TWI432189B - 使用油醯基乙醇醯胺來治療癌症 - Google Patents

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Description

使用油醯基乙醇醯胺來治療癌症
本發明是有關於使用油醯基乙醇醯胺(oleoylethanolamide,OEA)來治療癌症。
癌症是現今造成人類死亡的主要原因之一，雖然癌症的形成機轉仍未被完全地瞭解，據信，癌症的發生可歸因於當細胞蓄積外源性或內生性因素而導致基因變異(genetic abnormalities)時，該等細胞內的信號傳遞途徑會發生錯誤而使得細胞週期(cell cycle)失去控制，最後該等細胞會逐漸形成癌細胞。
細胞凋亡(apoptosis)被認為是動物細胞的一種自然調控細胞生長的機轉，其在許多細胞的發育過程(developmental processes)、體內恆定的維持(maintenance of homeostasis)以及受損細胞的清除(elimination of damaged cells)上扮演一個重要角色。因此，當細胞產生變化而使得細胞凋亡機轉失去控制時，該細胞會不正常增生(proliferation)，進而形成癌細胞。
近年來，細胞凋亡以及細胞週期控制(cell cycle control)已成為腫瘤學(oncology)研究的重要方向之一，世界各國的研究人員皆致力於開發會誘發癌細胞進行細胞凋亡以及抑制癌細胞的細胞週期進展(cell cycle progression)的抗癌藥物(anticancer drug)。然而，現今臨床上所使用的抗癌藥物在癌症治療上所達成的效果仍不盡理想，主要的原因包括：患者本身的個體差異、抗癌藥物的嚴重副作用(side effect)以及癌細胞的抗藥性(drug resistance)。因此，本領域的相關研究人員仍致力於開發有用的藥物來供治療癌症。
許多得自於動物或植物來源的活性成分(active ingredient)已被證實具有抗癌的功效，其中較常見的包括：維生素A(vitamin A)、類胡蘿蔔素(carotenoids)[諸如，茄紅素(lycopene)、α-胡蘿蔔素(α-carotene)、β-胡蘿蔔素(β-carotene)、葉黃素(lutein)、玉米黃素(zeaxanthin)、藻褐素(fucoxanthin)、紫黃素(violaxanthin)、蝦紅素(astaxanthin)、八氫茄紅素(phytoene)、六氫茄紅素(phytofluene)、新黃質(neoxanthin)以及β-隱黃素(β-cryptoxanthin)]、ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)[諸如，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)以及二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)]、ω-6多不飽和脂肪酸[諸如，花生油酸(arachidonic acid,AA)]以及共軛次亞麻油酸(conjugated linolenic acid,CLA)等(Dommels Y.E.et al .(2003),Carcinogenesis ,24:385-392;Calviello G.et al .(2004),Carcinogenesis ,25:2303-2310;H. Kohnoet al .(2004),Cancer Sci .,95:481-486;Mauro M.et al .(2005),Anticancer Research ,25:3871-3876;Keren H.et al .(2007),Breast Cancer Res. Treat ,104:221-230;Palozza P.et al .(2008),Carcinogenesis ,29:2153-2161;F. Y. Tanget al .(2009),Journal of Nutritional Biochemistry ,20:426-434;Y. Satomi and H. Nishino(2009),Biochimica et Biophysica Acta ,1790:260-266;Liu C.et al .(2011),Cancer Prev. Res .,4:1255-1266;Xiao-dong S.et al .(2011),Biol. Pharm. Bull .,34:839-844;Virginie P.et al .(2011),Mar. Drugs ,9:819-831;Reynoso-Camacho R.et al .(2011),Nutr. Cancer ,63:39-45)。另有報導指出，茄紅素與二十碳五烯酸(EPA)的組合可有效地以一協同的方式(synergistic way)來抑制人類結腸直腸癌(colorectal cancer) HT-29細胞的生長(F. Y. Tanget al .(2009)，同上述)。得自於動物或植物來源的活性成分在臨床應用上較為安全並且不會產生非所欲的副作用，因而已經成為當今醫藥界關注與研究的重點。
