TWI449911B

TWI449911B - 免疫球蛋白ａ型腎小球腎炎之分子標記及其應用

Info

Publication number: TWI449911B
Application number: TW099102619A
Authority: TW
Inventors: Ann Chen; Shuk Man Ka
Original assignee: Nat Defense Medical Ct
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2014-08-21
Also published as: TW201126165A

Description

免疫球蛋白A型腎小球腎炎之分子標記及其應用

本發明係關於IgA腎炎(IgA nephropathy)的生物標記及其應用。

IgA腎炎是目前世界上最常見的一種腎小球疾病，在20年的追蹤研究發現，有多達60%之病患最終會發展出末期腎臟疾病或慢性腎衰竭。雖然對IgA腎炎的發病機制仍非常不清楚，但已知內生腎小球細胞對於IgA免疫複合物(包括異常的糖化IgA1形成的新抗原(neoantigen))的初始反應扮演重要角色，導致細胞激素及生長因子在發病的腎小球釋放。迄今，IgA腎炎之診斷及預後需要腎臟切片，但許多病患或許不願意接受此種侵入流程，因而造成在臨床特徵日趨明顯或疾病開始惡化之前，無法診斷疾病或延遲診斷。不幸地，腎臟切片有嚴重出血併發症的風險，這亦是罹患腎小球疾病之病患之診斷及預後所面臨最主要的負面衝擊。

仍有需要一種可用於進行IgA腎炎之診斷及預後的生物標記，特別是採用非侵入性的方式進行。

在一方面，本發明提供一種診斷個體是否罹患IgA腎炎之方法，其包含：分析從個體所取得的測試樣本之一或多種基因的表現量，該基因係選自以下所組成的群組：胸腺素β4(Tsmb4 )、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑E組支系第2成員(Serpine2 )、分泌型磷蛋白1(OPN )、丁醯蛋白樣2(BTNL2 )、S100鈣結合蛋白A8(S100A8 )、血清胱蛋白C(CysC )及其任何組合，其中，相較於正常樣本之所述一或多種基因的表現量，該測試樣本之所述一或多種基因的表現量較高係表示該個體罹患IgA腎炎。

在另一方面，本發明提供一種評估罹患IgA腎炎之病患的預後之方法，其包含：分析從個體所取得的測試樣本之一或多種基因的表現量，該基因係選自以下所組成的群組：Tsmb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 、CysC 及其任何組合，其中相較於正常樣本之所述一或多種基因的表現量，該測試樣本之所述一或多種基因的表現量較高係表示不利預後。

以下將詳細說明本發明之各種具體實施例。本發明的其他特徵，將由以下的詳細說明與關於各種具體實施例的圖式及申請專利範圍而清楚地呈現。

相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者，無須進一步闡述而可依說明內容實施本發明之最廣範圍。因此，以下說明應作為例示之目的而非以任何形式來限縮本發明範圍。

除另有定義外，本案使用的所有技術與科學術語具有熟習本發明所屬技藝之技術者一般所理解的相同意義。本案所有引述文獻以參考方式併入本說明書中，以揭露並且說明與引述文獻相關的方法及/或材料。

在本文中，單數型態的語詞「a」、「an」、及「the」，除非文中另外清楚地指明，否則包括複數個所指對象。因此，例如，所稱「一樣本」包括複數個樣本及熟習此技藝者所知的等同物。

定義

名詞「核酸片段」、「核酸」和「多核苷酸」可交互使用，意指核苷酸單元所組成的多聚體，包括自然存在的核酸，例如，去氧核醣核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)，以及核酸類似物，包括具有非自然存在的核苷酸者。因此，此等名詞包括但不限於單、雙、多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、mRNA、DNA-RNA雜合體、或包括嘌呤與嘧啶鹼基或其他自然性、化學性或生物化學修飾過的、非自然的或衍生的核苷酸鹼基之聚合物。可理解的是，當核酸片段以DNA序列(也就是A、T、G、C)表示時，其亦包括RNA序列(也就是A、U、G、C)，其中以「U」取代「T」。

此處所使用的「引子」乙詞指特異之寡核苷酸序列，其與目標核苷酸序列互補，並用以與目標核苷酸序列雜交。引子係作為由DNA聚合酶、RNA聚合酶、或逆轉錄酶所催化之核苷酸聚合作用的起始點。例如，此處所使用的Tsmb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 之引子分別是指可雜交至個別目標基因之核苷酸序列以啟動核苷酸聚合作用並產生如基於引子之序列所預期的核苷酸產物。

