TWI461193B - 水飛薊或水飛薊賓用於治療神經受損之用途 - Google Patents

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Description

水飛薊或水飛薊賓用於治療神經受損之用途 相關申請案
本申請案主張美國臨時專利申請案序號61/228,434號(2009年7月24日申請)之優先權，該申請案之揭示內容全文以參考資料方式納入本說明書中。
本發明是關於水飛薊或水飛薊賓用以治療神經損傷的用途。
水飛薊是一種由乳薊(milk thistle,Silybum marianum)分離的黃酮木脂素混合物，常用於治療肝臟病症。其亦具有抗發炎、細胞保護、及抗致癌活性。水飛薊賓是水飛薊中的主要黃酮木脂素，且其已被發現具有上述的治療效應。
脊髓損傷(SCI)是脊髓的損害，其會造成感覺及運動控制的喪失。其可能系由脊髓的疾病(如，弗利德來運動失調(Friedreich's ataxia))或物理創傷(如，挫傷)而造成。
本發明是基於非可預期地發現水飛薊或水飛薊賓具有神經保護活性並可改善脊髓損傷大鼠的功能恢復。
因此，本發明是關於一種治療神經損傷(如，SCI)的方法，對需要該治療的個體投與有效量的水飛薊或水飛薊賓。特定而言，可將水飛薊或水飛薊賓傳輸至損傷的神經區域。在一實施例中，可經由注射而進行鞘內投與。用於本發明方法的水飛薊賓可為分離形式，亦即，由合成方法製備或由天然來源(如，水飛薊)富集。分離的水飛薊賓化合物是指含有以幹重計至少40%該化合物的製備物。分離化合物的純度可由，如，管柱層析、質譜、高效液相層析(HPLC)、NMR、或任何其它適當方法進行測量。
名辭「治療」在本文中是指對具有神經損傷、該損傷的症狀、或朝向該損傷的易感性的個體，以治癒、療癒、減輕、緩解、改變、補救、改善、改良、或影響該損傷、該損傷的症狀、或朝向該損傷的易感性的目的，施用或投與包括一或多種活性劑的組合物。「有效量」在本文中系指欲對該個體產生治療效應所需的各種活性劑的量，其可能為單獨使用或是結合一或多種其它活性劑。如熟習技藝者可知，根據投與的途徑、賦形劑的選擇、以及其它藥劑的共同使用，有效量可各有不同。
本發明亦是關於一種以水飛薊或水飛薊賓增進由SCI(如，挫傷性SCI)復原的方法。
本發明亦包括水飛薊或水飛薊賓在製備用於治療神經損傷的藥劑中的應用。
本發明又包括水飛薊或水飛薊賓在製備用於增進由脊髓損傷復原的藥劑中的應用。
本發明一或多個具體實例的細節示於下文的敘述。本發明的其它特徵或優點將可由下文的圖式及數個具體實例的詳細敘述以及附呈的申請專利範圍而得悉。
本發明是關於使用水飛薊或水飛薊賓以治療神經損傷或協助由此種損傷復原的用途。
在本文中，辭句「由SCI復原」是指罹患SCI病患的病理狀況的改善及/或損傷脊髓的生理功能的恢復(至少部分)。舉例而言，在用於本發明實施例的動物模型中，大鼠在脊髓T9-T10區域受到挫傷性的損傷。在此種情形下，由後肢運動缺陷的改善可證實SCI的復原。
水飛薊是取自乳薊(Silybum marianum Gaertn，亦稱為Carduus marianus L)的種子及果實的標準萃取物，其含有黃酮木脂素水飛薊賓(silybin，與silibinin同義)為其主要組成份。水飛薊可由任何習知方法製備，參見例如以下文獻所揭示的技術：Barreto等人，由水飛薊萃取營養藥物-熱水萃取法，Appl. Biochem Biotechnol. 108:881-9,2003；Wallace等人，由水飛薊萃取營養藥物：第二部份：有機溶劑萃取法，Appl. Biotechnol. 105-108:891-903,2003)；以及Wallace等人，由水飛薊進行黃酮木脂素的批次溶劑萃取，Phyotchemical Analysis. 16:7-16,2005。或者，水飛薊可由供應商處購得，諸如，Sigma-Aldrich(St. Louis,MO)。
