JP6038841B2 - 腫瘍性疾患の治療のためのドコサヘキサエン酸グリセリドの使用 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、腫瘍性疾患の治療のための薬物を製造するための、ドコサヘキサエン酸が濃縮された油の使用に関する。

背景
魚類中や、それらから得られる油中に存在する、オメガ−３脂肪酸、特に長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、例えば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、発癌を抑制し、潜在的な抗腫瘍活性を示すことが、動物での研究やin vitroでの研究からの様々な証拠により示されている（１）。ヒト腫瘍株でのin vitro研究からは、オメガ−３ＰＵＦＡ、主にＤＨＡは、種々のタイプの腫瘍性細胞（乳房、腸、膵臓、ならびに慢性骨髄性白血病および黒色腫におけるものなど）の増殖を減少させることが確認されている（２）。それにもかかわらず、オメガ−３脂肪酸取込みのマーカーとしての魚の消費量と癌の危険性との関連性についての疫学データは、むしろ一貫性が低く（３）、それは、ＤＨＡおよびＥＰＡの経口摂取は、齧歯類において腫瘍（乳腺、結腸、前立腺、肝臓、および膵臓の腫瘍など）の増殖を減少させるということを確立することが可能であることを証明しただけであった。

さらに、様々な研究によって、オメガ−３ＰＵＦＡは腫瘍性細胞の増殖を選択的に抑制し、正常細胞に対する毒性が低いことが示されている（４）。このようなオメガ−３ＰＵＦＡの感受性の違いは、脂肪酸の取込みの違いで簡単に説明することはできない。オメガ−３脂肪酸が発癌プロセスを変更する可能性がある様々な機構、特に以下が提示されている（１）：アラキドン酸（ＡＲＡ）に由来するエイコサノイドの生合成の抑制；転写因子の活性の変更、遺伝子発現および細胞内マーキングの調節；エストロゲン代謝の変更；フリーラジカルおよび活性酸素種の発生の変更、ならびに膜流動性の修飾。

ＡＲＡ由来のエイコサノイドは腫瘍成長と関係がある（５）。オメガ−３脂肪酸がＡＲＡ由来のエイコサノイドの生合成を減少させ得る様々な機構が存在する（１）。第１に、オメガ−３脂肪酸は、膜のリン脂質に取り込まれ、そこで、オメガ−６脂肪酸と部分的に置換される。第２に、オメガ−３ＰＵＦＡは、デサチュラーゼおよびエロンガーゼの基質としてオメガ−６ＰＵＦＡと競合する。このオメガ−３ＰＵＦＡは前記酵素に対してより高い親和性を有している。最後に、オメガ−３脂肪酸は、シクロオキシゲナーゼ−２を転写レベルで阻害し、エイコサノイドの形成においてシクロオキシゲナーゼの基質としてオメガ−６脂肪酸と競合する。

さらに、オメガ−３ＰＵＦＡおよびそれらの代謝産物は、様々な遺伝子の発現または増殖、分化、細胞アポトーシス、脈管形成、および転移の制御に関連するシグナル伝達分子の活性に影響を及ぼすことによりそれらの抗腫瘍効果を一部働かせることができる（１）。ペルオキシソーム増殖活性化受容体、核転写因子κＢ、ｒａｓ癌遺伝子、プロテインキナーゼＣ、コエンザイムＡ−３−ヒドロキシル−３−メチルグルタリルレダクターゼ、シクロオキシゲナーゼ−２、リポキシゲナーゼ、および一酸化窒素シンターゼの活性化受容体が最も重要である。ＤＨＡを用いた結腸癌細胞の治療では、細胞膜の特性を変更し、その転移能力を低下させることが証明されている。

フリーラジカルおよび活性酸素種の発生は、アポトーシスの開始や形質転換細胞に対する自然防御に関係しているようにと思われる（１）。そのため、腫瘍細胞の増殖に対する長鎖オメガ−３ＰＵＦＡの抑制効果は、細胞増殖の停止やアポトーシスプロセスの発現をもたらす酸化産物の形成によりある程度は説明される。腫瘍細胞は、正常細胞と比べて、抗酸化防御系が欠損しているため、酸化損傷を受けやすいということが示唆されている。ＰＵＦＡは、細胞膜に損傷を与えることによろうと、細胞組成または細胞骨格の構築を変更することによろうと、膜輸送系またはそれらの酵素の活性を変更することによろうと、ポリメラーゼの反応を阻害することによろうと、脂質過酸化反応における主要な細胞内基質である。そのため、腫瘍のＤＨＡ濃縮細胞は酸化的損傷を受けやすいと考えることが妥当である。

