KR101665253B1

KR101665253B1 - 도코사헥사에노산 및 트리아신 씨를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101665253B1
Application number: KR1020150087391A
Authority: KR
Inventors: 김태희; 정수호; 이해혁
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-10-25

Abstract

본 발명은 DHA 및 triacsin C를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 연구 결과, DHA나 triacsin C 단독처리는 RL95-2 세포에 뚜렷한 세포사멸 유도효과가 관찰되지 않았으나, DHA와 triacsin C를 병용 처리하였을 경우에는 유의한 수준의 자연세포사를 유발하였다. 더욱이, DHA와 tracsin C 병용처리가 유도하는 자연세포사는 caspase-8/tBID, caspases 9, -3, -7의 활성화에 의해 발생하는 것을 보였다. 본 연구로 인하여, DHA와 triacsin C의 병용처리에 의한 암세포 자살유도 증강효과가 밝혀졌고, 이와 같은 연구는 대부분의 임상 및 전임상 연구에서 아직까지 제시된 바가 없다. 향후 DHA 처리와 관련하여 ACS 발현의 제거 등을 통한 자연세포사 유발과 관련된 기전이 밝혀지게 되면 새로운 자궁내막암 치료전략 개발에 도움을 줄 것이라 생각된다.

Description

도코사헥사에노산 및 트리아신 씨를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물{Composition for Treating and Prevention of endometrial cancer Including docosahexaenoic acid and triacsin C}

본 발명은 DHA 및 triacsin C를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

자궁내막암은 가장 흔한 여성 생식기계에서 일반적인 부인과적 악성종양이며, 현재 전체 여성 암 중 13%를 나타낸다(1, 2). 미국 암 학회는 2010년에 자궁내막암에서 43,470 새로운 케이스와 7,950 사망을 추정하였다(3). 진행성 및 재발성 자궁내막암에 대한 대부분의 현재 치료방법은 아직 비효과적인 상태라 생각되어 지고 있다.

n-3 다중불포화지방산(오메가 지방산, dietary n-3 polyunsaturated fatty acids, PUFAs)은 자궁내막암의 성장을 방해할 수 있으며, 이는 in vitro 및 in vivo 모두에서 호르몬에 민감한 종양으로서 확인되어왔다(4).

역학조사 결과에 의하면, 자궁내막암 발병 빈도와 도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid, DHA, 22:6n-3))과 ecosapentaenoic acid(EPA, 20:5n-3)를 포함하는 PUFAs가 풍부한 음식의 섭취율 간에 역전관계가 있다고 보고된 바 있다(5, 6). DHA 보충은 많은 암의 종류에서 암 세포 증식과 종양의 진전과 음의 상관관계가 있음이 보고되어 왔다. DHA가 이러한 증식을 선택적으로 저해하는 반면, 중요하게도, 일반 세포에 대해서는 거의 현저하게 독성이 없다(7, 8).

DHA는 미토콘드리아 관련 기작에 의해 영향을 받을 뿐만 아니라, 멤브레인에서 조절되는 과정에 의한 세포자살을 유도한다는 사실이 제안되어왔다(9). 많은 연구들은 미토콘드리아 멤브레인과 DHA 통합이 콜로노사이트(colonocytes)와 HT-29 인간 콜론 종양 세포라인에서 생성된 활성산소종(ROS) 위험에 대한 민감도를 증가시키는 것을 증명해왔다(10, 11). 특이적으로, 카이디올리핀(cardiolipin, 미토콘드리아 내부 멤브레인 인지질)과 DHA 결합은 산화적 스트레스 유도와 미토콘드리아 멤브레인 포텐셜과 세포자살 신호경로와 관련된 미토콘드리아 인터멤브레인 스페이스로부터 사이토크롬 c의 방출을 개시하는 미토콘드리아-의존적 세포자살 경로에 기여한다(12).