醯基乙醇醯胺(acylethanolamide,AE)[亦被稱為脂肪酸乙醇醯胺(fatty acid ethanolamides,FAE)]是一群廣泛分布於植物與動物體內的脂質信號傳遞分子(lipid signaling molecules)。當細胞受到各種生理(physiological)或病理刺激(pathological stimuli)時，醯基乙醇醯胺會從細胞膜上被釋出，並經由信號傳遞途徑(signaling pathway)來調節各種細胞功能(cellular functions)[包括食物攝取(food intake)、能量平衡(energy balance)以及細胞發炎(cellular inflammation)與增生等]。目前已被發現的醯基乙醇醯胺包括：大麻素(anandamide)[亦即花生油醯基乙醇醯胺(arachidonoylethanolamide,AEA)]、十六醯基乙醇醯胺(palmitoylethanolamide,PEA)以及油醯基乙醇醯胺(oleoylethanolamide,OEA)等。
已知大麻素是大麻受體(cannabinoid receptor,CBR)[一種表現於神經元(neuron)以及免疫細胞(immune cell)的G蛋白-偶合的受體(G protein-coupled receptor)]的內生性配位子(endogenous ligand)，它可藉由活化大麻受體來增加食物攝取。此外，亦有研究報導，大麻素可抑制會表現環加氧酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)的結腸直腸癌細胞(colorectal carcinoma cell)的生長並且誘發非凋亡性細胞死亡(non-apoptotic cell death)，因而可作為一針對會高度表現COX-2的結腸直腸癌細胞或者對於細胞凋亡(apoptosis)具有抗性(resistance)的腫瘤細胞的治療劑(therapeutic agent)(H. A. Patsoset al .(2005),Gut ,54:1741-1750)。
油醯基乙醇醯胺(oleoylethanolamide,OEA)是大麻素的一種單不飽和類似物(monounsaturated analogue)，它具有下列化學式(I)：
與大麻素不同的是，油醯基乙醇醯胺僅具有一個雙鍵(double bond)，並且不會結合至大麻受體上，而是藉由活化過氧化體增生-活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPAR-α)來誘發飽食(satiety)以及抑制增重(weight gain)，同時刺激脂肪利用(fat utilization)[諸如脂肪分解(lipolysis)以及脂肪酸氧化(fatty acid oxidation)]。因此，油醯基乙醇醯胺可供用於治療飲食障礙(eating disorder)以及肥胖(obesity)(Jin Fuet al .(2003),Nature ,425:90-93;Manuel Guzmnet al. (2004),The Journal of Biological Chemistry ,27:27849-27854)。
經研究，申請人意外地發現，油醯基乙醇醯胺除了具有食慾減退(anorexiant)與解脂(lipolytic)的效用之外，還具有誘發癌細胞的細胞週期停滯(cell cycle arrest)以及細胞凋亡的能力。特別地，油醯基乙醇醯胺與茄紅素的組合使用可協同地(synergistically)抑制癌細胞的增生。因此，油醯基乙醇醯胺以及它與其他活性成分(諸如茄紅素)的組合被預期可供用於治療癌症。
 發明概要
於是，本發明提供一種用於抑制一腫瘤/癌細胞的生長的藥學組成物，其包含有油醯基乙醇醯胺。
本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有癌症的個體的方法，其包括對該個體投藥以油醯基乙醇醯胺。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
在開發可用於治療腫瘤/癌細胞的藥物上，申請人發現：油醯基乙醇醯胺(OEA)可以藉由誘發癌細胞的細胞凋亡以及細胞週期停滯來抑制癌細胞的生長。於是，本發明揭示油醯基乙醇醯胺供應用於製備一用來抑制一腫瘤/癌細胞的生長之醫藥品的用途。
特別地，申請人藉由活體外抗癌細胞試驗(in vitro anti-cancer cell test)而證實：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合對於各種癌症(包括結腸直腸癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、口腔癌以及胃腺癌)的細胞株皆具有細胞毒性(cytotoxicity)，並且油醯基乙醇醯胺(OEA)與茄紅素的組合使用可協同地抑制該等癌細胞株的生長，因而展現出優越的抗癌活性。此外，油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合皆會誘發癌細胞進行細胞凋亡的機制，進而促使癌細胞死亡，藉此達到抑制腫瘤/癌細胞生長的效用。因此，油醯基乙醇醯胺以及它與其他活性成分(諸如茄紅素)的組合具有發展成為一抗癌藥物的產業應用潛力。
於是，本發明提供一種用於抑制一腫瘤/癌細胞的生長的藥學組成物，其包含有油醯基乙醇醯胺。