此處所使用的「探針」乙詞是指經定義之核酸片段(或是核苷酸類似物片段，例如，本文所定義之聚核苷酸)，其可用以在雜交過程中辨識存在於樣本中之特定聚核苷酸序列，該核酸片段包含與待辨識之特定聚核苷酸序列互補的核苷酸序列。典型地，探針係以特定方式予以標記，例如，藉由併入報導者分子，例如，螢光物質或放射性核素，因此，探針可產生可偵測的訊號。例如，此處所使用的Tsmb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 之各個探針是指各自特異性地雜交至個別目標基因之對應核苷酸序列並產生由該雜交所產生的可偵測訊號。

此處所使用的「雜交」乙詞應包括一股核酸經由鹼基配對與一互補股結合的任何過程。相關技術係本領域所熟知者，且描述於，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2^nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；及Frederick M.A.等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons，Inc.(2001)。典型地，嚴格條件是在指定離子力及pH下低於指定序列之熱融點(T_m )約5-30℃。更典型地，嚴格條件為在指定離子力及pH下低於指定序列之T_m 約5-15℃。例如，嚴格雜交條件是鹽濃度低於約1.0 M鈉(或其他鹽類)離子濃度，典型地約0.01至約1 M鈉離子濃度，在約pH 7.0至約pH 8.3下，溫度對短探針(如，10至50個核苷酸)而言至少約25℃，及對長探針(如，大於50個核苷酸)而言至少約55℃。針對長探針(如，大於50個核苷酸)之例示性的非嚴格或低度嚴格條件可包含20 mM Tris,pH 8.5、50 mM KCl、及2 mM MgCl₂ 之緩衝液以及25℃之反應溫度。

此處所使用的「編碼」乙詞是指聚核苷酸(例如，基因、cDNA、mRNA)的特定序列之作為合成基因產物之模版的固有性質，該基因產物係具有指定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA、mRNA)或指定的胺基酸序列，及所產生的生物性質。

此處所使用的「表現」乙詞是指實現編碼於基因中的基因訊息以產生基因產物，例如，未剪接RNA，mRNA，剪接變異體mRNA，多肽或蛋白質，經轉譯後修飾的多肽，剪接變異體多肽等。

此處所使用的「表現量」乙詞是指特定基因在細胞中表現出的基因產物之含量，其可以此領域已知的任何適當的方法予以測定。

此處所使用的「多肽」和「蛋白」可交互使用，意指任何長度的胺基酸的聚合形式，包括編碼和非編碼的胺基酸、化學性或生物化學修飾過的或衍生的胺基酸、或具有經修飾的肽骨架之多肽。

此處所使用的「抗體」乙詞是指可結合至抗原的免疫球蛋白。此處所使用的抗體包括整個抗體以及任何抗體片段(例如，F(ab').sub.2，Fab'，Fab，Fv)，其能夠結合抗原決定位、抗原、或是所欲抗原片段。本發明之抗體對於指定蛋白質有免疫反應或具有免疫特異性，因此，可特異地及選擇地與其結合，例如，人類的Tmsb4、Serpine2、OPN、BTNL2、S100A8和CysC。針對所欲蛋白質的抗體較佳具有免疫特異性，也就是雖然會辨認跨物種的同源物，但不會與相關材料有實質的交叉反應。本文所用「抗體」乙詞包括所有類型的抗體(例如，單株和多株抗體)。

本文所使用「對象」、「個體」和「病患」三個詞彙可交互使用，是指任何需要進行診斷、預後、治療或醫療的哺乳類對象，特別是指人類。其他的對象可能包括牛、狗、貓、天竺鼠兔、大鼠、小鼠和馬等。

本文所使用「診斷」乙詞係指判定一對象是否有可能罹患特定疾病、病症或功能障礙。技藝人士通常基於一或多種診斷指標(即，標記)進行診斷，其中此等診斷指標之存在、不存在或其含量可作為該疾病、病症或功能障礙是否存在之指標。

本文所使用「預後」乙詞係指預測臨床症狀或疾病之可能進程或結果。病患的預後通常是評估可作為該疾病之有利或不利的進程或結果的指標的疾病因子或症狀而完成。應瞭解的是，所謂「預後」並不必然是能夠有100%的準確度來預測進程或症狀結果。反之，技藝人士將可明瞭，所謂「預後」是指有增加的機率會發生特定的進程或結果，也就是相較於未表現某特定症狀之病患而言，有表現特定症狀之病患比較有可能會造成某種進程或結果。預後可以不同的方式表示，例如，可用病患在一年、五年、十年之後，進展成末期腎臟疾病或慢性腎衰竭的百分比機會表示預後。

