TWI425004B - 自豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法 - Google Patents

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自豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法
本發明關於一種將豬肝製備具刺激膽囊收縮素分泌活性之水解產物，用於抑制採食量，進而開發成抑制體重，開發為保健食品用途之方法。
肥胖已成為現代工業社會中常見的疾病；在美國、加拿大過胖族群分別佔總人口之25%~27%。而肥胖也繼而引發代謝性症候群如：糖尿病、高血壓與動脈血管疾病等。現今社會肥胖症主要成因為兩種，第一為單純性肥胖(Simple obesity)，其中又分為體質性肥胖及獲得性肥胖兩種，體質性肥胖是指脂肪數目較多所引起之肥胖症，常見於兒童時期的肥胖，另外，獲得性肥胖指脂肪細胞增大所引起之肥胖，常見於成年時期，而95%以上肥胖症屬於單純性肥胖症。第二為續發性肥胖(Secondary obesity)為內分泌或代謝性疾病所引起之肥胖症。亦稱為症狀性肥胖。
在食物攝取時“飽足感”(Satiation)涉及動物停止進食動作。體內的平衡機制會維持攝入之能量與消耗，因此儘管採食量不停的改變，動物始終維持相同之體重。當腦部接收荷爾蒙、神經及代謝產物之刺激，體內為了因應這些刺激將做出反應以適應能量之攝入與消耗。飽足訊號藉由腸道系統中不同部位所產生，為了在腸道中達到最有效率之營養消化與吸收。飽足訊號藉由胃部膨脹與腸道內膜細胞分泌之胜肽，利用以上兩種方式在腸道引起飽足感，而胃部分佈密集的迷走神經與內臟神經，可在食物進入時，藉由膨脹達到飽足訊號的產生，避免進食過多食物造成胃部傷害。在食慾方面，分為短期訊號與長期訊號，短期訊號如腸胃荷爾蒙如膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)，為小腸近端之飽足訊號，主要調控進食後短時間之食物攝取與能量平衡，CCK具有許多生理功能如膽囊收縮，胰液分泌、小腸蠕動及胃部排空。當食物進入小腸內，特別是脂質與蛋白質將刺激腸內絨毛上I-cell造成CCK之分泌。人類的前膽囊收縮素(proCCK)為一具有95胺基酸殘基之蛋白質，在序列84-86(Gly-Arg-Arg)為一重要之Amidaiton序列，需要經過前荷爾蒙轉換酶(p r o h o rmo n e c o n v e r t a s e s),carboxypeptidase E及amidation enzyme complex以釋出具有活性之carboxyamidated CCK胜肽。最大的活性胜肽為CCK-83，可切斷四個鹼基位釋放CCK58，CCK33，CCK22及CCK8。以上四胜肽片段在C端具有相同七胜肽片段(-Tyr(SO3)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH2)。此片段之tyrosyl上的O-sulfated為CCK之活化位，將與CCK-A之接受器作結合。CCK之反應作用於腸道與腦之受器，分別為存在腸道系統之CCK受器1(CCK1R,CCK-A)與存在於腦部CCK受器2(CCK2R,CCK-B)，因此CCK不但可調控腸道功能，也可影響中樞神經，進而影響採食量。
近年來，許多研究由天然來源如動物和植物的蛋白質，經過酵素水解所產生之短鏈胜肽，在給予動物食用後幾乎無副作用，安全性較一般藥物高，且這些胜肽通常具多種機能性與容易吸收的特性，因此適合用來開發保健食品。根據Yvon(1994)可得知牛乳中κ-casein經過胃液水解產生之胜肽Caseinomacropeptide(CMP)，此胜肽由64個胺基酸殘基所組成，可直接刺激小腸上之I細胞使CCK分泌量上升，當血漿中CCK上升將可抑制胃部感覺空洞並抑制食物攝取。Cuber(1990)指出消化蛋白質(Peptone,如：蛋白質經過酸水解或酵素水解產物)具有刺激CCK之釋放之能力，Nemoz-Gaillard(1998)也利用可分泌腸道內CCK之STC-1細胞株證實消化蛋白質具有刺激CCK分泌之能力。因此利用水解過後之胜肽片段可藉由抑制食慾，進而減少能量之攝入，由以上之實驗結果可知利用動物性蛋白質經由酵素水解所產生之胜肽具有增加CCK分泌，並有抑制食慾之功能。
根據2008年農委會屠宰豬隻統計，台灣每年屠宰數量接近900萬頭，每頭屠宰豬隻重約100公斤，而肝臟佔豬隻體重約1.57%，因此每年肝臟部位之副產物約有一萬五千公噸，但豬肝之特殊風味使其接受度並不高，而近年來因飼養方式所造成藥物殘留之疑慮，使豬肝之食用漸趨減少，其大部分作為飼料原料或作為廢棄物，如此大量之動物副產物，不但造成浪費更加重環境汙染，因此選用其豐富之動物性蛋白作為本發明之原料，期能提高副產物之經濟價值。