オメガ−３脂肪酸は細胞周期に対する効果を有するということのいくらかの証拠がある。ＤＨＡを用いたin vitro 治療では、乳房および黒色腫の腫瘍性細胞の細胞周期の間Ｇ１／Ｓ期またはＧ２／Ｍ期における中止に導く。in vivoでは、乳房腫瘍株が移植されたラットへのオメガ−３高含有魚油の投与は、腫瘍性細胞のＤＮＡの複製を延期し、それにより合成期中進行を遅らせることができる。

それにもかかわらず、前臨床試験では、オメガ−３ＰＵＦＡはいくつかの抗腫瘍形成薬の細胞毒性および放射線療法の抗発癌作用を増大し得ることが示された（７，８）。これらの作用は、脂肪酸の腫瘍細胞膜への取込みにより媒介され、そのようなことにより物理的および機能的特性が変更される可能性がある。

もう一方で、得られる治療効力は、脂肪酸のバイオアベイラビリティ（この脂肪酸は次には、その脂肪酸が一部を構成する化学構造に関連する）、用いられるオメガ−３ＰＵＦＡのタイプ（ＡＬＡ、ＥＰＡ、またはＤＨＡ）、およびＰＵＦＡと標的細胞との相互作用有用性などのいくつかの因子によって決まる。

エチルエステル形態、遊離脂肪酸形態、およびトリグリセリド形態の３つの濃縮オメガ−３ＰＵＦＡのバイオアベイラビリティを経口投与後に比較した研究から得られたデータからは、再エステル化トリグリセリドは他の２つの調製物よりも高いバイオアベイラビリティを示すことが分かった（９）。

また、発癌の多臓器モデルでは、単剤療法による治療においてＤＨＡは最も効果的な抗腫瘍防御を提供するオメガ−３ＰＵＦＡであり、ＥＰＡのものを上回ることも示された（１，４）。この結果はまた、ＥＰＡ＋ＤＨＡ併用抗腫瘍治療においても確認され、その際、ＥＰＡの存在がＤＨＡの効力を減少させることが観察された。

最後に、その系の効力が左右される１つの重要な態様は投与経路である。例えば、腫瘍内投与は神経膠腫の治療に好ましい経路である（１０）。これに関して、腫瘍性細胞に容易に取り込まれるように、ＰＵＦＡが患者に投与されることが必要である。例えば、肝細胞腫の治療に適した非経口投与の場合（１１）、ＰＵＦＡとそれらの腫瘍細胞毒性を抑制する血清アルブミンとの結合を制限するというさらなる目的で、エマルションなどの輸送系を有することが必要である。リンパ腫の治療に適した経口投与の場合（１２）、処理および腸管吸収後、ＰＵＦＡは標的組織に輸送され、トリグリセリド形態でキロミクロンに取り込まれる。

発明の説明
本発明は、ＤＨＡグリセリドの含量が多い、特に含量が５０重量％を上回る油は、同じ濃度の任意の他の化学形態のＤＨＡよりも高い抗腫瘍効力を示すという予期せぬ発見に関する。

よって、本発明の１つの目的は、腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物を製造するための、ＤＨＡグリセリド形態のドコサヘキサエン酸（以下「ＤＨＡ」とも呼ぶ）が濃縮された油の使用であって、該油は該医薬組成物の総重量に対して７０重量％までの濃度で濃縮されており、かつ該ＤＨＡグリセリドは該油中の脂肪酸の全アシル基に対して少なくとも５０重量％の割合である、該油の使用である。

本発明において、表現「ドコサヘキサエン酸が濃縮された油」とは、脂肪酸のアシル基含量に対して５０〜１００重量％のドコサヘキサエノイル基を含有する天然または合成グリセロール誘導体を意味する。

本発明において、「ドコサヘキサエン酸グリセリド」は、該グリセリド中の脂肪酸の全アシル基に対して少なくとも５０重量％のドコサヘキサエン酸を含むグリセロールを意味すると解釈される。

本発明において、表現「７０重量％までの前記濃縮油」とは、医薬組成物の総重量の７０％がＤＨＡ濃縮油に相当するということを意味する。

本発明において、表現「脂肪酸の全アシル基に対して少なくとも５０％」とは、ＤＨＡが前記濃縮油の脂肪酸の全アシル基の少なくとも５０重量％に相当するということを意味する。

驚くべきことに、本発明の発明者らは、少なくとも５０％の量のＤＨＡを用いることで、前記ＤＨＡの抗腫瘍効果が２倍あるいは５倍になり、それにより、副作用なく、高特異的な腫瘍細胞毒性が得られるということを見出した。

