TWI447275B - 斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法，尤指一種使用銀杏毒素類似物之所建立之斑馬魚癲癇模式及使用其篩選抗癲癇藥物之方法。
癲癇是一種常見的神經病變，全世界約有五千萬人口罹患癲癇。癲癇在各個年齡層均可能發生，且一旦患上癲癇，就無法根治。
癲癇主要乃因大腦半球的神經細胞不正常放電，以致患者腦部無法進行正常的功能，進而造成患者無法理解和處理所得到的感官訊息，同時失去控制肌肉的能力甚或導致痙攣，嚴重時甚至影響患者的生命安全。
為了抑制癲癇發作，目前輕微癲癇病症係以藥物控制發作；當藥物無法有效控制癲癇發作時(嚴重癲癇病症)，則需透過手術治療。然而，無論是有經由手術治療，癲癇患者仍需終生服藥以有效抑制癲癇發作。
因此，目前臨床上已發展出多種抗癲癇藥物，如卡馬西平(Carbamazepine)、丙戊酸鈉(Depakene)、苯妥英鈉(Phenytoin)、奧卡西平(Trileptal)、唑尼沙胠(Zonegran)，均可展現不錯的療效。然而，這些藥物除了會產生副作用外，目前仍有超過百分之三十的病患其症狀仍無法以現有的藥物加以控制。
由於癲癇病因與致病機轉相當複雜，且並非所有藥物均適用於各個病患；因此，對於抗癲癇相關藥物研究，仍為刻不容緩的議題之一。
本發明之主要目的係在提供一種斑馬魚癲癇模式之建立方法，俾能快速及低成本的建立癲癇或痙攣模式。
本發明之另一目的係在提供一種斑馬魚癲癇模式，俾能使用此模擬之癲癇病症，以篩選抗癲癇或抗痙攣藥物。
本發明之再一目的係在提供一種抗癲癇藥物之篩選方法，其係透過本發明之斑馬魚癲癇模式，以作為一快速篩選抗癲癇或抗痙攣藥物之篩選平台。
為達成上述目的，本發明之斑馬魚癲癇模式之建立方法，包括下列步驟：飼養一斑馬魚於一含一誘發化合物之培養基，以誘發斑馬魚產生類癲癇症狀，其中此誘發化合物係如下式(I)所示：
其中，R1
係為C1-6
烷基，R2
係為氫、羥基(-OH)、-O-P(=O)(OH)2
或C1-6
烷基，且R3
係為C1-6
烷基、C1-6
烷氧基、或C1-6
醚基。
此外，本發明更提供一種斑馬魚癲癇模式，其係使用上述之斑馬魚癲癇模式之建立方法所建立。
再者，本發明亦提供一種抗癲癇藥物之篩選方法，包括下列步驟：(A)提供一斑馬魚癲癇模式，其係使用上述之斑馬魚癲癇模式之建立方法所建立；以及(B)添加一待篩選藥物至培養基中，並觀察斑馬魚之痙攣狀態，當斑馬魚之痙攣狀態減緩時，代表待篩選藥物具有抗癲癇功效。
於本發明中，係透過銀杏毒素類似物以建立斑馬魚癲癇模式，並使用此癲癇模式篩選抗癲癇藥物。相較於以往之篩選抗癲癇藥物所採用之囓齒類動物模式，本發明所使用斑馬魚建立癲癇模式，因斑馬魚具有近似人類的各種器官系統、體外受精且透明的胚胎極利於觀察、快速多產的繁殖力、容易進行誘發突變與相關的基因實驗操作、較為經濟便宜的養殖花費等優點，故斑馬魚動物模式為一種方便、便宜、有效率之動物模式。
目前有以戊二烯四唑(pentylenetetrazole,PTZ)誘發癲癇的斑馬魚疾病模式；但其主要是藉由以競爭方式來阻斷抑制性神經傳導物γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)與其受器的結合而誘發癲癇。然而，本發明係使用銀杏毒素類似物誘發斑馬魚癲癇模式，其誘發癲癇的機轉是藉由抑制維生素B6的活化進而抑制GABA的生合成，造成興奮性與抑制性神經傳導物失衡所致；故以銀杏毒素類似物可視為一種維生素B6拮抗劑，且其所導致之致病機制並不涉及GABA接受器的競爭阻斷。相較於以PTZ誘發之斑馬魚癲癇模式，以銀杏毒素類似物誘發的斑馬魚癲癇模式對藥物具不同的專一性及較高的敏感性，也將更有利於抗癲癇藥物的篩選。
