TWI425096B - 利用生物分子改質基板表面的方法 - Google Patents

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TWI425096B
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ming yu Lin
Yuh Shyong Yang
Yen Pei Lu
Chih Heng Lin
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Nat Applied Res Laboratories
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

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Description

利用生物分子改質基板表面的方法
本發明是有關於一種改質方法，特別是一種利用生物分子改質基板表面的方法，以使其回復原來未接上待測物的狀態或改變基板表面的化學特性，該發明可應用於改變生物感測器表面特性。
生物感測器可定義為「使用固定化的生物分子探針(bio-molecule probe)結合信號換能器(transducers)及電子元件，藉由生物分子探針與待測物特異性交互作用後產生物理訊號，用來偵測生物體內或體外的化學物質的一種裝置」。例如，利用如酵素或抗體等生物分子將系統中的化學物質濃度(如葡萄糖、鉀離子或膽固醇等)，轉換成電子訊號或光學訊號，以測定微量成份。而由於常用於臨床的檢查，因此對於精準度的要求相當的高。
將特定生物分子探針(去氧核糖核酸、蛋白質...等)固定於生物感測器的基板表面，不僅功能化生物感測器的基板表面，同時也提供生物感測器檢測之靈敏度與專一性。然而，一旦固定於生物感測器基板表面的生物分子探針接上了待測物，要使生物分子探針再生成原來尚未檢測的狀態是非常困難。故，大多數的生物晶片或是生物感測器是一次性使用，只可進行定性分析，無法重複使用，因此價格昂貴。
傳統上必須利用強酸、強鹼或高溫處理生物分子探針，使生物分子探針上的待測物脫離，並回復至未檢測之狀態。但，這對任何生物感測器之生物分子探針或是電子元件是一種不可逆的傷害，同時也影響了生物感測器的精準度，使生物感測器無法再次使用。此外，傳統使生物分子探針上的待測物脫離之方法係利用強酸、強鹼或高溫處理，可能會傷害生物感測器基板表面，使另一生物分子無法再功能化基板表面，使生物感測器無法再次使用。
綜上所述，現行改質基板表面的方法仍有著傷害生物感測器電子元件、降低生物感測器檢測之精準度，進而有無法再生並再次利用該生物感測器、且價格昂貴等缺點，實需一良好的解決方案。
有鑑於現有技術使生物分子探針上的待測物脫離之方法有傷害生物感測器電子元件、無法再生生物感測器、降低檢測精準度以及價格昂貴等缺點，本發明人予以改良發明，本發明之目的即為利用本發明之利用生物分子改質基板表面的方法，以解決現有技術之缺陷。
根據本發明之其中一目的，係提供一種利用生物分子改質基板表面的方法，該方法包括下列步驟：提供包含18至3000個鹼基之複數個重複序列的DNA探針固定於基板上，其中複數個親合性結合標記(affinity binding tag)係分別藉由互補於各重複序列且共軛於親合性結合標記之單股DNA附著至DNA探針，而分別共軛於親和性標記(affinity tag)之複數個第一蛋白質係藉由親合性標記與親合性結合標記間之可逆性反應而附著至DNA探針；加入複數個第二蛋白質，第二蛋白質分別與共軛於第一蛋白質之相同親合性標記共軛，且第二蛋白質之濃度大於第一蛋白質之濃度；以及藉由競爭使單股DNA上的第一蛋白質置換為第二蛋白質。。
較佳地，單股DNA之鹼基在15至35個之間。
較佳地，親合性標記可包含鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)，親合性結合標記可包含生物素(biotin)。
較佳地，第一蛋白質與第二蛋白質可包含鹼性磷酸酶(Alkaline phospatase)或山葵過氧化氫酶(Horseradish peroxidase)。
較佳地，基板可為生物晶片或生物檢測器。
此外，根據本發明之另一目的，提出一種利用生物分子改質基板表面的方法，方法包括下列步驟：提供一生物分子，生物分子結合至少一第一單股DNA，第一單股DNA與生物分子間具有第一自由能(△G1)。加入第二單股DNA，第二單股DNA與第一單股DNA間具有第二自由能(△G2)，且第二自由能小於第一自由能。以及藉由熱力學原理使第一單股DNA脫離生物分子並與第二單股DNA結合。