好ましい実施形態では、前記医薬組成物はエマルション形態である。

実際には、ＤＨＡグリセリドが濃縮された油を含有する医薬組成物が、上記のように、エマルション形態で患者に投与されると、（以下に含まれる実施例から明らかであるように）１０倍大きいオーダーの腫瘍性細胞毒性が得られるということが分かった。

エマルションは、当業者に周知の方法を用いて、非経口投与などのその投与に対して十分な物理的および化学安定性を有する無発熱および無菌条件で調製することができる。

もう１つの好ましい実施形態では、マイクロエマルションの平均径は２００ｎｍ未満である。

有利には、この平均径は、非経口使用を可能にし、それにより経口投与により得られるものよりも多い、有効量のＤＨＡが投与され、その結果、前記酸のバイオアベイラビリティが増大する。これは腸管吸収に伴う損失が避けられたためである。さらに、非経口経路によれば高濃度のＤＨＡを投与することができる。

上記の総てから、本発明の好ましい実施形態では、エマルション形態の前記医薬組成物は非経口経路により投与される。投与される用量は、治療すべき病状の種類および重篤度によって決まり、食事制限（食品との相互作用）はない。

本発明のエマルションはまた、経口的に、舌下に、静脈内に、筋肉内に、局所的に、皮下に、直腸に、あるいは本発明のエマルションの有効成分を液体または蒸気形態で、気道の入り口に位置する嗅覚器と接触させるだけで投与することができる。よって、投与は、エマルションのスプレー、ネブライザー、もしくはアトマイザーでの噴霧により、または吸入により行うことができる。

もう１つの好ましい実施形態では、前記医薬組成物は筋肉内注射により投与される。

もう１つの好ましい実施形態では、前記ＤＨＡ濃縮油はまた、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡとも呼ぶ）を、前記油中の脂肪酸の全アシル基に対して３０％までの重量百分率で含む。

好ましい実施形態では、ＤＨＡ濃縮油の濃度は、医薬組成物の総重量に対して１０〜７０％の範囲、好ましくは１０〜３０％の範囲である。

もう１つの好ましい実施形態では、前記濃縮油の脂肪酸のアシル基の総重量に対するＤＨＡの重量百分率は５０〜１００％の間、好ましくは７０〜９０％の間、より好ましくはＤＨＡの前記重量百分率は７０％である。

本発明の発明者らはさらに、本発明の医薬組成物が投与される場合、前記組成物は抗腫瘍形成薬の代謝経路に共通した経路で代謝されないため、患者に投与されている抗腫瘍形成処方の成分とは相互作用しないということを見出した。

そのため、本発明のもう１つの好ましい実施形態では、前記組成物は、少なくとも１種の抗腫瘍形成薬と併用して投与される

本発明において、「抗腫瘍形成薬」は、腫瘍または癌起源の病状の治療のために設計された有効成分または薬物を意味すると解釈される。

有利には、本発明のＤＨＡ濃縮油の抗腫瘍形成薬との共同投与は、前記治療の抗腫瘍活性を高め、次には抗腫瘍治療の副作用を抑制するということが観察された。

続いて、本発明の非限定的な例示としていくつかの実施例を示す

実施例１：本発明の医薬組成物の処方物
本発明は、ヒトへの投与のためのマイクロエマルション形態の安定した非洗剤組成物であって、
・１〜７０重量％間の、有効成分としてのＤＨＡを、脂肪酸のそのアシル基の少なくとも５０％において含有するグリセリド(Proyecto Empresarial Brudy)；
・１〜１．５重量％間のダイズリン脂質(Lipoid E80, Lipoid)；
・２．２５重量％のグリセロール(Sigma & Aldrich)；および
・１００％までの水ＵＳＰ(ADESCO)
を含む組成物に関する。

初期エマルションを高圧下で繰り返しホモジナイズして適当なサイズにし、そのｐＨを水酸化ナトリウム(Sigma & Aldrich)で生理値（６．５〜７の間）に調整する。一度最終容量に調整したら、そのマイクロエマルションをその最終的なガラス容器中に濾過滅菌する（０．２２μｍ, Millipore）。

