TWI403586B - 用於偵測目標反應與治療黃病毒感染症狀之化合物及方法 - Google Patents

Description

用於偵測目標反應與治療黃病毒感染症狀之化合物及方法

本申請案陳請美國專利申請案序號11/469,270號(2006年8月31日申請)，以及美國臨時專利申請案序號60/713,463號(2005年8月31日申請)之優先權以及權益，上述各申請案之揭示內容全文皆以參考資料方式納入本說明書中。

本發明係由台灣國家科學委員會94F008-5、NSC 95-2320-B-010010及NSC 95-3112-B-010-017之計畫所支持。本發明亦由台灣中央研究院94M002-1與國立陽明大學95A-CT8G02之計畫所支持。

本發明係關於一種基於免疫受體(特別是DLVR1/CLEC5A)與病原之交互作用之各種應用。

在本說明書中所參照之任何先前技術皆不或不應被視做承認或以任何形式暗示該先前技術在任何國家構成通識之一部分。本文所引用之所有文獻，其全文皆以參考資料方式具體納入本說明書中。

免疫系統能使宿主生物區辨本身及非本身抗原，以及識別及清除侵入之病原體。後天性免疫系統(adaptive immunity system)依存於高度多形(highly polymorphic)分子，諸如主要組織相容性複合體(MHC)之第I類及第II類抗原、T細胞受體及B細胞受體，以向T細胞及B細胞呈遞抗原，因而導致免疫系統之活化。先天免疫系統識別此等多樣性抗原之機制未明，直到Janeway提出模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)之觀念(Janeway,1989,Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54 Pt 1,1-13)。該假說後來藉由鑑定出由下列受體識別之病原體相關性分子模式(PAMPs)而證明為正確，該等受體為：類鐸受體(TOLL-like receptors)(Aderem and Ulevitch,2000 Nature 406,782-7；Akira and Takeda,2004,Nat Rev Immunol 4,499-511；Athman and Philpott,2004,Curr Opin Microbiol 7,25-32)、凝集素(lectin)受體(Cambi and Figdor,2003,Curr Opin Cell Biol 15,539-46)、類免疫球蛋白(類Ig)受體(Daws et al.,2003,J Immunol 171,594-9)、及NOD蛋白(Athman and Philpott,2004,Curr Opin Microbiol 7,25-32)、以及其他(Liu et al.,2001,J Biol Chem 276,34686-94；McDonald et al.,2005,J Biol Chem 280,20177-80)。

除了由類鐸受體所識別且經充分鑑定特徵之PAMPs(Akira and Takeda,2004,Nat Rev Immunol 4,499-511)之外，新近之研究顯示宿主免疫系統可經由特異性碳水化合物抗原而識別侵入之病原體。舉例言之，甘露糖受體可識別在病原體表面表現之具高甘露糖分子部分(Stahl and Ezekowitz,1998,Curr Opin Immunol 10,50-5)，同時樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1)受體可特異性地與β-葡聚糖結合，該β-葡聚糖為真菌壁表面之多醣體之主要骨架(Brown and Gordon,2001,Nature 413,36-7；Herre et al.,2004,Mol Immunol 40,869-76)。此等結果暗示與病原體相關之碳水化合物結構為由免疫細胞之先天性免疫受體所識別之標靶之一。

靈芝類(Ganoderma )及冬蟲夏草類(Cordyceps )真菌為在中國為最盛行服用之草藥。自靈芝(Ganoderma lucidum ，亦稱為Ling zhi、Reishi)萃取出之多醣體曾被用於傳統中藥而作為抗腫瘤劑及免疫調節劑(Lien,1990,Prog Drug Res 34,395-420；Wang et al.,2002,Bioorg Med Chem 10,1057-62；Shiao,2003,Chem Rec 3,172-80)，而從冬蟲夏草(Cordyceps sinensis )(Cordyceps、Caterpillar fungus)萃取出者則顯示會改變細胞凋亡自穩態(apoptotic homeostasis)，並會改善呼吸、腎臟、及心血管功能(Buenz et al.,2005,J Ethnopharmacol 96,19-29；Zhu et al.,1998,J Altern Complement Med 4,289-303；Zhu et al.,1998,J Altern Complement Med 4,429-57)，以及增加全身對於胰島素之敏感性(Balon et al.,2002,J Altern Complement Med 8,315-23)。不過，萃取物之多醣體組成於多醣體係萃取自不同來源、不同菌株、及於不同生長條件下培養時皆會發生變化。

仰賴高效液相層析(HPLC)及質子-核磁共振之分析方法曾被用於研究單離自靈芝(Ganoderma lucidum )及冬蟲夏草(Cordyceps sinensis )之多醣體之成分(He and Seleen,2004,Int.J.Med.Mushrooms 6,253)。不過，高效液相層析圖係基於與靈芝酸(ganoderic acid)A及C(靈芝之二種主要三萜化合物)或腺苷之比較。依據質譜仍難以知道萃取物是否含有多醣體之活性成分。

本發明辨識出在受到黃病毒(諸如，登革熱病毒(Dengue virus)或日本腦脊髓炎病毒(Japanese encephamyelitis virus))感染時會誘發細胞滲漏及其它負作用之細胞受體。使用本發明所揭露之融合蛋白，其判定出病原體(諸如，黃病毒)會經由糖苷鍵結而結合之受體。一旦判定出該等受體，即可判定結合特定受體之作用，其中對於造成特定症狀之受體的尋靶可由能夠阻斷病原體與受體結合之試劑靶向。因此，就登革熱病毒及日本腦脊髓炎病毒而言，TNF-α會在病原體結合DLVR1/CLEC5A受體時釋出。以單株抗體阻斷DLVR1/CLEC5A受體可減少TNF-α之分泌，且同時不會影響負責進行病毒清除之細胞激素的分泌，因而使經感染小鼠之存活率由零增加至約50%。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含取得融合蛋白質族群(complement)(其中各融合蛋白質包含受體的結合區域(domain)以及提供受質(substrate)固定之區域)，使融合蛋白質與病原體接觸以確認該病原體是否可與該融合蛋白質族群中至少一融合蛋白質上之結合區域結合，及偵測該病原體是否與該融合蛋白質結合。「融合蛋白質族群」乙辭代表至少一受體的許多不同結合區域。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含取得易受病原體感染之細胞，剔除至少一細胞受體基因，使該等細胞與該病原體接觸，及測量該等細胞之細胞激素分泌量。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含鑑定至少一可結合病原體所展示之配體(ligand)的細胞受體，以及對經該病原體感染之動物投予試劑，以阻斷該配體與該受體之結合而調控該病原體之作用。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含提供有效量的試劑，以調節感染動物之病原體的作用，以調節該病原體對該動物上的作用。該試劑係針對至少一該感染動物原有細胞之細胞受體，以防止該受體與該病原體所展示之配體結合。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVR1/CLEC5A抗體給予受登革熱病毒感染之動物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由登革熱病毒顆粒所呈現之配體與DLVR1/CLEC5A受體結合，其中TNF-α之分泌可受到抑制。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVR1/CLEC5A抗體給予受日本腦脊髓炎病毒感染之動物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由日本腦脊髓炎病毒所呈現之配體與DLVR1/CLEC5A受體結合，其中TNF-α之分泌可受到抑制。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之試劑給予受登革熱病毒感染之動物，其中該試劑可至少部分抑制至少一種促發炎性細胞激素之分泌，且不影響干擾素-α(Interferon-α)之分泌。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種小鼠，其包含易受登革熱病毒感染之小鼠，以及sh-RNA顆粒以剔除該小鼠體內之DLVR1/CLEC5A受體。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種組合物，其包含醫藥製備物，包含有效量之抗體，該抗體係抗動物體內至少一細胞受體，以調節該動物體內病原體感染之作用。該調節至少包含抑制該動物細胞之促發炎性細胞激素的分泌，且不影響可造成病毒清除之細胞激素的分泌。

根據本說明書揭露之特徵，本發明提供一種組合物，其包含醫藥製備物，包含有效量之抗體，該抗體係對抗受登革熱病毒感染之動物之DLVR1/CLEC5A受體，以調節該動物體內登革熱病毒感染之作用。該調節至少包含抑制該動物細胞之促發炎性細胞激素的分泌，且不影響可造成病毒清除之細胞激素的分泌。

在下列本發明具體例之詳述中，其參照附呈之圖式閱讀時更為明瞭，其中類似之參照數目代表類似之元件，且其中係以說明方式顯示可實施本發明之特定具體例。此等具體例係以足夠之細節進行敘述，以使一般技藝人士可據以實施本發明，且需明瞭者，可使用其他具體例，且可在不偏離本發明範圍之情形下進行邏輯、機械、生物、電學、功能、及其它之改變。下文之詳述因此不應被視為任何限制，而本發明之範圍僅由附呈之申請專利範圍定義。在本文中，「或」乙辭應可被理解為定義一種論理上之選言，且不應被視為一種排他性選言，除非其被標示為「或不」(xor)乙辭。