本發明「自豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法」之主要目的，係提供一種利用豬肝水解後所產生之活性胜肽以刺激膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)分泌之方法，除了用於抑制採食量進而開發成抑制體重之保健食品，亦可增加豬肝之利用價值，減少廢棄於環保之污染。
本發明「自豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法」，經實驗可從豬肝之水解產物中，在體外試驗獲得最佳刺激膽囊收縮素分泌之成效者。
本發明「自豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法」，可從豬肝水解產物中篩選具刺激膽囊收縮素分泌成效之胜肽，並藉由高脂飼糧誘導之肥胖鼠動物模式試驗中，獲得證實其效果者。
本發明對具膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)分泌活性水解產物之取得，係取適量豬肝加入二倍量的水進行均勻混合動作，混合後經水浴100℃加熱，流水冷卻，再加入下列三種酵素木瓜蛋白酶(Papain)、鹼性酶(Alcalase)、 蛋白酶N(Protease N)任一種，置放在往覆式循環水槽進行水解，接著進行水浴100℃加熱中止酵素反應及流水冷卻後，以離心機進行分離，再以濾紙過濾，濾液經乾燥，即為成品。
茲配合圖示，將本發明一較佳實施例詳細說明如后：
實例1、自豬肝製備具刺激膽囊收縮素分泌活性產物之方法
如第一圖本發明之方塊流程圖所示，本發明自豬肝製備具刺激膽囊收縮素分泌活性水解產物之方法，包含以下程序：一、加水絞碎混合：取豬隻屠宰分切後之豬肝250克，加入二倍量(500克)的純水或逆滲透水進行絞碎混合動作；二、水浴加熱：經混合均勻後以100℃水浴加熱5分鐘；三、流水冷卻：再以25℃流水冷卻5分鐘，使其溫度降至大約35℃；四、酵素進行水解：以酵素基質比1：50加入5g之下列三種酵素任一種〔木瓜蛋白酶(Papain)，pH 5.0、鹼性酶(Alcalase)，pH 8.0、蛋白酶N(Protease N)，pH 7.0〕，以500mL血清瓶置放在50℃震動頻率70rpm之往覆式循環水槽分別對豬肝水解2小時與4小時；五、水浴加熱以停止酵素反應：接著進行100℃水浴加熱10分鐘以停止酵素反應；
六、流水冷卻：再以25℃流水冷卻5分鐘，使其溫度降至大約35℃；
七、離心機分離：在28℃下以離心機10000×g進行離心10分鐘；
八、濾紙過濾：用濾紙進行過濾動作，分離濾液與雜質；
九、乾燥：取濾液以冷凍乾燥機在壓力0.1至0.2Torr下冷凍乾燥60小時或烘箱加熱乾燥15-20小時，即得到具刺激膽囊收縮素分泌活性之成品。
上述水浴加熱方式亦可以烘箱加熱或其他加熱方式取代。
本發明並參考Sufian等人(2006)加以修飾之方法測定成品之膽囊收縮素分泌量(Cholecystokinin，CCK)，細胞株STC-1為人類腸內分泌細胞(enteroendocrine cells)，由美國加州大學Dr. Hanahan(University of California,San Francisco,Calif.,U.S.A.)所贈與提供。測定由STC-1細胞株所分泌之CCK，利用Dulbecco’s modified Eagle’s Medium培養基(DMEM;4.5g/L glucose,with glutamin,without sodium pyruvate)含有10%胎牛血清，100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin。細胞培養增生至可進行試驗之代數及細胞數後，測其CCK分泌量。將細胞種於放入48孔盤中保存2至3天。利用HEPES(140mM NaCl,4.5mM KCL,20mM HEPES,1.2mM CaCl2,1.2mM MgCl2,10mM Gluscoe,pH7.4)洗兩次，後加入不同濃度之成品(2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和100毫克/毫升)溶於HEPES緩衝液中，於37℃環境中培養60分鐘後，於4℃以850g離心移出細胞，上清液置於-30℃貯存待測。利用市售套組enzyme immunoassay kit(Phoenix Pharmaceuticals,Inc.,USA)測量其CCK分泌量。所得之結果如第二圖(不同濃度成品)與第三圖(不同酵素成品)所示。
如第二圖以不同濃度之成品(2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和100毫克/毫升)分析其產生之膽囊收縮素分泌量之比較圖表所示，分組如下：本發明其一(Pa4)，豬肝使用木瓜蛋白酶酵素水解4小時產物(2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和100毫克/毫升)-．．●．．-，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