較佳地，生物分子可包含18至3000個鹼基之DNA 探針。
較佳地，第一單股DNA及第二單股DNA之鹼基在15至35個之間。
較佳地，第一自由能及第二自由能為負值。
較佳地，第一單股DNA可部分互補於生物分子，第二單股DNA與第一單股DNA完全互補。
較佳地，生物分子可應用於生物晶片或生物檢測器。
本發明的利用生物分子改質基板表面的方法，能在室溫及不需酸鹼化學試劑處理下，藉由化學競爭原理或熱力學原理，取代原本已鍵結之待測物，回復原來未接上待測物的狀態，亦可改變生物感測器基板表面的化學特性。本發明加入較高濃度的競爭物質取代原有的親合性結合，以達到將原具有特定功能的物質(如酵素)取代成具同一功能或另一功能的物質，以改變原有基板表面之功能性，使原有基板表面再功能化。另一方面，本發明亦適用於利用較強自由能配對的DNA互補之原理，使得原本已結合待測物並雙股配對之DNA回復成原有之單股DNA探針，以再生該DNA探針。
承上所述，依本發明之利用生物分子改質基板表面的方法，其可具有一或多個下述優點：
(1)本發明之利用生物分子改質基板表面的方法可適用於各種生物感測器及生物晶片的基板表面，使用者使用同一組生物感測器進行檢測，可維持訊號精確度(precision)與待測物的專一性(specificity)。
(2)本發明之利用生物分子改質基板表面的方法不需強酸、強鹼或高溫，於室溫下即可反應，不易傷害生物感測器之基板表面及電子元件，保持原基板表面之化學性質。
(3)本發明之利用生物分子改質基板表面的方法可有效置換大於90%的單股DNA，且可有效取代大於83%之酵素，使生物感測器之基板表面可進行如再功能化及再生之表面改質。
(4)本發明之利用生物分子改質基板表面的方法可使生物感測器及生物晶片進行如再功能化及再生之表面改質，故生物感測器及生物晶片可重複使用，降低檢測成本。
本發明以後述具體實施例進行詳述，並非對本發明作任何限制。
實施例一：DNA探針之再功能化
請參見第1及2圖，第1圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之步驟流程圖；第2圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之示意圖。如圖所示，本發明之利用生物分子改質基板表面的方法包含下列步驟：步驟S11，提供包含18至3000個鹼基之複數個重複序列的DNA探針固定於基板上，其中複數個親合性結合標記(affinity binding tag)係分別藉由互補於各重複序列且共軛於親合性結合標記之單股DNA附著至DNA探針，而分別共軛於親和性標記(affinity tag)之複數個第一蛋白質係藉由親合性標記與親合性結合標記間之可逆性反應而附著至DNA探針；步驟S12，加入複數個第二蛋白質，第二蛋白質分別與共軛於第一蛋白質之相同親合性標記共軛，且第二蛋白質之濃度大於第一蛋白質之濃度；以及步驟S13，藉由競爭使單股DNA上的第一蛋白質置換為第二蛋白質。
於本實施例之一較佳態樣中，生物分子11可為去氧核糖核酸(DNA)、酵素、抗體、受體(receptors)或任何可應用於生物感測器或生物晶片之生物分子，本發明中以單股DNA作為DNA探針為例，本發明之DNA探針長度介於18至3000個鹼基，較佳為500至2500個鹼基，但不以此為限。
於本實施例之一較佳態樣中，第一蛋白質13與第二蛋白質14可分別藉由親合性標記(affinity tag)15結合在至少一單股DNA之親合性結合標記(affinity binding tag)16上，親合性標記15與親合性結合標記16為配對使用，例如生物素-鏈黴抗生素蛋白(biotin-streptavidin)、組胺酸標記-鎳離子(His tag-Ni2+)、麩胱甘肽-S-轉移酶標記-麩胱甘肽(Glutathione-S-Transferase tag-glutathione)等，可視實驗需求或實驗條件在其中選擇適合之親合性標記15與親合性結合標記16，本發明中之親合性標記15為鏈黴 抗生素蛋白(streptavidin)，親合性結合標記16為生物素(biotin)作為示範，但不以此為限。
其中，親合性標記15與親合性結合標記16之結合為可逆性結合，例如蛋白質A與蛋白質B分別標定親合性標記15與親合性結合標記16，當蛋白質A與蛋白質B藉由親合性標記15與親合性結合標記16結合時，可加入高濃度之標定親合性標記15之蛋白質C，以取代標定親合性標記15之蛋白質A與蛋白質B結合；此時，親合性標記15與親合性結合標記16為可逆性結合。