在一具體例中，本發明提供一種融合蛋白質，其包含先天性免疫受體之碳水化合物識別區域及異源多肽。先天性免疫受體意指：1)由白血球受體複合物(LRC)中之基因及人類染色體19上之LRC-相關基因所編碼之受體，其包括，但不限於CD66家族(CEACAM1及PSG1)、SIGLEC家族、NGK7、FCGRT、ILT/LILRA/LILRB(CD85)家族、LAIR家族、KIR(CD158)家族(包括KIR2DL亞家族、KIR2DS亞家族及KIR3DL亞家族)、FCAR(CD89)、NKp46(NCR1)及GPVI(GP6)；以及

2)由在人類染色體12上之天然殺手受體複合物(NKC)中之基因所編碼之受體，其包括，但非限於，MAFA-L(KLRG1)、A2M、NKR-P1A(KLRB1)、LLt1(CLEC2D)、CD69(CLEC2C)、KLRF1、AICL(CLEC2B)、CLEC-2(CLECFS2)、Lox-1(OLR1)、CD94(KLRD1)、NKG2-D(KLRK1)、NKG2-F(KLRC4)、NKG2-E(KLRC3)、NKG2-C(KLRC2)、NKG2A(KLRC1)、Ly49L(KLRA1)及PRB3；以及

3)所有人類及小鼠C-型凝集素(CLEC)家族基因、所有人類之類唾液酸結合性Ig(SIGLEC)基因、所有人類之在骨髓細胞上表現之激發受體(TREM)基因、所有人類之類TREM(TREML/TLT)基因、所有人類之類鐸受體(TLR)基因以及所有在人類染色體發現之人類之類Fc受體(包括FCRL1至FCLR6，亦包括FCLRM1及FCLRM2)基因。

使用人類基因組組織(Human Genome Organization，HUGO)搜索引擎網站可以查到能應用於本發明方法中之此等分類中的其他基因。亦可參考Immunological Reviews 2001 Vol.181：20-38中之基因座說明，該文全文以參考資料方式納入本文。

來自非人類物種之任何上述基因之直系同源物(orthologues)亦可用於本發明之方法中。

可被考量用於本發明之C-型凝集素基因包括，但不限於，下列人類基因：ASGR1、ASGR2(CLEC4H2)、CD207(CLEC4K/郎罕細胞特異性蛋白)、CD209(DC-SIGN/CLEC4L)、CD302(CLEC13A)、CLEC1A、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC2A、CLEC2B、CD69、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC3O、CLEC3Q、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D(CLEC-6)、CLEC4E、CLEC4F(KCLR)、CLEC4G、CLEC4M(DC-SIGNR)、CD209、DLVR1/CLEC5A、CLEC6A(樹狀細胞凝集素-2)、CLEC7A(樹狀細胞凝集素-1)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC14A、FCER2、KLRB1、KLRF1、LY75(DEC205)、MRC1、MRC1L1、MRC2(Endo180)、OLR1、PLA2R1、DCAL1及COLEC10。此等基因之任一者之同源物(homologues)亦在考量之列，來自其他種動物諸如小鼠(mice)及大鼠(rats)之直系同源物(orthologues)亦同。同源物(homologues)及直系同源物(orthologues)與列舉之C-型凝集素(lectin)基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。被特別考量之直系同源物為小鼠中之庫佛氏(Kupffer)細胞受體(mKCR)基因(與人類CLEC4F同源)。

被考量用於本發明之TREM基因及TREML基因包括，但非限於，下列人類基因：類CD300抗原家族成員B(CD300LB)、類CD300抗原家族成員G(CD300LG)、TREM1、TREM2、TREML1(TLT1)、TREML2(TLT2)、TREML3(TLT3)及TREML4(TLT4)。此等基因之任一者之同源物亦在考量之列，來自其他種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源及直系同源物與此等列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。被特別考量之直系同源物包括來自小鼠之mTREM1、mTREM2、mTLT1及mTLT4。

被考量用於本發明之TLR基因包括，但不限於，下列人類基因：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12及TLR13。此等基因之任一者之同源物亦在考量之列，來自其他種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及直系同源物與所列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。

被考量用於本發明之SIGLEC基因包括，但不限於，下列人類基因：CD22、CD33、髓鞘相關醣蛋白(MAG)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC13及唾液酸黏附素(SN)。此等基因之任一者之同源物亦在考量之列，來自其他種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及直系同源物與所列舉之SIGLEC基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。

適用於本發明之其他先天性免疫受體包括在下述實施例中所記載者。

融合蛋白質可包含先天性免疫受體之整個細胞外區域，該細胞外區域包括碳水化合物識別區域；或者融合蛋白質可包含該細胞外區域之一部分，包括碳水化合物識別區域；或者融合蛋白質可僅包含碳水化合物識別區域。

異源多肽可包含能與先天性免疫受體之碳水化合物識別區域融合，以致該異源多肽在活體內或試管中皆不會干擾碳水化合物區域與其同系(cognate)特異性碳水化合物之結合之任何多肽。異源多肽較佳為免疫球蛋白，諸如人類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgD、IgAa及IgA2或者來自其他種動物之免疫球蛋白。較佳以免疫球蛋白之片段，例如IgG之Fc片段，做為異源多肽。在較佳之具體例中，該異源多肽為不會與人類Fc受體結合之免疫球蛋白變型。該等變型在本技術中已為熟知。舉例言之，可使用包含下列突變之人類IgG1 Fc變型：L234A、L235E、G237A及P331S。

該異源多肽尚可包含一個或一個以上允許融合多肽固定在固體支撐物上或從複合物混合物中純化之功能區域。舉例言之，該異源多肽可包含His6 tag以允許融合蛋白質依照本技術中所熟知之方法附接在Ni-NTA固體支撐物上。再舉例言之，該異源多肽可包含麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase)區域，以致生成之融合蛋白質可吸附在，例如，麩胱甘肽珠粒或由麩胱甘肽衍生之微量滴定平皿中。

該異源多肽亦可包含一分子或一分子以上之生物素或生物素衍生物。以此方式，融合蛋白質可固定在綴合有鏈黴抗生物素蛋白之固體支撐物上，或者可使綴合有鏈黴抗生物素蛋白之酶與融合蛋白質結合。

融合蛋白質視需要在異源多肽與先天性免疫受體之碳水化合物識別區域之間復可包含連結子(linker)。該連結子可為肽類連結子，或者其可為非肽類連結子，諸如聚乙二醇。

在融合蛋白質中，碳水化合物識別區域可為相對於異源多肽之C-端或者可為相對於異源多肽之N-端。

本發明之融合蛋白質可藉由蛋白質製造技術中已知之任何方法製備。融合蛋白質較佳使用本技術熟知之重組DNA技術及蛋白質表現技術製備。舉例言之，編碼先天性免疫受體之碳水化合物識別區域之DNA，可藉由使用對該特定目標先天性免疫受體之碳水化合物識別區域具特異性之引子進行mRNA之反錄酶PCR(RT-PCR)而製備。然後可將生成之DNA，連同編碼異源多肽序列之DNA，以可譯讀之方式選殖入表現載體中。本發明所使用之表現載體典型地含有複製源、位於5’端(即其上游)之啟動子、並接續編碼融合蛋白質之DNA序列、轉錄終止序列及剩餘之載體。該等表現載體亦可包括本技術已知之其他DNA序列，例如提供表現產物安定性之安定性前導序列、提供表現產物之分泌之分泌前導序列以及允許調節或誘發融合蛋白質表現之序列。表現載體亦可含有允許使用病毒表現系統，諸如本技術熟知之桿狀病毒(baculovirus)表現系統，來表現融合蛋白質之病毒序列。可將表現載體引進宿主細胞，諸如微生物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞。可將表現載體以裸DNA之形式引進細胞中，或者其可被包封在病毒(諸如桿狀病毒)中。可將表現載體保持在宿主細胞內，或者將表現載體整合入宿主細胞基因組中。

表現載體較佳包含能使分泌前導序列加至融合蛋白質上之DNA序列，藉此使得融合蛋白質分泌至環繞宿主細胞之培養基中。然後可用本技術已知之技術將融合蛋白質從培養基中純化。舉例言之，若融合蛋白質包含IgG以做為異源多肽，則蛋白質A管柱可用於結合融合蛋白質，以允許融合蛋白質與周圍培養基中之其他蛋白質分離。

