TWI404543B - 促進傷口癒合之組合物 - Google Patents

Description

促進傷口癒合之組合物

本發明係為一種促進傷口癒合之組合物，特別是一種以胜肽為活性成分之組合物。

通常慢性疾病患者往往會因為身體上的不適、不方便造成一些併發症，其中，最嚴重的莫過於糖尿病所造成之衍生併發症。糖尿病目前仍為我國十大死因之一，且在全世界均為重要疾病。如果糖尿病沒有得到足夠的控制，可能會引起一些急性或慢性的併發症，如低血糖症、心血管疾病、慢性腎衰竭、視網膜病變、神經病變及微血管(microvascular)病變等；其中，微血管病變可能導致勃起功能障礙(陽痿)以及傷口難以癒合。而若發生在足部，其難以癒合的傷口則可能導致壞疽(亦即俗稱之「糖尿病足」)，進而導致患者截肢。如果糖尿病得到了足夠的控制，並且對血壓充分控制並結合良好的生活習慣(如不吸煙，保持健康的體重等)，則可以在有效的降低罹患上述併發症的危險。初期只是腳部傷口難於癒合，若處理不當可引致截肢。

若是糖尿病足未能儘快醫治，可能會演變成難以復原之問題傷口；如同其它的問題傷口，其雖經由傳統一般內科或外科治療方法處理，但卻不容易痊癒，這可能是為病人整個系統性或局部的狀況不容許傷口進行正常的修復工作。這些包括了鬱血性之血管病變、未癒合的傷口、截肢後傷口癒合不好、及糖尿病足者等。若是無法妥善處理，將造成傷口的感染進一步的惡化。

長期糖尿病的患者，常有血管的病變及末稍神經炎的併發症。此類病人趾端的感覺因為神經炎的關係，常常喪失知覺，因此經常會碰撞至流血而仍不自知。此類的趾端或下肢的傷口再加上末梢血管的病變和膠原蛋白不正常，非常不容易癒合，而往往演變成慢性潰瘍。截肢的手術常常一節一節的往上切至膝蓋以上。根據Wagner’s的分類糖尿病足可分為五度，這種分類由傷口的大小、所到的深度和在整個足部的位置來描述一種簡單的改良的分類法。它尚包括了潰瘍所造成的嚴重缺氧和影響肢體血液循環的程度。治療這種病人成功的主要秘訣，乃在如何將缺氧和已潰爛病變部位的血管重建起來，而及時改良其惡化的環境。血管的病變可由輕度的病變到極嚴重的多處血管病變不等。

為了有效治療此等特殊傷口癒合問題，美國食品藥物管理局(FDA)曾核可一種重組之蛋白質藥物Regranex用於傷口癒合以治療糖尿病患者足部潰瘍，但依據其臨床研究資料，發現使用「Regranex gel」之患者死於癌症者較未使用之患者多。「Regranex gel」是一種重組之血小板衍生生長因子(recombinant PDGF)，我國衛生署核定之適應症為「促進全層糖尿病潰瘍小於或等於5公分傷口的癒合」。因生長因子使細胞分化更快速，故需持續監測使用「Regranex gel」之癌症發生率。美國FDA會在分析評估這些臨床研究資料後，再做出對該藥品之新建議，衛生署亦會密切注意此事之發展狀況，監視血小板生長因子之用藥安全，並呼籲醫師為病患處方血小板生長因子藥品時，應謹慎評估其用藥之風險與效益，以降低不良反應之發生。可見目前世面上可購得用於促進傷口癒合之蛋白質藥物具有致癌的潛在風險，仍不甚安全。

因此，針對未來之醫療需求，亟需開發一種高安全性之蛋白質藥物，以應用於促進傷口癒合。

本發明提供一種促進傷口癒合的組合物，其包含以SEQ ID NO. 1之胜肽為活性成分。

本發明之一較佳實施例中，該組合物更包括醫藥上可接受的載劑。

本發明之另一較佳實施例中，該活性成分之有效濃度為0.1微克/毫升至200毫克/毫升。

本發明之另一較佳實施例中，活性成分之有效濃度為10微克/毫升至150毫克/毫升。

本發明之另一較佳實施例中，該組合物係為液體、膏狀、凝膠狀、或噴霧。

本發明所提供之組合物，可用於接觸哺乳動物傷口，以促進該傷口癒合。

本發明更提供一種胜肽，其具有如SEQ ID NO. 1所示之胺基酸序列。

本發明更提供一種核酸分子，其係編碼SEQ ID NO. 1之胜肽。

本發明更提供一種載體，其係包含編碼SEQ ID NO. 1之胜肽的核酸分子。

本發明更提供一種轉型微生物，其係包含具有編碼SEQ ID NO. 1之胜肽之核酸分子的載體。

本發明復提供一種製造具有如SEQ ID NO. 1所示之胺基酸序列之胜肽的方法，其係培養包含具有編碼SEQ ID NO. 1之胜肽之核酸分子之載體的轉型微生物，並自該轉型微生物之培養基中分離該胜肽。

