋白之其他多種方法，諸如其他依序沈澱方法，其為熟習此項技術者所熟知。(參見例如Scopes,R. K. 「Protein Purification: Principles and Practice」，Springer-Verlag New York,1994，其關於蛋白質純化方法之教示係以引用的方式併入本文中)。完全令人滿意地實施本發明的習知蛋白質分離方法為「鹽析」出蛋白質溶離份，此係藉由使蛋白質自鹽溶液中沈澱來進行。可使用例如層析法自禽血清分離出IgY多株抗體。此外，存在多種為熟習此項技術者所熟知的自血清或卵黃樣品中分離免疫球蛋白的方法。
該方法之下一步驟為將IgY溶離份內之α-異烯醇酶I特異性多株抗體(pAbs)與非特異性抗體分離。為達成此目的，將分離之IgY溶離份施加至由α-異烯醇酶I與樹脂偶合產生親和性基質所建構的親和性管柱中。此酶結合基質將僅捕捉IgY溶離份內對α-異烯醇酶I具特異性之彼等抗體。藉由簡單鹽水緩衝溶液多次洗滌自管柱移除IgY溶離份內之非特異性多株抗體。從而使基質僅含有對α-異烯醇酶I具特異性之多株抗體。
單株抗體
在另一態樣中，本發明提供一種結合α-異烯醇酶I之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈免疫球蛋白可變域及輕鏈免疫球蛋白可變域，其中該輕鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SGGSGSYG(SEQ ID NO: 1)、SGGSSSYGYG(SEQ ID NO: 2)、SGSSGSYG(SEQ ID NO: 3)、SGGSSSYGYS(SEQ ID NO: 4)或SGSSGYGYG(SEQ ID NO: 5)；(ii)CDR2中之ANTNRPS(SEQ ID NO: 6)、NDNQRPS(SEQ ID NO: 7)、RDDKRPS(SEQ ID NO: 8)、SNNQRPS(SEQ ID NO: 9)或SNDKRPS(SEQ ID NO: 10)；及(iii)CDR3中之GGYDSSAGI(SEQ ID NO: 11)、GSGDSSTGM(SEQ ID NO: 12)、GSGESSTNNGI(SEQ ID NO: 13)、GSMDSSNSGV(SEQ ID NO: 14)或GGYDSSASYVGI(SEQ ID NO: 15)；且其中該重鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SFNMF(SEQ ID NO: 16)、SHDMG(SEQ ID NO: 17)、DYCVQ(SEQ ID NO: 18)、SFYMF(SEQ ID NO: 19)或SYAMH(SEQ ID NO: 20)；(ii)CDR2中之GINNAGSTTNHGAAVKG(SEQ ID NO: 21)、GIENAAGIGTFYGAAVKG(SEQ ID NO: 22)、AISNTGRYTGYGSAVKG(SEQ ID NO: 23)、GISGDGRYTGYGAAVDG(SEQ ID NO: 24)或GISRDGGSSTRYYGAAVKG(SEQ ID NO: 25)；及(iii)CDR3中之SPGGIDGIDG(SEQ ID NO: 26)、GADTGGWPAANIDA(SEQ ID NO: 27)、DGCAGCCGSYYIDG(SEQ ID NO: 28)、ESGSGCCNGDNIDA(SEQ ID NO: 29)或DSDNGGYYCDDIDA(SEQ ID NO: 30)。
在一實施例中，本發明之純化單株抗體或其抗原結合片段包含選自由雞免疫球蛋白之生殖系基因序列編碼之VH及VL FR1、FR2、FR3及FR4構架區的構架區(關於VL及VH，請分別參閱www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/16902088及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？cmd=Retrieve＆db=protein＆dopt=GenPept＆RID=MS2P2YSH012＆log%24=prottop＆blast_rank=1＆list_uids=104726)或胺基酸序列與由雞免疫球蛋白之生殖系基因序列編碼之VH及VL FR1、FR2及FR3構架區至少85%相同的構架區(framework region)。純化抗體或其抗原結合片段較佳包含胺基酸序列與由雞免疫球蛋白之生殖系基因序列編碼之VH及VL FR1、FR2及FR3構架區至少87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%或99%相同的構架區。在某些實施例中，本發明之單株抗體之VH及VL結構域可經生殖系化，亦即可使用習知分子生物學技術改變此等結構域之構架區(FR)以在一或多個位置(例如，至少70%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%、97%、98%或99%的構架位置)匹配人類生殖系基因或人類生殖系基因產物之共同胺基酸序列。在其他實施例中，構架序列不同於生殖系。