融合蛋白質亦可藉由使用試管內表現系統諸如爪蟾卵母細胞表現系統，在試管中轉譯編碼融合蛋白質之mRNA而製造。

在一具體例中，融合蛋白質係分開製造，然後使用本技術已知之化學技術將該等偶合在一起。舉例言之，可將碳水化合物識別區域及異源多肽分開製造，然後藉由使用戊二醛而將彼此偶合。

製造融合蛋白質之後，融合蛋白質可用可檢測之標記諸如螢光物質、放射線標記、酶、酶受質、染劑、化學發光劑、磁珠、量子點或其他任何能直接或間接產生可檢測信號之部分予以標幟。本技術已知許多使此等可檢測標記與蛋白質綴合之方法。舉例言之，可將經N-羥基琥珀醯亞胺活化之染料，最佳為經N-羥基琥珀醯亞胺活化之螢光物質，藉由與融合蛋白質上之一級胺反應而與融合蛋白質綴合。

在一些具體例中，使用本技術已知之方法將融合蛋白質生物素化，以致該融合蛋白質包含一個或多個生物素分子，或者一個或多個生物素衍生物分子。藉此方式，該融合蛋白質可附接於鏈黴抗生物素蛋白可檢測部分綴合物，諸如酶-鏈黴抗生物素蛋白綴合物。

在一系列之具體例中，本發明之融合蛋白質可被用於測定在包含多醣體之組合物中是否存在特異性碳水化合物成分。該方法涉及使多醣體與能和多醣體之特異性碳水化合物成分結合之融合蛋白質接觸，然後測定融合蛋白質是否與組合物中之多醣體結合。舉例言之，已知CLEC7A(亦稱為樹狀細胞凝集素-1)之碳水化合物識別區域可與β-1,3-D-葡聚糖交互作用(參見Brown,G.D.and Gordon,S.,2001,Nature 413,36-7，該文獻全文以參考資料方式納入本文)。所以包含CLEC7A之碳水化合物識別區域之融合蛋白質結合至多醣體組合物表示該多醣體組合物包含β-1,3-D-葡聚糖。同樣地，既然囓齒動物之庫佛氏(Kupffer)細胞受體(KCR；與人類CLEC4F同源)對於D-半乳糖及N-乙醯基半乳糖胺具有高親和性，並能從血清中清除以D-半乳糖及D-岩藻糖為終端之醣蛋白(參見Fadden,A.J.,Holt,O.J.and Drickamer,K.(2003)；Glycobiology 13,529-37,該文獻全文以參考資料方式納入本文)，包含KCR之碳水化合物識別區域之融合蛋白質結合至多醣體組合物表示該多醣體組合物包含D-半乳糖或N-乙醯基半乳糖胺或以D-半乳糖為終端之醣蛋白或以D-岩藻糖為終端之醣蛋白。此外，CD209(亦稱為DC-SIGN及CLEC4L)以及CLEC4M(亦稱為DC-SIGNR及L-SIGN)皆可結合至Man₉ GlcNAc₂ Asn醣肽，但只有CD209可結合至具有終端岩藻糖殘基之聚糖，而CLEC4M則否(參見Guo et al(2004)Nat Struct Mol Biol 11、591-8)；所以CD209及CLEC4M之融合蛋白質可區分包含此等碳水化合物成分之多醣體組合物。所以本發明之方法及試劑可用於鑑定多醣體組合物之碳水化合物成分以及此等碳水化合物成分之相對量，例如，以「指紋辨識(fingerprint)」多醣體組合物之獨特細微特徵。舉例言之，本發明之方法及試劑可用於測定具有免疫調節活性之多醣體組合物之碳水化合物成分。

此外，若已知表現融合蛋白質之碳水化合物識別區域所來自之先天性免疫受體之細胞為何種類別，則本發明之檢定分析(assay)將能顯示在身體內與所探討之多醣體結合之細胞之類別。該知識，例如，有助於揭露特定多醣體組合物(諸如單離自靈芝之多醣體)對於與該多醣體接觸之生物施予有利或有害作用之機制。在該具體例中，非必須知道該碳水化合物識別區域所結合之碳水化合物成分之類別。

本發明之融合蛋白質與其同系(cognate)碳水化合物成分之結合，可藉由將包含多醣體之組合物固定於固體支撐物，然後使該固體支撐物與融合蛋白質接觸而進行。融合蛋白質之結合可藉由檢測在固體支撐物之表面是否存在融合蛋白質，例如，藉由檢測固體支撐物之表面是否存在異源多肽或檢測固體支撐物之表面是否存在碳水化合物識別區域而檢測。例如，若異源多肽與螢光物質綴合，則沖洗後固體支撐物之表面存在螢光物質表示融合蛋白質存在，其最終表示存在包含由融合蛋白質之碳水化合物識別區域所識別之特異性碳水化合物成分之多醣體。

在本文中，「固體支撐物」被界定為分子可經由共價鍵或非共價鍵附接之任何表面。該固體支撐物包括，但不限於，膜(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)、塑膠(例如微量滴定平皿)、順磁珠(paramagnetic beads)、帶電紙、尼龍、Langmuir-Bodgett薄膜、官能化玻璃、鍺、矽、PTFE、聚苯乙烯、砷化鎵、金及銀。在本技術中任何已知之在表面能納入胺基、羧基、硫醇基或羥基之其他材料亦可列入考量。此包括具有任何拓樸結構之表面，該拓樸結構包括，但不限於，球表面、有溝槽表面及圓柱形表面，例如管柱。

包含多醣體之組合物(在本文中亦稱為多醣體組合物)可非限定地為包括多醣體之任何組合物，該多醣體包括，例如，醣蛋白(包括蛋白多醣(proteoglycan))、醣脂質、肽醣(peptidoglycan)、微生物細胞壁、病毒粒子及真菌細胞壁。在其他具體例中，包含多醣體之組合物為在溶液中之游離多醣體，例如未附接於蛋白質或脂質之多醣體。在本文中，「多醣體」意指包含2個或2個以上單醣之碳水化合物分子。

包含多醣體之組合物在固體支撐物上之固定化例如可藉由將組合物中之多醣體生物素化，然後將其固定在綴合有鏈黴抗生物素蛋白之固體支撐物上而達成。此外，可將多醣體固定在，例如，經甲醇活化之PVDF膜上。尤被列入考量者為以「轉漬」之方式進行本發明之方法，其中使用固定在PVDF膜上之多醣體點。

在一些具體例中，融合蛋白質與固定之多醣體之結合可藉由下法檢測：使第二試劑(secondary reagent)結合至融合蛋白質，較佳結合至異源多肽，繼而檢測第二試劑之存在。舉例言之，可將生物素化融合蛋白質附接於綴合有鏈黴抗生物素蛋白之酶，並藉由加入能得到可檢測產物之受質來檢測酶之存在。未生物素化之融合蛋白質可用例如可結合至異源多肽之抗體(若異源多肽為IgG或IgG Fc，則抗體為諸如抗-IgG抗體)而檢測，其中二次抗體與酶綴合。舉例言之，若酶為辣根過氧化酶(HRP)，則融合蛋白質結合之檢測可用本技術已知之加強化學發光(ECL)技術進行。可將第二試劑復綴合至或改為綴合至可檢測標記，諸如螢光物質或放射性核。在本技術中尚知道許多可用於檢測所揭示之融合蛋白質與固體支撐物之結合之其他技術。

尤被考量者為上述檢定分析可以多工化陣列模式進行。例如固體支撐物可被分隔成複數個空間上分離之位址，在該等位址上可結合有多個不同的組合物。然後將該固體支撐物與融合蛋白質接觸並檢測該融合蛋白質之結合。以此方式可以測定被固定之多醣體組合物中何者(若有)包含可與融合蛋白質之碳水化合物識別區域結合之特異性碳水化合物成分。

在另一具體例中，單一組合物被固定在固體支撐物上，該固體支撐物被分隔成複數個在空間上分離之位址。各位址然後與不同的融合蛋白質接觸，各不同的融合蛋白質包含不同的碳水化合物識別區域。沖洗以移除非特異性結合之材料後，然後可如上述檢測融合蛋白質之結合：檢測到之各結合反應之空間位址揭露所結合之融合蛋白質之類別。以此方式，可同時使用許多不同的融合蛋白質偵測組合物。在該具體例中，各融合蛋白質可包含相同的異源多肽，藉此允許使用單一第二試劑同時檢測在各位址之結合。例如，若各融合蛋白質包含IgG Fc以做為異源多肽，則可使用抗-IgG抗體或蛋白質A或蛋白質G檢測融合蛋白質之結合。