축적된 많은 증거들이 많은 세포 타입에서 종양의 진전에 대한 DHA 세포독성와 세포자살 효과를 증명하고 있음에도 불구하고, 인간의 자궁내막증 암 세포에서 DHA 유도 세포자살의 생화학적 기작은 조사된 바 없었다. 일반적인 상황에서, 긴 체인의 지방산은 아실-코엔자임 합성효소(ACSs)에 의해 처리된다. ACSs는 롱 체인 지방산을 아실-코A(acyl-coA)로의 변환에 의한 포유류 지방산 메타볼리즘의 초기 단계를 촉매하며, 세포 신호 전달과정을 조정하면서, 지방산 β-산화에 대한 활성화된 지방산에 대한 활성화된 지방 중개매개체로서 주로 역할을 한다(15, 16).

triacsin C에 대한 연구들은 ACS 저해가 인간의 림프모구양(lymphoblastoid, 17), 글리오마(15) 및 간세포암종세포(hepatocellular carcinoma cells, 19)에서 미토콘드리아에 의해 중개되는 경로를 통해 세포사멸을 야기하는 것을 나타내고 있다. 이러한 발견에 기초하여, RL95-2 자궁내막암에서 triacsin C에 의한 ACS의 저해는 아마도 DHA에 의해 세포독성 유도된 세포 자살에 기여하면서, DHA 메타볼리즘을 저해할 것으로 추측된다.

본 발명에서, triacsin C을 채용함으로 인한 세포사멸의 정도는 DHA 노출 후 세포사멸의 증가와 직접적으로 관련이 있으며, triacsin C와 DHA의 시너지 효과는 미토콘드리아 수정을 동반한 caspases-8,-9,-7 및 -3 의 활성화를 통한 RL95-2 세포에서 세포 자살 유도를 야기시킨다는 것을 증명하였다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 자궁내막암의 세포자살을 유도하는 DHA 및 triacsin C를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 DHA 및 triacsin C를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

또한, 바람직하게는 본 발명에서 DHA 및 triacsin C의 유효농도는 각각 DHA 125 μM 및 triacsin C 5 μM인 것을 특징으로 한다.

자궁내막암은 서구 유럽에서는 여성 생식기계에서 일반적인 부인과적 악성종양이다. 진행성 및 재발성 자궁내막암에 대한 대부분의 현재 치료방법은 아직 비효과적인 상태라 생각되어 지고 있다. 역학조사 결과에 의하면, 자궁내막암 발병 빈도와 n-3 다중불포화지방산 (오메가 지방산, dietary n-3 polyunsaturated fatty acids) 섭취율 간에 역전관계가 있다고 보고된 바 있다. 오메가 지방산 중 도코사헥사엔산 (docosahexaenoic acid, DHA)은 특히 암세포 증식과 다양한 유형의 암에서 종양형성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 다양한 종류의 종양세포를 대상으로 한 DHA의 세포독성 및 세포사멸 유도효과에 관한 결과들이 보고되고 있지만, 인간 자궁내막암세포에서 DHA가 유도하는 자연세포사(아포토시스)에 대한 정확한 세포 및 생화학적 기전에 대해서는 잘 알려진 바가 없는 상태이다.

따라서 본 연구에서는 인간 자궁내막암세포 유래의 세포주인 RL95-2를 대상으로 하여 자연세포사를 유발하기 위해서 DHA를 처리하거나, DHA와 함께 acyl-coA synthetase (ACS) 저해제 중의 하나인 triacsin C를 처리해 줌으로써 DHA에 의한 세포사멸 효과의 증강이 있는지의 여부를 조사하고자 하였다. 본 연구 결과, DHA나 triacsin C 단독처리는 RL95-2 세포에 뚜렷한 세포사멸 유도효과가 관찰되지 않았으나, DHA와 triacsin C를 병용 처리하였을 경우에는 유의한 수준의 자연세포사를 유발하였다. 더욱이, DHA와 triacsin C 병용처리가 유도하는 자연세포사는 caspase-8/tBID, caspases 9, -3, -7의 활성화에 의해 발생하는 것을 보였다.

본 연구로 인하여, DHA와 triacsin C의 병용처리에 의한 암세포 자살유도 증강효과가 밝혀졌고, 이와 같은 연구는 대부분의 임상 및 전임상 연구에서 아직까지 제시된 바가 없다. 향후 DHA 처리와 관련하여 ACS 발현의 제거 등을 통한 자연세포사 유발과 관련된 기전이 밝혀지게 되면 새로운 자궁내막암 치료전략 개발에 도움을 줄 것이라 생각된다.