水飛薊賓(silybin,silibinin)或2,3-二氫-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-(羥甲基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代苯並吡喃-2-基)苯並二惡烷，具有兩種非鏡像異構形式。該兩種異構物皆可由天然來源分離或是可由合成方法製備。同樣地，水飛薊賓亦可由Sigma-Aldrich(St. Louis,MO)及其它供應商處購得。
特定而言，為達成較佳效應，可將水飛薊或水飛薊賓直接投與至損傷的神經區域。在一具體實例中，水飛薊或水飛薊賓系由鞘內投與，亦即，注射進入浸泡著脊髓及腦的腦脊髓液中。
為協助傳輸，可將水飛薊或水飛薊賓與適當的醫藥可接受性載體共同調配為醫藥組合物。在本文中，名辭「醫藥可接受性載體」是指與該組合物的活性成分相容，且較佳為可安定該活性成分，同時不會對該待治療個體有害的載體。例示性的載體包括，但不限於，鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
待投與至SCI區域的水飛薊或水飛薊賓的量可因諸多因素而有所不同，諸如，該個體的狀況，以及該SCI的類型及嚴重性。在施用至罹患SCI的病患時，水飛薊或水飛薊賓的量應可達成所欲效應，亦即，修復損傷區域及/或至少部分增進該損傷脊髓的功能恢復。適當的量可由熟習技藝者在不須過度實驗的情形下基於本揭示內容及常規知識與技術判定。
本發明現將由下列的實例而進一步說明。此等實例係為說明的目的而提供，且不以任何方式被視為限制本發明的範圍。
實施例
化學品
水飛薊及水飛薊賓係購自Sigma-Aldrich(St. Louis,MO，產品編號分別為S0292及S0417)。將水飛薊或水飛薊賓溶於二甲亞碸(DMSO)中，並以培養基新鮮稀釋，以進行所有試管內的培養物實驗。
液相層析梯度溶劑及試劑係取自E. Merck(Darmstadt,Germany)。
除非另有明示，其它試劑係購自Sigma-Aldrich。
混合神經細胞/膠質細胞培養物
如Hung等人(Mol. Brain Res . 75(2000):330-336)及Tsai等人(Ann. N.Y. Acad. Sci . 1042(2005):338-348)所述的方法，由懷孕第15天的Sprague-Dawley大鼠胚胎的皮質或脊柱區域，製備混合神經細胞-膠質細胞培養物。簡言之，以木瓜蛋白酶/蛋白酶/去氧核糖核酸酶I的混合物(0.1%: 0.1%: 0.03%)分離細胞，再將其以1-2x105 個細胞/cm2 的密度塗盤至經聚離胺酸塗覆的培養盤上。將細胞維持在添加10%胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)中。
混合膠質細胞培養物
如Tsai及Lee(Free Radical Biology ＆ Medicine 24(1998):705-713)所述的方法，由新生Sprague-Dawley大鼠的皮質或脊髓，製備混合膠質細胞培養物。簡言之，使經研磨的皮質或脊髓通過尼龍布(80及10 μm)，塗盤在75 cm2 培養瓶中，並將其維持在含有5.5 mM葡萄糖及添加10%胎牛血清(FCS)的DMEM中。使細胞在5% CO2 、95%空氣的水飽和大氣中於37℃進行培育。為使培養物不含污染細胞，在第10天，以180 rpm隔夜震盪除去懸浮細胞以純化培養物。將燒瓶中的培養物再次塗盤于多孔培養盤上。培養物顯示針對膠質纖維酸性蛋白(GFAP)有90%以上的陽性染色。
小膠質細胞培養物
由大鼠混合膠質細胞培養物純化出小膠質細胞培養物(Tzeng and Huang,J. Cell Biochem. 90(2)(2003):227-33)。簡言之，在培養10至14天后，借著震盪燒瓶而分離漂浮細胞及輕微黏附的細胞。將所得的細胞懸浮液轉移至多孔培養盤(Corning,USA)中，並使其在37℃下黏附。在30分鐘後除去未黏附的細胞，分離出強力黏連形式的微膠質細胞。藉由離子鈣結合性適應分子-1(IBAl,Wako Chemicals,Japan)或ED-1(Serotec,UK)的免疫染色，測定出微膠質細胞的純度為大於96%。