本文所使用「有利預後」或「正面預後」及「不利預後」和「負面預後」在此處是指預測疾病之可能進展及/或可能結果的相對性語詞。相較於不利預後或負面預後，有利或正面預後是針對一種症狀預測出較佳的結果。有利或正面預後的典型實例包括治癒率優於平均值，及進展到末期腎臟疾病或慢性腎衰竭的較低傾向。另一方面，不利或負面預後的典型實例包括治癒率低於平均值，及進展到末期腎臟疾病或慢性腎衰竭的較高傾向。例如，假設病患的預後是有50%的可能性會在一年內進展成末期腎臟疾病或慢性腎衰竭，而平均罹患相同疾病的病患具有相同進展的可能性只有25%，則該名病患係表現出負面預後。

本發明之方法

本發明的特徵是IgA腎炎之新穎生物標記，其係由基於腎小球的方法予以確認，包括胸腺素β4(Tsmb4 )、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑E組支系第2成員(Serpine2 )、分泌型磷蛋白1(OPN )、丁醯蛋白樣2(BTNL2 )、S100鈣結合蛋白A8(S100A8 )及血清胱蛋白C(CysC )。根據本發明，這些生物標記與IgA腎炎的不利進展高度相關，因此，可用於此腎小球疾病的診斷及預測其不利進展。此外，由於本發明之生物標記係由下述基於腎小球的方法予以確認，因此相信相較於目前本領域使用的基於腎組織病理學之預測方式而言，本發明之生物標記對於IgA腎炎的診斷及預後更為可靠。

因此，在一方面，本發明提供一種診斷個體是否罹患IgA腎炎的方法，其包括分析從個體所取得的測試樣本之一或多種基因的表現量，該基因係選自以下所組成的群組：Tsmb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 、CysC 及其任何組合，其中，相較於正常樣本之所述一或多種基因的表現量，該測試樣本之所述一或多種基因的表現量較高係表示該個體罹患IgA腎炎。

在另一個方面，本發明提供一種評估罹患IgA腎炎之病患的預後之方法，其包含分析從個體所取得的測試樣本之一或多種基因的表現量，該基因係選自以下所組成的群組：Tsmb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 、CysC 及其任何組合，其中相較於正常樣本之所述一或多種基因的表現量，該測試樣本之所述一或多種基因的表現量較高係表示不利預後。

如本文所述者，IgA腎炎是指IgA1沉積在腎臟的腎臟疾病。最常見與IgA腎炎相關的組織病理學上的改變是在間質區域有增生性細胞及細胞外基質，造成局部或瀰漫性擴張。此外，經由光學顯微鏡確認，在有更嚴重的損害的病患中，可觀察到各種損害，包括瀰漫性毛細血管內增生、節段性硬化病変、節段性壞死及细胞新月体形成。有幾個因素已被確認與IgA腎炎之不利預後有高度相關，包含血尿、蛋白尿、中度的細胞增多、腎小球硬化症、腎小管間質發炎，以及瀰漫性腎小球共沉積IgG和/或IgM和補體成分3(C3)。

Tmsb4是thymosin家族的成員，是一種主要的肌動蛋白隔離蛋白，已知參與多種生物學功能，如誘導血管生成，促進傷口癒合，及促進細胞遷移。Serpine2，也被稱為纖溶酶原激活物抑制因子-2或蛋白酶nexin-I，是一種細胞外絲胺酸蛋白酶抑制劑，它可在病理生理條件下調節基質累積與凝集。OPN是一種糖化磷蛋白，已被報導可增強天然殺手T細胞的活化，促使嗜中性白血球滲潤於發炎的肝臟疾病，及在類風濕關節炎中，透過NF-kB和有絲分裂活化蛋白質激酶(MAPK)途徑，增加單核球化學吸引蛋白質-1或巨噬細胞發炎蛋白1β。S100A8屬於延伸因子(EF)手型鈣結合蛋白的S100家族成員；在發炎的狀態下，S100A8的表現是經由嗜中性白血球、活化的單核球和巨噬細胞與S100A9共同調節，其係作為趨化分子。BTNL2是第一個嗜乳脂蛋白家族的成員，其具有免疫調節的功能，可抑制T細胞增生及調節T細胞的活化和耐受性。

上述生物標誌基因的核苷酸序列，及其基因產物之對應胺基酸序列是本領域所習知者。例如，人類的Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 的cDNA序列分別是SEQ ID NOS: 1、3、5、7、9及11，而其對應的胺基酸序列分別是SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10及12。

此處所使用的測試樣本包括來自欲進行診斷或預後之對象的各種樣本類型，例如，活組織檢體或由此衍生的細胞或組織培養物。具體而言，測試樣本是腎臟組織。在具體實施例中，測試樣本包括腎小球組織，其可由任何已知的方法取得，如描述於Nephrol Dial Transplant 2006;21: 1794-1802的篩管技術。

此處使用的「正常」樣本是指各種樣本類型，例如，不具有此處所界定的疾病之細胞或組織。名詞「正常」是指細胞或組織之狀態，當相較於具有負面生物症狀之患病細胞或組織時，該正常的細胞或組織顯然不具有所述負面生物症狀。例如，正常的樣本是從正常個體(即已知沒有罹患IgA腎炎或相關病症或症狀之個體)或罹患此處所界定之疾病之病患的未罹病區域所取得之組織或細胞。