在一實施例中，本發明之純化單株抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的VL互補決定區：i)CDR1中之SEQ ID NO:1、CDR2中之SEQ ID NO: 6及CDR3中之SEQ ID NO: 11；ii)CDR1中之SEQ ID NO: 2、CDR2中之SEQ ID NO: 7及CDR3中之SEQ ID NO: 12；iii)CDR1中之SEQ ID NO: 3、CDR2中之SEQ ID NO: 8及CDR3中之SEQ ID NO: 13；iv)CDR1中之SEQ ID NO: 4、CDR2中之SEQ ID NO: 9及CDR3中之SEQ ID NO: 14及v)CDR1中之SEQ ID NO: 5、CDR2中之SEQ ID NO: 10及CDR3中之SEQ ID NO: 15，及具有選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的VH互補決定區：i)CDR1中之SEQ ID NO: 16、CDR2中之SEQ ID NO: 21及CDR3中之SEQ ID NO: 26；ii)CDR1中之SEQ ID NO: 17、CDR2中之SEQ ID NO: 22及CDR3中之SEQ ID NO: 27；iii)CDR1中之SEQ ID NO: 18、CDR2中之SEQ ID NO: 23及CDR3中之SEQ ID NO: 28；iv)CDR1中之SEQ ID NO: 19、CDR2中之SEQ ID NO: 24及CDR3中之SEQ ID NO: 29及v)CDR1中之SEQ ID NO: 20、CDR2中之SEQ ID NO: 25及CDR3中之SEQ ID NO: 30。較佳地，VL互補決定區具有ii)或v)中所提及之胺基酸序列且VH互補決定區具有ii)或v)中所提及之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明之純化單株抗體或其抗原結合片段包含具有選自由SEQ ID NO: 31-35組成之群之胺基酸序列的輕鏈免疫球蛋白可變域及具有選自由SEQ ID NO: 36-40組成之群之胺基酸序列的重鏈免疫球蛋白可變域。
在一實施例中，抗體或其片段之CDR序列與本文中所述抗體之CDR序列僅有非實質性差異。非實質性差異包括較少胺基酸改變，諸如CDR(例如，Chothia或Kabat CDR)序列中通常任何5-7個胺基酸中之1或2個胺基酸取代。通常胺基酸係由具有類似電荷、疏水性或立體化學特性之相關胺基酸取代。該等取代屬於一般技術者之技能範圍內。與CDR中不同，可在對抗體之結合性質無不利影響的情況下對結構構架區(FR)作出更多實質性改變。對FR之改變包括(但不限於)使非人源構架人類化或工程改造某些對抗原接觸或對結合位點穩定化重要的構架殘基，例如，改變恆定區之種類或次類，改變可能改變效應子(effector)功能(諸如Fc受體結合)之特定胺基酸殘基(Lund等人，(1991) J. Immunol. 147:2657-62；Morgan等人，(1995) Immunology 86:319-24)，或改變衍生自恆定區之物種。
本發明之單株抗體或其抗原結合片段可藉由噬菌體呈現(phage display)技術獲得。噬菌體呈現涉及使肽以與鞘蛋白(例如噬菌體粒子之pIII、pIIV)末端融合的形式定位。參見Scott,J. K.及G. P. Smith(1990) Science 249(4967):386-390；及Lowman,H. B.等人，(1991) Biochem. 30(45): 10832-10838。一般而言，具有特異性結合功能之多肽係如下分離：與標靶一起培育，洗掉非結合噬菌體，溶離已結合噬菌體，且隨後藉由感染新鮮細菌培養物而使噬菌體群體再擴增。其他呈現形式及方法包括mRNA呈現、核糖體或多核糖體呈現、真核病毒呈現，及細菌、酵母及哺乳動物細胞表面呈現。參見Mattheakis,L. C.等人，(1994) PNAS USA 91(19): 9022-9026；Wilson,D. S.等人，(2001) PNAS USA 98(7):3750-3755；Shusta,E. V.等人，(1999) Curr. Opin. Biotech. 10(2):117-122；以及Boder,E. T.及K. D. Wittrup(1997) Nature Biotech. 15(6):553-557。已開發且報導用於在微生物表面上呈現的多種替代呈現技術且作為分離蛋白質結合肽之一般策略加以推行，但尚未報導成功。參見Maurer,J.等人，(1997) J. Bacteriol. 179(3):794-804；Samuelson,P.等人，(1995) J. Bacteriol. 177(6):1470-1476；Robert,A.等人，(1996) FEBS Letters 390(3): 327-333；Stathopoulos,C.等人，(1996) Appl. Microbiol. ＆ Biotech. 45(1-2): 112-119；Georgiou,G.等人，(1996) Protein Engineering 9(2):239-247；Haddad,D.等人，(1995) FEMS Immunol. ＆ Medical Microbiol. 12(3-4):175-186；Pallesen,L.等人，(1995) Microbiol. 141(Pt 11):2839-2848；Xu,Z.及S. Y. Lee(1999) Appl. Environ. Microbiol. 65(11):5142-5147；Wernerus,H.及S. Stahl(2002) FEMS Microbiol. Lett. 212(1): 47-54；及Westerlund-Wikstrom,B.(2000) Int. J. Med. Microbiol. 290(3):223-230。