於本發明之斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法中，斑馬魚較佳為一斑馬魚胚胎。以斑馬魚或斑馬魚胚胎建立癲癇模式及進行藥物篩選時，因係以整隻活體動物直接作測試，可同時測驗藥物的藥效及對各個器官的毒性，省時又有效率。除此之外，更可以避免以細胞篩選藥物常見的問題，如所得的藥物往往到了動物身上會產生毒性，或根本沒有預期的藥效；特別是，抗癲癇或抗痙攣藥物係無法以細胞篩選藥物，而必須以動物模式篩選藥物。另外，若以斑馬魚胚胎建立癲癇模式及進行藥物篩選時，因斑馬魚胚胎非常小且發育快，故所需藥劑量較少；同時，斑馬魚胚胎可在體外發育，且透明的外觀易觀察研究藥效；再者，一般的藥品與化合物多可直接通過卵鞘及胚胎表皮，故可直接將藥物加入含有胚胎的96孔盤進行藥物篩選。因此，斑馬魚或斑馬魚胚胎可視為一個極有效率的藥物篩選平臺。
於本發明之斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法中，式(I)所示之誘發化合物中，R1
較佳為甲基或乙基，R2
較佳為羥基、-O-P(=O)(OH)2
、甲基或乙基，且R3
較佳為C1-6
醚基。更佳為，R2
為羥基，且R3
為-C1-3
-O-C1-3
。最佳為，誘發化合物係如下式(II)或(III)所示：
其中，式(III)化合物為式(II)化合物之磷酸鹽類。
式(II)所示之化合物，其化學學名為4-O-甲基吡哆醇(4-O-methylpyridoxine)。此化合物為銀杏種子中所含的微量毒素，一般稱之為銀杏毒素(ginkgotoxin)。
於本發明之斑馬魚癲癇模式及其建立方法、及使用其篩選抗癲癇藥物之方法中，培養基可為一般培養斑馬魚或其胚胎之培養基，如一水溶液。較佳為，誘發化合物於培養基之濃度係為0.05-1.5 mM；且更佳為0.2-0.8 mM。
此外，於本發明之抗癲癇藥物之篩選方法中，可先以誘發化合物(銀杏毒素類似物)建立斑馬魚癲癇模式後，再添加待篩選藥物至培養基中，以進行抗癲癇藥物或抗痙攣藥物之篩選；或者，可同時將銀杏毒素類似物與待篩選藥物添加至培養有斑馬魚之培養基中，以進行抗癲癇藥物或抗痙攣藥物之篩選。在此，斑馬魚之痙攣狀態可使用肉眼或顯微鏡進行觀察；較佳係使用光學解剖顯微鏡觀察。
本發明之斑馬魚癲癇模式及其建立方法，除了可用以篩選篩選抗癲癇藥物外，更可作為用研究維生素B6缺乏症的動物模式，以篩選維生素B6缺乏症相關之治療藥物。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
本發明所使用之斑馬魚(Daniorerio
,AB strain)係由台灣斑馬魚中心所提供，其係依照標準飼養方式培養，在28℃水溫下，並維持固定之光週期(10小時光照/14小時黑暗)進行培養。綠螢光基因轉殖斑馬魚胚胎Tg(alx:GFP)則由日本理化研究所腦科學綜合研究中心及自然科學研究機構所提供。所有實驗均根據成功大學實驗動物照護及使用委員會許可下進行(IACUC許可第99059號)。
式(II)所示之銀杏毒素及式(III)所示之銀杏毒素磷酸鹽則由Martin Safo博士所提供(Institute of Structural Biology and Drug Discovery/Virginia Commonwealth University,Richmond VA)。
銀杏毒素之水溶液係存放於-20℃下。誘發斑馬魚癲癇模式時，將40 mM之銀杏毒素濃縮液添加至培養水溶液中，使並銀杏毒素之濃度介於0.2 mM至1 mM之間。控制組則為培養在未添加有銀杏毒素培養水溶液之斑馬魚。
當測量斑馬魚胚胎癲癇模式對於抗癲癇藥物之功效時，係使用40 mM之5-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)及GABA水溶液進行試驗。至於抗癲癇藥物，如鎮頑癲(gabapentin)、癲能停(phenytoin)及撲癲酮(primidone)等，則溶於DMSO中以製得100 mM濃縮溶液。於進行試驗時，可將抗癲癇藥物與銀杏毒素同時添加至培養水溶液中；或者是於紀錄及分析斑馬魚狀態前3小時，再將抗癲癇藥物添加至培養水溶液中。此部份將於下述結果中詳細說明。
試驗結果係直接以肉眼判斷斑馬魚游泳型態，並以斑馬魚所游之距離及游泳速率做量化標準。每組試驗均使用至少10隻班馬魚。