도 1은 RL95-2 자궁내막암 세포에서 세포 생존능에 대한 도코사헥사에노산(A)과 트리아신 C(B))의 효과를 나타낸 것이다. 다양한 농도의 도코사헥사에노산(0~150 μM) 또는 트리아신 C(0~10 μM)를 24시간 동안 처리된 세포에서, 세포 생존능을 나타내었다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석으로 확인하였다. DHA 및 Tc는 각각 도코사헥사에노산과 트리아신 C를 나타낸다. 적어도 3번의 독립적인 실험이 수행되었고, 데이터는 평균±SD로 나타낸다. *, 0 μM 대조군에 비해 p <0.05.
도 2는 RL95-2 자궁내막암 세포에서 세포 자살에 대한 도코사헥사에노산(A)과 트리아신 C(B))의 효과를 나타낸 것이다. 다양한 농도의 도코사헥사에노산(0~150 μM) 또는 트리아신 C(0~10 μM)를 24시간 동안 처리된 세포에서, 세포사멸이 나타났고, 유동세포분석법으로 분석되었다. DHA 및 Tc는 각각 도코사헥사에노산과 트리아신 C를 나타낸다. sub-G1 DNA 함량을 갖는 세포의 비율은 세포 자살로 간주된다. 적어도 3번의 독립적인 실험이 수행되었고, 데이터는 평균±SD로 나타낸다. *, 0 μM 대조군과 비교하여 p <0.05
도 3은 RL95-2 자궁내막암 세포에서 세포 자살에 대한 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리의 효과를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었다. sub-G1 DNA 함량을 갖는 세포의 비율은 세포 자살로 간주된다. 적어도 3번의 독립적인 실험이 수행되었고, 데이터는 평균±SD로 나타낸다. #, p <0.001 대조군과 비교, DHA-처리 또는 Tc-처리 그룹.
도 4는 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포의 핵 분열을 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었다. 핵의 형태학은 Hoechst 33258로 염색되었다. 화살표는 분열된 핵을 나타낸다. 원본 확대: ×800.
도 5는 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, 세포 자살의 타입의 평가를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었다. 세포 자살 비율 또는 종류는 annexin V 세포 자살 분석에 의해 확인되었다. i, ii, iii, 및 iv 는 각각 살아있음(live), 괴사, 초기 세포자살 및 후기 세포자살 영역을 나타낸다.
도 6은 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 활성 caspase-3 및 -7과 PARP cleavage의 활성화를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었다. DHA 및 Tc 노출 후, caspase-3 및 -7의 활성화는 caspase-3, -7, 및 PARP cleavages에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 바와 같다. 동량의 단백질(30 μg)은 SDS-PAGE로 분리되었고, 각각 cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, PARP, 및 XIAP 항체를 이용하여 면역블롯팅되었다. 액틴은 내부 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 7은 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 활성 caspase-3 및 -7의 세포화학적 국소화를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었고, 시토스핀으로 준비되고, 고정되며, cleaved caspase-3 또는 -7 항체로 각각 면역염색되었다. 분핵 염색을 위해, 프로피디움 요오드화물(PI, 빨강) 염료가 사용되었다. 현미경 사진은 다초점 형광현미경을 사용하여 촬영되었다. 원본 확대 : ×800.
도 8은 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 caspase-8, BID, 및 caspase-9의 활성화는 procaspase-8, cleaved caspase-8, proBID, 절단 BID (tBID), procaspase-9, 및 cleaved caspase-9에 대한 웨스턴 블롯 분석에서 나타낸 바와 같다.
세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었다. 동량의 단백질(30 μg)은 SDS-PAGE로 분리되었고, 각각 procaspase-8, cleaved caspase-8, proBID, 절단 BID (tBID), procaspase-9, 및 cleaved caspase-9 항체를 이용하여 면역블롯팅되었다. 액틴은 내부 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 9는 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 활성 caspase-8의 세포화학적 국소화를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었고, 시토스핀으로 준비되고, 고정되며, cleaved caspase-8 및 Hsp60 (특정 미토콘드리아 단백질 마커로서) 항체로 각각 면역염색되었다. 분핵 염색을 위해, Hoechst 33258 (blue) 염료가 사용되었다. 125 μM DHA 및 5 μM Tc에서 24시간 병용처리에 노출 후, 미토콘드리아에서 활성-caspase-8 (초록) 및 Hsp60 (빨강) 의 공편재화를 나타낸 것이다.
도 10은 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 tBID의 세포화학적 국소화를 나타낸 것이다. 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었고, 시토스핀으로 준비되고, 고정되며, tBID 및 Hsp60 (특정 미토콘드리아 단백질 마커로서) 항체로 각각 면역염색되었다. 분핵 염색을 위해, Hoechst 33258 (blue) 염료가 사용되었다. DHA 및 Tc에서 24시간 동안 노출 후, 미토콘드리아에서 tBID (초록) 및 Hsp60 (빨강) 의 공편재화를 나타낸 것이다.
도 11은 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리에 노출된 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 활성 caspase-8 및 tBID의 면역화학적 공편재화(Immunocytochemical colocalization). 세포들은 125 μM DHA, 5 μM Tc 또는 125 μM DHA 및 5 μM Tc 병용처리로 24시간 동안 처리되었고, 시토스핀으로 준비되고, 고정되며, 활성 caspase-8 및 tBID 항체로 각각 면역염색되었다. 분핵 염색을 위해, Hoechst 33258 (blue) 염료가 사용되었다. DHA 및 Tc에서 24시간 동안 노출 후, 미토콘드리아에서 활성 caspase-8 (빨강) 및 tBID (초록)의 공편재화를 나타낸 것이다.
도 12는 도코사헥사에노산(DHA)과 트리아신 C(Tc))의 병용처리 후, RL95-2 자궁내막암 세포에서 카스파아제 저해제에 의한 caspase-8, -9, -3, 및 -7 활성의 억제. 세포들은 각각 zVAD-FMK (pan caspase 저해제), DEVE-CHO (caspase-3/-7 저해제), IETD-CHO (caspase-8 저해제), LEHD-CHO (caspase-9 저해제) 또는 IETD 플러스 LEHD의 존재 또는 부존재하에서 14시간 동안 125 μM DHA 및 5 μM Tc에 노출되었다. DHA 및 Tc의 노출 후, RL95-2 세포에서 카스파아제 저해제에 의한 카스파아제의 변화는 caspase-8, 9, -3, -7, 및 PARP cleavages에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 것과 같다. 동량의 단백질(30 μg)은 SDS-PAGE로 분리되었고, caspase-8, -9 -3 와 -7, 및 PARP 항체에 대한 분리된 형태에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯팅 하였다.
도 13은 RL95-2 자궁내막암 세포에서 카스파아제 저해제의 존재하에서, 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid, (DHA))과 트리아신(triacsin C, (Tc))의 병용처리에 이해 유도되는 세포자살의 억제. 세포들은 각각 zVAD-FMK (pan caspase 저해제), DEVE-CHO (caspase-3/-7 저해제), IETD-CHO (caspase-8 저해제), LEHD-CHO (caspase-9 저해제) 또는 IETD 플러스 LEHD의 존재 또는 부존재하에서 14시간동안 125 μM DHA 및 5 μM Tc에 노출되었다. 세포 자살은 유동세포분석법으로 분석되었다. sub-G1 DNA 량을 가지는 세포의 퍼센트는 세포 자살의 측정하는데 사용되었다. 적어도 3번의 독립적인 실험이 수행되었고, 평균± SD로 나타내었다. * 및 # 는 DHA 및 Tc-처리된 그룹과 비교하여 각각 p <0.05 및 p <0.001를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들이 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.