在特定具體實施例中，本發明之方法可由分析來自有需要的個體所取得的測試樣本的一或多種基因的表現量而進行，該基因係選自以下所組成的群組：Tmsb4 、Serpine 2、OPN 、CysC 及其任何組合。特定而言，測試樣本可由非侵入性的方式獲得。更特定而言，測試樣本是尿液。

據瞭解的是，在樣本中之本文所述的一或多種基因的表現量可由任何適當的已知方法予以測定。

在一具體實施例中，該一或多種基因的表現量可藉由測量該一或多種基因的mRNA而測定。可使用基於使用引子或探針之分析方法進行測量，該引子或探針可特異性辨識此處所述之基因的核苷酸序列，其包括但不限於反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和原位雜交(ISH)，該等技術之流程為本領域所熟知。

引子或探針可由熟習本領域之技術人士基於想要的核酸區域輕易地設計及合成。可理解的是，本發明欲使用的引子或探針可基於本領域已揭示的基因之核苷酸序列及使用任何適當方法予以設計。本發明使用的引子或探針之實例描述如下。

在另一具體實施例中，該一或多種基因的表現量可藉由測量該一或多種基因的多肽含量而測定。可使用基於使用抗體之分析方法進行測量，該抗體可特異性辨識此處所述之基因的蛋白質或多肽，其包括但不限於免疫組織化學染色法(IHC)，西方墨點法，或酵素連結免疫吸附分析(ELISA)，該等技術之流程為本領域所熟知。

此處使用的抗體可為多株或單株抗體。對抗特定蛋白之多株抗體可由注射有效量的胜肽或抗原成分至適當的實驗動物、收集動物血清、及分離特異性血清而予以製備，其可由任何已知的免疫吸附技術而達成。可輕易用於製造本發明使用的多株抗體之動物包括雞、小鼠、兔、大鼠、羊及馬等。

一般而言，較佳使用單株抗體進行本發明之檢測分析方法，因為單株抗體可產生較大產量及類似反應性。用於製備單株抗體的融合瘤細胞株可由融合永生細胞株及製造抗體之淋巴球而產生。此製備可由熟習本領域之技藝人士使用所熟知的技術予以完成。

本發明文件將參酌以下的具體實施例而更具體地予以描述，目的是為描述而非限制。

實例1：建立惡化型IgA腎炎(Pre-IgAN)動物模式及其臨床及病理評估

如同先前所述方法(Kidney Int 2006;70: 283-297)，藉由每日注射純化的抗磷醯膽鹼IgA和肺炎球菌C多糖(PnC)至B細胞缺乏(BCD)小鼠體內，誘發IgA腎炎。為確認惡化型IgA腎炎模式之建立，進行以下臨床和病理評估。

在不同的時間點收集小鼠的尿液和血液，分別使用脲酶分析方法及苦味酸方法，分析尿蛋白和血液尿素氮(BUN)及血清肌酸酐(Cr)的含量。(Nephron 1998;78: 440-452)。僅予以生理食鹽水處理的小鼠是正常對照組。

如圖1A所示，在惡化型IgA腎炎小鼠中，相較基礎值(0.08±0.02,p <0.01)，Cr校正後的尿蛋白含量(0.48±0.07)在第14天有顯著增加，而直到第21天小鼠被犧牲時，該蛋白含量仍維持高量。相較於正常對照組的基礎值(25.90±2.34 mg/dl)，BUN含量在第14天顯著提升(72.45±14.13 mg/dl)，顯示直到第21天小鼠被犧牲時，BUN仍維持高量。類似地，相較於基礎值(0.27±0.02 mg/dl,p <0.05)，Cr含量在第14天顯著增加並在小鼠被犧牲時仍維持高量(圖1B和圖1C)。。

此外，如先前所述方法(kidney Int 2006;70: 283-297)，在不同的時間點犧牲小鼠，進行病理評估。簡言之，腎組織用10%緩衝的福馬林固定，包埋於石蠟，進行常規的組織病理學評估。把經由福馬林固定的腎組織切片浸於二甲苯，以移除石蠟，在分級酒精中再次水合，以蘇木紫(hematoxylin)和曙紅(eosin)進行染色。接著進行腎損害嚴重度的評分，其中分別計算以下四個主要項目的比例(百分比)：(1)腎小球叢之增生、(2)新月體類似物之形成、(3)腎小球硬化、及(4)腎小球周圍發炎程度。