依據本發明，該腫瘤/癌細胞是選自於下列所構成的群組：結腸直腸癌細胞(colorectal cancer cell)、肺腺癌細胞(lung adenocarcinoma cell)、乳癌細胞(breast cancer cell)、肝癌細胞(hepatoma cell)、口腔癌細胞(oral cancer cell)、胃腺癌細胞(stomach adenocarcinoma cell)，以及它們的組合。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一活性成分。較佳地，該活性成分是選自於下列所構成的群組：維生素A、類胡蘿蔔素、ω-3多不飽和脂肪酸[諸如，二十碳五烯酸(EPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)]、ω-6多不飽和脂肪酸[諸如，花生油酸(AA)]、共軛次亞麻油酸，以及它們的組合。
依據本發明，該類胡蘿蔔素是選自於下列所構成的群組：茄紅素、α-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、葉黃素、玉米黃素、藻褐素、紫黃素、蝦紅素、八氫茄紅素、六氫茄紅素、新黃質、β-隱黃素，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該活性成分是茄紅素。
在本發明的藥學組成物的製造上，可以將油醯基乙醇醯胺以及該活性成分混合或分別製成一藥學上可接受的藥物組分，繼而將之包裝成適於投藥的劑型。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、局部地(topically)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)以及類似之物。
依據本發明的藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。
在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於以皮下注射而被投藥的劑型。
在本發明的另一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於口服投藥的劑型。
依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelatihg agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。
依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該溶劑是一含有醇的水性溶液。
本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有癌症的個體的方法，其包括對該個體投藥以油醯基乙醇醯胺。
依據本發明的方法，油醯基乙醇醯胺可進一步組合以一如上所述的活性成分而被投藥給該個體。在本發明的一個較佳具體例中，油醯基乙醇醯胺與該活性成分可被分開地投藥。在本發明的另一個較佳具體例中，油醯基乙醇醯胺與該活性成分可被一起投藥。
依據本發明，油醯基乙醇醯胺之投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是0.3 mg/Kg體重至1.5 mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥或非經腸道地投藥。
 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料： 1.　細胞株的來源與培養：
在下面實施例中所使用的細胞株的種類、來源與寄存編號被顯示於下面表1中，而它們分別是購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)或日本生物資源研究部(Japan Collection of the Research Biosources,JCRB)。
HT-29細胞被培養於含有McCoy’s培養基(McCoy’s medium)(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2 mM麩醯胺酸(glutamine)以及1.5 g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)]的75-cm2 培養瓶(75-cm2 flask)中，而其餘的細胞皆被培養於含有RPMI 1640培養基(Hyclone,Grand Island,NY,USA)(添加有10% FBS、2 mM麩醯胺酸以及1.5 g/L碳酸氫鈉)的75-cm2 培養瓶中。這些細胞皆在培養條件被設定為37℃與5% CO2 的培養箱中進行培養。
之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)來清洗細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)(Sigma,St. Louis,USA)以使細胞自培養瓶的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養瓶中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO2 的培養箱中進行培養。
