TWI427148B - 用於生產l-天冬醯胺酶ii的重組宿主 - Google Patents
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Description
本專利申請案主張2006年六月30日所提申之美國臨時專利申請案序號6-/817,817的利益,其完整內容係以引用方式納入本文中。
本發明係關於生產相同純度之特定重組大腸桿菌L-天冬醯胺酶II酵素的新穎載體、宿主細胞及方法。
L-天冬醯胺酶係水解胺基酸L-天冬醯胺成L-天冬胺酸鹽及氨之酵素,亦即,它係去胺基化酵素。大腸桿菌含有兩個天冬醯胺酶同功異構酵素:L-天冬醯胺酶I及L-天冬醯胺酶II。L-天冬醯胺酶I係位於細胞溶質及對於天冬醯胺具有低親和力。L-天冬醯胺酶II係位於胞外質及對於天冬醯胺具有高親和力。
L-天冬醯胺酶II係有用於治療依賴L-天冬醯胺以用於蛋白質合成之腫瘤或癌症,其係藉由移除細胞外之天冬醯胺。它係特別地有用於治療白血病,像是急性淋巴細胞白血病。L-天冬醯胺酶係典型上與其他抗腫瘤或抗癌療法結合而被使用,雖然它在某些臨床情況下可以被單獨應用。L-天冬醯胺酶係最初純化自數種有機體中,包含大腸桿菌(Escherichia coli
,“E.coli
”)及伊文氏桿菌(Erwinia carotovora
)。在哺乳動物之中,L-天冬醯胺酶II係只有在天竺鼠(豚鼠總科(Superfamily Cavioidea))及在某些新世界猴中被以稍多於微量發現。
大腸桿菌L-天冬醯胺酶II係為相同次單位之四複合體,其表現出優異的Kcat
及Km
。大腸桿菌L-天冬醯胺酶II(於技術領域中亦稱為L-天冬醯胺醯胺水解酶,EC-2,EC 3.5.1.1型)係商業上可以Elspar(Merck & Co.,Inc.)購得及亦可購自Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd。
L-天冬醯胺酶II,其自身,受限於蛋白質療法的慣常缺點,像是相對於病患為外來之蛋白質之清除的高效率,及以此酵素治療的病患中引發免疫反應之可能性。為求對付這些缺失,L-天冬醯胺酶II之共軛結合聚乙二醇之衍生物已經被開發出,及被Enzon Pharmaceuticals,Inc.以培門冬酶(pegaspargase)或Oncaspar販售。培門冬酶係使用萃取自大腸桿菌的L-天冬醯胺酶II生產,如Merck所供應。培門冬酶(亦稱為單甲氧聚乙二醇琥珀醯亞胺基L-天冬醯胺酶)具有本質上非抗原性、及表現降低的從循環系統清除比例之優點。
然而,儘管有這些成功,如果大腸桿菌L-天冬醯胺酶II蛋白質可以藉由重組宿主細胞應用適當之染色體外表現載體(例如,像是質體來)生產,則會更為有效率及經濟。這種表現載體可以被設計以用於更有效率的蛋白質生產,其係與可用的自原始大腸桿菌
品系之生產相比。儘管有這種重組生產的可能優點,咸信迄今為止尚無商業L-天冬醯胺酶II酵素的精確已發表多胜肽序列,及無編碼此酵素的多核苷酸的已發表核苷酸序列。舉例而言,L-天冬醯胺酶II胜肽序列係先前被Maita等人,1980,Hoppe Seyler’s Z.Physiol.Chem.
361(2),105-117,及Maita等人,1974,J.Biochem.
76,1351-1354〔東京〕所報導。然而,如同下述所討論,這些早先的工作受限於許多的序列錯誤。
對於L-天冬醯胺酶II酵素次單位之質體表現的另一可能障礙係對可能可以被應用作為宿主細胞之大腸桿菌品系的染色體為固有之編碼L-天冬醯胺酶II次單位之基因的存在。因此,重要的是,收穫自大腸桿菌宿主細胞(其帶有染色體外表現載體)之L-天冬醯胺酶可能包含表現不只一種的L-天冬醯胺酶同功型之次單位。由於需要具有良好特徵化之酵素產物(對於臨床及調控目的兩者),迄今為止此可能性已代表改進大腸桿菌L-天冬醯胺酶蛋白質之生產之效率的重要技術挑戰。
本發明滿足上面提及之對於以重組形式有效地及經濟地生產之大腸桿菌L-天冬醯胺酶II的需要,同時提供具有如同大腸桿菌L-天冬醯胺酶II蛋白質(以Oncaspar銷售)之相同胜肽結構之酵素產物,其亦無可偵測量之其它L-天冬醯胺酶II同功型。
因此,本發明提供大腸桿菌宿主細胞,其包括大腸桿菌染色體及至少一個重組染色體外載體之複製體,其中該染色體外載體編碼L-天冬醯胺酶II蛋白質之次單位,其中該大腸桿菌宿主細胞染色體編碼L-天冬醯胺酶II之相同次單位,且其中該大腸桿菌宿主染色體不編碼任何其他L-天冬醯胺酶II之同功型。該染色體外載體較佳係適合用於在大腸桿菌中複製及表現之質體。
較佳地,所表現的L-天冬醯胺酶II蛋白質包括四個次單位,其具有根據SEQ ID NO:1之多胜肽序列,其對應至用於製造Oncaspar中之L-天冬醯胺酶II酵素之次單位的序列,及該質體載體包括編碼L-天冬醯胺酶II蛋白質之次單位之核酸分子,其操作性地連結到適合的啟動子。啟動子係任何適當的啟動子,但係可選擇地選擇自由T7、araB、trp、tac、lac、λPL
、λPR
、aroH及phoA啟動子所組成之群組。質體載體可選擇地包含額外的質體元件,如對於有效率的表現及/或產物純化可能為需要,其係可實行地連結到L-天冬醯胺酶開放讀框及/或啟動子。這些載體元件包含,舉例而言,相容的操作子序列、核糖體結合位置、轉錄終止子、訊號序列、藥物抗性標記,及複製起點。帶有相關抑制子基因(例如lacI)之複製體之質體亦可以存在。
較佳地,編碼L-天冬醯胺酶II蛋白質之次單位的質體DNA分子包括SEQ ID NO:2,且編碼L-天冬醯胺酶II蛋白質之染色體DNA分子包括SEQ ID NO:3。
因此,為了提供於對應至Oncaspar及Kyowa Hakko L-天冬醯胺酶II之L-天冬醯胺酶II之生產中所欲的改進,需要獲得編碼該酵素之載體,及亦需要提供只會表現單一L-天冬醯胺酶II同功型之宿主細胞。因此,來自Merck & Co.,Inc.之L-天冬醯胺酶II酵素,以及獲自Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.之L-天冬醯胺酶II酵素被定序,及所得之序列係與獲自大腸桿菌K-12的L-天冬醯胺酶II酵素比較,如同Jennings等人,1990,J.Bacteriol 172:1491-1498(其係以引用方式納入本文中)所報導。K-12 L-天冬醯胺酶II酵素係由ansB基因所編碼(GeneBank No.M34277,其係以引用方式納入本文中)。
如同上述所提及,該技術領域之人士將領會到L-天冬醯胺酶II酵素包括四個相同的次單位。因此,當提及編碼該酵素之基因或DNA分子,及酵素蛋白質序列時,係提及編碼這些相同次單位之一的基因。
胜肽定序係藉由技術領域中之標準方法來實施,如同概述於下文之實施例1。Merck & Co.,Inc.及Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.兩者之次單位的蛋白質序列係出人意外地被發現為相同的(參照SEQ ID NO:1)。依照此數據,現在咸可以領會到來自Maita等人,1980,Hoppe Seyler’s Z.Physiol.Chem.361(2),105-117,及Maita等人,1974,J.Biochem.76,1351-1354〔東京〕之Merck L-天冬醯胺酶之序列之早期報導實際上包含許多的錯誤。