本發明其二(A12)，豬肝使用鹼性酶酵素水解2小時產物(2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和100毫克/毫升)-◆-，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
本發明其三(Pn2)，豬肝使用蛋白酶N酵素水解2小時產物(2毫克/毫升，5毫克/毫升，10毫克/毫升和100毫克/毫升)---▲---，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
隨著水解產物濃度增加至100毫克/毫升，膽囊收縮素 分泌量也顯著上升，Pa4產物之膽囊收縮素分泌量由0.65毫微克/毫升提高至1.05毫微克/毫升；A12產物之膽囊收縮素含量由0.10毫微克/毫升提高至0.58毫微克/毫升；Pn2產物之膽囊收縮素含量由0.40毫微克/毫升提高至0.79毫微克/毫升。顯示本發明之豬肝酵素水解產物具有刺激細胞分泌膽囊收縮素之作用，其中又以Pa4產物有最佳之效果。
如第三圖以未水解豬肝與經不同酵素水解之成品(統一濃度為100毫克/毫升)分析其產生之膽囊收縮素分泌量之比較圖表所示，分組如下：PositiveControl，市售套組內所附之誘導膽囊收縮素(CCK)分泌之正向對照組。
Control，豬肝未經任何酵素水解，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
本發明其一(Pa4)，豬肝使用木瓜蛋白酶酵素水解4小時產物(100毫克/毫升)，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
本發明其二(A12)，豬肝使用鹼性酶酵素水解2小時產物(100毫克/毫升)，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
本發明其三(Pn2)，豬肝使用蛋白酶N酵素水解2小時產物(100毫克/毫升)，產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量。
顯示本發明之豬肝酵素水解產物在100毫克/毫升的濃度下與豬肝比較確實具有提高刺激細胞分泌膽囊收縮素之作用，其中又以Pa4產物有最佳之效果，Pn2次之。
實例2、高脂飼糧誘導之肥胖鼠動物模式試驗評估
另以動物模式之活體試驗方面，使用實驗動物由樂斯科實驗動物中心購買，品系為雄性6週齡之正常大鼠(Wi star-Kyoto Rat,WKY/NCrl)，先以網狀不銹鋼籠飼養於25±1℃，溼度50-60%之中興大學實驗動物舍中，控制每天光照及黑暗期各為12小時(光照期為7:00至19:00，黑暗期為19:00至隔日7:00)，飼料及飲水採自由攝取並作紀錄，飼養第一週作為適應期。馴養第二週以隨機分類將7週齡的WKY雄鼠每5隻為一組，分成以下六個組別，持續進行七週的試驗：
一、對照組(Control)，给予基礎飼糧(Test Diet,58 B0)，脂肪含量為5%；
二、單獨給予高脂飼糧(High Fat,HF)組，給予高脂飼糧(Test Diet,58V8)，脂肪含量為23.6%；
三、給予高脂飼糧並灌食羅氏鮮(脂肪分解酵素抑制劑，Orlistat商品名Xenical)(HF+O)組，羅氏鮮依照70公斤(kg)成人每日建議劑量360毫克(mg)換算成大鼠體重後溶於1毫升(mL)之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)/乙醇(Ethanol)溶液進行強迫灌食。
四、給予高脂飼糧並灌食木瓜蛋白酶酵素水解4小時產物(HF+Pa)組，水解產物以大鼠體重每公斤500毫克(mg)之比例並溶於1毫升(mL)去離子水進行強迫灌食。
五、給予高脂飼糧並灌食鹼性酶酵素水解2小時產物(HF+A)組，水解產物以大鼠體重每公斤500毫克(mg)之比例並溶於1毫升(mL)去離子水進行強迫灌食。
六、給予高脂飼糧並灌食蛋白酶N酵素水解2小時產物(HF+Pn)組，水解產物以大鼠體重每公斤500毫克(mg)之比例並溶於1毫升(mL)去離子水進行強迫灌食。 進行試驗包含有：
1.大鼠每週體重變化：所得之結果如第四圖(不同處理組大鼠之每週體重變化)、第五圖(不同處理組大鼠試驗期第一週之體重)與第六圖(不同處理組大鼠試驗期七週後之體重)所示。
2.七週後體增重：所得之結果如第七圖(不同處理組大鼠試驗七週後之體增重)所示。
3.飼料採食量之變化：所得之結果如第八圖(不同處理組大鼠於試驗期之平均採食量)所示。
第四圖所示，飼養第一週時，各處理組之大鼠體重並無顯著差異(p<0.05)。在經過七週給予不同水解物與減肥藥羅氏鮮(Xenical®)後，其體重之變化皆隨著飼養時間的變化而漸趨上升。在對照組部份，給予的為脂肪含量5%之基礎飼糧，因此體重上升並不如其他給予高脂飼糧之體重持續升高。單獨給予高脂飼糧體重上升之趨勢也較其他處理組明顯，而給予酵素水解物處理組之體重相較於高脂飼糧之處理組並無持續上升之現象。