< 실시예 1 : 시약 및 항체 >

도코사헥사에노산(DHA), triacsin C (Tc), 디메틸 설폭사이드(DMSO), Hoechst 33258, 페닐메틸-설포닐 플루오라이드(PMSF), 파라포름알데히드(PFA), 프로피디움 아이오다이드(PI), RNase A, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2.5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue (MTT) 및 안티-액틴은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Anti-procaspase-8, procaspase-9, proBID, ㅁ및 tBID는 Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Anti-cleaved caspase-8, caspase-9, caspase-3, 및 caspase-7은 Signaling Tech (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-PARP, z-VAD, DEVD-CHO, IETD, 및 LEHD은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Anti-XIAP은 BD pharmingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Anti-rabbit 및 mouse Ig 복합 horseradish peroxidase는 Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. FITC-복합-anti-rabbit IgG 및 anti-mouse IgG, 및 Texas Red-복합 anti-rabbit IgG와 anti-mouse IgG는 Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)에서 구입하였다. Alexa-conjugated anti-rabbit IgG은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.

< 실시예 2 : 세포 배양 >

RL95-2 세포(인간 자궁내막암 세포 라인; American Type Culture Collection, MD)는 10 μg/ml 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 보충된 10% fetal bovine serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 1.2 g/L sodium bicarbonate를 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) nutrient mixture F-12 HAM (Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 배양되었다. 세포들은 37℃ 5% CO₂의 습한 인큐베이터에서 배양되었고, confluency가 20%에 도달했을 때, DHA 또는 Triacsin에 노출되었다.

< 실시예 3 : MTT cell 생존능 분석 >

세포들은 well 당 5 x 10⁵ cells 의 밀도의 12-well plates에 심어졌다. 적당한 시간(24 또는 48시간)에서 처리 후, 배양 배지는 제거되고, phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)에 용해된 0.5 mg MTT를 포함하는 배지로 대체되었다. 4시간 후, 결정 크리스탈은 200μl DMSO로 용해되었다. 각 웰에 색의 강도는 microplate reader (BIOTEK EL-312e, VT, USA)를 이용하여 490 nm의 파장에서 측정되었다.

< 실시예 4 : Flowcytometric cell death assay >

세포들을 수집하여 24시간 동안 95% 에탄올로 고정하였고, 0.05 mg/ml PI 및 1 ㎍/ml RNase A로 37°C에서 30 분간 배양되었고, Epics XL 및 analysis software (EXPO32 TM; Beckman Coulter, MI, USA)를 갖는 유동세포분서겁에 의해 분석되었다. sub-G1 에 속하는 세포들은 세포사멸 세포로 간주되고, 세포 주기의 각 단계의 비율이 확인되었다.

< 실시예 5 : Hoechst 33258 staining >

세포들은 37℃에서 30분동안 Hoechst 33258 (4 μg/ml)에서 염색되었고, 4% paraformaldehyde (PFA)에서 10분간 고정되었으며, 이후, Axiophot microscope (Zeiss, Germany)하에서 관찰되었다.

< 실시예 6 : Annexin V cell death assay >

세포들은 제조사의 프로토콜에 따라 AnnexinV-FITC Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, NJ, USA)를 이용하여 염색되었다. 염색된 세포들은 유동세포분석법에 의해 분석되었다.

< 실시예 7 : Western blot analysis >

전체 세포 용해물은 30분간 얼음에서 용해 버퍼[30 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na₃VO₄, 25 mM NaF, 10 mM Na₄P₂O₇]를 배양하여 분비되었다. 14,000 rpm 4 ℃에서 30분간 원심분리에 의해 불용성 부분이 제거된 후, 상등액이 수집되었고, 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, Woburn, MA, USA)로 확인되었다. 동량의 단백질(~30 μg)을 SDS-PAGE로 처리하여 nitrocellulose membrane에 이동시켰다. 멤브레인은 5% 탈지유의 존재하에 0.05% Tween-20 [TBS-T (pH 7.4)]를 포함하는 Tris-buffered saline 에서 1차 항체를 가지고 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 멤브레인이 TBS-T에서 세척된 후, 2차 항체 반응은 horseradish peroxidase로 복합된 적절한 항체원으로 수행되었다. 신호전달은 LAS-3000 detector (Fujifilm, Japan)에서 강화된 chemiluminescence detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 탐지되었다. β-액틴에 대한 면역블롯이 내부 대조군으로서, 매 실험마다 수행되었다.

< 실시예 8 : Immunocytochemistry >

수집된 세포들은 사이토스핀 원심분리에 의해 슬라이드 글래스에 부착되었다. 세포들은 4% PFA로 고정되고, PBS로 세척되고, 0.2% Triton X-100로 배양되었다. 이후, 세포들은 실온에서 1% bovine serum albumin로 적당한 1차 항체로 배양되었다. 2차 항체반응을 위해, 세포들은 실온에서 적절한 형광-2차 항체로 배양되었다. 핵의 대조염색을 위해, 필요하다면, 세포들은 실온에서 PI (50 μg/ml)로 배양되었다. 최종적으로, 세포들이 공초점 현미경(LSM510, Carl Zeiss, Germany)에 올려져서 관찰되었다.

< 실시예 9 : 통계 >

데이터들은 3번 또는 4번의 독립된 실험의 평균 ± SD 로 나타내었다. 적절한 곳에서, 데이터는 analysis of variance (ANOVA)후, Duncan’s post hoc test를 수행하였다. 평균은 P<0.05에서 현저히 다른 것으로 고려된다.

< Results >

DHA 및 triacsin C의 개별 세포 독성을 평가하기 위해, RL95-2 cells가 각각 다양한 농도의 DHA(0~150μM) 또는 triacsin C (0~10μM)에 노출되었다. 세포 생존은 Sub-G1 assay(프로피디움 아이오다이드 염색) 뿐만 아니라, MTT에 의한 증가하는 시약의 농도에 24시간 노출 후 측정되었다. 세포생존능은 DHA 또는 triacsin C의 농도가 증가함에 따라 약간 감소되었다(도 1 A 및 B). 그러나, sub-G1 analysis에 의해 확인된 세포 자살은 DHA 또는 triacsin C 단독 처리가 24시간 동안 어떤 농도에서도 심각한 세포 자살을 유도하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 2A 및 B).