動物
Sprague-Dawley(SD)大鼠係取自國立陽明大學(NYU)或國家科學委員會的動物中心(臺灣)。使用介於240-280 g的間的成年雌性SD大鼠作為誘發性挫傷性SCI模型。動物的處理及實驗流程皆經臺北榮民總醫院的動物實驗委員會仔細審核通過。
脊髓挫傷
使用NYU落重裝置(weight-drop device)誘發挫傷性SCI。麻醉成年雌性SD大鼠。在第九胸(T)椎位置進行背側椎板切除術。由50 mm高度落下10 g短柱而損傷T9-T10脊髓的背側表面。硬膜保持機械完整，而落重損傷造成了蛋形壞死區域的特徵，在首尾方向延伸至數個脊髓節段(Grossman et al.,Exp Neurol. 168(2)(2001):283-9;Widenfalk et al.,J Neurosci. 21(10)(2001):3457-75)。
實施例1：水飛薊不會影響脊髓神經細胞-膠質細胞培養物中的細胞類型
在種下細胞後第二天，使混合神經細胞/膠質細胞培養物與水飛薊(40 μM)共置培育3天。接著處理細胞以進行神經細胞、星形膠質細胞、或小膠質細胞標記的免疫組織化學分析。
將原代神經細胞-膠質細胞培養物塗盤至經聚離胺酸塗覆的培養盤上，並以4%多聚甲醛溶液固定20分鐘。以0.2% Triton X-100透化細胞。接著以初級抗體染色細胞，包括抗-βIII微管蛋白(Covance MMS-435P)、抗-GFAP(Chemicon AB 5804)、及抗-ED1(Serotec MCA 341)抗體，再以其個別的螢光標記性次級抗體(Jackson ImmunoResearch Inc.)染色。βIII微管蛋白是一種神經元專一性標記，GFAP是星形膠質細胞標記、而ED1是小膠質細胞標記。以配備螢光鏡片的螢光顯微鏡取得脊髓神經元或非神經元細胞的影像。以CCD相機拍攝神經元或免疫反應性細胞的影像。
根據該等結果(資料未顯示)，水飛薊並不會影響脊髓培養物中的神經元存活以及非神經元細胞的數目。
實施例2：水飛薊可保護脊髓神經細胞-膠質細胞培養物對抗LPS及紅藻胺酸誘發的毒性
在種下細胞後第二天，在有或無內毒素脂多醣(LPS,1.2 μg/ml)或興奮性神經毒素紅藻胺酸(KA,150 μM)的存在下，以水飛薊(40 μM)處理混合神經細胞-膠質細胞培養物2天。收集培養基以進行釋出的硝酸鹽/亞硝酸鹽的分析，並收集細胞以進行免疫組織化學及西方點漬分析。
在多聚甲醛(paraformaldehyde)固定及Triton X-100透化後，使細胞與初級抗體抗-IL-1β(Chemicon)隔夜共置培育(4℃)，並接著在室溫下與驢抗山羊488(Alexa)或驢抗小鼠cy3(Jackson Lab)共置培育90分鐘。根據該等結果(資料未顯示)，LPS或KA的處理在該等脊髓培養物中誘發IL-1β表現。
亦處理細胞，以進行可誘發性一氧化氮合成酶(iNOS)及環氧合酶-2(COX-2)表現的西方點漬分析。簡言之，將等量的細胞裂解物蛋白加樣至SDS-PAGE凝膠上並進行分離。根據標準流程進行電泳。在電泳後，將凝膠轉移至PVDF膜上(Millipore,USA)，並在4℃下與對抗iNOS(BD transduction,USA)或COX-2(Cayman)的抗體隔夜共置培育。將點漬膜與驢抗兔IgG HRP(辣根過氧化物酶)-綴合性次級抗體(Santa Cruz)或山羊抗小鼠IgG HRP-綴合性次級抗體(Santa Cruz)共置培育1小時，再使用超訊息化學冷光基質(Pierce,USA)進行HRP偵測。