於本實施例之一較佳態樣中，單股DNA12之序列可依DNA探針之序列任意設計，本發明以序列識別號：1之單股DNA12為例，其於5’端更修飾一生物素。
於本實施例之一較佳態樣中，第一蛋白質13與第二蛋白質14可為相同或不同之酵素、抗體或蛋白質，本發明中，以第一蛋白質13與第二蛋白質14為不同之酵素為例。其中，第一蛋白質13為鹼性磷酸酶(Alkaline phospatase)，第二蛋白質14為山葵過氧化氫酶(Horseradish peroxidase)；於本實施例之另一較佳態樣中，第一蛋白質13為山葵過氧化氫酶，第二蛋白質14為鹼性磷酸酶，並不以此為限。
此外，本發明之利用生物分子改質基板表面的方法中之生物分子可應用於各種生物晶片或生物檢測器，例如血糖機、血脂機、微陣列生物晶片等，並不以此為限。
實施例二：DNA探針之再生方法
請參見第3及4圖，第3圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第二實施例之步驟流程圖；第4圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第二實施例之示意圖。如圖所示，本發明之利用生物分子改質基板表面的方法包括下列步驟：步驟S21，提供一生物分子，生物分子結合至少一第一單股DNA，第一單股DNA與生物分子間具有第一自由能(△G1)；步驟S22，加入第二單股DNA，第二單股DNA與第一單股DNA間具有第二自由能(△G2)，且第二自由能小於第一自由能；以及步驟S23，藉由熱力學原理使第一單股DNA脫離生物分子並與第二單股DNA結合。
於本實施例之一較佳態樣中，生物分子21可為去氧核糖核酸(DNA)、酵素、抗體或任何可應用於生物感測器或生物晶片之生物分子，本發明以單股DNA作為DNA探針為例，且DNA探針長度介於18至3000個鹼基，較佳為500至2500個鹼基，但不以此為限。
於本實施例之一較佳態樣中，為避免單股DNA產生第一單股DNA22及第二單股DNA23之長度介於12至40個鹼基之間，較佳為15至35個鹼基，本實施例中以21個鹼基為例，其中序列識別號：2之第一單股DNA22以靠近5’端之15個鹼基與DNA探針部份互補，並於3’端再延伸出6個鹼基，且第一單股DNA22於3’端更修飾一生物素；此外，如序列識別號：3之第二單股DNA23與序列識別號：2之第一單股DNA22完全互補。
於本實施例之一較佳態樣中，第一自由能(△G1)及第二自由能(△G2)為負值，較佳地，於本實施例中，第一自由能(△G1)及第二自由能(△G2)分別為-15.94kcal/mL及-22.72kcal/mL。
此外，本發明之利用生物分子改質基板表面的方法中之生物分子可應用於各種生物晶片或生物檢測器，例如血糖機、血脂機、微陣列生物晶片等，並不以此為限。
實施例三：本發明之較佳實施例
為了使本領域具有通常知識者能夠據以實施本發明，故將以下闡述本發明之較佳實施例。須注意的是，以下所有參數以及化學試劑等僅作為解釋之用，並非作為限制本發明之態樣。
DNA探針之再功能化
加入於5’端修飾生物素(biotin)之單股DNA(1.3μM；序列識別號：1)與DNA探針反應，使單股DNA結合至DNA探針。接著使用磷酸鹽緩衝液清洗後，加入150μL之牛血清白蛋白(BSA)進行阻斷作用(blocking)。利用300μL洗滌緩衝液(washing buffer)清洗三次，洗去多餘之牛血清白蛋白。接著加入70μL的鏈黴-鹼性磷酸酶溶液(7.2nM)或鏈黴-山葵過氧化氫酶溶液(5nM)，並於25℃下反應45分鐘，以使鹼性磷酸酶或山葵過氧化氫酶接上DNA探針，使DNA探針功能化。最後，利用300μL洗滌緩衝液清洗三次，洗去多餘之試劑、酵素及DNA。
分別於已接上鏈黴-鹼性磷酸酶或鏈黴-山葵過氧化氫酶的DNA探針中，加入不同濃度的鏈黴-山葵過氧化氫酶(0，3.5，17.5，350nM)或鏈黴-鹼性磷酸酶(0，7，35，700nM)，競爭生物素結合區域(biotin binding site)，以取代原本已結合在DNA探針的鏈黴-鹼性磷酸酶或鏈黴-山葵過氧化氫酶。
為了確認測到的酵素活性是來自功能化之DNA探針，DNA探針與基板表面相接之一端設計有酵素HindIII的切點，當加入酵素HindIII反應時可移除DNA探針。加入20單位的限制酵素HindIII，於37℃下反應50分鐘，以移除DNA探針及與其結合之酵素。
DNA探針之再生