本發明之組合物係以具有SEQ ID NO. 1之序列的胜肽為活性成分，該胜肽係為黏液蛋白MUC15片段之重組蛋白。已知GenBank Accession No. BC058007的MUC15蛋白質全長為334個胺基酸，本發明所選擇的片段為GenBank Accession No. BC058007的第28至229個胺基酸，其序列如SEQ ID NO. 1所示，將純化所得的重組蛋白進行小鼠的動物實驗，發現本發明之重組蛋白能促進小鼠背上的傷口癒合。

本發明之組合物係以具有SEQ ID NO. 1之序列的胜肽為活性成分，而可編碼該SEQ ID NO. 1之胜肽序列的核酸分子均可用於本發明之選殖，在適當的修飾增刪情形之下，多種核酸分子可用於表現本發明組合物之胜肽。

本發明之組合物係塗抹於哺乳動物傷口上，以促進該傷口之癒合。本發明之組合物依循一般之藥理常識，其劑型可為液體，包括外用液、擦液、塗液、滴液，或是膏狀，包括乳霜、油膏、軟膏、糊狀劑、以及凝膠狀、或噴霧，其係為外用。

本發明之組合物以具有SEQ ID NO. 1之序列的胜肽為活性成分，該組合物之有效濃度係以該胜肽之具有促進傷口癒合效果之濃度為基準，可依據傷口種類、面積、以及組合物之劑型等，而分別製備不同濃度之活性成分的組合物，其有效濃度可為0.1微克/毫升至200毫克/毫升，並可視需要而調整不同的濃度。

MUC15是一種膜結合式黏液蛋白(membrane-bound mucin)，最初是從牛奶純化而來(Pallesen et al.,2002)。人類的MUC15具有細胞外功能區塊(extracellular domain)、穿膜功能區塊、以及細胞質尾端(cytoplasmic tail)。在許多人類器官中，可透過RT-PCR偵測到MUC15 mRNA的表現。本發明所選用之具有SEQ ID NO. 1之序列的胜肽係位於MUC15黏液蛋白之細胞外功能區塊，以作為本發明之組合物的活性成分。

如Singh與Hollingsworth的報導(Trends in Cell Biology,Vol. 16,467-476,2006)，黏液蛋白(mucins,MUC)為一類具有高度醣化的蛋白質，表現在多種表皮細胞上，通過細胞表現位置的不同，可將黏液蛋白分為兩類：膜結合式黏液蛋白(membrane-bound mucins)以及分泌式黏液蛋白(secretory mucins)。分泌式黏液蛋白缺乏穿膜功能區塊(transmembrane domain)，因此會分泌到細胞外，其表現侷限在分泌器官與細胞，所包含的成員為MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8以及MUC19。膜結合式黏液蛋白的成員則包括MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17以及MUC20。由相關文獻報導可知，黏液蛋白家族種類繁複，且其型態功能各異。

現有已上市之唯一治療糖尿病傷口之蛋白質藥物係為一種經過基因工程改造之重組血小板衍生生長因子(recombinant PDGF)，若將本發明與其相比較，由於FDA警告已上市之此重組PDGF產品有致癌危險，而本發明之組合物所選用者係為大量存在於乳汁的MUC15黏液蛋白，具有相當之生物安全性，因此本發明較具優勢。

關於本發明之優點與精神可以藉由以下發明詳述及所附圖式得到進一步的瞭解。

本發明係利用大腸桿菌表現MUC15的重組蛋白，在小鼠動物實驗中，發現本發明之重組蛋白能促進小鼠的傷口癒合。

實施例1：重組蛋白的製備

本發明係選擇GenBank Accession No. BC058007序列之第28至229個胺基酸作為重組蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明並選殖其對應之基因片段，以用於表現本發明之MUC15片段。

為了將選擇之基因片段序列接入細菌表現蛋白質體中，設計5’端具有KpnI限制酶切位的引子(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示)、以及3’端含有XhoI限制酶切位的引子(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示)，使用前述之引子對進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)，以選殖標的核苷酸片段。

將所選殖得到之標的核苷酸片段、蛋白質表現質體pET30(+)(購自Novagen,Madison,WI,USA)分別經過限制酶KpnI(購自NEB,Ipswich,England)、以及XhoI(購自NEB,Ipswich,England)處理後，利用T4 DNA結合酶(T4 DNA ligase，購自TAKARA,Shiga,Japan)作用，使標的核苷酸片段與質體接合，再將接合之重組質體轉殖進入DH5α大腸桿菌。隨後利用限制酶圖譜(restriction enzyme mapping)進行篩選，再將正確大小之重組質體進行DNA定序確認之。