如圖2所示，相較於正常對照組，接受IgA和PnC的BCD小鼠，早在疾病誘導後第3天，就進展出瀰漫性間質細胞增生，並接著在第21天前進展成新月體類似物之形成及硬化。除了腎小球損傷外，相較於正常對照組，亦在此時觀察到各種腎小管間質變化，包括腎小管間質(特別是腎小球周圍)發炎以及腎小管萎縮並伴隨蛋白圓柱及偶發的紅細胞圓柱。

實例2：基因表現態樣

使用結合雷射微組織細胞擷取技術(LCM)和cDNA微陣列分析，針對惡化型IgA腎炎模式之腎小球的基因表現變化的態樣進行特徵分析。簡言之，依據先前描述的實驗方法(Reprod Biol Endocrinol 2007;5: 18;andMethods Mol Biol 2009;466: 73-82)，在第21天進行LCM從正常對照組和惡化型IgA腎炎小鼠取得腎小球切片。對每個樣本而言，約從至少三個連續切片收集約150個腎小球。接著，依先前描述方方法(Nephrol Dial Transplant 2006;21: 288-298)，進行cDNA微陣列分析。針對相較於正常對照組之第21天的惡化型IgA腎炎模式，總共篩選8,500個小鼠基因點。

結果顯示，在腎小球共鑑定出918個向上調節基因(第21天惡化型IgA腎炎/正常組，比值≧2)。在惡化型IgA腎炎模式中，主要依據已知的生物活性和發炎過程之間的可能相關性，共選出39個高度表現基因(比值≧10)，包括：Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 。這6個基因尚無有關IgA腎炎之報導，以下進行後續確認分析。

實例3：候選基因的mRNA表現

為測定是否此等腎小球之向上調控基因與IgA腎炎的進展有關，針對來自惡化型IgA腎炎模式的分離腎小球，利用RT-PCR進行時間進程(第0、3、14和21天)的mRNA的表現分析。依據前人所述的篩管技術(Nephrol Dial Transplant 2006;21: 1794-1802)，分離出惡化型IgA腎炎小鼠的腎小球樣本，然後依據廠商說明書(Life Technologies,MD,USA)使用Trizol試劑萃取出全部RNA。接著，基於這些RNA樣本，使用表1所列基因特異性引子，進行即時RT-PCR。

圖3顯示經GAPDH正常化後的RT-PCR定量結果。如結果所示，相較於正常對照組，這些基因在惡化型IgA腎炎模式的腎小球中，在第3天(S100A8 ,5.82±0.91倍,p <0.05)、第14天(Tmsb4 ,29.94±7.94倍,p <0.01;Serpine2 ,7.21±1.69倍,p <0.05;OPN ,33.61±6.77倍,p <0.005;BTNL2 ,9.21±2.78倍,p <0.05;S100A8 ,24.58±6.82倍,p <0.01;CysC ,8.05±3.35倍,p <0.05)、及第21天(Tmsb4 ,40.07±5.23倍,p <0.005;Serpine2 ,11.59±2.11倍,p <0.01;OPN ,29.41±4.03倍,p <0.005;BTNL2 ,28.33±4.67倍,p <0.005;S100A8 ,20.21±3.35倍,p <0.005;CysC ,26.22±4.55倍,p <0.005)，有顯著增加的mRNA表現。

實例4：候選基因之mRNA或其編碼蛋白質在腎臟的細胞位置

為分析來自惡化型IgA腎炎小鼠之腎臟組織的特定基因表現的細胞來源，以時間進程方式進行ISH及IHC。

1.原位雜交(ISH)

為進行ISH，以表1所列引子進行RT-PCR，在小鼠腎臟中產生針對Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 、CysC 之cDNA探針，並以地高辛(digoxigenin)標示。

依據先前所述的方法(J Biol Chem 2006;281: 1066-1072)，從惡化型IgA腎炎小鼠取得腎臟組織，然後使用上述探針進行ISH。

如圖4A所示，在惡化型IgA腎炎模式的腎小球中，Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 的mRNA表現量隨時間提升，雖然有些腎小管也被發現有表現這些基因。注意到的是，在第21天，當腎小球新月體類似物形成和硬化趨向明顯時，相較於惡化型IgA腎炎小鼠的早期階段及正常對照組而言，發現到惡化型IgA腎炎小鼠針對上述基因表現出最大量及密集的mRNA表現量(圖4B-4G)。此外，在惡化型IgA腎炎小鼠的腎小球附近浸潤的發炎細胞亦發現有提升的BTNL2 和S100A8 之mRNA表現量(圖4A，p及t)。

2.　免疫組織化學分析(IHC)

依據先前所述方法((J Am Soc Nephrol 2007;18 : 1777-1788))，取得惡化型IgA腎炎小鼠的石蠟包埋切片，然後以特異性抗體進行IHC，包括抗-Tmsb4、抗Serpine2、抗S100A8(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)、抗小鼠OPN(Assay Designs Inc.,MI,USA)、抗人類OPN(Lab Vision Corp.,CA,USA)及抗CysC(Upstate,NY,USA)。