加入已於3’端修飾生物素(biotin)之第一單股DNA(1.3μM；序列識別號：2)與DNA探針反應，使第一單股DNA結合至DNA探針。接著使用磷酸鹽緩衝液清洗後，加入150μL之牛血清白蛋白(BSA)進行阻斷作用(blocking)。利用300μL洗滌緩衝液(washing buffer)清洗三次，洗去多餘之牛血清白蛋白。更進一步，加入70μL之鏈黴-山葵過氧化氫酶(4.8nM)，使鏈黴-山葵過氧化氫酶藉由第一單股DNA之生物素結合至DNA探針上，以功能化DNA探針，並做為第一單股DNA探針脫離效果之指標。
為了自DNA探針上移除第一單股DNA探針並再生DNA探針，設計與第一單股DNA完全互補的第二單股 DNA(序列識別號：3)，並加入100μL之不同濃度的第二單股DNA(0，1，2，3μM)於37℃下反應60分鐘，與DNA探針競爭與第一單股DNA結合。
測定酵素活性
將已功能化的DNA探針以300μL洗滌緩衝液清洗三次後，進行測定酵素活性。當測定山葵過氧化氫酶活性時，加入150μL四甲基聯苯胺溶液(0.1μg/μL)，在25℃孵育10分鐘後，取出100μL反應後的四甲基聯苯胺溶液並加至96孔盤(96-well microtiter plates)中，接著利用多功能化學發光全自動檢測儀(Victor Multilabel Counter,Perkin-Elmer Life Science,Inc.；USA)進行測定波長650nm之吸光值。當測定鹼性磷酸酶活性時，加入150μL對硝基苯磷酸酯(Sigma)，在25℃孵育30分鐘後，利用多功能化學發光全自動檢測儀進行測定波長405nm之吸光值。
實驗結果
1. DNA探針之再功能化
請參見第5A及5B圖，第5A圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之第一態樣之酵素活性圖；第5B圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之第一態樣之酵素活性圖。如第5A圖所示，原本被山葵過氧化氫酶功能化的DNA探針，結合在DNA探針上的鏈黴-山葵過氧化氫酶逐漸被鏈黴-鹼性磷酸酶取代。更詳細的說，在加入700 nM的鏈黴-鹼性磷酸酶競爭之下，約有83%結合於DNA探針的鏈黴-山葵過氧化氫酶被鏈黴-鹼性磷酸酶取代。也就是說，原有0.81mU(1.63fmole)的山葵過氧化氫酶結合於DNA探針上，但加入鹼性磷酸酶後，大約0.05mU(0.17fmole)的鹼性磷酸酶取代山葵過氧化氫酶而結合於DNA探針上。更進一步，加入不同濃度的鹼性磷酸酶競爭後，所測到的山葵過氧化氫酶酵素活性以濃度依賴性(concentration dependent)之方式逐漸減少，且鹼性磷酸酶酵素活性以濃度依賴性之方式逐漸增加，也就是說，鏈黴-鹼性磷酸酶與鏈黴-山葵過氧化氫酶兩者同時競爭與單股DNA上標定的生物素結合。
相似地，如第5B圖所示，原本被鹼性磷酸酶功能化的DNA探針，結合在DNA探針上的鏈黴-鹼性磷酸酶逐漸被鏈黴-山葵過氧化氫酶取代。更詳細的說，在加入350nM的鏈黴-鹼性磷酸酶競爭之下，約有88%結合於DNA探針的鏈黴-鹼性磷酸酶被鏈黴-山葵過氧化氫酶取代。也就是說，原有0.04mU(0.15fmole)的鹼性磷酸酶結合於DNA探針上，但加入山葵過氧化氫酶後，大約1.71mU(3.43fmole)的山葵過氧化氫酶取代鹼性磷酸酶而結合於DNA探針上。更進一步，加入不同濃度的山葵過氧化氫酶競爭後，所測到的鹼性磷酸酶酵素活性以濃度依賴性之方式逐漸減少，且山葵過氧化氫酶酵素活性以濃度依賴性之方式逐漸增加，也就是說，鏈黴-鹼性磷酸酶與鏈黴-山葵過氧化氫酶兩者同時競爭與單股DNA上標定的生物素結合。
此外，如第5B圖所示，為確認所測到的酵素活性皆來自結合於DNA探針上之酵素，因此加入限制酵素HindIII切去DNA探針。加入HindIII切去DNA探針後，原本所測到之山葵過氧化氫酶酵素活性幾乎都被去除，表示所測到的山葵過氧化氫酶活性皆來自結合於DNA探針上之山葵過氧化氫酶。
2. DNA探針之再生
請參見第6圖，第6圖係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第二實施例之酵素活性圖。如圖所示，隨著加入第二單股DNA的濃度增加，DNA探針上測到之山葵過氧化氫酶酵素活性隨著逐漸減少。也就是說，原結合於DNA探針上，具有山葵過氧化氫酶酵素活性之第一單股DNA，在加入第二單股DNA後，脫離了DNA探針。更詳細地說，第一單股DNA與DNA探針具有第一自由能(△G1)-15.94kcal/mL，第一單股DNA與第二單股DNA具有第二自由能(△G2)-22.72kcal/mL。因此，根據熱力學原理，第一單股DNA傾向與第二單股DNA結合，而與DNA探針分離，使DNA探針上測到之山葵過氧化氫酶酵素活性隨著逐漸減少。