NO的產生是以Griess反應試劑進行比色反應偵測培養基中的亞硝酸鹽積累而予以分析。簡言之，在LPS處理2天后，收集培養物上清液(150 μl)，並與50 μl的含有1%磺胺/0.1%萘基乙二胺二鹽酸鹽/2%磷酸的Griess反應試劑混合，再在室溫下共置培育10分鐘。在540 nm測量吸收值。使用亞硝酸鈉(NaNO2 )作為標準物以計算二氧化氮(NO2)。
如圖1(A)至(C)所示，LPS誘發COX-2及iNOS表現、iNOS-陽性細胞數目、以及一氧化氮(NO)釋出的增加，以硝酸鹽/亞硝酸鹽含量表示。水飛薊可有效降低LPS或KA的刺激。水飛薊賓可顯著降低LPS誘發的NO釋出。
實施例3：水飛薊及水飛薊賓可抑制混合膠質細胞培養物的細胞增殖
5-溴-2-去氧尿苷(BrdU)是一種在有絲分裂S期納入遺傳物質中的胸苷類似物，以其處理細胞，進行混合膠質細胞培養物增殖活性的研究。
將水飛薊或水飛薊賓(20-80 μM)加入未匯合的膠狀細胞中2天。在細胞固定前2小時，將5-溴-2-去氧尿苷(BrdU,10 μM，其可由增殖細胞攝入)加入培養的細胞中。以4%多聚甲醛溶液固定(30分鐘，室溫)後，以2 M HCl(10分鐘，37℃)處理細胞以使其DNA變性。接著以PBS重複清洗細胞，直到pH值到達6.5或以上。接著以小鼠抗-BrdU(1:100,Chemicon,Temecula,CA)及兔抗-GFAP(1:300,Chemicon)抗體進一步進行重複處理(4℃，隔夜)，再與FITC-及羅丹明(rhodamine)-綴合性次級抗體(室溫，90分鐘)共置培育。在各孔隨機選取7個區域，計數含有BrdU的細胞。計算出BrdU/總細胞的比例。
如圖2(A)所示，水飛薊及水飛薊賓兩者皆可有效降低膠質細胞的增殖(由BrdU(+)/GFAP(+)的比例表示)。
實施例4：水飛薊及水飛薊賓可減少脊髓星狀膠質細胞、小膠質細胞、及神經細胞-膠質細胞培養物以及皮質神經細胞-膠質細胞培養物中的毒素誘發性自由基形成
抗氧化活性是神經保護劑的一種重要作用機制，因為自由基的傷害在各種不同物質的神經毒性效應以及諸如發炎、缺血及再灌注、動脈粥狀硬化、及老化過程的致病機制中皆扮演重要角色。自由基的含量(氧化壓力)可借由H2 O2 或第三丁基過氧化氫(t-BOOH)(參見圖3(C)、圖4(A-B)、及圖5(A-C)中的「對照組」)的挑戰在細胞中誘發。
在本實施例中，以各種不同的自由基產生物處理混合膠質細胞、小膠質細胞、或是混合神經細胞-膠質細胞培養物而誘發氧化壓力，並以經改良而可使用螢光微試驗盤視讀器的DCF分析檢驗水飛薊及水飛薊賓的抗氧化活性。細胞內的活性氧分子(reactive oxygen species)(ROS)的形成是以非熒旋旋光性的2',7'-二氯二氫螢光素二乙酸酯(DCF-DA)偵測，其為用於偵測胞內氧化物生成的靈敏且廣泛使用的探針。DCF-DA可自由進入細胞，並由胞內酯酶修飾成為親水性(並因此「受困」)、即非熒旋旋光性的報導分子DCF。DCF的氧化會產生高度熒旋旋光性的DCF，其可由流式細胞計數或其它螢光偵測方法偵測。
為進行DCF分析，首先在培養物中加入無血清培養基中(DMEM+N2)的40 μM DCF-DA(Molecular Probe D-399;Invitrogen,Carlsbad,CA)處理1小時。接著以含有毒素(包括H2 O2 (1 mM用於神經元；3 mM用於非神經元細胞)以及t-BOOH(0.75 mM))的生長培養基置換該培養基處理2小時。在毒素處理起始後10分鐘內，加入不同劑量(介於自20至160 μM)的水飛薊或水飛薊賓。以螢光試驗盤視讀器，在485 nm/538 nm的激發'發射波長，測量所得的螢光DCF含量。
如圖2(B)、圖3(A)及(B)、及圖4(A)至(C)所示，水飛薊及水飛薊賓兩者皆為強力的抗氧化劑，因其在所有試驗的培養物中，包括脊髓混合膠狀細胞培養物(圖2(B))、脊髓混合神經細胞-膠狀細胞培養物(圖3(A)；圖4(A))、皮質混合神經細胞-膠狀細胞培養物(圖3(B)；圖4(B))、以及脊髓小膠質細胞培養物(圖4(C))，皆可顯著降低H2O2-或t-BOOH-誘發性自由基形成。重要的是，介於自20 μM至160 μM)的水飛薊可在脊髓或皮質混合神經細胞-膠狀細胞培養物中有效減少H2 O2 -誘發性自由基(圖3(A)及(B))。