本發明之融合蛋白質及方法可用於「指紋辨識(fingerprint)」任何包含多醣體之組合物之獨特細微特徵，該等組合物包括，但不限於得自草藥製劑之多醣體組合物，諸如單離自真菌：靈芝(Ganoderma lucidim)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)及蘑菇(Lentinus edodes)以及得自植物霍山石斛(Dendrobium huoshanense)之含多醣體部分。特定而言，尤被考量者為使用本文所述之方法測定靈芝多醣體之F3多醣體部分之碳水化合物成分(參見Wang,et al(2002)Bioorg Med Chem 10,1057-62；Chen,et al(2004)Bioorg Med Chem 12,5595-601；Chien,et al(2004)Bioorg Med Chem 12,5603-9.；以及Hsu et al(2004)J Immunol 173,5989-99，各文獻全文以參考資料方式納入本文)。

本文提供之方法可被用於指紋辨識複合物混合物之獨特細微特徵，該複合物混合物包括許多不同的多醣體組合物，或者可用於只含單一多醣體種類，例如單一醣蛋白或單一多醣體之製劑。

若已知表現碳水化合物識別區域所來自之先天性免疫受體之細胞之類別，則上述檢定分析將可揭露當將多醣體組合物引進體內時，體內會與多醣體結合之細胞。然後亦可能得到調節所鑑定之先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，若先天性免疫受體與多醣體之交互作用在體內造成有益之作用，則可以製造擬似該多醣體之結構或加強該多醣體與該先天性免疫受體間之交互作用之藥劑。參見下文以「調節劑」為標題之段落。

在另一系列具體例中，本發明之方法及融合蛋白質被用於測定在病原體表面展示之多醣體之類別(identity)，該等病原體諸如真菌細胞、細菌細胞或病毒(諸如具套膜病毒；且病毒亦非限定性地包括來自黃熱病毒科之病毒)。適用於本發明方法之黃熱病毒科病毒非限定性地包括黃熱病毒屬成員(諸如登革熱病毒(DV)、西尼羅熱病毒(WNV)、日本腦脊髓炎病毒(JEV)、黃熱病毒(YFV)及蜱傳腦脊髓炎病毒)或肝炎病毒屬成員(諸如C型肝炎病毒)。在一該具體例中，將融合蛋白質固定在固體支撐物上(例如若異源多肽為IgG或其片段，則使用由蛋白質A所衍生之固體支撐物)，然後使固體支撐物與包含所探究病原體之組合物接觸。沖洗後，使用例如第二試劑檢測病原體之結合，該第二試劑可以不會與融合蛋白質之結合競爭之方式，與病原體特異性地結合。舉例言之，可使用對病原體具特異性之二次抗體。然後第二試劑之結合可如上述檢測(例如使用綴合有HRP之二次抗體)或者使用與第二試劑結合之第三試劑進行檢測(舉例言之，若第二試劑為抗-病原體IgG，則使用與HRP綴合之抗-IgG抗體)。若檢測到二次試劑之結合，其顯示該病原體包含多醣體且該多醣體包含融合蛋白質之碳水化合物識別區域所識別之特異性碳水化合物成分。

或者，該檢定分析可藉由將與病原體特異性結合之試劑固定在固體支撐物上而進行。例如將可與病原體結合之抗體固定在固體支撐物上，繼而與包含病原體之組合物接觸。然後使固體支撐物與融合蛋白質接觸，並如上述檢測融合蛋白質之結合(該融合蛋白質較佳不會和病原體競爭與固定試劑之結合)。舉例言之，若融合蛋白質之異源多肽為IgG Fc，則抗-IgG抗體可檢測融合蛋白質與病原體之結合；或者若融合蛋白質與可檢測之標記綴合，則該標記之檢測被用於檢測結合。

被經常列入考量者為上述病原體檢定分析，例如同時使用複數種不同的融合蛋白質以多重方式進行。舉例言之，將可與病原體結合之抗體固定在固體支撐物上之複數個分開的位址；然後使固體支撐物與包含病原體之組合物接觸；接著使各特異性位址與不同的融合蛋白質接觸，各不同的融合蛋白質包含不同的碳水化合物識別區域。若各融合蛋白質包含相同的異源多肽，則融合蛋白質之結合可用能與異源多肽結合之單一試劑檢測。舉例言之，若異源多肽為IgG Fc，則抗-IgG抗體可被用於檢測融合蛋白質之結合。各結合反應之空間位址即可揭露出融合蛋白質之種類。或者，可使用固定在固體支撐物之空間分離位址上之複數種不同融合蛋白質進行多重檢定分析，其中使固體支撐物與包含病原體之組合物接觸，繼而使固體支撐物與能和病原體特異性結合之第二試劑接觸。舉例言之，若病原體為登革熱病毒，則第二試劑可為對抗E套膜蛋白質之抗體。如在上述所有檢定分析中者，可進行沖洗以從固體支撐物移除非特異性結合之物質。

使用本文揭示之方法時，已發現登革熱病毒會與CD14+巨噬細胞表面上之DVLR1/CLEC5A結合。參見實施例11。再者，已證明DVLR1/CLEC5A結合於登革熱病毒造成DAP12之活化，其最終導致促發炎性細胞激素TNF-α、MIP-1 α、IFN-α及IL-8從巨噬細胞之釋放。參見實施例12。此等細胞激素之釋放參與出血性登革熱(DHF)及登革熱休克症候群(DSS)之發展。

根據本文揭示方法之具體例，其已明確顯示DVLR1/CLEC5A可與登革熱病毒作用。參見實施例16-18。此外，其顯示DVLR1/CLEC5A可調節DAP12之磷酸化作用，咸信該磷酸化作用可至少部分調節諸如TNF-α之促發炎性細胞激素的釋出。參見實施例18。當經登革熱病毒感染之細胞中的DVLR1/CLEC5A表現下降(knock down)時，DAP12之磷酸化作用會降低，且包括TNF-α之促發炎性細胞激素之分泌會減少，同時並不會影響諸如干擾素-α之負責進行病毒清除之細胞激素的分泌。參見實施例18-19。根據具體例，DVLR1/CLEC5A之下降(knock down)可使用習知之RNA-干擾技術完成，包括si-RNA及sh-RNA兩者之使用。參見實施例18-19。

對於會與病原體交互作用之先天性免疫受體之類別(identity)之認知，繼而可被用於開發能調節先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，可以獲取能活化所鑑定出之先天免疫性受體之調節劑，以加強對於特定病原體之免疫反應。若先天性免疫受體與特定多醣體組合物之交互作用對於身體有害(例如當病原體引起過度發炎時)，則可獲取能降低先天性免疫受體之活性之調節劑。例如可使用能封阻病原體結合於先天性免疫受體之藥劑(諸如抗體)，以防止該病原體感染所造成之不期望促發炎反應之發生。同樣地，若本發明之篩選方法揭露特定病原體(諸如病毒)利用先天性免疫受體而獲取進入細胞之管道，則封阻該病原體結合於先天性免疫受體之藥劑將會防止病原體進入細胞。

根據本文揭示方法之具體例，其顯示投與能夠減少可用DVLR1/CLEC5A結合位點之干擾藥劑可增加經登革熱病毒感染小鼠之存活率。根據具體例，其顯示投與能夠干擾DVLR1/CLEC5A與DVLR1/CLEC5A配體結合之DVLR1/CLEC5A抗體可增加小鼠之存活率。參見實施例25。

在另一系列具體例中，本發明之融合蛋白質被用於干擾或防止多醣體與細胞表面上之先天性免疫受體間之交互作用。在該系列之具體例中，融合蛋白質包含在細胞表面上表現之先天性免疫受體之碳水化合物識別區域。然後使該表現先天性免疫受體之細胞與融合蛋白質在活體內或試管中接觸，藉此融合蛋白質和多醣體競爭與先天性免疫受體之結合。

若多醣體與細胞表面上之先天性免疫受體間之交互作用對於生物產生有害的作用，可將治療有效量之融合蛋白質以醫藥組合物之形式投與至生物，以防止或減輕該交互作用。所投與之融合蛋白質之異源多肽較佳不會與任何細胞表面受體結合。例如，異源多肽可包含IgG Fc之突變型，該突變型不會與細胞表面上之Fc受體結合。

純化

在另一系列具體例中，融合蛋白質被用於至少部分純化或單離包含融合蛋白質之碳水化合物識別區域所識別之特異性碳水化合物成分之多醣體。舉例言之，可將融合蛋白質固定在固體支撐物上，並使疑似含有或已知含有多醣體組合物之組合物與固體支撐物接觸。若該組合物包含可與融合蛋白質之碳水化合物識別區域結合之多醣體，則該多醣體會與融合蛋白質結合。然後可沖洗固體支撐物以移除組合物之非特異性結合成分，而結合之多醣體可藉由解開與融合蛋白質之交互作用而溶析，然後將其收集。舉例言之，若融合蛋白質包含凝集素受體之碳水化合物識別區域，則可使用EDTA螯合Ca²⁺ 以解開交互作用。以此方式，可以從複合物混合物純化出特異性多醣體組合物。在較佳具體例中，其使用該方法純化單離自靈芝之多醣體。