綜觀上述，可見本發明在突破先前之技術下，確實已達到所欲增進之功效，且也非熟悉該項技藝者所易於思及，再者，本發明申請前未曾公開，且其所具之進步性、實用性，顯已符合專利之申請要件，爰依法提出專利申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發 明，至感德便。
以上所述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。
11‧‧‧生物分子
12‧‧‧單股DNA
13‧‧‧第一蛋白質
14‧‧‧第二蛋白質
15‧‧‧親合性標記
16‧‧‧親合性結合標記
21‧‧‧生物分子
22‧‧‧第一單股DNA
23‧‧‧第二單股DNA
24‧‧‧親合性結合標記
S11-S13及S21-S23‧‧‧步驟
第1圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之步驟流程圖。
第2圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之示意圖。
第3圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第二實施例之步驟流程圖。
第4圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第二實施例之示意圖。
第5A圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之第一態樣之酵素活性圖。
第5B圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的方法之第一實施例之第二態樣之酵素活性圖。
第6圖 係為本發明之利用生物分子改質基板表面的 方法之第二實施例之酵素活性圖。
<110> 財團法人國家實驗研究院
<120> 利用生物分子改質基板表面的方法
<130> 098128433
<140> 101104498
<141> 2012-02-10
<160> 3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根據DNA探針之重複序列而設計之互補單股DNA，作為DNA探針與蛋白質之連接子(linker)。
<400> 1
ggtgtgttgt tgatg 15
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根據DNA探針之重複序列而設計之部分互補單股DNA。
<400> 2
ggtgtgttgt tgatgacgta a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根據序列識別號：2之單股DNA設計之完全互補單股DNA。
<400> 3
ttacgtcatc aacaacacac c 21
S11-S13‧‧‧步驟

Claims (5)

  1. 一種利用生物分子改質基板表面的方法，該方法包括下列步驟：提供包含18至3000個鹼基之複數個重複序列的DNA探針固定於一基板上，其中複數個親合性結合標記(affinity binding tag)係分別藉由互補於各該重複序列且共軛於該些親合性結合標記之一單股DNA附著至該DNA探針，而分別共軛於一親和性標記(affinity tag)之複數個第一蛋白質係藉由該親合性標記與該些親合性結合標記間之可逆性反應而附著至該DNA探針；加入複數個第二蛋白質，該些第二蛋白質分別與共軛於該些第一蛋白質之相同親合性標記共軛，且該些第二蛋白質之濃度大於該些第一蛋白質之濃度；以及藉由競爭使該單股DNA上的該些第一蛋白質置換為該些第二蛋白質。
  2. 如申請專利範圍第1項之利用生物分子改質基板表面的方法，其中該單股DNA包含15至35個鹼基。
  3. 如申請專利範圍第1項之利用生物分子改質基板表面的方法，其中該親合性標記包含鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)，該些親合性結合標記包含生物素(biotin)。
  4. 如申請專利範圍第5項之利用生物分子改質基板表面的方法，其中該些第一蛋白質與該些第二蛋白質包含鹼性磷酸酶(Alkaline phospatase)或山葵過氧化氫酶(Horseradish peroxidase)。
  5. 如申請專利範圍第1項之利用生物分子改質基板表面的方法，其中該基板為生物晶片或生物檢測器。
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