此外，斑馬魚胚胎則置於顯微鏡載玻片之凹槽中，以200 μl之培養水溶液進行培養。在此，係使用高解析度之解剖顯微鏡進行觀察及紀錄(Panasonic Digital video camera,DMC-FX55GT)。另外，使用運動追蹤系統(EthoVision XT8.0 locomotion tracking system(Noldus Information Technology,Inc.,Leesburg,VA,USA))分析並定量斑馬魚之各個狀態，如所游之距離及游泳速率等。控制組則為培養在未添加有銀杏毒素培養水溶液之斑馬魚胚胎。
將受精後第5天(5-dpf)之斑馬魚胚胎置於含有各種不同濃度銀杏毒素之培養水溶液中(0.2-1 mM)，以誘發癲癇模式。在誘發2小時後，紀錄並進行分析。結果係如圖1A及圖1B所示；其中階段0表示活動不受影響或些微影響，階段I表示活動有明顯影響，階段II表示抽搐或痙攣。
如圖1A及圖1B所示，培養在不含有銀杏毒素之培養水溶液之斑馬魚，其活動幾乎不受影響；然而，隨著銀杏毒素劑量增加，斑馬魚的活動力影響越趨嚴重，且在0.5 mM的劑量下，即可穩定的建立起斑馬魚癲癇模式。此外，如圖1B所示，在較少(0.2 mM)的劑量下，當誘發2小時後，仍可穩定的建立起斑馬魚癲癇模式。
此外，銀杏毒素磷酸鹽之效果，亦與銀杏毒素相似(結果未示)。
由上述結果顯示，銀杏毒素及其磷酸鹽確實用於建立斑馬魚癲癇模式上。往後，僅以銀杏毒素進行後續實驗，且使用劑量為0.5 mM。
在此，係使用GABA、PLP、鎮頑癲、癲能停進行試驗。其中，培養在未添加有銀杏毒素培養水溶液之斑馬魚胚胎係以「控制組」表示；僅以銀杏毒素處理之斑馬魚胚胎以「GT」表示；以銀杏毒素及0.5 mM之PLP同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+PLP」表示；以銀杏毒素及0.5 mM之GABA同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+GABA」表示；以銀杏毒素及1 mM之鎮頑癲同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+鎮頑癲」表示；且以銀杏毒素及1 mM之癲能停同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+癲能停」表示。結果係如圖2A至圖4B所示；其中，圖2A及圖2B係本實驗例之以受精後第3天之斑馬魚經處理2小時後之結果圖，圖3A及圖3B係本實驗例之以受精後第5天之斑馬魚經處理2小時後之結果圖，而圖4A及圖4B係本實驗例之以受精後6小時之斑馬魚胚胎經處理3天後之結果圖。其中，當瞬間游泳距離越長且游泳速率越快者，表示癲癇或痙攣的情形越嚴重。
如圖2A至圖4B所示，無論是斑馬魚受精後第幾天，以銀杏毒素處理之斑馬魚(GT)，均會產生癲癇或痙攣之狀態。特別是，受精後第3天之斑馬魚及受精後6小時之斑馬魚之癲癇或痙攣情形最為顯著，如圖2A、2B、4A、4B所示。
此外，如圖2A至圖4B所示，當同時添加有PLP或GABA時，癲癇或痙攣的情形會較為舒緩；特別是，受精後6小時之斑馬魚受到PLP或GABA影響之情形最為明顯，如圖4A及4B所示。此結果除了證明本實施例所建立之斑馬魚癲癇模式可用於抗癲癇藥物之篩選外，因維生素B6缺乏症所造成的症狀亦與GABA生成受到抑制有關，故本實施例所建立之斑馬魚癲癇模式亦可用於維生素B6缺乏症之藥物篩選上。
再者，如圖2A至圖4B所示，無論是斑馬魚受精後第幾天，當培養水溶液中同時添加有鎮頑癲或癲能停時，癲癇或痙攣的情形會較為舒緩。特別是，受精後6小時之斑馬魚受到鎮頑癲或癲能停影響之情形最為明顯，如圖4A及4B所示。此結果顯示，本實施例所建立之斑馬魚癲癇模式，確實可做為抗癲癇藥物或抗痙攣藥物之篩選上。
於本實驗例中，僅揭示斑馬魚同時經銀杏毒素及PLP/GABA/抗癲癇藥物之結果。此外，當斑馬魚先以銀杏毒素處理2小時後，再分別以PLP、GABA、抗癲癇藥物處理3小後之觀察結果均與前述相似(結果未示)。