就上述純化方法而言，該固體支撐物可包含例如結合有融合蛋白質之管柱。適當的管柱包括瓊脂糖(Sepharose)蛋白質A管柱，其中包含IgG以做為異源多肽之融合蛋白質可經由融合蛋白質之IgG區域與蛋白質A之交互作用而結合在該管柱上。或者，可以經CNBr活化之管柱介質而與融合蛋白質結合。

本發明亦提供可用於上述方法之任一者之套組。在一具體例中，套組包含本發明之融合蛋白質，其裝在一個或多個容器中。該套組亦可包含第二試劑，諸如與融合蛋白質之異源多肽區域特異性結合之抗體，舉例言之，若異源多肽為IgG或其片段，該第二試劑為抗-IgG抗體。該套組亦可包含檢測融合蛋白質與多醣體結合用之試劑及緩衝液。例如，在使用綴合有HRP之二次抗體檢測融合蛋白質與多醣體之結合之具體例中，該套組可包含建立增強之化學發光反應所需之試劑，例如一個或一個以上容器包含魯米諾(luminol)、對-香豆酸(p-coumaric acid)、Tris緩衝液及過氧化氫。該套組亦可包含一個或一個以上陽性對照多醣體。該套組亦可包含一個或一個以上用於上述方法之固體支撐物，例如，一個或一個以上PVDF膜或者一個或一個以上多孔微量滴定平皿。

調節劑

如上述，本發明之方法鑑定出會與特定多醣體交互作用之先天性免疫受體。該等資料使吾等得以得到所鑑定出之先天性免疫受體之調節劑。調節劑可為先天性免疫受體之催動劑、桔抗劑(包括競爭性或非競爭性桔抗劑)或逆向催動劑。調節劑可(但非限於此)抑制多醣體與先天性免疫受體之結合；加強多醣體與先天性免疫受體之結合；或者做為可與先天性免疫受體結合之多醣體之擬似劑，藉此甚至在缺乏多醣體時亦可活化先天性免疫受體。

先天性免疫受體之調節劑包括抗體。舉例言之，對抗先天性免疫受體之拮抗性抗體可防止病原體與先天性免疫受體之結合。在一些情況，該抗體為中和抗體，因其會防止病原體進入表現該先天性免疫受體之細胞。或者，催動性抗體可做為對於細胞施予有益作用之多醣體組合物之擬似物。拮抗性抗體與先天性免疫受體之結合方式亦可封阻受體於病原體結合時所進行之下游信號傳導。抗體可為(但非限於此)多株抗體、單株抗體、單價抗體、雙特異性抗體、雜綴合型抗體、多特異性抗體、人類抗體、人型化抗體或嵌合抗體；單鏈抗體；Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現庫產生之片段；抗基因型(anti-idiotypic，anti-Id)抗體；以及上述抗體之任一種之抗原決定部位-結合性片段。本文所用之術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有可與抗原免疫特異性地結合之抗原結合部位之分子。該免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。再者，術語「抗體」(Ab)或「單株抗體」(Mab)意欲包括完整的分子以及能與蛋白質特異性地結合之抗體片段(諸如Fab及F(ab')₂ 片段)。Fab及F(ab')₂ 片段缺乏完整抗體之Fc片段，因而可較快速地從動物或植物之循環清除，且其與完整的抗體相較，具有較少的非特異性組織結合性(Waahl et al.、J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。製造抗體催動劑之方法例如記載於PCT公開號WO 96/40281；美國專利第5,811,097號；Deng et al.,Blood 92(6)：1981-1988(1998)；Chen et al.,Cancer Res.58(16)：3668-3678(1998)；Harrop et al.,J.Immunol.161(4)：1786-1794(1998)；Zhu et al.,Cancer Res.58(15)：3209-3214(1998)；Yoon et al.,J.Immunol.160(7)：3170-3179(1998)；Prat et al.,J.Cell.Sci.111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard et al.,J.Immunol.Methods 205(2)：177-190(1997)；Liautard et al.、Cytokine 9(4)：233-241(1997)；Carlson et al.,J.Biol.Chem.272(17)：11295-11301(1997)；Taryman et al.,Neuron 14(4)：755-762(1995)；Muller et al.,Structure 6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek et al.,Cytokine 8(1)：14-20(1996)；Harlow et al.,Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling,et al.,in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(所有文獻全文以參考資料之方式納入本文)。

本發明提供可在DV感染後防止TNF-α從巨噬細胞釋出之抗-DVLR1/CLEC5A單株抗體之非限定特異性實施例。參見實施例15。此等抗體可用於本文所指定之醫藥組合物及治療方法，尤其是用於治療或預防人類DV感染之組合物及方法。

本發明亦提供可在DV或JEV感染後防止TNF-α從巨噬細胞釋出之人型化抗-DVLR1/CLEC5A抗體。參見實施例20-26。在特定具體例中，該人型化抗體係選自由人型化抗體9B12、3E12A2、3E12C1、3E12G9、及8H8F5所組成之群。此等抗體可用於本文所指定之醫藥組合物及治療方法，尤其是用於治療或預防人類DV感染之組合物及方法。特定之治療包括抑制DV-誘發性血漿滲漏以及皮下及生命器官(vital organ)出血。該等人型化抗體可作為DV-誘發性出血休克及敗血症之治療方法。尤被考量者，本文所述有關由病毒所造成之細胞激素刺激減輕可應用於所有可結合並調節細胞之刺激性受體的病毒。

再者，病毒之發現及治療原則可以類似方式延伸至細胞侵入受體以及細菌、真菌、及寄生物之作用。本發明之方法將可使一般精於本技術者能夠判斷病原體之結合特性(亦即，其與何種受體結合)，判斷與該受體之結合具有何種作用，並提供諸如抗體之干擾劑以干擾病原體結合目標受體之能力。

根據具體例，藉由融合小鼠脾細胞及NS1骨髓配對細胞而產生之單株抗體(mAbs)抗-DVLR1/CLEC5A mAb可以噬菌體展示技術產生，以產生單鏈人類抗-人類DVLR1/CLEC5A mAbs。催動性及拮抗性mAbs可根據實例19-25所揭示之篩選方法而選擇。

為降低現有小鼠抗-人類DVLR1/CLEC5A mAbs之抗原性，根據具體例，以人類免疫球蛋白G1(IgG1)取代野生型Fc部分。為進一步廢除Fc與Fc受體之結合並防止補體活化，可使用人類IgG1之突變Fc片段(L234A、L235E、G237A、及P331S)取代野生型Fc部分以產生人型化mAbs。為進一步降低抗原性，可以人類序列取代抗體V區域之框架區域。

先天性免疫受體之調節劑亦包括由高通量篩選方法所鑑定出之小分子。該高通量篩選方法典型地提供含有大量潛在治療化合物(例如配體或調節劑化合物)之組合化學品或肽庫。然後在一個或一個以上檢定分析中篩選該等組合化學品庫或配位體庫，以鑑定出此等可與所探究之先天性免疫受體結合之庫成員(例如特定的化學品種類或亞類)。如此鑑定出之化合物可做為習知之引導化合物(lead compound)，或者本身可做為潛在的或實際的治療劑。

組合化學品庫為藉由化學合成或生物合成，或者藉由組合許多化學建構基塊(即試劑，諸如胺基酸)所產生之在化學上分歧之化合物之集合物。舉例言之，線性組合庫，例如多肽或肽庫，藉由以對既定化合物長度(即在多肽或肽化合物中胺基酸之數目)而言每種可能的方式，組合一套化學建構基塊而形成。數以百萬計之化合物可經由組混化學建構基塊而合成。