所得到之序列亦與K-12 L-天冬醯胺酶II酵素之次單位結構比較。發現到K-12 L-天冬醯胺酶II酵素次單位與Merck & Co.,Inc.L-天冬醯胺酶II酵素次單位在四個特定的殘基位置有差異。相對於Merck L-天冬醯胺酶II酵素,K-12酵素次單位具有Val27
取代Ala27
、Asn64
取代Asp64
、Ser252
取代Thr252
取代、及Thr263
取代Asn263
。
如同上述提及,較佳係大腸桿菌宿主細胞之染色體不表現與由染色體外載體所表現的L-天冬醯胺酶II同功型不同的L-天冬醯胺酶II同功型。此所欲之結果可以藉由數種替代策略之一達成。舉例而言,存在於大腸桿菌宿主細胞染色體上之任何L-天冬醯胺酶II基因可以被完全或部分地刪除或剔除(knock out)。另外,存在於宿主染色體上之任何替代的L-天冬醯胺酶II基因的表現可以被抑制,其藉由天然啟動子的本質調控特性,該特性在有助於由染色體外載體編碼之L-天冬醯胺酶II同功型的表現之相同培養條件之下無法允許表現。然而,較佳係令染色體及染色體外L-天冬醯胺酶II基因表現相同的L-天冬醯胺酶II酵素同功型。
為此目的,藉由數種可獲得之大腸桿菌品系所產生之L-天冬醯胺酶II酵素次單位被定序及與商業上之酵素產品比較。意外地發現大腸桿菌BLR(DE3)品系〔獲自Novagen股份有限公司;Cat.No.69208-3〕產生染色體性編碼的L-天冬醯胺酶II酵素,其在結構上相同於商業上可獲得之酵素,而亦被測試之大腸桿菌GX1210及大腸桿菌GX6712品系被發現生產不同的L-天冬醯胺酶II酵素之同功型。
隨著較佳大腸桿菌宿主之確認,染色體外表現載體(亦即以染色體外實體之形式存在之載體,其複製係獨立於染色體複製)可以被建構。適合使用於大腸桿菌之染色體外載體包含(舉例而言)pUC或pBR322衍生之質體。這些包含像是pET及pBAD之質體,以及許多具有來自T7、araBAD、phoA、trc、OL
、OR
、PL
、PR
之表現元件的質體。
在載體中,編碼L-天冬醯胺酶II酵素次單位之核酸序列被可操作地連結至適合之啟動子序列。適合之啟動子包含(例如)T7、araBAD、pho A、trc、OL
、OR
、PL
及PR
啟動子。較佳地,啟動子係T7病毒啟動子。
適合之誘導物元件包含(舉例而言)阿拉伯糖、乳糖、或熱誘導、磷酸鹽限制、色胺酸限制(僅舉幾例)。較佳地,誘導物元件係Lac操縱組,其係藉由異丙基硫代半乳糖苷(“IPTG”)誘導。
適合的訊號序列(訊號胜肽)可以衍生自pelB、fd pIII、或ompA。較佳地,訊號胜肽係衍生自ansB。
適合的抗生素篩選標記係技術領域中所熟知者且包含(舉例而言)那些給予安比西林、康黴素、氯黴素、立汎黴素(refampicin)、或四環素抗性(以及其他)者。
適合的複製序列起始點包含那些發現於下列質體中者:pUC19
、pACYC177
、pUB110
、pE194
、pAMB1
、pIJ702
、pBR322
、pBR327
、及pSC101
。
適合的終止序列包含(舉例而言)噬菌體fd主要終止子、TF、及rrnB。
大體而言,質體對於於大腸桿菌中使用係較佳的。常見的質體載體係雙股環狀DNA分子,較佳被設計成具有酵素辨識位置,其適合用於插入外來DNA序列、抗生素篩選基因、用於在宿主細胞中自發性增殖之複製的起始點、以及用於區別或篩選含有重組插入DNA的殖系之基因。可用之質體載體包含(舉例而言)pET3、pET9、pET11及延伸的pET系列(由Novagen股份有限公司編目)、pBAD、trc、phoA、trp、及OL/R
/PL/R
質體。
如同下文例示,pET表現系統的質體(像是pET27b+)係較佳的。為求提供酵素之有效及受控制的表現,表現載體亦包含啟動子、操縱基因、核醣體結合位置、號序列、轉錄終止子、複製起始點、抑制子基因(例如、LacI)的經調節複製體。
宿主大腸桿菌品系會在它的染色體上具有相容的調控元件。舉例而言,受到lacUV5啟動子控制之用於T7 RNA聚合酶之基因係存在於BLR(DE3)細胞中。這個品系係噬菌體DE3之溶原菌。IPTG添加到BLR(DE3)的培養中會誘導T7 RNA聚合酶,其轉而轉錄pET質體上之目標基因。BLR(DE3)亦為recA-
,其可以提供染色體外質體上基因的進一步穩定性。
為求獲得編碼Merck及Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.酵素之核酸分子,可用的L-天冬醯胺酶II可以藉由適合的方法修飾。E.col i
K-12 ansB之326成熟胺基酸序列L-天冬醯胺酶II次單位係編碼於978鹼基對片段,如同報導於Jennings MP及Beacham IR(1990 J Bacteriol 172:1491-1498;GeneBank No.M34277)。ansB基因(其在成熟蛋白質之前包括22胺基酸訊號胜肽)係藉由常見的聚合酶連鎖反應(PCR)方法自另一個大腸桿菌K-12品系(GX1210;獲自Genex股份有限公司)選殖。編碼大腸桿菌K-12 ansB L-天冬醯胺酶II次單位之ansB基因係藉由定點誘變(例如,利用Amersham Sculptor方法)改造以表現具有先前所討論之殘基取代的L-天冬醯胺酶II,以製造下列鹼基取代。在鹼基530之T換成C;在鹼基640之A換成G;在鹼基1205之T換成A及在鹼基1239之C換成A。編號係根據GeneBank No.M3 4277所給定,其係以引用方式納入本文中。所得之密碼子改變〔在相對應的位置GTG改成GCG
;ATT改成GAT;TCT改成ACT;ACC改成AAC〕將ansB基因轉變成修飾的基因(下文稱之為ansB*;SEQ ID NO:2),其表現與獲自Merck & Co.,Inc.及Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd.者相同之L-天冬醯胺酶II酵素次單位。
如同上面所討論的,ansB*基因可以被插入適合用於在大腸桿菌中有效蛋白質表現之至任何染色體外載體。特別的是,ansB*基因被插入質體pET27b+(Novagen股份有限公司)及藉由電穿孔法傳入大腸桿菌品系BLR(DE3)(如同於下文所提供之實施例中所詳細敘述者),以提供攜帶ansB*質體及表現L-天冬醯胺酶II次單位(呈與Merck L-天冬醯胺酶II相符合之相同同功型)之大腸桿菌。
較佳地,實施例中所鑑定為品系EN538之殖系(以ATCC號碼PTA7490及食品工業發展研究所寄存號碼BCRC 940535寄存)被使用及使用任何技術領域中已知適合用於大腸桿菌的方法來培養。適合的培養系統包含批次、饋料批次及連續式培養方法。培養基係選自技術領域中已知對於大腸桿菌優化之培養基。一旦培養到達足夠之密度(範圍自大約20 OD660
到大約200 OD660
),適當的誘導物(像是IPTG)被添加到培養基中。在足夠的時間期間(範圍自大約0.5小時到大約20小時)之後,所產生之L-天冬醯胺酶II係藉由標準方法由培養基及/或由培養獲得之細胞團塊中純化。