將確認之重組質體再次轉殖進入BL21大腸桿菌菌株，以表現本發明之重組蛋白。將轉殖之BL21菌液塗抹於培養皿上，經過37℃、12至14小時之培養後，挑選一菌落接種於1毫升(ml)之LB培養液，再經過5至8小時培養後，吸取100微升(μl)菌液加入100毫升LB培養液置於250毫升錐形瓶中繼續培養，當菌液的O.D. 600nm吸光值達到0.3時，加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG；購自Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)以刺激細菌大量表現重組蛋白；再培養12至14小時之後，將菌液打散於含有10mM咪唑(imidazol；購自Sigma-Aldrich,St. Louis,MO,USA)之結合緩衝液(bind buffer)，再利用超音波震碎。依據供應商建議之步驟，將此菌液利用Ni-NTA His-Bind樹脂(Ni-NTA His-Bind resins；購自Novagen,Madison,WI,USA)純化，之後將純化蛋白質進行電泳分析，確定蛋白質的大小與產量，其結果如第1圖所示。

第1圖係為本發明之純化重組蛋白的電泳圖譜。純化後的重組蛋白大約為30kDa，且與對照組的血清蛋白(BSA)比較後，確定培養100毫升的菌液能純化獲得1毫克的重組蛋白。

實施例2：動物傷口癒合試驗

取14週大、公的、C57BL/6的小鼠8隻，先以4%的水化氯醛(10ml/kg chloral hydrate；購自Merck,Darmstadt,Germany)將小鼠麻醉，刮去小鼠背上的毛髮，並替小鼠背上的皮膚消毒，隨後使用直徑1公分之打洞器在小鼠背上打出兩個傷口。以2%海藻酸鈉作為對照組，將濃度100微克/毫升之本發明重組蛋白(溶於2%海藻酸鈉)作為實驗組，每天分別將溶液塗抹於小鼠背上的傷口，並在隔天拍攝小鼠傷口的情況。以Image-Pro Plus software(購自Media Cybernetics,Bethesda,MD,USA)分別定量不同天數的的傷口面積，利用Student’ s-test統計實驗結果，其結果如第2A與2B圖所示。

第2A與2B圖係為濃度100微克/毫升之本發明重組蛋白促進傷口癒合之情形。由第2A圖可見，相較於2%海藻酸鈉之對照組，本發明具有顯著地促進傷口癒合之效果。以第7天的情形為例，對照組的傷口大小為42.42±18.69平方公釐，而實驗組僅剩24.75±15.73平方公釐；至第10天時，對照組的傷口大小尚餘14.10±5.00平方公釐，而實驗組更僅剩6.71±3.17平方公釐；其統計分析數據如第2B圖所示，可見本發明確實具有良好之促進傷口癒合之效果。

另取7週大、公的、C57BL/6的小鼠9隻改以較低濃度進行測試，其結果如第3A與3B圖所示。由第3A圖可見，當濃度降為30微克/毫升時，本發明重組蛋白相較於2%海藻酸鈉之對照組，第3B圖仍明顯具有促進傷口癒合之功效。

此外，改以MUC20黏液蛋白進行傷口癒合實驗，以佐證本發明之功效。取8週大、公的、BALB/C的小鼠8隻配合濃度100微克/毫升之MUC20重組蛋白進行實驗，其結果如第4A與4B圖所示。第4A圖所示由傷口癒合情形可見，MUC20黏液蛋白相較於對照組，第4B圖所示並無明顯促進傷口癒合之情形，可知縱使同為黏液蛋白類型之蛋白質，並非每一種均具有促進傷口癒合之功效，足見本發明之可貴且具有高度的新穎性與進步性。

本發明之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請專利範圍內。

第1圖係為本發明之純化重組蛋白的電泳圖譜。

第2A與2B圖係為濃度100微克/毫升之本發明重組蛋白促進傷口癒合之情形。

第3A與3B圖係為濃度30微克/毫升之本發明重組蛋白促進傷口癒合之情形。

第4A與4B圖係為濃度100微克/毫升之其他黏液蛋白促進傷口癒合之情形。

<110> 國立臺灣大學

<120> 促進傷口癒合之組合物

<160> 3

<210> 1

<211> 202

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

Claims (6)

1. 一種促進傷口癒合的組合物，其包含以SEQ ID NO.1之胜肽為活性成分。
2. 如申請專利範圍第1項的組合物，更包括醫藥上可接受的載劑。
3. 如申請專利範圍第1項的組合物，其中該活性成分之有效濃度為0.1微克/毫升至200毫克/毫升。
4. 如申請專利範圍第1項的組合物，其中該活性成分之有效濃度為10微克/毫升至150毫克/毫升。
5. 如申請專利範圍第1項的組合物，其中該組合物係為液體、膏狀、凝膠狀、或噴霧。
6. 如申請專利範圍第1項的組合物，其可用於接觸哺乳動物傷口，以促進該傷口癒合。