使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)的還原程度，測量細胞存活或是測定活細胞的代謝活性。MTT可由存活細胞的粒線體酵素還原成為藍色的甲暨(formazan)產物，其與代謝功能的完整性成正比(Edmondson et al.,J. Tiss. Cult. Meth. 11(1998):15-17)。為進行MTT分析，如上所述以毒素以及水飛薊或水飛薊賓處理該等培養物2小時。在處理後，由孔中除去培養基，並以添加葡萄糖(5 mM)的PBS中的0.5 mg/mL MTT置換。在37℃下共置培育2 hrs後，除去此溶液，並以酸化的異丙醇溶解該等藍色的甲暨晶體。以分光光度計在570 nm測量該所得溶液的光學密度。
如圖5所示，水飛薊及水飛薊賓可強效增進MTT的還原。MTT還原分析取決於代謝活性細胞將MTT四唑鎓鹽還原成為甲暨的能力。還原的吡啶核苷酸輔因數NADH與大部分的MTT還原作用有關。此種結果指出水飛薊及水飛薊賓的強抗氧化特性。
實施例5：水飛薊的鞘內投與對於挫傷性SCI的效應
由於高濃度(純)DMSO的直接注入可能會造成細胞毒性，因此使用替代性的較安全試劑聚乙二醇(PEG;MW 2000Da)溶解水飛薊以進行鞘內注射(intrathecal injection)。PEG是一種親水性的聚合物，已被證實為安全且對急性脊髓損傷具有神經保護作用(Shi and Borgens,J. Neurophysiol. 81(1999):2406-2414;Shi et al.,J. Neurotrauma 16(1999):727-738;Shi and Borgens,J. Neurocytol. 29(2000):633-644)。以鹽水製備PEG溶液(50%)。接著將水飛薊以5至20 mg/ml的濃度溶於PEG溶液中。在誘發挫傷性損傷的後30分鐘內，將6 μl含或不含水飛薊的PEG由鞘內投與至損傷脊髓的中心。縫合皮膚，並如上所述在脊髓損傷後的第二天及每週監測後肢功能(BBB量表)。如圖6所示，水飛薊的鞘內注射(20μg/μl)可顯著有助於SCI大鼠的功能恢復，而PEG(水飛薊的載劑)則不具神經保護性。在損傷5周後，麻醉大鼠，並以4%多聚甲醛進行血管灌注。接著矢狀切片脊髓(10 μm厚)，並加以處理以使用抗神經絲蛋白(針對神經元)或抗-ED1(針對活化的小膠質細胞)進行免疫組織化學染色。根據該等結果(資料未示)，在經水飛薊處理的脊髓中，其脊髓軸突(神經絲蛋白陽性)獲得較佳的保存，並可見較低程度的小膠質細胞活化(ED-1)。
創傷性的脊髓損傷具有破壞性，並會起動一系列的細胞及分子事件，包括初級及次級的損傷級聯。脊髓的損傷會引發發炎反應，該發炎反應一開始便會造成進一步的組織損傷。降低對於脊髓損傷的早期發炎反應，因此可能限制組織損傷的範圍，並因此限制後續的失能。在損傷3天后犧牲有或無鞘內投與水飛薊的SCI大鼠。快速取出脊髓的損傷中心，並以冰冷的萃取緩衝液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS、40 mM Tris緩衝液(pH7.5)及蛋白酶抑制劑(Roche 11836145001))予以均質化。使用Bradford法(Bio-Rad Protein Assay,Bio-Rad Laboratories)測量蛋白濃度。將等量的蛋白加樣至8% SDS-PAGE凝膠上並進行分離。在轉移後，以抗COX-2、抗ED-1、及抗肌動蛋白抗體探測所得的PVDF膜。與圖6的結果相符，鞘內投與水飛薊可在損傷3天后的損傷脊髓中，降低COX-2(一種促發炎酶)的表現，並抑制ED-1(+)小膠質細胞浸潤，如圖7所示。