細胞團塊係藉由離心及/或過濾來獲得,及藉由任何中技術領域已知之方法來溶胞。細胞體之溶胞可以藉由包含以下者之方法完成:酵素性細胞壁溶胞接著滲透溶胞、冷凍-融解、音波振動處理、機械性破壞(例如微流化(microfluidization))、溶胞劑及類似物的使用,接著藉由過濾及/或離心以自可溶解蛋白質內容物中分離受到破壞之細胞團塊。數個循環之溶胞、清洗及分離可以被實施以優化回收。
酵素可以接著自上清液及/或培養基中回收及純化,其藉由已知的純化方法,包含硫酸銨沈澱法、酸萃取法、聚焦層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和性層析法、氫氧磷灰鹽(Hydroxylapatite)層析法、FPLC(快速蛋白質液相層析法)、高效率液相層析法、及類似方法。
數種發酵程序的參數可以被調整以優化天冬醯胺酶表現或以控制蛋白質自胞外質外洩到生長培養液基的程度。這些變數包含培養液組成(例如碳及氮源及所添加之胺基酸或其他營養物)、溫度、pH、誘導物濃度、及表現的持續時間。總體之大腸桿菌遺傳譜系(基因型)亦可以影響表現及產物外洩。只由細胞(胞外質)或只由培養基,或由總體之發酵內容收穫天冬醯胺酶產物可能係所欲的,其取決於蛋白質表現結果及自宿主細胞的外洩。
根據本發明所製備L-天冬醯胺酶II酵素之較佳效用係呈聚合物共軛酵素的形式。本發明之L-天冬醯胺酶-聚合物共軛物通常相當於分子式(I):(I) (R)Z
-NH-(ASN)
其中(ASN)代表L-天冬醯胺酶或其衍生物或片段;NH-係發現於ASN、其衍生物或片段上,用於連接到聚合物之胺基酸的胺基;Z係正整數,較佳由大約1到大約80;及R係實質上非抗原性聚合物殘基,其係以可釋放或非可釋放之形式連接到ASN。
共軛物(R)之非抗原性聚合物殘基部分可選自基於聚合物系統之非限制清單,像是:
其中:R1-2
、R10-11
、R22-23
可以相同或不同,及係獨立地選擇之非抗原性聚合物殘基;R3-9
、R12-21
、R24
(見下文)係相同或不同,及每一係獨立地選擇自氫、C1-6
烷基、C3-12
分支烷基、C3-8
環烷基、C1-6
經取代烷基、C3-8
經取代環烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、C1-6
雜烷基、經取代C1-6
雜烷基、C1-6
烷氧基、苯氧基及C1-6
雜烷氧基;Ar係芳香族部份,其形成多-經取代芳香族碳氫化合物或多-經取代雜芳香族基團;Y1-11
及Y13
可以係相同或不同,及係獨立地選擇自O、S及NR24
;A係選擇自氫、烷基團、目標部分、脫離基、官能基團、診斷劑、及生物性活性部分;X係O、NQ、S、SO、或SO2
,其中Q係H、C1-8
烷基、C1-8
分支烷基、C1-8
經取代烷基、芳基或芳烷基;Z係選擇自活性地運送入目標細胞之部分、疏水部分、雙功能連結部分及其組合;L1-6
及L8
可以係相同或不同,及係獨立選擇之雙功能連結基團;a、c、d、f、g、i、j、j’、k、l、n、o、p、q及t可以係相同或不同,及係獨立地0或正整數,較佳地,在大多數方面中;b、e、r、r’、s、h、h’及m可以係相同或不同,及係獨立地0或1;mPEG係H3
CO(-CH2
CH2
O)u
-及u係正整數,較佳由大約10到大約2,300,及更佳由大約200到大約1000。
在上述之中,較佳係Y1-11
及Y13
為O;R3-8
、R12-21
及R24
係每一獨立地為氫或C1-6
烷基,其中甲基及乙基係最佳之烷基及R9
較佳為CH3
。
本發明之進一步方面中,共軛物之聚合物部分可係為L-天冬醯胺酶提供多個連接點者。這種系統之非限制性清單包含:
及
其中所有變數係與前述所列相同。
可以被應用以製造L-天冬醯胺酶共軛物之經活化聚合物會自然地直接對應於上述之聚合物部分。主要差異係脫離或活化性基團之存在,其幫助聚合系統之可釋放連接到於L-天冬醯胺酶上發現之胺基。因此,化合物(i)-(xiii)包含脫離或活化性基團,像是:p-硝基苯氧基、四氫噻唑硫酮(thiazolidinyl thione)、N-羥基琥珀醯亞胺基
或其他適合之脫離或活化性基團,像是N-羥基苯並三氮唑、鹵素、N-羥基萘二甲醯亞胺基(N-hyrdophthalimidyl)、咪唑基、O-醯基脲類、五氟苯酚或2,4,6-三-氯苯酚或其他對熟習該項技術者而言為顯而易見,且於在共軛反應後L-天冬醯胺酶所連接處發現之適合的脫離基。
一些較佳之經活化PEG包含那些揭示於共同讓渡的美國專利案第5,122,614、5,324,844、5,612,460及5,808,096號,其內容係以引用方式納入本文中。如同會被技術領域中具有通常知識者所領會的,這些共軛反應典型上係在適合之緩衝液中實行,其使用數倍莫耳過量之經活化PEG。一些以線型PEG(像以上提及之SC-PEG)所製成之較佳共軛物,可以含有平均而言從大約20至大約80 PEG鏈每酵素。因此,對這些而言,數百倍之莫耳過量(例如200-1000x)可以被使用。使用於分支聚合物及連接至酵素之聚合物之莫耳過量會較低且可以使用於以下提及之描述相同者案及專利申請案所描述之技術測定。
為本發明之目的,脫離基被視為該等可以與於L-天冬醯胺酶上所發現之胺基(親核基)反應(例如,在Lys上)之基團。
為本發明之目的,前述係亦關於經活化之聚合物連結物。聚合物殘基較佳係基於聚環氧烷的及更佳係基於聚乙二醇(PEG)的,其中PEG係線型或分支。
現在論及以上所描述之經活化的聚合物,咸可以看出Ar係形成多-經取代芳香烴或多-經取代之雜芳基團的部分。關鍵特徵係Ar部份在自然界中為芳香族。一般而言,作為芳香族,π(pi)電子必須在環狀分子平面之上及之下兩者之“電子雲”內被共享。更進一步,π電子的數目必須滿足Huckle規則(4n+2)。該等具有通常知識者會瞭解大量的部分會滿足部分之芳香族需要及因此於此係適合與鹵素及/或側鏈使用,如該等術語在技術領域中被共同一般地了解的。
在本發明之一些較佳的方面中,經活化之聚合物連結物較佳係根據共同讓渡之美國專利案第6,180,095、6,720,306、5,965,119、6624,142及6,303,569號(其等內容係以引用方式納入本文中)製備。在這個背景中,以下經活化之聚合物連結物係較佳:
及
。
在本發明之一個供選擇的方面中,L-天冬醯胺酶聚合物共軛物係使用某些分支或二羥乙甘胺酸聚合物殘基(像是那些於共同讓渡美國專利申請案第7,122,189及7087,229號及美國專利申請案第10/557,522、11/502,108、及11/011,818號所描述者)製造。每一該等專利申請案之揭示係以引用方式納入本文中。一些較佳之經活化聚合物包括:
亦應瞭解以上顯示之脫離基僅係合適基團之一且其它在本文提及者亦可以無需過渡實驗而使用。
在供選擇的方面,經活化之聚合物連結物係使用分支之聚合物殘基(像是那些於共同讓渡美國專利案第5,643,575;5,919,455及6,113,906及6,566,506號(每一之揭示係以引用方式納入本文中)所描述者)製備。如此經活化聚合物對應至聚合物系統(v)-(ix),而以下為代表:
其中B係L-天冬醯胺酶II且所有其他變數係如同先前所定義。
如同以上敘述,R1-2
、R10-11
、及R22-23
每一者較佳係水可溶性聚合物殘基,其較佳係實質上非抗原性,如聚乙二醇(PAO的),且更佳係聚環氧乙烷像是mPEG。為說明而非限制之目的,R1-2
、R10-11
、及R22-23
之聚乙二醇(PEG)殘基部分可以選擇自以下之中:J-O-(CH2