組合化學品庫之製備及篩選為精於相關技術者所熟知。該組合庫包括，但非限於肽庫(例如美國專利第5,010,175號；Furka,1991,Int.J.Pept.Prot.Res.,37,487-493；以及Houghton et al.,1991,Nature,354：84-88)。亦可使用其他產生化學上分歧之化學品庫之化學方法。化學上分歧之化學品庫之化學類別之非限定性例子包括肽(PCT公開號WO 91/019735)，經編碼之肽(PCT公開號WO 93/20242)，隨機生物寡聚物(PCT公開號WO 92/00091)，苯并二吖呯類(benzodiazepines)(美國專利第5,288,514號)，分歧異構物(diversomers)諸如海因類(hydantoins)、苯并二 呯類(benzodiazepines)及二肽類(Hobbs et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6909-6913)，類乙烯多肽(Hagihara et al.,1992,J.Amer.Chem.Soc.,114：6568)，具葡萄糖框架(glucose scaffolding)之非肽類擬肽(Hirschmann et al.,1992,J.Amer.Chem.Soc.,114：9217-9218)，小型化合物庫(Chen et al.,1994,J.Amer.Chem.Soc.,116：2661)，寡聚胺基甲酸酯(Cho et al.,1993,Science,261：1303)，及/或膦酸肽酯(Campbell et al.,1994,J.Org.Chem.,59：658)之類似有機合成，核酸庫(例如參見美國專利第5,270,163號，其述及核酸配體(亦稱為“aptamers”)之產生)，肽-核酸庫(美國專利第5,539,083號)，抗體庫(例如Vaughn et al.,1996,Nature Biotechnology,14(3)：309-314)及PCT/US96/10287)，碳水化合物庫(例如參見Liang et al.,1996,Science,274-1520-1522)及美國專利第5,593,853號)，小型有機分子庫(例如，苯并二呯類，Baum C&EN,Jan.18,1993,page 33；以及美國專利第5,288,514號；類異戊二烯類，美國專利第5,569,588號；噻唑啶酮類(thiazolidinones)及間全氫噻口井酮類(metathiazanones)，美國專利第5,549,974號；吡咯啶類(pyrrolidines)，美國專利第5,525,735號及第5,519,134號；嗎啉類化合物，美國專利第5,506,337號；以及類似者)。

製備組合庫之裝置可從市面購得(例如357 MPS,390 MPS,Advanced Chem Tech,Louisville Ky.；Symphony,Rainin,Woburn,Mass.；433A Applied Biosystems,Foster City,Calif.；9050 Plus,Millipore,Bedford,Mass.)。此外，許多組合庫可從市面購得(例如,ComGenex,Princeton,N.J.；Asinex,Moscow,Russia；Tripos,Inc.,St.Louis,Mo.；ChemStar,Ltd.,Moscow,Russia；3D Pharmaceuticals,Exton,Pa.；Martek Biosciences,Columbia,Md.,以及類似者)。

醫藥組合物

本發明亦提供醫藥組合物。在一些具體例中，醫藥組合物包含本發明之融合蛋白質。在其他具體例中，醫藥組合物包含先天性免疫受體之調節劑(例如對抗先天性免疫受體諸如DVLR1/CLEC5A之抗體，包括實施例15所例示之抗體)。在該等醫藥組合物中，融合蛋白質或先天性免疫受體調節劑構成「活性化合物」。在一些具體例中，其將醫藥組合物投與至病患，以治療或預防以多醣體結合至病患細胞表面之先天性免疫受體為特徵之疾病或失調。在其他具體例中，其係於增加先天性免疫受體之活性對於病患有助益之情況，將該等醫藥組合物投與至病患以活化該先天性免疫受體。在另一些具體例中，其將醫藥組合物投與至病患，以加強多醣體組合物與先天性免疫受體之結合。

醫藥組合物除了包含活性化合物之外，較佳復包含至少一種醫藥上可接受之載劑。本文所用之術語「醫藥上可接受之載劑」包括與醫藥投與相容之溶劑、分散體介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及類似物。亦可將輔助的活性化合物納入組合物中。將醫藥組合物調配成與其意欲的投與途徑相容。投與途徑之例子包括腸道外投與，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、穿皮(外用)、穿黏膜及直腸投與。用於腸道外、皮內或皮下投與之溶液或懸浮液可包括下列成分：無菌稀釋液諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩衝液諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及等張性調整劑諸如氯化鈉或葡萄糖。pH值可用酸或鹼諸如鹽酸或氫氧化鈉調整。腸道外製劑可密封在玻璃或塑膠製之安瓿、可拋棄式注射筒或多劑量小瓶中。

本文中所用之術語「病患」係指人類及非人類靈長類(例如猩猩、獼猴、狨猴)，家畜(例如綿羊、牛、馬、驢子、豬)，寵物(例如狗、貓)，實驗室試驗動物(例如小鼠、兔子、大鼠、天竺鼠、倉鼠)，圈養之野生動物(例如狐狸、鹿)以及任何可從本發明藥劑獲益之其他生物。對於可從本文所述之藥劑獲益之動物類型沒有限制。在本發明中最佳之病患為人類。不論是人類或非人類生物皆可被稱為病患(patient)、個體(individual)、動物、宿主(host)或接受者(recipient)。

適合注射用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在可溶於水之情況)或分散體以及無菌注射溶液或分散液之即時調配製劑用之無菌粉末。就靜脈內投與而言，適當的載劑包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況，組合物必須為無菌以及具有某種程度之流體性，以易於注射。組合物在製造及貯存條件下應當安定且必須對抗微生物諸如細菌及真菌之污染作用而進行防腐。載劑可為溶劑或分散體介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇以及類似物)以及其適當的混合物。適當的流體性例如可以藉由使用塗膜諸如卵磷脂而維持，在分散體之情況藉由保持所需之粒度而維持以及藉由使用界面活性劑而維持。防止微生物之作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)及類似物而達成。在許多情況，組合物較佳包括等張劑，例如，糖、多元醇諸如甘露醇及山梨醇、或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑例如單硬脂酸鋁及明膠而達成。

無菌注射溶液可藉由將所需量之活性化合物引進適當的溶劑中，視需要同時引進上文列舉之成分之一種或組合物，繼而過濾滅菌而製備。一般而言，分散液藉由將活性化合物引進無菌載劑而製備，該無菌載劑含有基本分散介質及上文列舉者中之所需其他成分。製備無菌注射溶液所用之無菌粉末之情況，較佳之製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其可從先前經無菌過濾之溶液得到活性成分加上任何其他期望成分之粉末。

口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用之載劑。就口服治療投與之目的而言，活性化合物可與賦形劑混合並以錠劑、含錠或膠囊劑(例如明膠膠囊劑)之形式使用。口服組合物亦可用流體載劑製備，以做為漱口水。醫藥相容性結合劑或佐劑物質可被納入做為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊劑、含錠劑及類似製劑可含有下列成分之任一種或具有相似性質之化合物：黏合劑諸如微晶形纖維素、西黃耆膠或明膠；賦形劑諸如澱粉或半乳糖；崩散劑諸如藻膠酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑諸如硬脂酸鎂或Sterotes；滑劑諸如膠體二氧化矽；甜味劑諸如蔗糖或糖精；或調味劑諸如薄荷(peppermint)、水楊酸甲酯或橙類調味劑。

就藉由吸入之投與而言，化合物以氣溶膠噴霧劑(aerosol spray)之形式從含有適當推進劑(例如氣體諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器輸出，或由霧化器(nebulizer)輸出。

全身性投與亦可經由穿過黏膜(transmucosal)或穿皮投與。就穿過黏膜或穿皮投與而言，在調配物中使用適於透過障壁之滲透劑。此等滲透劑在本技術中為眾所週知，例如就穿過黏膜投與而言，包括清潔劑、膽鹽及褐黴酸(fusidic acid)衍生物。穿過黏膜投與可經由使用鼻噴霧劑或栓劑而達成。就穿皮投與而言，活性化合物被調配成本技術所週知之軟膏、油膏、凝膠或乳霜。

該等化合物亦可被製成供直腸輸送用之栓劑(例如使用習用之栓劑基劑諸如可可油脂及其他甘油酯)或滯留性灌腸劑。

在一具體例中，活性化合物藉由使用能保護該化合物使其免於從身體快速清除之載劑，而製備成例如控制釋放調配物，該控制釋放調配物包括植入物、顯微包膠輸送系統。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物諸如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚羥乙酸、膠原、聚原酯(polyortho-ester)及聚乳酸。該等調配物之製法對精於本技術者而言為顯而易知。該等物質亦可從Alza公司及Nova藥品公司獲得。微脂粒懸浮液(包括具有針對細胞-特異性抗原之單株抗體而可標定於感染細胞之微脂粒)亦可被用做醫藥上可接受之載劑。此等微脂粒懸浮液可依照精於本技術者已知之方法製備，例如美國專利第4,522,811號所述者。

將口服或腸道外組合物調配成單位劑型係為有利，因為便於投與及劑量均勻。本文所稱之「單位劑型」係指適於做為待治療病人之單位劑量之物理上分離之單位；各單位含有經計算能產生期望治療作用之預定量活性化合物以及所需之醫藥載劑。

該等化合物之毒性及治療效力可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥方法測定，例如測定LD50(使群體之50%死亡之劑量)以及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性作用與治療作用間之劑量比稱為治療指數且係以LD50/ED50比表示。以顯示高治療指數之化合物為較佳。雖然可以使用顯示毒性副作用之化合物，但應小心設計將該等化合物標定於受犯組織部位之輸送系統，以使對於未感染細胞之潛在傷害減至最低，藉此減少副作用。