目前有實驗證實，PTZ誘發之癲癇模式無法篩選出撲癲酮之抗痙攣藥物。在此，係使用PTZ及銀杏毒素誘發之斑馬魚癲癇模式做一比較。其中，培養在未添加有銀杏毒素培養水溶液之斑馬魚胚胎係以「控制組」表示；僅以銀杏毒素處理之斑馬魚胚胎以「GT」表示；僅以PTZ處理之斑馬魚胚胎以「PTZ」表示；以銀杏毒素及DMSO同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+DMSO」表示；以PTZ及DMSO同時處理之斑馬魚胚胎以「PTZ+DMSO」表示；以銀杏毒素及2 mM之撲癲酮同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+撲癲酮」表示；以PTZ及2 mM之撲癲酮同時處理之斑馬魚胚胎以「PTZ+撲癲酮」表示；以銀杏毒素及1 mM之葉酸同時處理之斑馬魚胚胎以「GT+葉酸」表示；而以PTZ及1 mM之葉酸同時處理之斑馬魚胚胎以「PTZ+葉酸」表示。在此，葉酸係做為一負控制組。
結果係如圖5A及圖5B所示，其中圖5A中之階段0表示活動不受影響或些微影響，階段I表示活動有明顯影響，階段II表示抽搐或痙攣。由此結果顯示，以銀杏毒素誘發之斑馬魚癲癇模式，可篩選出撲癲酮做為一抗癲癇藥物或抗痙攣藥物；此為以PTZ誘發之斑馬魚癲癇模式所無法達成的。
因此，除了以往所使用之PTZ誘發之癲癇模式，本發明提供另一種以銀杏毒素誘發之斑馬魚癲癇模式，其對抗癲癇藥物的反應及敏感性相當高，可做為篩選抗癲癇藥物或抗痙攣藥物之大量篩選平臺。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1A係本發明實驗例1之誘發斑馬魚癲癇模式1小時後之統計結果圖。
圖1B係本發明實驗例1之誘發斑馬魚癲癇模式2小時後之統計結果圖。
圖2A及圖2B係本發明實驗例2之以受精後第3天之斑馬魚經處理2小時後之結果圖。
圖3A及圖3B係本發明實驗例2之以受精後第5天之斑馬魚經處理2小時後之結果圖。
圖4A及圖4B係本發明實驗例2之以受精後6小時之斑馬魚經處理3天後之結果圖。
圖5A及圖5B係本發明實驗例3之以銀杏毒素及PTZ誘發斑馬魚癲癇模式之實驗比較結果圖。
Claims (14)
- 一種斑馬魚癲癇模式之建立方法，包括下列步驟：飼養一斑馬魚於一含一誘發化合物之培養基，以誘發斑馬魚產生類癲癇症狀，其中該誘發化合物係如下式(I)所示：
- 如申請專利範圍第1項所述之建立方法，其中該斑馬魚係為一斑馬魚胚胎。
- 如申請專利範圍第1項所述之建立方法，其中R1 係為甲基或乙基，R2 係為羥基、甲基或乙基，且R3 係為C1-6 醚基。
- 如申請專利範圍第1項所述之建立方法，其中R3 係為-C1-3 -O-C1-3 。
- 如申請專利範圍第1項所述之建立方法，其中該誘發化合物係如下式(II)所示：
- 如申請專利範圍第5項所述之建立方法，其中該培養基係為一水溶液。
- 如申請專利範圍第1項所述之建立方法，其中該誘發化合物於該培養基之濃度係為0.05-1.5mM。
- 一種抗癲癇藥物之篩選方法，包括下列步驟：(A)提供一斑馬魚癲癇模式，其中該斑馬魚癲癇模式係由下列步驟所建立：飼養一斑馬魚於一含一誘發化合物之培養基，以誘發斑馬魚產生類癲癇症狀，其中該誘發化合物係如下式(I)所示：
- 如申請專利範圍第8項所述之篩選方法，其中該斑馬魚係為一斑馬魚胚胎。
- 如申請專利範圍第8項所述之篩選方法，其中R1 係為甲基或乙基，R2 係為羥基、甲基或乙基，且R3 係為C1-6 醚基。
- 如申請專利範圍第8項所述之篩選方法，其中R3 係為-C1-3 -O-C1-3 。
- 如申請專利範圍第8項所述之篩選方法，其中該誘發化合物係如下式(II)所示：
- 如申請專利範圍第12項所述之篩選方法，其中該培養基係為一水溶液。
- 如申請專利範圍第8項所述之篩選方法，其中該誘發化合物於該培養基之濃度係為0.05-1.5mM。
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