CH2
O)u
-、J-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
C(O)-O-、J-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
CH2
NR25
-、及J-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
CH2
SH-其中:u係聚合的程度,亦即從大約10到大約2,300;R25
係選擇自氫、C1-6
烷基、C2-6
烯基、C2-6
炔基、C3-12
分支烷基、C3-8
環烷基、C1-6
經取代烷基、C2-6
經取代烯基、C2-6
經取代炔基、C3-8
經取代環烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、C1-6
雜烷基、經取代C1-6
雜烷基、C1-6
烷氧基、苯氧基及C1-6
雜烷氧基、且J係加帽基團,亦即在聚合物之末端發現的基團且,在一些方面,可以選擇自NH2
、OH、SH、CO2
H、C1-6
烷基之任一者,較佳係甲基,或其他PEG末端活化性基團,如該等基團被該等具有通常知識者所瞭解者。
在一特定較佳具體實例中,R1-2
、R10-11
、及R22-23
係選擇自以下之中,CH3
-O-(CH2
CH2
O)u
-、CH3
-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
C(O)-O-、及CH3
-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
CH2
NH-及CH3
-O-(CH2
CH2
O)u
-CH2
CH2
SH-,其中u係正整數,較佳係選擇以使得重量平均分子量由大約200至大約80,000 Da。更佳地,R1-2
、R10-11
、及R22-23
獨立地具有由大約2,000至大約42,000 Da之平均分子量,而平均分子量由大約5,000至大約40,000 Da係最佳。其他分子量亦被考慮以符合技術領域中之人士之需求。
PEG係通常藉由以下結構表示:-O-(CH2
CH2
O)u
-且R1-2
、R10-11
、及R22-23
較佳包含此式之殘基。聚合物之聚合的程度代表在聚合物鏈中重複單位之數目及係取決於聚合物之分子量。
亦有用者係聚丙二醇、分支PEG衍生物(像是那些於共同讓渡美國專利案第5,643,575號('575專利案)所描述者)、“星形-PEG”及多臂PEG(像是那些於海鷗股份有限公司(Shearwater Corporation)之2001目錄“用於生醫應用之聚乙二醇及衍生物(polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application)”所描述者)。上述每一者之揭示係以引用方式納入本文中。'575專利案所提供之分支允許二級或三級分支,作為增加在生物性活性分子上由單一連接點之聚合物裝載的方法。咸會瞭解如果需要的話,水溶性聚合物可以被官能化以用於連接至雙功能性連結基團,而無需過渡實驗。
舉例而言,本發明之共軛物可以藉由包括以下者之方法製造:轉換多臂PEG-OH或“星形-PEG”產物(像是那些於NOF Corp.藥物投遞系統目錄,Ver.8,2006四月(其揭示係以引用方式納入本文中)所描述者)成適合地經活化之聚合物,其使用於前面提及之'614或'096專利案描述的活化技術。特別地,PEG可以係分子式:
或
其中:u’係由大約4至大約455之整數,以較佳地提供具有由大約5.000至大約40,000之總分子量之聚合物;及最高至3個殘基之末端部分係以甲基或其他低碳數烷基加帽。
在一些較佳例子中,所有4條PEG臂被轉換為合適之脫離基,亦即,N-羥琥珀醯亞胺碳酸酯(SC)等,以幫助連接至重組蛋白質。在轉換之前的該化合物包含:
及
本文所包含之聚合物質較佳係在室溫為水溶性。這種聚合物之非限制性清單包含聚環氧烷同元聚合物,像是聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物,其條件為嵌段共聚物之水可溶性係維持。
在進一步實例中,及作為基於PAO之聚合物的替代,R1-2
、R10-11
、及R22-23
每一者係可選擇地選擇自一或多種有效地非抗原性材料之中,像是葡聚醣、聚乙烯醇、基於碳水化合物之聚合物、羥丙基甲-丙烯醯胺(hydroxypropylmeth-acrylamide,HPMA)、聚環氧烷、及/或其共聚物。亦可參照共同讓渡美國專利案第6,153,655號,其內容係以引用方式納入本文中。具有通常知識者會了解相同類型之活化被應用,如本文所描述於PAO像是PEG。技術領域中之具有通常知識者會進一步瞭解前述的清單僅係說明性且會考慮所有具有本文所描述之特性的聚合物材料且其他聚環氧烷衍生物(像是聚丙二醇等)亦被考慮。
在本發明之許多方面中,L1-6
及L8
係連結基團,其幫助聚合物鏈(例如R1-2
、R10-11
、及/或R22-23
)的連接。所提供之連結可以係直接的或透過具有通常知識者已知的進一步耦合基團。在本發明之這個方面中,L1-6
及L8
可以係相同或不同且可以選擇自具有通常知識者已熟知之廣泛不同的基團,像是雙功能及雜雙功能之脂肪族及芳香族-脂肪族基團、胺基酸等。因此,L1-6
及L8
係可以係相同或不同及包含像是以下者之基團:-[C(=O)]v’
(CR32
CR33
)t’
-、-[C(=O)]v’
O(CR32
CR33
)t’
O-、-[C(=O)]v’
O(CR32
CR33
)t’
NR36
-、-[C(=O)]v’
O(CR32
CR33
O)t’
NR36
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
)t’
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
)t’
O-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
O)t’
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
O)t’
(CR34
CR35
)y’
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
O)t’
(CR34
CR35
)y’
O-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
)t’
(CR34
CR35
O)y’
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
)t’
(CR34
CR35
O)y’
NR36
-、-[C(=O)]v’
NR31
(CR32
CR33
)t’
NR36
-、
其中:R31
-R37
係獨立地選擇自由氫、胺基、經取代胺基、疊氮基、羧基、氰基、鹵素、羥基、硝基、矽醚、磺醯基、巰基、C1-6
烷基巰基、芳基巰基、經取代芳基巰基、經取代C1-6
烷硫基、C1-6
烷基、C2-6
烯基、C2-6
炔基、C3-19
分支烷基、C3-8
環烷基、C1-6