如圖五所示，Tmsb4、Serpine2、OPN、S100A8及CysC蛋白表現態樣與前述原位雜交態樣類似。目前沒有針對BTNL2之特異性抗體。腎小管上皮細胞以特定模式顯示CysC蛋白，暗示有蛋白之再吸收現象，但非蛋白之重新製造。

實例5：候選基因在動物尿液樣本中之增加的蛋白含量

接著，我們想確認是否此等惡化型IgA腎炎相關蛋白會分泌到尿液中。在不同的時間點取得惡化型IgA腎炎小鼠之尿液樣本，用西方墨點法(Western blot)或ELISA，依據先前所述方法(Nephrol Dial Transplant 2006;21: 288-298;BJU Int 2009)，檢測尿液樣本中所欲個別蛋白的含量。依先前描述方式，數據是以各個目標蛋白之強度對於尿液的Cr濃度之比例予以呈現。

如圖6所示，如西方方墨點法所證實，相較於正常對照組(各自p <0.005)，在第21天的惡化型IgA腎炎小鼠的尿液樣本中，可檢測到OPN(1356.47±181.32 vs. 0)、CysC(1164.82±268.61 vs. 367.83±73.47)及Serpine2(1149.35±102.34 vs. 0)蛋白，且有顯著增加。其中，在惡化型IgA腎炎模式中，Serpine2的蛋白早在第7天時就可以被偵測到，且以時間依賴方式顯著提升，暗示Serpine2可作為與IgA腎炎之進展及惡化相關的非侵入式方法之早期生物標記。在惡化型IgA腎炎小鼠或對照組中沒有在尿液中偵測到S100A8蛋白。目前沒有特異性抗體可檢測小鼠尿液之Tmsb4。

實例6：候選基因的向上調節表現可能涉及動物之細胞自戕的增強

我們進一步用TUNEL技術，以時間依賴方式，確認惡化型IgA腎炎的特徵。根據製造廠商之說明書，使用ApopTag Plus Peroxidase原位細胞自戕偵測套組(Chemicon，CA，USA)，以對石蠟包埋切片進行染色。依據先前所述方法，藉由計算每一腎小球橫切面的陽性細胞，計數腎小球中細胞自戕的數目。

如圖7所示，細胞死亡的量化分析顯示，相較於正常對照組，在惡化型IgA腎炎模式中，在第3天時，腎小球含有一或多個自戕的細胞核(2.40±0.38細胞/gcs)，自戕的細胞核的數目隨著惡化型IgA腎炎模式的進程而逐漸增加並在第21天小鼠犧牲時，急遽升高(11.52±2.31細胞/gcs vs. 0,p<0.01)。

實例7：候選基因在具有不利預後因子(UPF)的惡化型IgA腎炎病患取得的腎組織中的提升表現 1.病患群

總共徵募7個罹患IgA腎炎的病患，該病患帶有先前所述(Kidney Int 2007;71: 343-348)的不利預後因子(unfavorable factors,UPF)，以確認使用上述小鼠的惡化型IgA腎炎模式所獲得的潛在候選生物標記的表現。除了血尿及尿蛋白之外，這些病患的腎臟切片顯示中度的細胞增多、腎小球硬化、腎小球間質發炎及瀰漫性腎小球共沉積IgG和/或IgM和C3。這些病患安置在台灣的台北三軍總醫院，且依據台灣台北三軍總醫院國防醫學中心人體試驗委員會之規範，所有提供樣本的病患均已簽署受試者同意書。

在診斷時，取得病患的腎臟切片和尿液樣本。從為了腎細胞癌而取出的腎臟中取出未受侵襲的軸區的腎組織作為正常對照組。從正常健康志願者收集正常尿液樣本。

2.以ISH分析基因表現

以表3所列的引子，進行個別RT-PCR在人體腎臟檢體中產生Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 和CysC 的cDNA。

此等製得的cDNA片段接著以地高辛標示作為ISH探針，其序列顯示於表4。

如前所述從病患取得腎臟組織，依據先前所述方法，以上述探針進行ISH。圖8顯示病患的ISH結果。

3.以IHC分析基因表現

類似於實例4，從病患取得石蠟包埋切片，以特異性抗體進行IHC，包括抗Tmsb4、抗Serpine2、抗S100A8(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)和抗小鼠OPN(Assay Designs Inc.,MI,USA)，抗人類OPN(Lab Vision Corp.,CA,USA)及抗CysC(Upstate,NY,USA)。圖9顯示病患的IHC結果。