鞘內水飛薊的分佈可能與全身性sc投與者不同。對SCI大鼠鞘內投與水飛薊(120 μg/6 μl/大鼠)。在損傷1、2、7、及14天后，取出脊髓中心，並以5倍體積的50 mM Tris-HCl(pH 7.4)予以均質化。以等體積的溶劑(丁醇：甲醇,95:5;v/v)進一步萃取組織均質物。離心後，收集所得的有機層，濃縮，再直接注射至具有UV偵測的HPLC裝置中。圖8顯示脊髓中所達成的水飛薊素接觸時程(藥物動力學)。水飛薊素的分佈僅限於損傷的脊髓中心。在注射2周後，仍保留約8 μg/g組織的水飛薊素。因此，水飛薊素藥物動力學的差異可能可說明鞘內水飛薊素注射的有效結果。
熟習技藝者將可明瞭，可對上述的具體實例進行變化而不偏離其廣泛的發明概念。因此，鹹可明瞭，本發明並不限於所揭示的特定具體實例，其係欲涵括由附呈的申請專利範圍所定義的本發明精神及範圍中的修飾。
上述發明內容及以下具體實施方式與所附圖式一併閱讀將更增瞭解。為達闡明本發明的目的，圖式中所示具體實例為目前較佳者。然而，應瞭解本發明並不限於所示的特定排列及結構。
在圖式中：
圖1顯示水飛薊及水飛薊賓在大鼠脊髓神經細胞-膠質細胞培養物中對於LPS及紅藻胺酸誘發性毒性的效應，其中(A)顯示各個處理組中每1.5 mm2 的iNOS-陽性細胞數目(Con=對照組；a: P<0.05(LPS對對照組)；b: P<0.05(LPS+SM對LPS))；(B)顯示各處理組中iNOS及環氧合酶-2(COX-2)的西方點漬分析結果(Con=對照組)；及(C)顯示各處理組中釋入培養基中的亞硝酸鹽量(a: P<0.05(處理組對對照組);b: P<0.05(SM/LPS或SB/LPS對LPS);SM=水飛薊；SB=水飛薊賓)。
圖2顯示水飛薊及水飛薊賓在混合膠質細胞培養物中對於細胞增殖以及對於H2O2-誘發性自由基形成的效應，其中(A)顯示各個處理組中每1.5 mm2 的BrdU-陽性細胞數目；及(B)顯示水飛薊(80 μM)及水飛薊賓(80 μM)對於H2O2-誘發性自由基形成(ROS)的有效抑制。
圖3顯示水飛薊在由(A)脊髓或(B)皮質所製備的神經細胞-膠質細胞培養物中對於H2 O2 -誘發性自由基形成的劑量反應性保護效應。
圖4(A)顯示水飛薊(80 μM)及水飛薊賓(80 μM)在脊髓神經細胞-膠質細胞培養物中對於H2 O2 -或t-BOOH-誘發性自由基形成的效應。圖4(B)顯示水飛薊(80 μM)及水飛薊賓(80 μM)在皮質神經細胞-膠質細胞培養物中對於H2 O2 -或t-BOOH-誘發性自由基形成的效應。圖4(C)顯示水飛薊(80 μM)在小膠質細胞培養物中對於H2O2-或t-BOOH-誘發性自由基形成的效應。(*相較於對應DMSO組的P<0.05)
圖5顯示水飛薊及水飛薊賓在MTT分析中的結果。
圖6顯示鞘內投與水飛薊在挫傷性SCI大鼠中的效應，以後肢功能的恢復說明(SM20=50% PEG中的20 μg/μl水飛薊，6 μl/大鼠；SM5=50% PEG中的5 μg/μl水飛薊，6 μl/大鼠；*由單因數ANOVA及Student-Newman-Keuls法的P<0.05)。
圖7顯示大鼠脊髓中心的西方點漬分析結果，其指出水飛薊(SM)可減少損傷脊髓中心的損傷誘發性ED1及環氧合酶-2(COX-2)表現。
圖8顯示在鞘內投與水飛薊(120 μg/大鼠)後不同時程時於損傷脊髓中的水飛薊賓保留情形。

Claims (10)

  1. 一種以水飛薊(silymarin)為唯一活性成分在製備用於治療脊髓損傷(SCI)的藥物之用途，其中該藥物係經鞘內投與。
  2. 根據請求項1之用途，其中該藥物係投與至脊髓的損傷區域。
  3. 根據請求項1之用途，其中該SCI係挫傷性SCI。
  4. 根據請求項3之用途，其中該藥物係投與至脊髓的損傷區域。
  5. 根據請求項1至4中任一項之用途，其中水飛薊主要成分為水飛薊賓(silybin)。
  6. 一種以水飛薊(silymarin)為唯一活性成分在製備用於增進由脊髓損傷(SCI)復原的藥物之用途，其中該藥物係供鞘內注射。
  7. 根據請求項6之用途，其中該藥物係投與至脊髓的損傷區域。