經取代烷基、C2-6
經取代烯基、C2-6
經取代炔基、C3-8
經取代環烷基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、C1-6
雜烷基、經取代C1-6
雜烷基、C1-6
烷氧基、芳氧基、C1-6
雜烷氧基、雜芳氧基、C2-6
醯基、芳羰基、C2-6
烷氧羰基、芳氧基羰基、C2-6
醯氧基、芳羰基氧基、C2-6
經取代醯基、經取代芳羰基、C2-6
經取代醯氧基、經取代芳氧羰基、C2-6
經取代醯基氧基、經取代及芳羰基氧基所組成的群組中,其中取代基係選擇自由醯基、胺基、醯胺基、脒、芳烷基、芳基、疊氮基、烷基巰基、芳基巰基、羰基、羧酸基、氰基、酯、醚、甲醯基、鹵素、雜芳基、雜環烷基、羥基、亞胺基、硝基、硫代羰基、硫酯、硫代乙酸基、硫代甲酸基、烷氧基、磷醯基、膦酸基、亞膦酸基、矽基、巰基、硫酸基、磺酸基、胺磺醯基、磺胺所組成之群組中;(t’)及(y’)係獨立地選擇自零或正整數,較佳係1到6;且(v’)係0或1。
較佳地,L1-6
及L8
係選擇自以下之中:-C(O)CH2
OCH2
C(O)-;-C(O)CH2
NHCH2
C(O)-;-C(O)CH2
SCH2
C(O)-;-C(O)CH2
CH2
CH2
C(O)-;與-C(O)CH2
CH2
C(O)-。
此外,合適的胺基酸殘基可以選擇自任何已知天然產生的L-胺基酸,其係例如丙胺酸,纈氨酸,白胺酸等及/或其組合(僅舉幾例)。L1-6
及L8
亦可以包括胜肽,舉例而言,其大小範圍從大約2到大約10個胺基酸殘基。
天然產生的胺基酸(以及不同的技術領域已知非天然產生的胺基酸(D或L))之衍生物及類似物(疏水性或非疏水性)亦被預期在本發明之範圍內。
1.脫離或活化性基團
在那些其中A係活化性基團之方面中,合適的部分包括(非限制)像是N-羥基苯并三唑基,鹵素,N-羥基萘二甲醯亞胺基,p-硝苯氧基,咪唑基,N-羥基琥珀醯亞胺基;四氫噻唑硫酮,O-醯基尿素,五氟苯氧基、2,4,6-三氯苯氧基或對於那些具有通常知識者而言係顯而易見的其它合適的脫離基之基團。
為了本發明之目的,脫離基被理解為那些可以與在所欲目標(亦即生物性活性部分、診斷劑、標的部分、雙功能分隔子中間物、等)上發現之親核基反應的基團。因此,標的含有用於置換之基團,像是於蛋白質、胜肽、酵素、天然或化學合成治療分子(像是多柔比星(doxorubicin))分隔物(像是單-保護二胺)上發現之NH2
基團。應瞭解除了生物上活性親核基之外,那些選擇用於A之部分亦可以與其它部分反應。
2.官能基團
A亦可係官能基團。如此官能基團之非限制性例子包括順丁烯二醯亞胺基、乙烯基、碸之殘基、羥基、胺基、羧基、巰基、醯肼、肼基甲酸基(carbazate)卡唑及類似者,其可以透過含胺之分隔子連接到二羥乙甘胺酸部分。一旦被連接到二羥乙甘胺酸部分,官能基團(例如順丁烯二醯亞胺)可以被使用以連接二羥乙甘胺酸-聚合物到標的物,像是多胜肽、胺基酸或胜肽分隔子等之半胱胺酸殘基。
3.烷基基團
在其中A係烷基基團之化學式(I)之那些方面中,合適基團之非限制性清單係由C1-6
烷基、C2-6
烯基、C2-6
炔基、C3-19
分支烷基、C3-8
環烷基、C1-6
經取代烷基、C2-6
經取代烯基、C2-6
經取代炔基、C3-8
經取代環烷基、芳烷基、C1-6
雜烷基、及經取代C1-6
雜烷基所組成。
在本發明之一方面中,Z係L7
-C(=Y12
),其中L7
係選擇自定義L1-6
的群組之中的雙功能連接子,且Y12
係選擇自如同定義Y1
的相同群組之中。在本發明之此方面中,Z基團作為聚合物遞送系統之L-天冬醯胺酶及其餘者之間的連接。在本發明之其它方面中,Z係活性地被運送到標的細胞之中的部分、疏水性部分及其組合。當存在時,Z’可以作為雙功能連接子,活性地被運送到標的細胞之中的部分、疏水性部分、及其組合。
在本發明之此方面中,可釋放之聚合物系統被製備,以致於活體內水解自L-天冬醯胺酶剪切聚合物,及釋放酵素到細胞外液體之中,而仍然連接到Z部分。舉例而言,一個可能的Z-B結合物係白胺酸-L-天冬醯胺酶。
為了說明的目的,合適的共軛反應包括將L-天冬醯胺酶與描述於本文中之合適地被活化的聚合物系統反應。反應係較佳使用具有通常知識者熟知的用於蛋白質修飾的條件來實行,包括使用pH在大約6.5-8.5之範圍的PBS緩衝系統等。咸預期在大部分例子中,過量之經活化聚合物會與L-天冬醯胺酶反應。
此種反應將常常會造成含有一或更多聚合物連接到L-天冬醯胺酶之共軛物的形成。如咸會領會的,分離不同餾分及提供較同質的產物常常係所欲的。在本發明之大部分方面中,反應混合物被收集,裝載入合適的管柱樹脂中及所要的餾分係以增加水平之緩衝液,被連續地洗提出來。餾分係藉由合適的分析工具分析,以在進一步被處理之前測定被共軛結合蛋白質之純度。不管所選擇之合成路徑及所活化的聚合物,共軛物會符合本文中所定義之公式(I)。一些來自本文所描述於此中之合成技術之較佳化合物包括:
其中B係L-天冬醯胺酶。
根據本發明製備之更進一步共軛物包括:
其中所有變數係與以上所描述相同。舉例而言,一些包括於共軛物之具體實例係選擇自由以下所組成之群組。
進一步共軛物包括:
其中B係L-天冬醯胺酶。應用於共軛物之非限制清單係在以下之中
其中B係L-天冬醯胺酶。
特別較佳的共軛物係:
其中mPEG之分子量係從大約10,000到大約40,000。
當使用基於二羥乙甘胺酸之聚合物系統時,兩個較佳的共軛物係:
其中mPEG之分子量係與以上相同。
要注意的是,L-天冬醯胺酶之PEG化會針對總PEG連接物每蛋白質、PEG聚合物大小、及PEG連接子設計憑經驗地優化。用於估計PEG化優化之PEG化L-天冬醯胺酶的關鍵特徵包括試管內試驗(例如酵素活性及穩定性)及活體內試驗(例如藥物動力學及藥力學)兩者。
藉由本文所描述之DNA、載體及宿主細胞所生產之L-天冬醯胺酶係有用於所有技術領域中已知用於Elspar(Merck & Co.,Inc.)及Oncaspar(Enzon)之方法及適應症。因此,發明之L-天冬醯胺酶酵素(無論是聚環氧烷共軛化的,或以未共軛結合之蛋白質)被投藥至需要其之病患,其量係有效於治療疾病或失調或其他對於該治療有反應之情況。技術領域中之人士會領會到適合之量、投藥之路徑及給藥計劃表,其自Elspar及Oncaspar之已知特性推斷。
以下提出之以下非限制性實施例說明本發明之若干方面。
為求獲得L-天冬醯胺酶II酵素(分別商業上可獲自Merck & Co.及Kyowa Hakko Kogyo Co.)之胺基酸序列,對這些蛋白質進行蛋白質序列分析及與已發表之大腸桿菌K-12 ansB基因(GeneBank新添編號M34277)比較。
L-天冬醯胺酶II係如下定序。2 mL之L-天冬醯胺酶II(80 mg/mL;Merck)之分裝係於試劑等級水來稀釋,以產生經稀釋之溶液,其具有5.0 mg/mL之蛋白質濃度。為求在實施蛋白質序列分析前降低生物負荷量(bioburden),經稀釋溶液係透過0.22 μm之濾膜過濾入小管中。相似地,100 mg之L-天冬醯胺酶II(Kyowa Hakko Kogyo)被溶解於20 mL之試劑等級水,以產生5.6 mg/mL之經稀釋溶液並無菌過濾。定量性胺基酸分析、N端序列決定、胜肽圖譜、及質譜分析被使用以測定兩種蛋白質之完整序列。胰蛋白酶消化、胰凝乳蛋白酶消化、Lys-C消化及溴化氰(CnBr)片段被製備及藉由高壓液相層析儀(“HPLC”)分離,及在純化之胜肽上進行質譜分析及胺基酸定序。完整的分析證明在兩種商業上之L-天冬醯胺酶II酵素之間明顯的序列相同。然而,四個胺基酸位置不同於衍生自來自大腸桿菌K-12之天冬醯胺酶之基因序列。這四個不同位置係顯示於下列表1。