4.以西方墨點法或ELISA分析基因表現

為確認此等蛋白是否可作為進行病患之非侵入式診斷及預後判斷之生物標記，我們進一步使用西方墨點法或ELISA檢測病患的尿液蛋白量。從健康的自願者取得尿液樣本作為正常對照組。如圖10(A)、(B)、(C)所示，西方墨點法證實，相較於正常對照組而言，病患的Serpine2(525.87±58.68 vs. 0,p<0.005)、OPN(1748.35±215.99 vs. 0,p<0.005)和CysC(1297.86±371.65 vs.25.66±22.34,p<0.05)之尿液蛋白量有顯著增加。以ELISA檢測，相較於正常對照組而言，具有UPF的IgA腎炎病患之Tmsb4尿液蛋白量亦有顯著增加(0.154±0.024 vs.0.027±0.006,p <0.005，圖10D)。

上述ISH、IHC、西方墨點法及ELISA分析基因表現之結果紀錄於表5。

PEC：腔壁上皮細胞；P：足細胞；MC：間質細胞；ND：沒有偵測到。(-)表示無法偵測。ISH和IHC染色強度分數0-20、20-50、50-100和>100分別表示為微量、(+)、(++)和(+++)。*表示p <0.05、**表示p <0.01、***表示p <0.005。

如同表5之記錄，相較於正常對照組而言，在具有UFP的IgA腎炎病患中，此處所述之生物標記基因的mRNA表現及其編碼的蛋白之主要位置是在腎小球的足細胞和腎小球腔壁上皮細胞，雖然在腎小球附近的部分腎小管亦觀察到OPN 的mRNA表現。此外，ISH染色亦證實，在病患的腎小球附近浸潤的發炎細胞亦有BTNL2 的mRNA表現。再者，在這些病患中可發現Tmsb4、OPN、CysC及Serpine2之提升的尿液蛋白含量，因此建議這些蛋白可用於腎小球疾病之非侵入式診斷及預後。

總而言之，我們使用來自惡化型IgA腎炎模式之腎臟組織的LCM分離的腎小球切片，進行動物模式的腎小球的轉錄態樣分析。再者，在動物模式及具有UPF的IgA腎炎病患中，我們證實Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 和CysC 及其編碼蛋白之提升的腎小球表現。特定地及重要地，我們證實在具有UPF的IgA腎炎病患中，針對Tmsb4、Serpine2、OPN、和CysC有提升的尿液蛋白表現，其有助於發展IgA腎炎之非侵入式診斷及預後生物標記(在尿液樣本中)。

圖1顯示惡化型IgA腎炎模式尿液蛋白及腎功能分析結果，其中(A)表示尿蛋白含量，(B)表示血清BUN含量，及(C)表示血清Cr含量。各點表示平均±標準誤差。虛線表示來自正常對照組(第0天)的尿液或血清樣本之平均值，*p <0.05及**p <0.01表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。

圖2顯示惡化型IgA腎炎模式之腎臟的組織病理結果，其中(A)至(D)分別表示的腎小球增生(箭號)，腎小球新月體類似物形成(箭頭)，硬化(雙箭號)，及腎小球周圍發炎(彎箭號)之進展變化；及(E)至(G)表示這些變化的評分。此結果係由蘇木紫及曙紅染色所得。各圖原始倍率是400倍。*p <0.05及**p <0.01表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。

圖3顯示來自惡化型IgA腎炎模式之分離的腎小球，經由即時RT-PCR，以時間依賴方式所得的mRNA含量定量分析結果，其中(A)到(F)分別表示Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 的結果。各點表示平均±標準誤差。*p <0.05、**p <0.01及***p <0.005表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。

圖4顯示來自惡化型IgA腎炎模式以時間依賴方式之腎臟原位雜交(ISH)結果，其中(A)表示來自正常對照組(第0天)及IgAN模型(第3天、第14天及第21天)之腎臟切片的Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、S100A8 和CysC 結果。陽性細胞染成深棕色。(d)、(h)、(l)、(p)、(t)及(x)的箭號是指腎小球之新月體類似物形成的表皮細胞。各圖原始倍率是400倍。(B)到(G)顯示IHC中細胞蛋白質表現的半定量分析。針對三種項目進行評分：腔壁上皮細胞(實心柱狀)、足細胞(空心柱狀)和間質細胞(劃線柱狀)。各點表示平均±標準誤差。*p <0.05、**p <0.01及***p <0.005表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。符號「#」表示數據未偵測。