本文中所述之多株或單株抗體亦可標記可偵測或功能性標記。可偵測標記包括諸如131 I或99Tc之放射性標記，其可使用此項技術中習知之化學方法連接至本文中所述之抗體。標記亦包括酶標記，諸如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶。標記進一步包括諸如生物素之化學部分，其可經由結合特定同源可偵測部分(例如經標記之抗生物素蛋白)加以偵測。
本文中所揭示抗體之結合特性可由任何適合方法量測，包括以下方法：Biacore分析、酶結合免疫吸附分析(ELISA)、X射線結晶學、序列分析及掃描突變誘發，及此項技術中熟知之其他方法。
本發明之醫藥組合物
抗α-異烯醇酶I抗體可併入醫藥組合物中，例如與醫藥學上可接受之載劑組合。此組合物亦可含有例如多種稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑，及此項技術中熟知之其他物質。術語「醫藥學上可接受」意謂不干擾活性成份之生物活性效力的無毒物質。載劑之特性可視投藥途徑而定。
如本文中所用，術語「治療有效量」意謂醫藥組合物或方法之各種活性組份之足以顯示患者有意義受益(例如改善該等病狀之症狀、治癒該等病狀或提高該等病狀之治癒速率)的總量。當應用於單獨投與之個別活性成份時，該術語係指單獨彼成份。當應用於組合時，該術語係指產生治療效果之活性成份的組合量，不論組合、依序或同時投與。
在實施本文中所述之例示性治療方法或用途時，可將治療有效量之結合α-異烯醇酶I且干擾功能性α-異烯醇酶I信號傳導複合物形成(且例如中和或抑制一或多種α-異烯醇酶相關活性)之抗體投與個體，例如哺乳動物(例如人類)。可根據所述方法將抗體單獨或與其他療法組合投與。當與一或多種藥劑共投與時，抗體可與第二藥劑同時投與，或分別(例如依序)投與。若分別(例如依序)投與，則主治醫師將決定投與抗體與其他藥劑之適當順序。
醫藥組合物(例如，含有可結合α-異烯醇酶之抗體的醫藥組合物)之投與可以多種習知方式進行，諸如經口攝入、吸入，或經皮、皮下或靜脈內注射。皮下投與患者為較佳。
當治療有效量之結合α-異烯醇酶I且干擾功能性α-異烯醇酶I信號傳導複合物形成之抗體係經口投與時，結合劑將呈錠劑、膠囊、散劑、溶液或酏劑形式。當呈錠劑形式投與時，醫藥組合物可另外含有諸如明膠之固體載劑或佐劑。錠劑、膠囊及散劑含有約5%至95%結合劑，且較佳約25%至90%結合劑。當呈液體形式投與時，可添加液體載劑，諸如水、石油、動物或植物來源之油(諸如花生油、礦物油、大豆油或芝麻油)或合成油。醫藥組合物之液體形式可進一步含有生理鹽水溶液、右旋糖或其他醣類溶液，或諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇之二醇類。
當治療有效量之結合α-異烯醇酶I之抗體係藉由靜脈內、經皮或皮下注射投與時，結合劑將呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式。製備該等非經腸可接受之蛋白質溶液(具有預定pH值、等張性、穩定性及其類似性質)在此項技術範圍內已知。用於靜脈內、經皮或皮下注射之較佳醫藥組合物除了含有結合劑之外，亦應含有等張性媒劑，諸如氯化鈉注射劑、林格氏注射劑(Ringer's Injection)、右旋糖注射劑、右旋糖及氯化鈉注射劑、乳酸化林格氏注射劑或此項技術中已知之其他媒劑。醫藥組合物亦可含有穩定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑或熟習此項技術者已知的其他添加劑。
醫藥組合物中抗體之量可視所治療病狀之性質及嚴重程度以及患者已經歷之先前治療的性質而定。最終，主治醫師將決定用於治療各個別患者之抗體量。最初，主治醫師將投與低劑量之抗體且觀察患者之反應。可投與較大劑量之抗體直至獲得對患者之最佳治療效果，且此時一般不再進一步增加劑量。舉例而言，可投與劑量之範圍為每公斤體重0.1-50 mg、0.5-50 mg、1-100 mg、0.5-25 mg、0.1-15 mg或1-8 mg。
抗α-異烯醇酶I抗體之治療及預防用途
本發明之抗體可用於治療α-異烯醇酶I相關病症，例如，選自以下一或多者之病症：癌症、自體免疫病症、局部缺血及細菌感染。
α-異烯醇酶I及其受體可能涉及至少一些類型之癌症(例如，源自造血細胞之癌症或源自肺癌之癌症)的發展。癌症較佳為肺癌、乳癌、肛門癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦腫瘤、腎癌、白血病、肝癌、胰癌、前列腺癌、直腸癌。肺癌更佳為非小細胞肺癌。癌症係指一或多種細胞喪失對正常生長控制之反應性，且通常隨調節減低(相對於相應正常細胞而言)而增殖。
抗α-異烯醇酶I抗體之診斷用途
在另一態樣中，本發明提供一種活體外偵測α-異烯醇酶I之存在的診斷方法(例如生物樣品(諸如組織)活體檢查)。該方法包括：(i)使樣品與本發明之抗α-異烯醇酶I抗體接觸；及(ii)偵測α-異烯醇酶I抗體與樣品之間之複合物的形成。該方法亦可包括使參考樣品(例如對照樣品)與配位體接觸，及相對於參考樣品測定配位體與樣品之間之複合物形成的程度。相對於對照樣品或個體，樣品或個體中之複合物形成之變化(例如統計學顯著變化)可指示樣品中存在α-異烯醇酶I。