実施例２：異なる腫瘍モデルにおけるＤＨＡ調製物の評価
この研究では、実験的腫瘍モデルとして、ＫＧ−１ａ細胞（急性骨髄性白血病由来、これらの細胞はさらにＭＤＲ＋である，ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４６．１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（急性型Ｔリンパ腫由来，ＴＩＢ−１５２）、ＨｅＬａおよびＫＢ３．１細胞（ヒト上皮癌由来，ＣＣＬ−２）、ＨＴ−２９細胞（ヒト結腸腫瘍由来，ＨＴＢ−３８）、４３５細胞（ヒト乳房腫瘍由来，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽腫由来，ＣＲＬ−２２６６）、ならびにＮＰ−１８細胞（ヒト膵臓腫瘍由来）を用いた。用いた非腫瘍モデルは、包皮細胞（未分化表皮繊維芽細胞，ＣＲＬ−１６３５）およびＲＥＰＴＣ細胞（腎近位尿細管細胞，ＤＰＫ−ＫＴＥＣ−Ｈ）であった。Merck Pharm and Chemistry Bioresearch Laboratoryにより譲渡されたＮＰ−１８細胞およびDominion Pharmakineから購入したＲＥＰＴＣを除く、総ての細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手した。これらの細胞培養物を好適な増殖条件下で維持した：この目的のための特別なインキュベーター内で温度（３７℃）、ＣＯ_２濃度（５％）、および湿度（９５％）。これらの細胞は培養瓶で増殖を続けたが、試験を行うために９６−ウェルプレートに移した。研究は、常に、脂肪酸組成物中に様々な割合（２０％、５０％、または７０％）のＤＨＡを含有する魚油由来の、グリセリド（ＴＧ）、エチルエステル（ＥＥ）に組み込まれた、または遊離脂肪酸（ＦＡ）としてのＤＨＡを用いて行われた。

細胞生存性研究は、異なるサンプルの細胞毒性を評価するために行われた。この方法は、水性媒質に溶解するＭＴＴ試薬（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム），Sigma & Aldrich)をインキュベーション培地に添加することで構成される。生存細胞はこの化合物を代謝し、この化合物はホルマザン塩に変換される。この塩は水性媒質には溶解しないが、ＤＭＳＯには溶解する発色化合物であり、細胞生存性の１つの指標として用いることができる。この方法は、７．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液をウェル当たり２０μｌ（過度に）添加することで構成される。生存細胞はこの化合物を代謝し、ホルマザン塩を生成し、一方、非生存細胞は代謝しないように、それを３７℃で１時間インキュベートする。１時間のインキュベーション後、それらの細胞を沈殿させ、１００μｌのＤＭＳＯ(Sigma & Aldrich)を添加し、そのＤＭＳＯにホルマザン塩を溶解する。最後に、プレートリーダーで５５０ｎｍでの吸光度を測定する。
生存性の結果は、対照に対しての光学濃度の割合として表され、対照が１００％生存性を有すると考える。細胞生存曲線は、９６−ウェルプレートにおいて、ウェル当たり適当な量の培地２００μｌにウェル当たり約２０，０００細胞（それらの増殖比に照らして細胞の正確な数を分析した後）を播種することにより作成した。それらの細胞を製品に、細胞増殖／生存性を対照に対して５０％まで低下させるのに必要な有効成分の濃度として定義されるＩＣ_５０値を決定するのに十分に広く間隔をあけた濃度において７２時間曝露した後、製品有効性研究を行った。

試験結果を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ８．０ソフトウェアを用いてＨｉｌｌ方程式に合わせて、培養物の生存性を対照に対して５０％まで低下させるのに必要なＤＨＡの濃度として定義されるＩＣ_５０を決定した。

結果
ＤＨＡの抗腫瘍薬としての作用を決定するために研究されるべき第１の態様は、その細胞毒性の特異性である。これに関連して、本発明者らは、正常細胞と同じような代謝を有する非不死化細胞の細胞増殖／生存性に対するＤＨＡの効果を研究した。用いたモデルは、ほとんど分化していない包皮細胞およびヒト腎近位尿細管細胞（ＲＰＴＥＣ）であり、得られた結果を表１に示す。

研究したＤＨＡの異なる変形構造（トリグリセリド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＡ）、およびエチルエステル（ＥＥ））で観察されるように、トリグリセリドは、正常細胞の両モデルにおいてより低い細胞毒性を示すものである。しかし、腫瘍モデル（ＨｅＬａ細胞）では、種々の変形ＤＨＡはこれらの同じ条件下で、極めて大きな毒性を示し、どの場合もＩＣ_５０は１００μＭ未満であった。細胞毒性能力は、同じＤＨＡ含量（７０％）でＴＧ＞ＦＡ＝ＥＥの順である。

また、前記酸の割合を減少させることにより細胞毒性能力が低下する（ＴＧ−７０、ＴＧ−５０、およびＴＧ−２０の結果を比較する）ことから、製品の細胞毒性はＤＨＡの存在下で存在するということも分かり、また、ＤＨＡ濃度７０％で最適な治療効果が得られるが、治療的進展を得るのに必要な閾値濃度はＤＨＡ中少なくとも５０％の含量と推定される。