도 2는 DHA 또는 triacsin C 단독 처리가 RL95-2 cells에서 세포 자살을 유도하기에 충분하지 않음을 나타낸다. 이러한 결과에 기초하여, 병용처리에서 효과적인 세포독성의 유도에 대한 적정한 농도는 일련의 결합된 실험에 의해 선택되었다(데이터 미도시): DHA 125 μM 및 triacsin C 5 μM.

도 3은 RL95-2 cells가 5 μM triacsin C 및 125μM DHA로 병용처리에 24시간 동안 노출된 후, 세포 자살이 65.9±12.6 %까지 현저히 증가되었다. 병용처리의 Hoechst staining은 핵의 단편화를 나타내는 반면(도 4d), Annexin V 염색은 처리 동안 생존하는 세포 군집(Region i)의 이동이 후기 세포 자살(Region iv)로 이동하는 것을 나타낸다(도 5). 이러한 결과는 DHA 및 triacsin C의 병용처리가 DHA 또는 triacsin C의 단독 처리에서 일어나지 않는 세포 자살의 유도에 대한 시너지임을 나타내는 것이다. DHA 및 triacsin C 유도 세포사멸이 caspase 활성과 관련이 있는지 여부를 확인하기 위해, initiator (-8과 -9) 및 effector (-3과 -7) caspases의 활성은 특정 활성형태의 항체를 이용하여 웨스턴 블롯과 면역세포화학(immunocytochemistry)에 의해 분석되었다. 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, DHA 및 triacsin C의 병용처리는 PARP and XIAP의 분리 뿐만 아니라, caspases-3 및 -7의 활성화를 야기시킨다(도 6). 또한, 웨스턴 블롯 결과와 일치하여, 면역세포화학에서 증가된 수준의 caspases-3 및 -7은 DHA 및 triacsin C-처리 RL95-2 cells에서 관찰되었다(도 7). 다음으로, 어떤 기작에 의해 DHA 및 triacsin C가 외부 및 내부 세포 자살 경로를 야기할 수 있는지를 알아보기 위해, caspases-8, -9 및 BID의 활성화가 확인되었다. 웨스턴 블롯 분석은 분리된 caspases-8 (43/41 및 18 kda), -9 (37/35 kda)와 tBID (17 kda)의 수준이 DHA나 triacsin C 단독처리와 비교하여 병용처리시에 현저하게 증가됨을 나타낸다(도 8). 활성화된 caspase-8는 cytochrome c의 분리를 야기하는 미토콘드리아의 이동을 개시함으로써, 직접적으로 caspase-3를 활성화시키거나, Bcl-2 단백질 패밀리 멤버 중 BH3만 분리시킨다(20). caspase-8/tBID의 미토콘드리아 기능에 기여 정도를 확인하기 위하여, 활성화된 caspase-8 및 tBID의 세포 내 위치파악은 미토콘드리아 마커 단백질로서, mt-hsp60로 활성 caspase-8 및 tBID의 이중 면역염색에 의해 확인되었다.

도 9 및 도 10에서 나타난 바와 같이, 활성 caspase-8 및 tBID의 면역반응성은 DHA 및 triacsin C 노출 후, 미토콘드리아에서 대부분 나타날 수 있다. caspase-8가 미토콘드리아에서 tBID 와 공동으로 위치하는지 여부를 확인하기 위하여, 이중 면역염색이 공초점 분석(confocal analysis)으로 수행되었다. 겹쳐 놓아졌을 때, 2 분자가 미토콘드리아에 공존함을 나타내면서, caspase-8 및 tBID의 활성 부분의 형광 신호는 노란색 이미지를 나타낸다(도 11). 이러한 결과들은 DHA 및 triacsin C의 병용처리가 caspase-8의 미토콘드리아 이전을 야기하며, 여기서, BID와 결합하여, 미토콘드리아에서 tBid 활성화를 야기한다.

DHA 및 triacsin C 유도 세포 자살에 대한 caspase 활성화의 요구는 caspase 특이적 저해제, zVAD-FMK (pan-caspase 저해제), DEVE-CHO (caspase-3/-7 저해제), IETD-CHO (caspase-8 저해제) 및 LEHD-CHO (caspase-9 저해제)를 이용하여 확인되었다. RL95-2 세포는 DHA 및 triacsin C로 14시간 동안 처리하기 전에 저해제로 2시간 동안 미리 처리되었다.