可藉由量測或顯現與α-異烯醇酶I結合之配位體或未結合配位體來偵測α-異烯醇酶I抗體與α-異烯醇酶I之間的複合物形成。可使用習知偵測檢定，例如酶結合免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學。除標記α-異烯醇酶I抗體外，亦可利用標記可偵測物質之標準物及未標記之α-異烯醇酶I抗體藉由競爭免疫分析法分析樣品中α-異烯醇酶I之存在。
套組
抗α-異烯醇酶I抗體或其片段可例如作為套組組份提供於套組中。舉例而言，套組包括(a)抗α-異烯醇酶I抗體或其片段，例如包括抗α-異烯醇酶I抗體或其片段之組合物，及視情況存在之(b)資訊材料。資訊材料可為與本文中所述方法及/或抗α-異烯醇酶I抗體或其片段用於本文中所述方法之用途有關的描述性、指導性、銷售或其他材料。
套組之資訊材料形式不受限制。在一實施例中，資訊材料可包括關於化合物生產、化合物分子量、濃度、有效日期、批次之資訊，或生產地點資訊等。在一實施例中，資訊材料係關於使用配位體治療、預防或診斷本文中所述之病症。
套組可包括一或多個用於含有抗α-異烯醇酶I抗體或其片段之組合物的容器。在一些實施例中，套組含有用於組合物及資訊材料之各別容器、間隔物或隔室。舉例而言，組合物可包含於瓶、小瓶或注射器中，且資訊材料可包含於塑膠封套或封包中。在其他實施例中，套組之各別要素包含於單一未分隔容器中。舉例而言，組合物包含於附有標籤形式之資訊材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些實施例中，套組包括複數個(例如一包)個別容器，各容器含有一或多個抗α-異烯醇酶I抗體或其片段之單位劑型(例如本文中所述之劑型)。舉例而言，套組包括複數個注射器、安瓿、箔包、霧化器或吸入裝置，其各含有一個單位劑量之抗α-異烯醇酶I抗體或其片段，或多個單位劑量。
套組視情況包括適於投與組合物之裝置，例如注射器、吸管、鑷子、量匙、滴管(例如滴眼管)、藥簽(例如棉質藥簽或木製藥簽)，或任何此等傳遞裝置。在一較佳實施例中，裝置為分配定劑量之配位體的可植入裝置。
下述實例有助於理解本發明，但不意欲且不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。
實例 實例1　表徵經純化之重組α-異烯醇酶及多株抗α-異烯醇酶 IgY抗體
藉由反轉錄-PCR、使用基因特異性引子5'-GGTGGAATTCTATCTATTCTCAAGATCCATGCC -3'(SEQ ID NO: 41)(前置引子)及5'-ACTCCATGGTTACTTGGCCAAGGGGTTTCT -3'(SEQ ID NO: 42)(反置引子)自PE089細胞選殖出編碼α-異烯醇酶蛋白之基因。所得PCR片段選殖於pGEX-KG載體中EcoRI及NcoI位點上且轉型於大腸桿菌BL-21(DE3)菌株中以便其表現。該基因亦使用5'-CCGCGTGAATTCGGGGATCC ATGTCTATTCTCAAGATCC -3'(SEQ ID NO: 43)(前置引子)及5'-CATGGAGTCGACCTCGAG CTTGGCCAAGGGGTTTCTG -3'(SEQ ID NO: 44)(反置引子)次選殖於pET21a載體中且以His融合α-異烯醇酶形式表現。在37℃下使個別純系在5 ml含有安比西林(ampicillin)(100 μg/ml)之LB培養基中生長隔夜。用相同LB培養基將細菌培養物稀釋10倍且使其進一步生長，直至OD600 達到0.6與1.0之間。為誘導GST融合α-異烯醇酶或His融合α-異烯醇酶蛋白質表現，添加異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)直至其在培養物中之最終濃度為0.5 mM。將細胞小球再懸浮於2 ml含有1% Triton x-100的1×PBS中且利用三輪冷凍(-70℃)及解凍(37℃)溶胞。離心後，所得細胞溶胞物根據製造商之說明(General Electronics,Piscataway,NJ,USA)與麩胱甘肽瓊脂糖4B(Glutathione Sepharose 4B)或Ni2+ -帶電荷樹脂管柱一起培育以純化α-異烯醇酶蛋白。
在電泳及庫馬斯藍(Coomassie blue)染色後，經純化之His融合α-異烯醇酶及GST融合α-異烯醇酶顯現為48kD及75kD之單色帶(圖1A中分別為泳道2及3)。如圖1B泳道3中所示，使用抗GST抗體證實GST融合α-異烯醇酶之身分。類似地，經純化His融合α-異烯醇酶免疫之雞中產生的多株IgY抗體能夠明確識別西方墨點上固定之His融合α-異烯醇酶與GST融合α-異烯醇酶(圖1C中之泳道2及3)。
實例2　雞的免疫
藉由肌肉內注射、以含於等體積之弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)中之100 μg純化α-異烯醇酶使雌性白萊亨雞(white leghorn)(家雞(Gallus domesticus ))免疫。以7天之時間間隔用不完全佐劑進行另外三次免疫。在各次免疫後，採集血清及卵黃中之IgY抗體且藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)進行滴定以測定體液抗α-異烯醇酶免疫反應之存在。如先前所述(Akita及Nakai,1993a,b)使用10%硫酸葡聚糖將卵黃與卵白分離以進行IgY純化。將來自各卵之經純化總IgY抗體溶解於5 ml含有0.05%疊氮化鈉的TBS中且儲存於-20℃下。