表１．正常細胞株および腫瘍性細胞株におけるＤＨＡの毒性に対する化学構造および濃度の効果

研究された第２の態様は、抗腫瘍薬としてのＤＨＡの適用性範囲であり、また、その化学構造およびそれが向けられる病理過程の性質を変数と見なし、ＤＨＡ含量は７０％に維持した。得られた結果を表２に示す。

表２．異なる病理学的起源の細胞株におけるＤＨＡの細胞毒性に対する化学構造の効果

最も注目すべき特徴は細胞毒性の保持であり、その細胞毒性は用いた全てのモデルにおいてそれらの起源と相互依存的にＴＧ＞ＦＡ＞ＥＥの順に従う。得られた結果から、本発明者らは、第１に、血液学的性質の腫瘍プロセス（ＪｕｒｋａｔおよびＫＧ−１ａ）では、固形腫瘍（その他）に比べてＤＨＡに対する感受性がより高い（５〜８倍高い）ことを強調してよい。規則の例外として、膵臓腫瘍由来の細胞（ＮＰ１８）においてより高い感受性が観察される。

これらの結果に基づいて、腫瘍性細胞毒性と正常細胞に対する無毒性との最適関係を維持するものであることから、有効成分として、ＤＨＡの割合が脂肪酸の全アシル基の７０％以上であるトリグリセリドを用いることに決めた。

これらを考慮し、前節に記載のとおり、油の割合が１０重量％であり、かつ様々な割合のＤＨＡを含有するエマルションを調製し、その細胞毒性の特異性についての遊離ＤＨＡのトリグリセリドとの比較研究を行った。対照として、ＤＨＡマイクロエマルションと同じ条件下で調製したオレイン酸のマイクロエマルションを用いて、得られた結果を表３に示す。

遊離トリグリセリドについて記載されている性質と同じような性質が観察された。マイクロエマルションの細胞毒性は、正常株（包皮細胞）よりも腫瘍株（ＨｅＬａ細胞）において非常に高く、グリセリド中のＤＨＡの濃度に直接依存する。さらに、オレイン酸トリグリセリドを用いて調製された同じ特徴を有するエマルションは全く無毒であることから、観察された毒性は、輸送系（エマルション）ではなく、ＤＨＡのみに起因する。

ＤＨＡマイクロエマルションの種々の腫瘍株に対する細胞毒性効力も解析した。この場合も対照として、ＤＨＡマイクロエマルションと同じ条件下で調製したオレイン酸のマイクロエマルションを用いて、得られた結果を表４に示す。

得られた結果から、ＤＨＡのエマルションは、それらの抗腫瘍活性においては遊離グリセリドに組み込まれたＤＨＡと少なくとも同じくらい有効であることが確認される。固形腫瘍由来の細胞または上皮起源の細胞では、その効力は１．５〜３倍高い。オレイン酸トリグリセリドを用いて調製された同じ特徴を有するエマルションは全く無毒であることから、輸送系（エマルション）の無毒性もまた確認される。

表３．正常細胞株および腫瘍性細胞株における遊離形態のグリセリド、またはマイクロエマルションに含められたグリセリドの比較細胞毒性に対するＤＨＡ含量の効果

表４．様々な病理学的起源の細胞株における遊離形態またはマイクロエマルション中のＤＨＡグリセリドの比較細胞毒性研究

参考文献

Claims (10)

1. 腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物であって、トリグリセリド形態のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が濃縮された油を含んでなり、該トリグリセリド形態のドコサヘキサエン酸が該油中の脂肪酸の全アシル基に対して少なくとも５０重量％の割合で油中に含まれる、医薬組成物。
2. 前記医薬組成物がエマルション形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記濃縮油が、エイコサペンタエン酸を、前記油の脂肪酸の全アシル基に対して３０重量％までの割合で含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記トリグリセリド形態のドコサヘキサエン酸が前記油中の脂肪酸の全アシル基に対して７０重量％〜９０重量％の割合で油中に含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記トリグリセリド形態のドコサヘキサエン酸が前記油中の脂肪酸の全アシル基に対して７０重量％の割合で油中に含まれる、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記エマルションの平均径が２００ｎｍ未満である、請求項２に記載の医薬組成物。
7. 前記医薬組成物が非経口経路により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記医薬組成物が腫瘍内注射により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 前記医薬組成物が、少なくとも１種の抗腫瘍形成薬を併用して受けている患者に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 治療すべき腫瘍性疾患が、肺、前立腺、腸、乳房、膵臓、脳、中枢および末梢神経系の癌、黒色腫を含む群のうちの１つである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。