第五圖與第六圖所示，試驗期第一週時，對照組(Control)與所有處理組之大鼠平均體重均沒有顯著差異。而在試驗期結束之大鼠體重，HF+Pa處理組與HF+A處理組顯著較HF處理組之體重低(p<0.05)，但HF+Pn處理組與羅氏鮮處理組抑制體重增加之效果並不顯著，與HF處理組比較沒有顯著差異。上述不同處理組大鼠七週後之體增重亦呈現在表一，即HF+Pa與HF+A處理組有最低的體增重。
不同處理組大鼠於試驗期之平均飼料採食量所得之結果如第八圖所示。給予高脂飼糧之大鼠，其採食量顯著較給予一般飼糧低(p<0.05)，Levin(1987)也提出給予15週齡之大鼠高脂肪之食物，雖減少約4%之採食量但體重卻較給予一般飼糧之大鼠重，與本發明動物試驗模式有相似之結果，Horn(1996)推測高能量之食物攝入將產生飽足訊號，使中樞感到飽足感進而停止進食，達到短期之能量平衡，此原因造成高脂飼糧之採食量減少。同時給予高脂飼糧與水解物之處理組其採食量皆顯著低於對照組(p<0.05)，與本發明實例1之膽囊收縮素(CCK)分泌量比較可推測採食量之降低與膽囊收縮素之分泌相關。此結果顯示，本發明之豬肝酵素水解物均具有與臨床上所使用之減肥藥物-羅氏鮮(脂肪分解酵素抑制劑，Orlistat，商品名Xenical)效果相當之抑制體重增加情形，此結果顯示本發明之豬肝酵素水解產物成品經長期性攝取確實在動物模式之實驗表現有抑制體重增加之生理功效。
由上述可知，本發明可將目前少部份利用或直接丟棄之豬肝，製備成有效抑制體重增加之產物，可增加豬肝之附加價值，提高農民之收益，並且可以降低環境污染及減少廢棄物處理成本。
綜上所述，當知本發明具有產業上利用性與進步性，且本發明未見於任何刊物，亦具新穎性，當符合專利法之規定，爰依法提出發明專利申請，懇請貴審查委員惠准專利為禱。
唯以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以之限定本發明實施之範圍。即大凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應屬本發明專利涵蓋之範圍內。
第一圖：係本發明之方塊流程圖。
第二圖：係以不同濃度之豬肝水解產物產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量之比較圖表。
第三圖：係以不同酵素之豬肝水解產物(100毫克/毫升)產生之膽囊收縮素(CCK)分泌量之比較圖表。
第四圖：係以高脂飼糧誘導之肥胖鼠分組餵飼不同豬肝酵素水解產物成品其長期每週體重變化之比較圖表。
第五圖：係以高脂飼糧誘導之肥胖鼠分組餵飼不同豬肝酵素水解產物成品試驗期第一週體重之比較圖表。
第六圖：係以高脂飼糧誘導之肥胖鼠分組餵飼不同豬肝酵素水解產物成品試驗期七週後體重之比較圖表。
第七圖：係不同處理組大鼠試驗七週後之體增重比較表。
第八圖：係以高脂飼糧誘導之肥胖鼠分組餵飼不同豬肝酵素水解產物成品其試驗期之平均飼料採食量比較圖表。

Claims (4)

  1. 一種以豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法，其包含下列程序：加水絞碎混合，取豬肝加水後絞碎混合；第一次加熱冷卻，以100℃加熱5分鐘使蛋白質變性，加熱後冷卻至室溫；酵素水解，加入酵素進行水解，加入之酵素可由下列三種：(1)木瓜蛋白酶(Papain)，酵素/基質比為1：50，水解溫度為50℃，水解時間4小時，pH5.0；(2)鹼性酶(Alcalase)，酵素/基質比為1：50，水解溫度為50℃，水解時間為2小時，pH8.0；(3)蛋白酶N(Protease N)，酵素/基質比為1：50，水解溫度為50℃，水解時間為2小時，pH7.0；擇一與基質瓶裝置放在50℃震動頻率70rpm之往覆式循環水槽進行上述水解時間；第二次加熱冷卻，以100℃加熱10分鐘以停止酵素反應，加熱後冷卻至室溫；離心分離與過濾，以離心機10000×g進行離心10分鐘，並以濾紙過濾收集濾液；及濾液乾燥，以冷凍乾燥機在壓力0.2Torr下冷凍乾燥60小時或60-70℃熱風乾燥15-20小時，製成成品。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法，其中將豬肝與水混合後絞碎，該混合程序水之水量為豬肝二倍。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之以豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法，其中加熱之方式為水浴加熱。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之以豬肝開發具抑制體重增加水解產物之方法，其中水浴加熱之方式亦可以烘箱加熱方式取代。
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