在各次免疫之前及之後採集雞之血清及卵。將卵黃中之總IgY抗體純化且使用結合辣根過氧化酶之抗雞IgY抗體偵測重鏈與輕鏈片段的存在(資料未展示)。使用純化IgY測試其對固定於硝化纖維素膜(圖1C)或ELISA板孔上之α-異烯醇酶的結合活性。如圖2中所示，在第4次免疫後自卵黃製備之IgY抗體在以1:16,000稀釋滴定時特異性結合α-異烯醇酶而非牛血清白蛋白，表明在雞宿主中引起強體液抗體反應。與之相反，來自免疫前雞卵之IgY抗體對兩種抗原均展示極小的結合信號。
實例3 scFv抗體文庫之建構及生物淘選
基於先前報導建立抗體文庫：Andris-Widhopf,J.,Rader,C.,Steinberger,P.,Fuller,R.,Barbas,C.F.,第3版，2000,Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242,159-181。簡言之，在最終免疫後採集雞脾且立即置於Trizol試劑中均質化7天。使用SuperScript RT套組(Invitrogen,USA)將10 μg總RNA反轉錄為第一股cDNA。使用雞特異性因子擴增後，用短或長連接子使重鏈及輕鏈可變(VH及VL)區之PCR產物進行第二輪PCR以形成全長scFv片段，用Sfi I進一步消化且選殖入pComb3X載體中。重組DNA藉由電穿孔轉型於大腸桿菌XL-1 blue菌株中。藉由添加VCS-M13輔助噬菌體開始產生重組噬菌體，以4%聚乙二醇8000及3% NaCl(w/v)沈澱，且最終再次懸浮於含有1%牛血清白蛋白(BSA)之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且儲存於4℃下。接著，將1011 個溶菌斑形成單位(plaque-forming units，pfu)之來自scFv抗體文庫之重組噬菌體添加至預塗α-異烯醇酶蛋白(0.5微克/孔)的孔中，且在37℃下培育2小時。移除未結合噬菌體後，已結合噬菌體用0.1 M HCl/甘胺酸(pH 2.2)/0.1% BSA溶離，用2 M Tris鹼緩衝液中和且用於感染XL-1 blue菌株。經擴增噬菌體如上所述沈澱且回收以進行第二輪選擇。重複淘洗程序三次或四次。利用最終淘選過程隨機選擇一組純系且使其生長。在0.5 mM IPTG誘導6小時後，收集細菌細胞且藉由三輪冷凍及解凍及/或音波處理溶胞。使用西方墨點法及ELISA分析上清液之scFv抗體表現及其對α-異烯醇酶之結合反應性。在流動式細胞量測及免疫螢光分析中亦製備ScFv抗體，該等抗體表現於TOP 10F'大腸桿菌(Invitrogen，非抑制菌株)中且如製造商(Amersham Biosciences,UK)所述使用Ni2+ -帶電荷瓊脂糖純化。
在最後免疫之後8週將雞處死且自腫大之脾提取總RNA以建構抗體文庫。使用2個連續的PCR步驟擴增全長scFv基因片段。在第一個PCR中，使用含有短連接子(GGSSRSS)(SEQ ID NO: 45)及長連接子(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)(SEQ ID NO: 46)之引子將VH基因產物擴增為400 bp大小，分別如EnVH.S(圖3A，泳道2)及EnVH.L(圖3A，泳道3)所顯示。相應地，VL基因擴增為350 bp之色帶且負載於圖3A中之泳道4(EnVL)中。隨後，將經擴增VH與VL連接以形成約750 bp之全長scFv基因片段，如圖3B中之EnscFv.S(泳道2)及EnscFv.L(泳道3)所顯示。建構多個噬菌體呈現抗體文庫且用於篩檢特異性抗α-異烯醇酶scFv抗體。
實例4　表徵抗α-異烯醇酶scFv純系
為偵測scFv抗體表現，對細胞溶胞物進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將所有蛋白質轉移至硝化纖維素膜(Amersham Biosciences,UK)上，隨後用5%脫脂牛奶之TBST溶液阻斷1小時。添加1:3000稀釋之多株山羊抗雞IgY輕鏈抗體(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)且再培育1小時。用TBST洗滌膜三次，每次5分鐘。藉由添加1:3000稀釋之辣根過氧化酶(HRP)結合驢抗山羊Ig抗體(Sigma,St. Louis,MO,USA)來偵測結合抗體。三次洗滌後，用二胺基聯苯胺(DAB)受質使膜顯影，直至達到所需強度。為研究其結合反應性，將來自第4次免疫之雞的純化IgY或經表現scFv抗體與固定於硝化纖維素膜或ELISA板孔上之純化α-異烯醇酶一起培育，且隨後藉由添加如上所述之山羊抗雞IgY輕鏈抗體及HRP結合驢抗山羊Ig抗體來偵測。各樣品均於雙重複孔中進行ELISA測試。