從細胞培養物檢定分析及動物研究得到之數據可用於調配某範圍之劑量以供病患使用。該等化合物之劑量較佳在包括ED50且引起極微或未引起毒性之循環濃度範圍內。劑量可在該範圍內，視所用劑型及投與途徑而變化。對於本發明方法所用之任何化合物而言，治療有效劑量初始可從細胞培養物檢定分析評估。在動物模型中調製能達到包括IC50(即受試化合物達到症狀之最大抑制之一半之濃度，該IC50如在細胞培養物中測得者)之循環血漿濃度範圍的劑量。該資料可被用於更精確地測定在病患中之有用劑量。血漿濃度例如可藉由高效液相層析測量。

如在本文中所定義，本發明之活性化合物之治療有效量可為約0.001至30毫克/公斤體重，較佳約0.01至25毫克/公斤體重，更佳約0.1至20毫克/公斤體重，甚至更佳約1至10毫克/公斤，2至9毫克/公斤，3至8毫克/公斤，4至7毫克/公斤，或者5至6毫克/公斤體重。活性化合物可以每星期1次至每天3次或3次以上之頻率投與，總計投與約1至10星期，較佳2至8星期，更佳約3至7星期，甚至更佳約4、5或6星期，但非限於此。精於本技術人士當了解某些因子會影響有效治療病患所需之劑量及給藥時間，該等因子包括，但不限於，疾病或失調之嚴重度、先前之治療、病患之一般健康狀況或年齡以及其他存在之疾病。再者，病患以治療有效量之本發明醫藥組合物之治療可包括單一治療或較佳包括一系列之治療。

基因治療及RNAi

編碼本發明之融合蛋白質之構築體可被用作基因治療規程之一部分，以將治療有效劑量之受體融合蛋白質輸送至病患。在活體中將核酸引進細胞之較佳途徑為藉由使用含有編碼本發明之融合蛋白質之核酸之病毒載體。以病毒載體感染細胞具有下述優點：高比例之標定細胞可接受核酸。此外，病毒載體中所編碼之分子，例如藉由病毒載體所含之cDNA所編碼之分子，在攝入病毒載體核酸之細胞中能有效率地表現。

反錄病毒(retrovirus vectors)及腺病毒相關性病毒載體可做為在活體中移轉編碼融合蛋白質之外源核酸分子之重組基因輸送系統。此等載體將核酸有效率地輸送入細胞中且所移轉之核酸被安定地整合入宿主之染色體DNA中。只製造複製-缺陷型反錄病毒之特異化細胞系(稱為「套裝細胞」)之開發使反錄病毒在基因治療之利用性上更為增加，且缺陷型反錄病毒經特徵定性而應用於基因治療目的之基因轉移中(該法之評介可參考Miller,A.D.(1990)Blood 76：271)。複製用缺陷型病毒可被組裝入病毒粒子中，該病毒粒子可藉由標準技術及使用輔助病毒感染標定細胞。產生重組反錄病毒之規程以及在試管中或活體中用該等病毒感染細胞之規程可記載於分子生物學之現有規程(Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.et al.,(eds.)Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14)以及其他標準實驗室手冊中。

另一有用的病毒基因輸送系統係使用衍生自腺病毒之載體。可將腺病毒之基因組加以處理，以致其編碼及表現所探討之基因產物，但在正常溶裂病毒生命循環中之複製能力則喪失。例如參見BerKner et al.,BioTechniques 6：616(1988)；Rosenfeld et al.,Science 252：431-434(1991)；以及Rosenfeld et al.,Cell 68：143-155(1992)。衍生自腺病毒Ad株5型d1324或腺病毒之其他株之適當腺病毒載體(例如Ad2,Ad3,Ad7等)為精於本技術者所已知。重組腺病毒在某些情況下為有利，因其不會感染未分裂細胞且可被用於感染廣泛種類之細胞類型，包括上皮細胞(Rosenfeld et al.,(1992)，如上文所引用者)。再者，該病毒粒子相對安定及可進行純化及濃縮，且如上述可加以修改，以影響感染力之範圍。此外，引進之腺病毒DNA(以及其所含之外來DNA)未被整合入宿主細胞之基因組而保持為游離基因體(episomal)，藉此可避免引進之DNA整合入宿主基因組(例如反錄DNA)時於整合位置發生插入性突變所引起之潛在問題。再者，腺病毒基因組攜帶外來DNA之能力比其他基因輸送用載體大(高達8仟鹼基)(Berkner et al.,上文所引用者；Haj-Ahmand et al.,J.Virol.57：267(1986))。

在另一具體例中，本發明之非病毒基因輸送系統依賴細胞吞噬途徑(endocytic pathways)而使標定細胞攝入目標核苷酸分子。例示之此型基因輸送系統包括衍生自微脂粒之系統、聚離胺酸綴合物及人造病毒套膜。在代表性具體例中，編碼本發明之融合蛋白質之核酸分子可封入表面帶正電之微脂粒[例如親脂質(lipofectins)]中且(視需要)核酸分子可用對抗目標組織之細胞表面抗原之抗體加以標記(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Geka 20：547-551；PCT公開WO91/06309；日本專利申請案第1047381號；以及歐洲專利公開EP-A43075)。

編碼本發明融合蛋白質之基因所用之基因輸送系統可藉由許多方法之任一者引進病患中。舉例言之，基因輸送系統之醫藥製劑可全身性地，例如藉由靜脈注射引進，而在目標細胞中蛋白質之特異性轉導主要係基於基因輸送載體所提供之特異性轉染、由轉錄調節序列控制之受體基因表現所造成之細胞型或組織型表現、或其組合。在其他具體例中，重組基因之初始輸送較為侷限，在動物中之引進十分局部化。舉例言之，基因輸送載體可經由導管(參見美國專利第5,328,470號)或經由立體定向注射(例如Chen et al.(1994)PNAS 91：3054-3057)引進。基因治療構築體之醫藥製劑可主要由在可接受稀釋劑中之基因輸送系統組成，或者可包含包埋有基因輸送載劑之緩釋基質。在融合蛋白質可由重組細胞例如反錄病毒載體完整產生之情況，醫藥組合物可包含一種或一種以上會產生融合蛋白質之細胞。

在另一具體例中，使用RNA干擾(RNAi)降低或完全抑制先天性免疫受體之表現，其中該先天性免疫受體依照本文揭示之方法被鑑定為參與致病過程。RNAi為本技術所熟知且可藉由使用小型干擾性RNA(siRNA)達成。依照本發明之siRNAs具有達29 bps、25 bps、22 bps、21 bps、20 bps、15 bps、10 bps、5 bps或在上述數值附近或之間之任何整數。該等siRNAs可以例如載體(例如編碼小型髮夾狀RNA(shRNA)之載體)所編碼之形式或以微脂粒核酸複合物投與。脂質：核酸複合物(包括標定之微脂粒諸如免疫脂質複合物)之製備為精於本技術者所熟知(例如參見Crystal,Science 270：404-410(1995)；Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr et al.,Bioconjugate Chem,5：382-389(1994)；Remy et al.,Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao et al.,Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad et al.,Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美國專利第4,186,183號、第4,217,344號、第4,235,871號、第4,261,975號、第4,485,054號、第4,501,728號、第4,774,085號、第4,837,028號及第4,946,787號)。所以，本發明亦提供包含RNA分子之醫藥組合物，該RNA當投與至病患時，能媒介先天性免疫受體之RNA干擾。

根據具體例，本文提供在巨噬細胞中由RNAi所媒介之DVLR1/CLEC5A基因表現下降(knock down)的非限定性實例。以此方式產生之DVLR1/CLEC5A減活(attenuation)顯著降低感染登革熱病毒(DV)之巨噬細胞中促發炎性細胞激素之分泌，因而表示RNAi所媒介之DVLR1/CLEC5A減活在治療登革熱病毒上有用。