編碼大腸桿菌K-12 ansB L-天冬醯胺酶II之基因被改造以表現具有殘基取代(說明於實施例
1之表1)之L-天冬醯胺酶II,如同下述。大腸桿菌K-12 ansB之326成熟胺基酸L-天冬醯胺酶II序列係在978鹼基對片段中編碼,如Jennings MP及Beacham IR所報導(1990J Bacteriol
172:1491-1498;GeneBank No.M34277)。ansB基因(其包含在成熟蛋白質之前的22胺基酸訊號胜肽)係藉由常見的聚合酶連鎖反應(PCR)方法自另一個大腸桿菌K-12品系(GX1210;獲自Genex股份有限公司)選殖。特別地,寡核苷酸5’-TACTGAATTCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCA-3’(SEQ ID NO:4)及5’-ACAGTAAGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCTG-3’(SEQ ID NO:5)被用作為引子,使用Perkin Elmer Gene Amp 9600溫度循環調控機、Taq聚合脢、及標準試劑,使用這些循環參數:30 sec 94℃,30 sec 40℃,1 min 72℃,25個循環。
所放大的~1 kb條帶係在TBE瓊脂糖凝膠電泳上純化,以Eco RI及Hind III消化,及選殖入噬菌體載體M13mp8。ansB基因之DNA序列〔GeneBank No.M34277〕係藉由手動DNA雙去氧定序法確認。接下來,所選殖之ansB基因被使用於定點誘變中,以改變ansB基因的四個密碼子〔在鹼基530之GTG改成GCG
;在鹼基640之ATT改成GAT;在鹼基1205之TCT改成ACT;在鹼基1239之ACC改成AAC〕,以編碼替代的胺基酸(Val127Ala;Asn64Asp;Ser252Thr;及Thr263Asn),其使用Amersham RPN 1523版本2誘變組,如同Whitlow及Filpula所描述〔Single Chain Fvs,In Tumour Immunology.A Practical Approach,Ed.G.Gallagher,R.C.Rees,及C.W.Reynolds,1993,Oxford University press,pp 279-291〕。
特別地,所應用之誘變寡核苷酸係:5’-CAACTTTACCCGCTGTGTAGTTAG-3’(SEQ ID NO:6)用於Val127Ala改變;5’-CAGCCAGACATCATCGTTCATGTC-3’(SEQ ID NO:7)用於Asn64Asp改變;5’-GTCGAACACAGTTTTATACAGGTTGC-3’(SEQ ID NO:8)用於Ser252Thr改變;5’-CTGCAGTACCGTTTTTCGCGGCGG-3’(SEQ ID NO:9)用於Thr263Asn改變。所有四個改變係在單一批中被製造及DNA定序確認經修飾之ansB基因序列〔此處命名為ansB*
基因(SEQ ID NO:2)〕。
ansB*
基因進入質體pET-27b+(Novagen股份有限公司)之選殖係藉由利用PCR擴增分別在基因的5’及3’端導入側翼限制酶位點(NdeI及BamHI)來完成。在以限制酵素NdeI及BamHI消化合成之DNA之後,1千個鹼基基因係經由T4 DNA連接酶連接入質體載體pET-27b(+)質體中,其亦已經以這兩種酵素消化。重組之質體係使用BTX Electro Cell Manipulator 600(根據製造商之說明)藉由電穿孔導入大腸桿菌
品系BLR(DE3)中。
pET載體建構物將ansB*
基因放置於T7啟動子之後,其可因IPTG的添加而被誘導。IPTG誘導染色體T7 RNA聚合脢基因之表現,其係在lacUV5啟動子控制之下及T7RNA聚合脢接著轉錄ansB*
基因,產生ansB*
蛋白質產物的高度表現。
轉型混合物被塗在含有卡那黴素(kanamycin,15μg/ml)的LB瓊脂平板上,以使用於選擇含有質體pET-27b(+)/ansB*
的菌落。如同FIG.1所述,此係稱為為質體pEN537。經分離之菌落係進一步純化,其藉由塗盤及針對IPTG可誘導之基因表現分析(藉由標準方法,像是那些於Novagen pET系統手冊第九版描述者)。基因序列係使用Applied Biosystems Prism 310 Genetic Analyzer來證實。
品系EN538係在37℃被培養於具有卡那黴素(15μg/ml)之LB培養基中。在OD600
大約為0.8時,IPTG(1 mM)被加入培養及允許基因表現之誘導進行2、3、或4 hr。培養之SDS-PAGE分析確認34.6 kDa ansB*
多肽的高度表現。使用抗大腸桿菌天冬醯胺酶II兔子多株抗體之西方墨點分析證實在SDS-PAGE上主要被誘導的蛋白質條帶係L-天冬醯胺酶II。
因為L-天冬醯胺酶II正常被分泌至周質空間中,接著訊號胜肽移除,額外的實驗被實施以檢驗在細胞或培養基中天冬醯胺酶之位置。培養物被離心及形成小丸之細胞被重新懸浮於溶菌酶溶液以破壞細胞壁,其係在藉由SDS-PAGE檢驗可溶及不可溶細胞相關蛋白質,加上在培養過程中釋放到生長培養基中之蛋白質之前。
這些分析證實在37℃下3或4 hr之誘導提供大約所有細胞蛋白質之30%之幾乎最高anSB*
表現。至少70%之天冬醯胺酶可以藉由溶菌酶處理由細胞小丸中被溶解。在培養過程中,釋放至生長培養基中的天冬醯胺酶量係大約所有所表現天冬醯胺酶之25%。
藉由溶菌酶處理由胞外質釋放之可溶性天冬醯胺酶被進一步檢驗酵素活性,其使用測量天冬胺酸(來自受質(天冬醯胺)之天冬醯胺酶反應之產物)之RP-HPLC分析。來自經IPTG誘導樣品之粗萃取中之酵素活性係大約60 IU/mg,而由未經誘導培養所製備之樣品中僅大約2 IU/mg。因為在此階段蛋白質只有大約20%的純度,此與所報導之純L-天冬醯胺酶II之比活性(~250-300 IU/mg)充分相符。此天冬醯胺酶製備物之N端序列分析亦使用Applied BioSystems PROCISE蛋白質定序儀來完成。N端序列LPNITILATGGTIAGGGDSA(SEQ ID NO:10)精準地與所預測之成熟、正確地加工的天冬醯胺酶之N端蛋白質序列相符。LC-MS分析(Jupiter C-18反相管柱)亦在此樣品施行。主要蛋白質種類展現34,592之質量,其精準地所預測成熟ansB*
天冬醯胺酶質量相符。沒有帶有正亮胺酸取代之蛋白質種類之證據被觀察到。