如上所述進行四輪淘選。在各次淘選後，隨機選擇15種純系且對pCom3X選殖載體中之750 bp片段插入物及其scFv抗體蛋白表現進行分析。資料(未示)指示各輪淘選之純系67%(10/15)、87%(13/15)、100%(15/15)及100%(15/15)具有全長插入物。此外，最後一輪淘選之10種具有750 bp插入物之純系經誘導以表現其scFv抗體。如圖4中所示，使用山羊抗雞IgY輕鏈抗體及辣根過氧化酶(HRP)結合驢抗山羊Ig抗體，對純系EnL2、EnL4、EnL5、EnL6及EnL7明確偵測到scFv表現，而對純系EnL1、EnL3、EnL8、EnL9及EnL10極少或未偵測到表現。此等結果指示具有高度保守序列之免疫球蛋白基因的表現量可顯著不同，即使在相同實驗條件下。
實例5　基因定序及ELISA分析
藉由自動定序機(ABI PRISM 377；Perkin-Elmer,National Health Research Institute)使用ompseq(5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG-3')(SEQ ID NO: 47)及HRML-F(5'-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC-3')(SEQ ID NO: 48)引子對所選純系之重鏈及輕鏈可變區進行核苷酸序列測定。使用比對程式BLAST及載體NTI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析結果。
測定10種純系之重鏈及輕鏈基因之可變區的核苷酸序列且與雞免疫球蛋白之生殖系基因序列進行比對。結果揭示30%之定序純系(EnL5、EnL6及EnL7)共有相同之重鏈及輕鏈基因，導致其scFv抗體表現概況相似，如圖4之泳道5、6及7中所見。與生殖系基因序列相比之總體突變率在重鏈及輕鏈可變區中分別為18.6%至27.4%及13.5%至23.1%(圖5)。使用ELISA分析所表現之EnL1至EnL7 scFv抗體針對α-異烯醇酶的結合活性。發現與2種先前已表徵且已知特異性識別SARS-CoV棘蛋白(spike protein)之其他scFv抗體相比，彼等scFv抗體片段展現針對α-異烯醇酶的顯著結合活性。特定言之，與來自經人類α-異烯醇酶分子免疫之雞的純化多株IgY相比，EnL2、EnL4、EnL5及EnL6 scFv抗體展示更強的正反應性(圖6(A)及(B))。
實例6　流動式細胞量測術(Flowcytometry)分析
PE089細胞株最初獲自患有IV期肺腺癌之36歲患者的積液腫瘤細胞，其係由來自National Institute of Cancer Research,National Health Research Institutes,Tainan,Taiwan之Neng-Yao Shih博士友情提供。該等細胞已活體外於補充有5%胎牛血清、2 mmol/L麩醯胺酸及抗生素之RPMI 1640中培養至少40個繼代。採集總共2×106 個細胞且如先前所述用2%三聚甲醛固定。用經純化scFv EnL2及EnL5抗體偵測表現於PE089細胞中之α-異烯醇酶，以小鼠抗HA(1:200)及結合Cy-2之山羊抗小鼠抗體(1:200)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA,USA)顯現，且使用FACScan流動式細胞量測儀(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)進行分析。在不使用一次scFv EnL2及EnL5抗體的情況下如上所述進行陰性對照分析，同時使用兔多株抗人類異烯醇酶抗體(1:200)替代scFv EnL2及EnL5抗體來進行陽性對照分析。
為測試該等經選殖scFv抗體之結合反應性，將人類α-異烯醇酶基因轉染於PE089腫瘤細胞中以便其於膜表面上表現，隨後藉由流動式細胞量測術進行分析。SDS-PAGE上為單色帶之經純化EnL2及EnL5 scFv抗體(資料未示)能夠偵測表現於PE089細胞中之重組α-異烯醇酶蛋白，其結合信號與對α-異烯醇酶具特異性之市售兔多株抗體之結合信號類似，如圖7中所示。
實例7　免疫螢光及雷射掃描顯微法
將PE089細胞(2×105 個細胞/毫升)接種於蓋玻片上且藉由用等體積之冰冷8%三聚甲醛(新鮮製備)於冰上培育15分鐘進行固定。固定後，以70%、95%及99%甲醇依序處理使細胞脫水且用95%及70%甲醇再水合。隨後在室溫下用阻斷緩衝液(含有1% BSA之1×PBS)覆蓋載片1小時。以1×PBS洗滌後，將scFv抗體與細胞在室溫下再培育1小時。最後，依次藉由小鼠抗HA抗體及結合Cy-2之山羊抗小鼠抗體來偵測scFv抗體與α-異烯醇酶蛋白之結合。亦用所推薦之PI溶液(Invitrogen,USA)對核進行對比染色。利用共焦光譜顯微鏡成像系統(Confocal Spectral Microscope Imaging System)(TCS SP5,Leica)對載片進行觀察。
亦應用免疫細胞化學染色來評估經純化EnL2及EnL5 scFv抗體針對表現於PE089細胞中之α-異烯醇酶分子的結合能力。已證實α-異烯醇酶分子主要表現且移位於PE089細胞之核膜上(與N-Y Shih博士之個人通信)。因此，重組EnL2及EnL5 scFv抗體在細胞核膜周圍展現顯著結合信號，如圖8中所示。與之相比，兩種陰性對照物(包括結合Cy-2或4L8純系(表現對SARS-CoV棘蛋白具特異性之scFv抗體)之山羊抗小鼠抗體)未展示任何反應性。光學顯微鏡下之細胞形態及分布包括於最左圖中以進行比較。總而言之，結果進一步表明噬菌體呈現技術可為選殖及產生抗特異性抗原之scFv抗體的更佳替代方法。