一般實驗方法： 1.　統計學分析(Statistical Analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，而實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean,SEM)”來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)，繼之以事後檢測(post hoc test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p ＜0.05，這表示有統計顯著性(statistical significance)。
實施例1.　油醯基乙醇醯胺(oleoylethanolamide,OEA)的製備
首先，將1 mL DMF、99.7 mg油酸(oleic acid)以及80 μL三乙胺(triethylamine)混合，接而在室溫下攪拌所形成的混合物歷時2分鐘。之後，將N -乙醇胺(N -ethanolamine)(122 μL,1.0 mmol)以及苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基胺基)-六氟磷酸化磷[Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate,BOP](243.8 mg)溶於CH2 Cl2 (1 mL)中，繼而將之加入至該混合物中並在0℃下進行攪拌歷時30分鐘，然後將之置於室溫下並使其回溫至室溫，接而進行攪拌過夜。之後，所形成的反應混合物於50℃下進行減壓濃縮以移除溶劑，繼而所形成的殘餘物是藉由使用矽膠管柱層析法(n -己烷/EtOAc=1：1)而被純化，而得到有如一無色液體的化合物。
所純化出的化合物是使用一Finnigan TSQ-46C質譜儀來進行高解析電子衝擊質譜(high-resolution electron impact mass spectrometry,HREIMS)分析。而所測得的實驗數據是：關於C20 H39 O2 N[M+1]+ 的HREIMS計算值：326.2971；發現值：326.2974。
依據所測得的質譜數據，該化合物被確認是具有下列化學結構式的油醯基乙醇醯胺(oleoylethanolamide,OEA)：
實施例2.　油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合的 活體外抗癌試驗( in vitro anti-cancer test) 實驗方法： A、製備OEA溶液、茄紅素溶液以及組合溶液(combined solution)：
將茄紅素(lycopene)(Extrasynthese,Genay,France)以及在上面實施例1中所製得的油醯基乙醇醯胺(OEA)分別溶於四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)[含有0.025%二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)作為抗氧化劑(antioxidant)]以及乙醇中，而配製出一濃度為10 mM的茄紅素儲備溶液(stock solution)以及一濃度為400 mM的OEA儲備溶液。
之後，分別取適量的茄紅素儲備溶液以及OEA儲備溶液，繼而分別加入FBS並予以混合均勻歷時30分鐘，然後以無血清(serum free)的細胞培養基、四氫呋喃以及乙醇來調整濃度，藉此而分別配製出具有不同濃度的OEA溶液(亦即，50、100以及200 μM)與茄紅素溶液(亦即，2以及5 μM)，以及組合溶液1(含有200 μM OEA與2 μM茄紅素)與組合溶液2(含有200 μM OEA與5 μM茄紅素)。有關這4種溶液的組成與配方被顯示於下面表2中。
在下面實施例的細胞實驗中，被處理以該等OEA溶液的細胞實驗組被稱之為“OEA組”，而被處理以該等茄紅素溶液的細胞實驗組被稱之為“茄紅素組”，至於被處理以該等組合溶液的細胞實驗組則被稱之為“協同組”。
B、以OEA溶液、茄紅素溶液以及組合溶液來處理各種癌細胞株：
首先，將HT-29細胞、HCT 116細胞、SW-480細胞、A549細胞、MDA-MB-231細胞、HuH-7細胞、CAL 27細胞以及AGS細胞各自分成8組，其中包括1個對照組(control)以及7個實驗組(亦即OEA組1至3、茄紅素組1與2，以及協同組1與2)。將各組細胞分別加入至含有1 mL的細胞培養基(有關各個細胞所使用的培養基是如上面“一般實驗材料”的第1項“細胞株的來源與培養”當中所述者)的24-井培養盤(24-well plate)(5x104 細胞/井)中，接著在培養箱(37℃、5% CO2 )中進行培養歷時24小時。
之後，移除各組的培養基，然後依據下面表3中所示的用量，將在上面第A項中所製得的4種溶液分別添加至各個實驗組中。至於對照組則被添加以等體積的細胞培養基[添加有10%(v/v) FBS、0.05%(v/v)的四氫呋喃以及0.05%(v/v)的乙醇]。
接著，各組細胞在培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時24小時，所得到的細胞培養物被拿來進行下面的細胞可活性分析(cell viability analysis)。
C、細胞可活性分析：
將3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，0.5 mg/mL，200 μL)分別加入至各組的細胞培養物中，然後於培養箱(37℃，5% CO2 )中進行培養歷時2小時。接著，移除各井中的液體，繼而加入200 μL酸性異丙醇(acidic isopropanol)並予以混合均勻，所形成的混合物於570 nm的波長下以一微量滴定盤讀取儀(microplate reader)(Tecan Inc.,Mannedorf,Switzerland)來讀取各井的吸光值(OD570 )。