圖5顯示來自惡化型IgA腎炎模式以時間依賴方式之免疫組織化學分析(IHC)結果，其中(A)表示來自正常對照組(第0天)及IgAN模型(第3天、第14天及第21天)之腎臟切片的Tmsb4、Serpine2、OPN、S100A8及CysC結果。陽性細胞染成紅色。(d)、(h)、(l)、(p)及(t)的箭號是指腎小球之新月體類似物形成的表皮細胞。各圖原始倍率是400倍。(B)到(F)顯示IHC中細胞蛋白質表現的半定量分析。針對三種項目進行評分：腔壁上皮細胞(實心柱狀)、足細胞(空心柱狀)和間質細胞(劃線柱狀)。各點表示平均±標準誤差。*p <0.05、**p <0.01及***p <0.005表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。符號「#」表示數據未偵測。

圖6顯示在惡化型IgA腎炎模式中，以時間依賴方式偵測尿液中OPN、CysC及Serpine2的結果。(A)是表示分別以抗OPN、抗CysC及抗Serpine2的抗體探針對尿液樣本進行西方墨點法的結果。右邊顯示分子量標記。(B)表示對於尿液肌酸酐密度比例的定量分析。各點表示平均±標準誤差(第0天)。

圖7顯示針對惡化型IgA腎炎模式以時間依賴方式之末端脫氧核苷酸轉移酶末端標記法(TUNEL)分析結果。(A)至(D)表示腎臟組織在第0天、第3天、第14天和第21天出現細胞自戕。各圖原始倍率是400倍。(E)表示細胞自戕的評分。**p <0.01表示相較於正常對照組(第0天)有統計上的顯著差異。

圖8顯示帶有不利預後因子(UPF)之IgA腎炎病患的腎臟ISH結果。(A)表示Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 的結果。箭號是指腔壁上皮細胞，及箭頭是指足細胞。各圖原始倍率是400倍。(B)至(G)表示細胞mRNA表現的半定量分析。針對三種項目進行評分：腔壁上皮細胞(實心柱狀)、足細胞(空心柱狀)和間質細胞(劃線柱狀)。各點表示平均±標準誤差。*p <0.05、**p <0.01及***p <0.005表示相較於正常對照組有統計上的顯著差異。符號「#」表示數據未偵測。

圖9顯示帶有UPF之IgA腎炎病患的腎臟IHC結果。(A)表示Tmsb4 、Serpine2 、OPN 、BTNL2 、S100A8 及CysC 的結果。箭號是指腔壁上皮細胞，及箭頭是指足細胞。各圖原始倍率是400倍。(B)至(G)表示細胞蛋白表現的半定量分析。針對三種項目進行評分：腔壁上皮細胞(實心柱狀)、足細胞(空心柱狀)和間質細胞(劃線柱狀)。各點表示平均±標準誤差。*p <0.05、**p <0.01及***p <0.005表示相較於正常對照組有統計上的顯著差異。符號「#」表示數據未偵測。

圖10顯示在來自正常個體及帶有UPF之IgA腎炎病患之樣本中，偵測尿液中Serpine2、OPN、CysC及Tmsb4的結果。(A)是表示分別以抗OPN、抗CysC及抗Serpine2的抗體探針對尿液樣本進行西方墨點法的結果。(B)、(C)及(D)分別是Serpine2、OPN及CysC的定量分析，以對於尿液Cr的密度比例表示，以及(E)顯示Tmsb4的ELISA結果。**p <0.05及***p <0.005表示相較於正常對照組有統計上的顯著差異。符號「#」表示數據未偵測。

Claims

一種在體外診斷個體是否罹患IgA腎炎(IgA nephropathy)之方法，其包含：分析從待測個體所取得的測試尿液樣本之一或多種基因的表現量，該基因係選自以下所組成的群組：胸腺素β4(Tsmb4 )、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑E組支系第2成員(Serpine2 )及其任何組合，其中，相較於來自正常個體之尿液樣本之所述一或多種基因的表現量，該測試尿液樣本之所述一或多種基因的表現量較高係表示該待測個體罹患IgA腎炎。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中該基因進一步包括選自以下所組成的群組：分泌型磷蛋白1(OPN )、血清胱蛋白C(CysC )及其任何組合。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該測試樣本是以非侵入式方法取得。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中所述一或多種基因的表現量係由測量所述一或多種基因之mRNA含量而測定。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中所述一或多種基因的表現量係由測量所述一或多種基因之多肽含量而測定。
根據申請專利範圍第4項之方法，其中該mRNA含量係由反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)而測量。
根據申請專利範圍第5項之方法，其中該多肽含量係由西方墨點法或酵素結合免疫吸附分析法而測量。
一種以基因於個體之尿液樣本測得之表現量作為體外診斷IgA腎炎之生物指標之用途，其中該基因係選自以下所組成的群組：胸腺素β4(Tsmb4 )、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑E組支系第2成員(Serpine2 )及其任何組合。
根據申請專利範圍第8項之用途，其中該基因進一步包括選自以下所組成的群組：分泌型磷蛋白1(OPN )、血清胱蛋白C(CysC )及其任何組合。