染色體DNA係自大腸桿菌BLR(DE3)〔獲自Nrvagen股份有限公司;Cat.No.69208-3〕製備。2 mL BLR培養(在37℃下生長於含有卡那黴素(15μg/ml)之LB培養液)係在微量離心機中離心2 min及細胞小丸被重新懸浮於0.5 mL之STET緩衝液。酚/氯仿(0.5 mL)被加入及混合物被震盪及在室溫下離心5 min。上清液被收集及與50 μL之3M醋酸鈉及1 mL之乙醇混和。在冰上培養10 min之後,DNA係藉由離心小丸化及重新懸浮於100μL之水中。PCR係在樣品上實施以分離染色體ansB基因。PCR反應混合物包含5 μL之10×高保真度PCR緩衝液(10×High Fidelity PCR Buffer)、5 μL之10 mM dNTP混和、1 μL之50 mM硫酸鎂、0.5 μL(50 pmol)之寡聚核苷酸5’-GATCCATATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCAC-3’(SEQ ID NO:11)、0.5 μL(50 pmol)之寡聚核苷酸5’-GTACGGATCCTCATTAGTACTGATTGAAGATC-3’(SEQ ID NO:12)、1 μL之BLR DNA、36 μL之蒸餾水、及1 μL之白金級Taq高保真度聚合酶(Platinum Taq High Fidelity polymerase)。PCR產物係使用商業上之TOPO選殖系統(獲自Invitogen股份有限公司)及藉由製造者所述實施選殖。
使用PCR產物及TOPO TA載體之選殖反應係在室溫下在6 μL中實施30 min。反應之黏合產物被轉型至勝任TOP10大腸桿菌細胞及塗於具有卡那黴素選擇性之LB瓊脂平板上。所選殖ansB BLR染色體基因及pEN537 ansB*
基因之DNA序列分析係在質體上實施,其使用Applied Biosystems Prism 310 Genetic Analyzer。兩股皆被定序。ansB BLR基因及pEN537 ansB*
基因之編碼序列相異之處為在成熟蛋白質之編碼序列中之29個錯配鹼基分配。然而,這些鹼基之取代不會造成胺基酸序列之任何改變,其係因為密碼子之簡併。來自BLR之所編碼之ansB蛋白質及來自pEN537之所編碼之ansB*
蛋白質被確認於胺基酸序列係相同。所有326個位置於這兩種天冬醯胺酶蛋白質中皆被係顯示為相同。
下述之程序係改造自Harms等人,1991蛋白質表現及純化
(Protein Expression and Purification)2:144-150。
大腸桿菌品系EN538的培養,如同上文描述,係於振盪培養箱中,在37℃下生長於存在卡那黴素(15μg/ml)之Luria液體培養基。在OD660
0.8時,IPTG係加入至最終濃度為1 mM,及生長持續額外4 h。細胞係藉由離心收集。為了分析之目的,2 mL之培養物被使用。
為製備細胞萃取物,小丸被懸浮於1 mL之裂解緩衝液(50 mM KPO,pH 7.5,1mM EDTA,0.5mM二硫蘇糖醇)及藉由微流化裂解細胞。細胞碎片係藉由離心去除及上清液體係被針對L-天冬醯胺酶II活性分析及亦被使用於藉由聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)評估酵素產生。滲壓衝擊分餾法(osmotic shock fractionation)係以如同Boyd等人(1987,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 84:8525-8529,其係以引用方式納入本文中)所述實行。簡言之,小丸被懸浮於2 mL之球芽(spheroblast)緩衝液(0.1 M Tris-HCl,pH 8.0,0.5 M蔗醣,0.5 M EDTA),在冰上培養5 min,及離心。小丸被回溫至室溫,重新懸浮於0.3 mL之冰冷水,在冰上培養5 min,及再次離心。上清之胞外質部分被使用(無進一步處理)於活性測定及電泳。
為了大規模L-天冬醯胺酶II製備,細胞係生長於批次培養基(10升)及進行上述之滲壓衝擊法。50-100 ml之球芽緩衝液及30-40ml之水係被應用在每升培養物。下述程序開始於獲得自2升培養物之胞外質萃取物。所有步驟係在5-10℃下實行。
29.5 g之固體硫酸銨被加入100 mL之上清液體,以給定50%之飽和度。在2小時之後,沈澱物係藉由離心去除,及小丸被丟棄。上清液係以硫酸銨(29.5加到100 mL)帶到90%之飽和度。在小丸放置隔夜之後,藉由離心收集它,溶解於數毫升之25 mM哌-HCl,pH 5.5緩衝液,及以相同緩衝液透析。此相同程序亦應用於剩餘之細胞培養基以回收所分泌之L-天冬醯胺酶II。
多緩衝液交換器PBE 94之1×30-cm管柱係以200 ml之以上哌-HCl緩衝液(起始緩衝液)平衡。在加入樣品溶液(10 mL)之後,管柱係以200 ml洗提緩衝液(多緩衝液74(Polybuffer),以H2
O稀釋10倍及以HCl調整至pH 4.0),在流速30 mL/h下洗提。2 mL之餾分係被收集及在適當20μL樣品之稀釋之後針對L-天冬醯胺酶II活性分析。含L-天冬醯胺酶II之餾分係被混合及對飽和之硫酸銨溶液透析。酵素小丸物係以90%硫酸銨清洗及在此培養基中以懸浮液儲存。
大腸桿菌品系EN538的培養(如同上文描述)係於發酵槽中,在25至37℃下生長於存在卡那黴素(15μg/ml)之培養基中〔例如,如於以下者描述:Filpula,D.,McGuire,J.及Whitlow,M.(1996)單體及多體單鏈Fv的生產(Production of single-chain Fv monomers and multimers),於抗體工程學:實用方法(Antibody Engineering:A Practyical Approach)(J.McCafferty、H.Hoogenboom、及D.J.Chiswell,des;Oxford University press,牛津,UK)pp 253-268〕。在OD660
20到200時,IPTG被加入至最終濃度為0.1-1 mM,及繼續生長額外1-12 h。細胞係藉由離心收集及通過Manton-Gaulin細胞均質機。細胞溶胞物係在6℃下在24,300 g離心30 min及上清液係被收集及進行超濾(ultrafiltration)/透析過濾(diafiltration),及導電率被調整至3 mS。溶胞物之pH係以25%醋酸調整至4.1及以緩衝液(5 mM醋酸鈉,25 mM NaCl,pH 4.1)透析過濾。
天冬醯胺酶係在S-Sepharose陽離子交換管柱層析上被捕捉。所結合之天冬醯胺酶係以12.5 mM磷酸鉀,25 mM NaCl,pH 6.4(緩衝液NK64)洗提。
由S-Sepharose樹脂層析所收集之天冬醯胺酶高峰餾分係被混和及0.1%Tween 80被加入及在室溫中培養20 min。一倍體積之緩衝液NK64被加入及樣品係被注入到Q-Sepharose管柱上。Q管柱係以Q-25緩衝液(25 mM NaCl,10 mM磷酸鉀pH 6.4)清洗及然後天冬醯胺酶係以緩衝液Q-135(135 mM NaCl在10 mM磷酸鉀pH 6.4中)洗提。
所混和之酵素餾分係加入硫酸鎂粉末到最終濃度0.25 M及被注入到苯基疏水性交互作用管柱中(以在10 mM磷酸鉀pH 7.8中之0.25 M MgSO4
預先平衡)。天冬醯胺酶係在流經流動中透過餾分收集及在Filtron單位(使用30 kDa分子量直徑之聚諷膜,與緩衝液,75 mM NaCl,10 mM磷酸鉀,pH 7.2)中透析過濾。