細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD570 )代入下列公式(1)而被計算出：
公式(1)：A=(B/C)×100
其中：A=細胞可活性百分比(%)
B=各組所測得的OD570 吸光值
C=對照組所測得的OD570 吸光值
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
圖1至圖8分別顯示HT-29細胞、HCT 116細胞、SW-480細胞、A549細胞、MDA-MB-231細胞、HuH-7細胞、CAL 27細胞以及AGS細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比。從圖1至圖8可見，與對照組相較之下，各種癌細胞株的OEA組1至3以及茄紅素組1至2的細胞可活性百分比皆被降低，並且會隨著油醯基乙醇醯胺(OEA)或茄紅素之濃度的增加而更趨於明顯。另外，與OEA組3、茄紅素組1以及2相較之下，協同組1與2的細胞可活性百分比則是顯著地被降低。
這個實驗結果顯示：油醯基乙醇醯胺(OEA)與茄紅素對於各種癌症(包括結腸直腸癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、口腔癌以及胃腺癌)的細胞株皆具有細胞毒性(cytotoxicity)並且具有一正向的劑量-效應關係(positive dose-effect relationship)。此外，OEA與茄紅素的組合使用在抑制該等癌細胞株(特別是結腸直腸癌細胞株SW-480)的存活上具有一協同效應(synergistic effect)。因此，申請人推論：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合具有抑制癌細胞生長的活性而可供用於治療癌症，特別是結腸直腸癌。依據此結果，申請人選用結腸直腸癌細胞來進行下面的實驗。
實施例3.　油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合對於人類結腸直腸癌細胞株HT-29的細胞週期(cell cycle)與增生(proliferation)的影響
為瞭解油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合對於人類結腸直腸癌細胞株HT-29的細胞週期與增生的影響，依照上面實施例2的第B項所得到之經不同溶液處理的HT-29細胞培養物被用來進行下面的實驗。
實驗方法： A、流動式細胞測量術(flow cytometry)：
將上面實施例2的第B項所得到之各組的HT-29細胞培養物以PBS予以清洗2次，繼而以70%(w/v)冰冷的乙醇來固定細胞歷時1小時。接著，將所得到之經固定的細胞以冰冷的PBS予以清洗，繼而以300 g進行離心歷時5分鐘。之後，移除上澄液並分別予以加入1 mL冰冷的DNA染色溶液[配於PBS中，含有200 μg/mL的RNase A溶液以及200 μg/mL的碘化丙錠(propidium iodide,PI)]以散浮細胞，接而在室溫下進行避光作用歷時30分鐘。
之後，所得到之經染色的細胞以BD FACSCantoTM 流式細胞分析儀(BD FACSCantoTM flow cytometer)(BD Biosciendes,Cat. No. 338960)來進行細胞週期分析，每次分析1x104 個細胞的DNA含量。細胞以氬離子的雷射光束488 nm激發而發出螢光。細胞週期圖形(cell cycle profile)是藉由使用BD FACSDiVaTM 軟體(BD FACSDiVaTM software)(Becton Dickinson,Cat. No. 643629)而從DNA含量直方圖(DNA content histograms)中被分析。當細胞處於細胞凋亡(apoptosis)時，該等細胞內所含有的DNA會被內切酶(endonuclease)所分解，因而出現Sub-G1波峰(Sub-G1 peak)。處於Sub-G1期(Sub-G1 phase)的細胞的百分比是藉由使用ModFit LT軟體來進行分析。
最後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
B、與細胞週期進展(cell cycle progression)有關聯的蛋白質的表現情形：
為了測定HT-29細胞的蛋白質表現量，本實驗所使用之經不同溶液處理的HT-29細胞培養物大體上是參照上面實施例2的「B、以OEA溶液、茄紅素溶液以及組合溶液來處理各種癌細胞株」而被製得，不同之處在於：各組細胞是被培養於一直徑為10 cm的培養皿中，而各個實驗組是依據表3所示來添加不同的溶液，並且用量皆為10 mL。