  8. 根據請求項6之用途，其中該SCI係挫傷性SCI。
  9. 根據請求項8之用途，其中該藥物係投與至脊髓的損傷區域。
  10. 根據請求項6至9中任一項之用途，其中水飛薊主要成分為水飛薊賓(silybin)。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101301253B1 (ko) * 2011-12-09 2013-08-28 한국원자력연구원 방사선을 이용한 크로메논 유도체의 제조방법
US8877259B2 (en) 2012-02-09 2014-11-04 Mary Kay Inc. Cosmetic formulation
CN102924438B (zh) * 2012-10-30 2015-04-22 晨光生物科技集团股份有限公司 从水飞蓟籽中提取水飞蓟素和水飞蓟油的方法
NZ631536A (en) * 2012-12-17 2016-12-23 Newsouth Innovations Pty Ltd Treatment of diseases involving mucin
KR101726513B1 (ko) * 2015-09-21 2017-04-13 경북대학교 산학협력단 실리비닌을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008095093A2 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Robert Keller Method of increasing cellular function and health of glutathione deficient animals

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005229008B2 (en) * 2004-03-23 2011-03-24 Lifeline Nutraceuticals Corporation Compositions and method for alleviating inflammation and oxidative stress in a mammal
CN101309682A (zh) * 2005-10-21 2008-11-19 脑细胞股份有限公司 通过pde抑制调节神经发生
US20080167363A1 (en) * 2006-12-28 2008-07-10 Braincells, Inc Modulation of Neurogenesis By Melatoninergic Agents
US20080188457A1 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Braincells, Inc. Modulation of Neurogenesis with Biguanides and GSK3-beta Agents
JP5529874B2 (ja) * 2008-09-25 2014-06-25 インヴィーヴォ セラプーティクス コーポレーション 脊髄の損傷、炎症および免疫疾患に用いられる局所的に放出を制御しうる治療薬

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008095093A2 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Robert Keller Method of increasing cellular function and health of glutathione deficient animals

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