도 12에 나타난 바와 같이, pan-caspase 저해제(zVAD-FMK), caspase-8 저해제(IETD-CHO) 및 caspase-8/-9 저해제 조합(IETD-CHO/LEHD-CHO)은 완전히 DHA 및 triacsin C 유도 caspases-8, -9, -7 및 PARP의 분리를 약화시킨다. 그러나, caspase-3/7 (DEVD-CHO) 및 caspase-9 ㅈ저해제(LEHD-CHO)는 특히, caspase -3, -9, -7 및 PARP의 분리를 방해하지만, caspase-8는 그렇지 않다. caspase-3의 p17 단편은 병용 처리 동안 pan-caspase 저해제 및 caspase-8, -8/9 저해제로 미리 배양한 후에만 약하게 탐지되었다.

마지막으로, sub-G1 analysis은 DHA 및 triacsin C-유도 세포 자살은 부분적으로 caspase-9 및 -3/7 저해제에 의해 억제되는 반면, pan-caspase, caspase-8 및 caspase-8/9 저해제에 의해서는 완전히 억제된다(도 13). 이러한 결과는 DHA and triacsin C 유도 세포사멸이 caspase-8 활성화와 뒤이은 caspases -9, -3 및 -7의 활성화를 통해 개시됨을 나타낸다.

최근 수십년 동안, 도코사헥사에노산(DHA)는 유망한 항암제로서 부각되어왔다. 생리학적 농도에서 악성 종양 세포에 선택적 세포독성 효과를 나타냄에도 불구하고(7, 8), 본 발명에서는 DHA 단독으로는 자궁내막암 세포라인 RL95-2에서 세포 자살을 유도하기에 충분하지 않음을 밝혀내었다. long chain 지방산을 활성화시키고, 전환시키는 ACS 패밀리 효소들은 인지질 생합성, 베타-산화 및 지방 신진대사에 우세한 역할을 한다(15, 16). 따라서, ACS 기능의 저해가 RL95-2 자궁내막암 세포에서 세포 자살이 유도에 기여하고, 미토콘드리아세서 외인성 DHA의 축적을 야기하면서, DHA 대사의 혼란을 야기할 수 있다고 가정되었다.

본 발명은 제한된 농도 조건하에서, 125 μM DHA 또는 5 μM triacsin C 만으로, 명백한 세포 독성 효과를 유도할 수 없음을 나타내었다. 그러나, 125 μM DHA 및 5 μM triacsin C의 병용처리는 sub-G1 population과 세포사멸 단편을 현저하게 증가시킨다. DHA 및 triacsin C가 caspase-8/BID 활성화에 의한 외부 경로뿐만 아니라, caspase-9, -3 및 -7를 통한 미토콘드리아 경로를 통해 세포 자살을 유도함이 증명되었다.

일반적인 인간 세포에서, 2가지 주요 세포 자살 경로가 제안되어왔다. 외부 세포자살 경로는 Fas 및 TNFR1를 포함하는 죽음 수용체의 자극과 연관되어 있으며, initiator caspase-8 뿐만 아니라, Fas-associated death domain (FADD) 어댑터 단백질과 관련되어 있다. 동일하게, 세포 자살의 내인적 경로는 미토콘드리아 상태에서의 변화, 아포토시스 소체(apoptosome) 및 caspase 활성화 케스케이드를 활성화시키는 사이토졸로의 미토콘드리아 사이토크롬 c의 분비로부터 기인한다(21, 22). 이러한 시스템에서 활성화된 caspase-8은 미토콘드리아내에서의 이동을 개시하고, cytochrome c, Smac/DIABLO 및 apoptosis inducing factor 분비를 야기하면서, 직접적으로 executioner caspase (caspase 3)를 활성화시키거나, BID(Bcl-2 단백질 패밀리 중 BH3 멤버)를 분리시킨다(20, 23). 다른 연구들은 pro-caspase-8가 미토콘드리아로 이동하고, tBID 분리와 단백질가수분해 상 활성화된 p43 및 p10 단편을 생성을 야기하면서, cardiolipin와 결합하고, 올리고머를 합성하여, 활성화된다(24).