之後，將對照組、OEA組3、茄紅素組1與2以及協同組1與2的HT-29細胞培養物以PBS清洗2次，接著加入75 μL的溶解緩衝液(lysis buffer)[含有PBS、1% Ipegal CA-630(Sigma,St. Louis,MO)、0.5%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、0.1% SDS、100 μM苯甲基磺醯氯(phenylmethylsulfonyl fluoride)、20 μg/mL抑肽酶(aprotinin)、1 mM PMSF以及3 μM釩酸鈉(sodium orthovanadate)]，並予以混合均勻。所形成的細胞混合物是依據製造商的操作指南並且使用NE-核質萃取試劑(NE-Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents)(Thermo Scientific,Cat. No. 78833)來進行核蛋白質(nuclear protein)的萃取，藉此而得到一核蛋白質樣品。
之後，該核蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析，以及細胞週期蛋白D1(cyclin D1)、p-NF-κB p65的西方墨點分析(Western Blotting)，同時選用核纖層蛋白A/C(Lamin A/C)作為內部對照組(internal control)，而所使用的儀器與試劑分別如下所述：
(1)　SDS-PAGE分析是使用垂直電泳槽(BioRAD Mini-3 Cell)來進行。
(2)　蛋白質轉印(protein transfer)是使用轉漬電泳槽(BioRAD Mini Trans-Cell)以及硝基纖維素膜(nitrocellulose membrane)來進行。
(3)　在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表4中。
(4)　化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用WesternPlus-ECL(Perkin Elmer,Cat. No. NEL105)來進行，並使用一Fujifilm LAS-4000(Fujifilm Life Science,USA)來偵測訊號。
結果： A、流動式細胞測量術：
圖9顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得之處於Sub-G1期的細胞的百分比。從圖9可見，油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素皆會促使HT-29細胞是處於Sub-G1期，並且會隨著油醯基乙醇醯胺(OEA)或茄紅素之濃度的增加而更趨於明顯。特別地，相較於油醯基乙醇醯胺(OEA)或茄紅素的單獨使用，油醯基乙醇醯胺(OEA)與茄紅素的組合使用會促使更多的HT-29細胞是處於Sub-G1期。
這個實驗結果顯示：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合皆會引起HT-29細胞的細胞週期停滯(cell cycle arrest)並且具有一正向的劑量-效應關係。
B、與細胞週期進展有關聯的蛋白質的表現情形：
圖10是一西方墨點分析圖，其顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞週期蛋白D1以及p-NF-κB p65的表現情形。從圖10可見，與對照組相較之下，OEA組3以及茄紅素組1與2的HT-29細胞的細胞週期蛋白D1與p-NF-κB p65的表現量皆被降低。另外，與OEA組3、茄紅素組1以及2相較之下，協同組1與2的HT-29細胞的細胞週期蛋白D1與p-NF-κB p65的表現量亦顯著地被降低。
這個實驗結果顯示：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合皆會降低結腸直腸癌細胞株HT-29的細胞週期蛋白D1與p-NF-κB p65的表現量。申請人據此而推論：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合能夠藉由調控癌細胞內與細胞週期進展有關聯的蛋白質之表現來促使癌細胞的細胞週期停滯，進而達到抑制癌細胞增生的效用。
實施例4.　油醯基乙醇醯胺以及它與茄紅素的組合對於人類結腸直腸癌細胞株HT-29的細胞凋亡(apoptosis)的影響
為了進一步探討油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合在誘發人類結腸直腸癌細胞株HT-29進行細胞凋亡上的效用，依照上面實施例2的第B項所得到之對照組、OEA組3、茄紅素組1與2以及協同組1與2的HT-29細胞培養物被用來進行下面的實驗。
實驗方法：
首先，收取各組的細胞培養物並以冰冷的PBS予以清洗2次，繼而在300 g下予以離心歷時5分鐘。之後，移除上澄液並分別予以加入1X膜聯蛋白V結合緩衝液(Annexin V Binding Buffer)(BD PharmingenTM )以充分散浮細胞沉澱物(cell pellet)，藉此而得到一細胞濃度為1x105 細胞/mL的細胞懸浮液。然後，對所得到的細胞懸浮液分別加入5 μL FITC膜聯蛋白V(FITC Annexin V)(BD PharmingenTM )以及5 μL的碘化丙錠(PI)染色溶液[Propidium Iodide(PI) Staining Solution](BD PharmingenTM )並予以混合均勻，繼而在室溫下進行避光作用歷時15分鐘。