天冬醯胺酶餾分係以等體積之水稀釋及注入到羥基磷灰石管柱中。雜質係以緩衝液H15(50 mM NaCl,15 mM磷酸鉀pH 7.8)洗提而被移除。所純化之天冬醯胺酶係以緩衝液H150(50 mM NaCl,150 mM磷酸鉀pH 7.8)洗提。
大腸桿菌品系EN538之培養(其如同在實施例六中所描述生長、誘導、及均質化)係以50 kDa Microgon中空纖維在流速2.9 L/min,16 psi下,使用八倍產物體積針對20 mM醋酸鈉,40 mM NaCl,pH 4.6透析過濾直到A280
係低於0.1及導電率係5 mS。產物係使用0.22 μm膜過濾。
陽離子交換層析係以Poros-HS管柱來實施。管柱係在20 mM醋酸鈉,pH 4.6,40 mM NaCl中平衡。經透析過濾淨化之培養液基在0.5管柱體積(CV)/min下被注入及管柱係以5 CV之20 mM醋酸鈉,pH 4.6,40 mM NaCl清洗。天冬醯胺酶係以20 mM醋酸鈉,pH 4.6,135 mM NaCl洗提。
以上產物係被加入0.2 M之磷酸氫二鈉,pH 9.2以調整pH至6.3。然後,樣品係以50 kDa Microgon中空纖維在流速0.74 L/min,16.5 psi下對10 mM醋酸鈉,pH 6.3透析過濾。
陰離子交換層析係在TMAE Fractogel上實施。管柱係在10mM醋酸鈉,pH 6.4中平衡。所透析過濾之陽離子管柱洗提物係在0.5CV/min下注入及管柱係以5CV之10mM醋酸鈉,pH 6.4清洗。管柱係係進一步以5CV之10mM醋酸鈉,pH 6.4,25mM NaCl清洗。天冬醯胺酶係以10mM醋酸鈉,pH 6.4,100mM NaCl洗提。
產物係以50kDa膜,針對10mM醋酸鈉,pH 7.5透析過濾至濃度為40mg/mL及經由0.22μm膜過濾。
以下生物性材料之培養已經被寄存於以下國際寄存機構:美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)
10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,U.S.A.
其係在滿足國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約之需求的條件下。
大腸桿菌/EN538亦以寄存編號BCRC 940535寄存在食品工業發展研究所。
圖1圖解pEN537質體載體之圖譜。
<110> 大衛雷菲爾普拉王懋梁<120> 用於生產L-天冬醯胺酶Ⅱ的重組宿主<130> 213.1239-U <140> TW096123026 <141> 2007-06-26 <150> 60/817,817 <151> 2006-06-30 <160> 12 <170> PatentIn 3.4版<210> 1 <211> 326 <212> PRT <213> 大腸桿菌<400> 1 <210> 2 <211> 1530 <212> DNA <213> 大腸桿菌<400> 2 <210> 3 <211> 1044 <212> DNA <213> 大腸桿菌<400> 3<210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 4<210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 5 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 6 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 7<210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 8<210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 9<210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> 大腸桿菌<400> 10<210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 11<210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> 寡核苷酸引子<400> 12
Claims (16)
- 一種用於生產大腸桿菌L-天冬醯胺酶II酵素之重組大腸桿菌宿主細胞,其包括大腸桿菌染色體及至少一個重組染色體外載體之複製體,其中該重組染色體外載體編碼L-天冬醯胺酶II酵素之次單位,其中該宿主細胞染色體亦編碼L-天冬醯胺酶II酵素之相同次單位,且其中該宿主染色體不編碼任何其他L-天冬醯胺酶II之同功型,其中所編碼的L-天冬醯胺酶II次單位包括SEQ ID NO:1且其中該重組染色體外載體包括SEQ ID NO:2之DNA分子。
- 根據申請專利範圍第1項之重組大腸桿菌宿主細胞,其中該染色體外載體係質體。
- 根據申請專利範圍第1項之重組大腸桿菌宿主細胞,其中該編碼L-天冬醯胺酶蛋白質之DNA分子係操作性地連接到適合的啟動子。
- 根據申請專利範圍第3項之重組大腸桿菌宿主細胞,其中該啟動子係選擇自由T7、araB、λ PL 、λPR 、phoA、trc、及trp啟動子所組成之群組。
- 根據申請專利範圍第3項之重組大腸桿菌宿主細胞,其中該重組染色體外載體進一步包括操作子、核糖體結合位置、訊號序列、轉錄終止子、抗生素篩選標記、複製起點、及受調控的抑制子之複製體。
- 根據申請專利範圍第3項之重組大腸桿菌宿主細胞,其中該宿主細胞染色體包括根據SEQ ID NO:3之DNA分子。
- 一種經分離的核酸分子,其編碼SEQ ID NO:1之L-天冬醯胺II酶酵素次單位,其係選擇自由根據SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3之核酸分子所組成的群組。
- 根據申請專利範圍第7項之經分離的DNA分子,其包括SEQ ID NO:2。
- 一種重組染色體外載體,其包括係SEQ ID NO:2且編碼L-天冬醯胺酶II酵素之次單位之根據申請專利範圍第7項之核酸分子。
- 根據申請專利範圍第9項之重組染色體外載體,其係質體。
- 根據申請專利範圍第10項之重組染色體外載體,其係質體pEN537。
- 根據申請專利範圍第9項之重組染色體外載體,其中SEQ ID NO:2操作性地連接到適合的啟動子。
- 根據申請專利範圍第12項之重組染色體外載體,其中該啟動子係選擇自由T7、araB、λ PL 、λPR 、phoA、trc、及trp啟動子所組成之群組。
- 一種大腸桿菌宿主細胞,其包括根據申請專利範圍第11項之質體,其係命名為EN538及以食品工業發展研究所寄存編號BCRC 940535寄存。
- 一種生產實質上不含其它L-天冬醯胺酶II同功型之重組L-天冬醯胺酶II酶酵素的方法,其包括培養根據申請專利範圍第14項之宿主細胞,及分離所生產之L-天冬醯胺酶II酵素。
- 根據申請專利範圍第15項之方法,其進一步包括將重組L-天冬醯胺酶II酵素共軛至至少一種聚環氧烷聚合物。
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