이러한 결과에 기초하여 미토콘드리아 기능에서 caspase-8/tBID의 영향을 더 조사하기 위하여, caspase-8/tBid의 세포내 위치파악이 활성화 caspase-8, tBID 및 mt-hsp60 항체로 이중 면역염색에 의해 모니터링되었다. 면역형광 분석을 이용하여, DHA 및 triacsin C 노출 후, pro-caspase-8의 특징적인 부분이 미토콘드리아에서 tBID 와 같은 위치에 있음에도 불구하고, 활성 caspase-8 및 tBID가 대부분 미토콘드리아 내에 위치하는 것이 밝혀졌다.

따라서, DHA 및 triacsin C가 caspase-8의 미토콘드리아로의 이동을 유도하여, 여기서 BID와 결합한 후, 미토콘드리아에서 tBid의 활성화를 야기할 수 있는 것으로 보인다. 또한, sub-G1 analysis은 DHA 및 triacsin C 유도 세포 자살이 caspase-8 저해에 의해 완전히 억제될 수 있으며, 이는 세포내에서의 세포자살이 caspase-8 및 BID의 활성화를 필요로 함을 나타내는 것이다.

이러한 결과들이 DHA 및 triacsin C에 의한 세포자살이 외인성 및 내인성 세포 자살 경로 모두와 관련이 있음을 나타냄에도 불구하고, caspase-8/Bid 활성화는 RL95-2 세포에서의 세포자살의 유도에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 미토콘드리아는 특별히, 산화적 스트레스에 민감하며, 많은 연구들이 cardiolipin를 갖는 DHA의 축적 및 관련성이 활성 산소종의 생성, cardiolipin 변형 및 세포자살 신호전달 경로를 야기할 수 있음을 증명하고 있다(25, 26).

또한, triacsin C에 의한 ACS 저해는 외인성 자유 지방산의 축적을 야기할 수 있으며(27, 28), 이는 세포 자살을 겪는 세포에서의 미토콘드리아 상태에 영향을 미칠 수 있다. Cardiolipin은 일반적으로 미토콘드리아의 내부 멤브레인에 위치하는 것으로 알려져 있으며, 또한, 미토콘드리아의 내부 및 외부 멤브레인 사이에 형성된 접촉 사이트에 위치한다(29). caspase-8 및 tBid 모두를 불러들이는 활성화 플랫폼으로서 행동하는 것을 나타내왔다. 세포자살 동안, 내부 및 외부 미토콘드리아 멤브레인 사이의 접촉 사이트에서 caspase-8/tBid의 이동이 cardiolipin 양의 감소를 야기시키며, 미토콘드리아에서 cytochrome c의 분리를 야기시킨다. (24, 30~32).

따라서, triacsin C에 의한 ACS 저해는 미토콘드리아의 cardiolipin로 DHA 축적을 통해 RL95-2 세포에서 caspase-8/tBid 활성화를 야기하는 것으로 상정하였다. caspase-8/BID의 활성화 및 연이은 미토콘드리아 멤브레인으로 이동(cardiolipin에 따른)은 세포 자살의 유도에 중요하며, 이우희 전자 이동 체인에서 ROS 생성을 야기하며, 미토콘드리아 멤브레인의 기능과 integrity에 영향을 미칠 수 있다(33). 또한, triacsin C에 의한 ACS의 저해는 cardiolipin의 구조와 함량을 변경할 수 있으며(24), 이는 ACS가 세포 생존 뿐만 아니라, cardiolipin 함량의 유지에 필수적임을 나타낸다.

본 발명 이전에는 DHA 및 triacsin C간의 시너지 효과는 이들 둘 시약과 관련된 대부분의 임상적 및 비임상적인 연구들이 조사된 바없었다. 그럼에도 불구하고, DHA 및 ACS 제거(ablation)와 관련된 세포자살 대사를 더 밝히는 것은 자궁내막암의 가능한 치료 전략에 대한 불빛을 밝힐 수 있을 것이다. 또한, DHA 및 triacsin C 유도 세포 자살 기작에 대한 연구는 자궁내막암에 대한 치료 전략의 개발하도록 할 수 있을 것이다.

상기에 제시된 실시예는 예시적인 것으로 이 분야에서 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위에서 제시된 실시예에 대한 다양한 변형 및 수정 고안을 만들 수 있을 것이다. 이러한 변형 및 수정 고안에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.

Claims

DHA(docosahexaenoic acid) 및 triacsin C를 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물.
제 1항에 있어서,
DHA 및 triacsin C의 유효농도는 각각 DHA 125 μM 및 triacsin C 5 μM인 것을 특징으로 하는 자궁내막암 치료 및 예방용 조성물.