之後，所得到之經染色的細胞以BD FACSAriaTM 流式細胞分析儀來進行分析，其中有被FITC膜聯蛋白V以及PI染色[亦即FITC膜聯蛋白V陽性(FITC Annexin V positive)以及PI陽性(PI positive)]的細胞即表示被誘發細胞凋亡並且已經死亡的細胞，而無法被FITC膜聯蛋白V以及PI染色[亦即FITC膜聯蛋白V陰性(FITC Annexin V negative)以及PI陰性(PI negative)]的細胞則表示活細胞(viable cell)。有關被FITC膜聯蛋白V以及PI染色的細胞數目是藉由使用BD FACSDiVaTM 軟體而被計算出。
各組的細胞死亡百分比(cell death percentage)(%)是藉由將所測得的細胞數目代入下列公式(2)而被計算出：
公式(2)：D=(E/F)×100
其中：D=細胞死亡百分比(%)
E=被FITC膜聯蛋白V以及PI染色的細胞數目
F=全部細胞
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
圖11顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞死亡百分比。從圖11可見，與對照組相較之下，OEA組3以及茄紅素組2的細胞死亡百分比皆被增高。另外，與OEA組3或茄紅素組2相較之下，協同組1與2的細胞死亡百分比則是顯著地被增高。
這個實驗結果顯示：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合皆會誘發HT-29細胞進行細胞凋亡的機制，進而促使癌細胞死亡並抑制癌細胞的生長。特別地，油醯基乙醇醯胺(OEA)與茄紅素的組合使用在誘發HT-29細胞進行細胞凋亡上具有協同效應並表現出明顯優越的抗癌活性。因此，申請人認為：油醯基乙醇醯胺(OEA)以及它與茄紅素的組合具有發展成為一抗癌藥物的高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
圖1顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖2顯示HCT 116細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖3顯示SW-480細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖4顯示A549細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖5顯示MDA-MB-231細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖6顯示HuH-7細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖7顯示CAL 27細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖8顯示AGS細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞可活性百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖9顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得之處於Sub-G1期的細胞的百分比，其中“＊”表示p ＜0.05；
圖10是一西方墨點分析圖，其顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞週期蛋白D1以及p-NF-κB p65的表現情形；以及
圖11顯示HT-29細胞在分別被處理以不同濃度的油醯基乙醇醯胺(OEA)以及茄紅素後所測得的細胞死亡百分比，其中“＊”表示p ＜0.05。

Claims (7)

  1. 油醯基乙醇醯胺供應用於製備一用來抑制一腫瘤/癌細胞的生長之醫藥品的用途。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該腫瘤/癌細胞是選自於下列所構成的群組：結腸直腸癌細胞、肺腺癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、口腔癌細胞、胃腺癌細胞，以及它們的組合。
  3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品進一步包含有一活性成分。
  4. 如申請專利範圍第3項的用途，其中該活性成分是選自於下列所構成的群組：維生素A、類胡蘿蔔素、ω-3多不飽和脂肪酸、ω-6多不飽和脂肪酸、共軛次亞麻油酸，以及它們的組合。
  5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中該類胡蘿蔔素是選自於下列所構成的群組：茄紅素、α-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、葉黃素、玉米黃素、藻褐素、紫黃素、蝦紅素、八氫茄紅素、六氫茄紅素、新黃質、β-隱黃素，以及它們的組合。
  6. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
  7. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
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