圖1為重組α-異烯醇酶及多株抗α-異烯醇酶IgY抗體之表徵。各圖中之樣品為蛋白質標記(泳道M)、純化GST(泳道1)、純化α-異烯醇酶(泳道2)及純化GST-α-異烯醇酶融合蛋白(泳道3)。將藉由庫馬斯藍染色而顯現之純化蛋白(圖A)點漬於硝化纖維素紙上，且用抗GST抗體(圖B)或第4次免疫雞之血清(圖C)探測。重組α-異烯醇酶蛋白之分子量為約48 kD；
圖2為藉由ELISA分析的第4次免疫後之雞中的體液IgY反應。將純化α-異烯醇酶蛋白及牛血清抗原(BSA)塗於板孔上。檢驗一系列經稀釋IgY抗體對α-異烯醇酶或BSA之特異性結合活性。實心及空心條柱分別表示第4次免疫之雞或免疫前之雞之IgY與α-異烯醇酶的結合。另外，由深灰色及淺灰色條柱表示之第4次免疫之雞或免疫前之雞之IgY與BSA的結合係作為陰性對照並行展示；
圖3為雞免疫球蛋白基因中可變區之PCR擴增。輕鏈(EnVL)及具有短連接子之重鏈(EnVH.S)或具有長連接子之重鏈(EnVH.L)的可變區經成功擴增(圖A)。第二輪PCR產生具有短連接子之全長scFv基因片段(EnscFv.S)或具有長連接子之全長scFv基因片段(EnscFv.L)(圖B)；
圖4為藉由西方墨點法分析之scFv抗體表現。將來自30種純系之相同量之總細胞溶胞物負載於SDS-PAGE上且轉移至硝化纖維素紙上。依次以1:3000稀釋之山羊抗雞輕鏈抗體、HRP結合驢抗山羊IgG偵測scFv抗體的存在。scFv片段之預測分子量約為35 kDa。墨點為10種所選純系中scFv表現之代表性結果；
圖5為藉由ELISA分析的scFv抗體對純化α-異烯醇酶之結合活性。檢驗第4輪淘選隨機所選之含有scFv抗體的細胞溶胞物與塗於板孔上之純化α-異烯醇酶的結合。依次使用1:3000稀釋之山羊抗雞輕鏈抗體、HRP結合驢抗山羊IgG偵測偵測結合活性且在450 nm下量測。使用兩種抗SARS-CoV scFv抗體(SCoS-S8及SCoS-L22)作為陰性對照物。在不添加一次重組scFv抗體之情況下如所述進行另一對照實驗。使用經純化α-異烯醇酶免疫之雞的多株IgY抗體作為陽性對照物。ELISA資料以雙重複實驗之平均值表示；
圖6為scFv抗體之VL (圖6(A))及VH (圖6(B))序列之序列分析。測定10種純系之VH 及VL 之核苷酸序列且轉譯成胺基酸序列以與雞生殖系基因之胺基酸序列比對。FR：構架區；CDR：互補決定區。序列缺口經引入以最大化比對且由空白區表示。圓點表示共同序列。構架區(FR)及互補決定區(CDR)邊界指示於生殖系序列上方；
圖7為藉由流動式細胞量測術分析之scFv抗體對純化α-異烯醇酶的結合活性。使用純化EnL2及EnL5 scFv抗體、小鼠抗HA(1:200)及Cy-2結合山羊抗小鼠抗體(1:200)偵測PE089細胞表面結合之α-異烯醇酶。灰色細線表示陰性對照，其為經單獨DMSO處理且經螢光標記之抗表面標記Abs染色的細胞；灰色實線表示經螢光標記之Ig同型對照物染色的細胞；且黑色實線表示經抗表面α-異烯醇酶之scFv抗體EnL2及EnL5螢光標記Abs染色的細胞。展示三個獨立實驗中之一代表性實驗之結果；及
圖8為PE089細胞中α-異烯醇酶蛋白之免疫螢光染色。如「Materials and Methods」中所述將細胞固定於玻璃板上。使用純化EnL2及EnL5 scFv抗體、接著使用小鼠抗HA及Cy-2結合山羊抗小鼠抗體偵測α-異烯醇酶表現。細胞核(紅色)藉由PI顯現。EnL2與EnL5 scFv抗體均使PE089細胞核膜清晰染色(綠色)。抗SARS-CoV scFv抗體4L8未展示與核膜之任何反應性。
(無元件符號說明)

Claims (16)

  1. 一種純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含結合α-異烯醇酶I之重鏈免疫球蛋白可變域及輕鏈免疫球蛋白可變域，其中該輕鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SGGSGSYG(SEQ ID NO：1)、SGGSSSYGYG(SEQ ID NO：2)、SGSSGSYG(SEQ ID NO：3)、SGGSSSYGYS(SEQ ID NO：4)或SGSSGYGYG(SEQ ID NO：5)；(ii)CDR2中之ANTNRPS(SEQ ID NO：6)、NDNQRPS(SEQ ID NO：7)、RDDKRPS(SEQ ID NO：8)、SNNQRPS(SEQ ID NO：9)或SNDKRPS(SEQ ID NO：10)；及(iii)CDR3中之GGYDSSAGI(SEQ ID NO：11)、GSGDSSTGM(SEQ ID NO：12)、GSGESSTNNGI(SEQ ID NO：13)、GSMDSSNSGV(SEQ ID NO：14)或GGYDSSASYVGI(SEQ ID NO：15)；且其中該重鏈免疫球蛋白可變域包含以下胺基酸序列：(i)CDR1中之SFNMF(SEQ ID NO：16)、SHDMG(SEQ ID NO：17)、DYCVQ(SEQ ID NO：18)、SFYMF(SEQ ID NO：19)或SYAMH(SEQ ID NO：20)；(ii)CDR2中之GINNAGSTTNHGAAVKG(SEQ ID NO：21)、GIENAAGIGTFYGAAVKG(SEQ ID NO：22)、AISNTGRYTGYGSAVKG(SEQ ID NO：23)、GISGDGRYTGYGAAVDG(SEQ ID NO：24)或GISRDGGSSTRYYGAAVKG(SEQ ID NO：25)；及(iii)CDR3中之SPGGIDGIDG(SEQ ID NO：26)、GADTGGWPAANIDA(SEQ ID NO：27)、DGCAGCCGSYYIDG (SEQ ID NO：28)、ESGSGCCNGDNIDA(SEQ ID NO：29)或DSDNGGYYCDDIDA(SEQ ID NO：30)；其限制條件為該抗體不為輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3分別為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：12及重鏈可鏈區之CDR1、CDR2及CDR3分別為SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：22與SEQ ID NO：27的抗體。
  2. 如請求項1之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含選自由雞免疫球蛋白之生殖系基因序列(SEQ ID NO：31)編碼之VH及VL FR1、FR2、FR3及FR4構架區的構架區或胺基酸序列與由雞免疫球蛋白之該生殖系基因序列(SEQ ID NO：31)編碼之該等VH及VL FR1、FR2及FR3構架區至少85%相同的構架區。
  3. 如請求項2之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含選自胺基酸序列與由雞免疫球蛋白之該生殖系基因序列(SEQ ID NO：31)編碼之該等VH及VL FR1、FR2及FR3構架區至少87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%或99%相同的構架區。
  4. 如請求項1之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的VL互補決定區：i)CDR1中之SEQ ID NO：1、CDR2中之SEQ ID NO：6及CDR3中之SEQ ID NO：11；ii)CDR1中之SEQ ID NO：2、CDR2中之SEQ ID NO：7及CDR3中之SEQ ID NO：12；iii)CDR1中之SEQ ID NO：3、CDR2中之SEQ ID NO：8及CDR3中之SEQ ID NO：13；iv)CDR1中之SEQ ID NO： 4、CDR2中之SEQ ID NO：9及CDR3中之SEQ ID NO：14及v)CDR1中之SEQ ID NO：5、CDR2中之SEQ ID NO：10及CDR3中之SEQ ID NO：15。
  5. 如請求項1之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有選自由以下胺基酸序列組成之群之胺基酸序列的VL互補決定區：ii)CDR1中之SEQ ID NO：2、CDR2中之SEQ ID NO：7及CDR3中之SEQ ID NO：12；及v)CDR1中之SEQ ID NO：5、CDR2中之SEQ ID NO：10及CDR3中之SEQ ID NO：15。
  6. 如請求項1之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有選自由SEQ ID NO：31-35組成之群之胺基酸序列的VL互補決定區及具有選自由SEQ ID NO：36-40組成之群之胺基酸序列的VH互補決定區。
  7. 如請求項6之純化單株抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL互補決定區及具有SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VH互補決定區。
  8. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  9. 一種如請求項1之單株抗體於治療α-異烯醇酶I相關病症之藥劑之用途。
  10. 如請求項9之用途，其中該病症係選自由以下組成之群：癌症、自體免疫病症、局部缺血及細菌感染。
  11. 如請求項10之用途，其中該癌症係選自由以下組成之 群：肺癌、乳癌、肛門癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、腦腫瘤、腎癌、白血病、肝癌、胰癌、前列腺癌、直腸癌。
  12. 如請求項11之用途，其中該癌症為肺癌。
  13. 如請求項12之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌。
  14. 一種偵測樣品中α-異烯醇酶I之存在的活體外診斷方法，其包含：(i)使樣品與請求項6之抗α-異烯醇酶I抗體接觸；及(ii)偵測該α-異烯醇酶I抗體與該樣品之間的複合物的形成。
  15. 一種用於偵測樣品中α-異烯醇酶I之存在的套組，其包含請求項6之抗α-異烯醇酶I抗體或其片段，及視情況存在之資訊材料。
  16. 如請求項15之套組，其中該抗α-異烯醇酶I抗體為如請求項11之單株抗體。
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