減少DVLR1/CLEC5A表現之siRNA或shRNA被特別考量用於登革熱患者之RNAi-媒介治療。設計、合成及投與shRNA及siRNA以減少特異性基因表現之方法為本技術所熟知且記載於，例如，美國專利第7,022,828號。適於與本發明之shRNA構築體及siRNA分子一起調配之藥劑之非限定性例子包括：與PEG綴合之核酸、與磷脂綴合之核酸、含有親脂部分之核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、P-醣蛋白抑制劑(諸如Pluronic P85)[其可促進藥物進入各種組織，例如CNS(Jolliet-Riant and Tillement,1999,Fundam.Clin.Pharmacol.,13,1626)]；生物可降解聚合物，諸如植入後持續釋放輸送用之聚(DL-丙交酯-乙交酯)微球囊(Emerich,DF et al,1999,Cell Transplant,8,47 58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.；以及有負載之奈米粒子諸如由聚氰基丙烯酸丁酯製成者，其可將藥物輸送通過血腦障壁且可改變神經元攝取機制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,23,941 949,1999)。輸送手段(包括本發明之核酸分子之CNS輸送)之其他非限定性例子包括下列文獻所述之材料：Boado et al.,1998,J.Pharm.Sci.,87,1308 1315；Tyler et al,1999,FEBS Lett.,421,280 284；Pardridge et al.,1995,PNAS USA.,92,5592 5596；Boado,1995,Adv.Drug Delivery Rev.,15,73 107；Aldrian-Herrada et al.,1998,Nucleic Acids Res.,26,4910 4916；及Tyler et al.,1999,PNAS USA.,96,7053 7058。所有此等文獻以參考資料方式納入本文。此外，包含表面經修改之微脂粒之組合物，其中該表面經修改之微脂粒含有聚(乙二醇)脂質，即經PEG修改或長時間循環之微脂粒或長命微脂粒(stealth liposomes)，亦可與本發明之核酸合用。本發明之核酸分子亦包含共價連接之具有各種分子量之PEG分子。此等調配物提供在目標組織中增加藥物蓄積之方法。該類藥物載劑可阻止藥物被單核吞食系統(MPS或RES)調理(opsonization)及清除，藉此使得經包納之藥物在血液循環中之時間增長及組織暴露增加(Lasic et al.Chem.Rev.1995,95,2601 2627；Ishiwata et al.,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005 1011)。已證明該等微脂粒會選擇性地蓄積在腫瘤中，此可能係經由在血管新生化目標組織中之血管外滲及擷取而產生(Lasic et al.,Science 1995,267,1275 1276；Oku et al.,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86 90)。長時間循環微脂粒，尤其當與已知會蓄積在MPS組織中之習知陽離子性微脂粒相較時，會促進DNA及RNA之藥品動力及藥品靜力性質(Liu et al.,J.Biol.Chem.1995,42,24864 24870；Choi et al.,國際PCT公開號WO 96/10391；Ansell et al.,國際PCT公開號WO 96/10390；Holland et al.,國際PCT公開號WO 96/10392；所有此等文獻皆以參考資料方式納入本文)。長時間循環微脂粒由於能避免蓄積在代謝旺盛之單核吞食系統(MPS)組織諸如肝及脾，因此與陽離子性微脂粒相較，對於藥物可能有較大的保護作用，使其免於被核酸酶降解。

實施例

本發明藉由下列非限定性實施例進一步說明：

實施例1：先天性免疫受體：Fc融合蛋白質之製備 細胞培養物

將293F細胞(Invitrogen,R790-07)在置於回轉式振盪器(125rpm)上之125mL燒瓶內，於不含血清之293FREESTYLE 203表現培養基(Invitrogen,12338-018)中，於37℃在CO₂ 培育器內培養。

受體.Fc融合基因之構築

凝集素受體之細胞外區域，TREMs及TLTs，藉由反錄酶聚合酶連鎖反應(RT-PCR)選殖，繼而次選殖入yT&A載體，然後選殖入pcDNA3.1(+)hIgG1.Fc表現載體。生成之受體.Fc構築體編碼與經突變之人類IgG1 Fc部分(其不會與人類Fc受體結合)融合之重組蛋白質。在IgG1 Fc部分中之突變為L234A、L235E、G237A及P331S。用於以RT-PCR擴增細胞外區域之引子之序列如下(或者可自表2所列之序列選擇引子)：

CLEClA/CLEC-1

意義引子

5’-GAATCCTTTCAGTACTACCAGCTCTCC-3’

序列編號：1

反義引子

5’-GAATTCTCAGTCACCTTCGCCTAATGT-3’

序列編號：2

CLEC1B/CLEC-2

意義引子

5’-GGATCCCTGGGGATTTGGTCTGTC-3’

序列編號：3

反義引子

5’-GAATTCTTAAGGTAGTTGGTCCAC-3’

序列編號：4

CLEC2B/AICL

意義引子

5'-GGATCCTCTCAGAGTTTATGCCCC-3'

序列編號：5

反義引子

5'-GGATCCCCCCATTATCTTAGACAT-3'

序列編號：6

CLEC4A/DCIR

意義引子

5’-GGATCCTTTCAAAAATATTCTCAGCTTCTT-3’

序列編號：7

反義引子

5’-GAATTCTCATAAGTGGATCTTCATCATC-3’

序列編號：8

CLEC4C/BDCA-2

意義引子

5’-GGATCCTTTATGTATAGCAAAACTGTCAAG-3’

序列編號：9

反義引子

5’-GAATTCTTATATGTAGATCTTCTTCATCTT-3’

序列編號：10

CLEC4D/CLEC-6

意義引子

5’-GAATCCCATCACAACTTTTCACGCTGT-3’

序列編號：11

反義引子

5’-GAATTCCTAGTTCAATGTTGTTCCAGG-3’

序列編號：12

CLEC4E/MINCLE

意義引子

5’-GAAGATCTACATTTCGCATCTTTCAAACC-3’

序列編號：13

反義引子

5’-GCGGTTAAAGAGATTTTCCTTTGTTCA-3’

序列編號：14

CLEC4K/郎罕細胞特異蛋白

意義引子

5’-GGATCCCGGTTTATGGGCACCATA-3’

序列編號：15

反義引子

5’-GGATCCTCACGGTTCTGATGGGAC-3’

序列編號：16

CLEC4L/DC-SIGN

意義引子

5’-GGATCCAAGGTCCCCAGCTCCATAAG-3’

序列編號：17

反義引子

5’-GAATTCCTACGCAGGAGGGGGGT-3’

序列編號：18

CLEC4M/DC-SIGNR/L-SIGN

意義引子

5’-GGATCCTCCAAGGTCCCCAGCTCC-3’

序列編號：19

反義引子

5’-GAATTCCTATTCGTCTCTGAAGCAGG-3’

序列編號：20

DTVR1/CTFC5A(MDL-l)

意義引子

5’-AGATCTAGTAACGATGGTTTCACCAC-3’

序列編號：21

反義引子

5’-GAATTCCTGTGATCATTTGGCATTCTT-3’

序列編號：22

CLEC6A/樹狀細胞凝集素-2

意義引子

5’-GGATCCACATATGGTGAAACTGGC-3’

序列編號：23

反義引子

5’-GAATTCCATCAGTCGATGGGC-3’

序列編號：24

CLEC7A/樹狀細胞凝集素-1

意義引子

5’-GGATCCACCATGGCTATTTGGAGATCC-3’

序列編號：25

反義引子

5’-GAATTCTTACATTGAAAACTTCTTCTCACA-3’

序列編號：26

CLEC10A/ML2

意義引子

5’-GGATCCTCCAAATTTCAGAGGGACCTG-3’

序列編號：27

反義引子

5’-GAATTCTCAGTGACTCTCCTGGCTG-3’

序列編號：28

CLEC12A/CLL-1

意義引子

5’-GGATCCGTAACTTTGAAGATAGAAATGAAA-3’

序列編號：29

反義引子

5’-GAATCCTCATGCCTCCCTAAAATATGTA-3’

序列編號：30

CLEC13A/BIMLEC

意義引子

5’-GGATCCTCATGCTCCGGGCCGCG-3’

序列編號：31

反義引子

5’-GAATTCGCTAGCAATCACCAATGCTGA-3’

序列編號：32

COLEC12/CL-P1

意義引子

5’-AGAGGTGACAGAGGATCCCA-3’

序列編號：33

反義引子

5’-GAATTCGTGATCCCATCACAGTCC-3’

序列編號：34

MAFA-L/KLRG-1

意義引子

5’-GGATCCTGCCAGGGCTCCAACT-3’

序列編號：35

反義引子

5’-ATGACAGATCTGAGGGTCA-3’

序列編號：36

重組受體.Fc融合蛋白質之表現及純化

受體Fc蛋白質藉由使用FREESTYLE 293表現系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)過度表現並在蛋白質A管柱上純化。簡言之，將3 X 10⁷ 293-F細胞以1,500rpm旋轉沈澱，繼而重新懸浮於28 ml FREESTYLE 293表現培養基中。然後將40μl之293FECTIN與1 ml OPTI-MEM(Invitrogen,31985-062)於室溫混合5分鐘，然後與30 μg質體DNA在1 ml OPTI-MEM(Invitrogen,31985-062)中再培育20分鐘後，加至293-F細胞中。48小時後，收取上清液並藉由蛋白質A管柱純化重組融合蛋白質。

實施例2：多醣體萃取物之製備 靈芝之粗製萃取物

粗製靈芝萃取物(經由鹼性萃取，中和及乙醇沉澱而製備)得自Pharmanex公司(CA,USA)。除非另有指示，分子量排除界線(MWCO)為6000-8000道爾頓之Spectrapor管狀透析膜、Thermo bio-basic SEC-1000管柱、Tosoh TSK G5000PWx1 SEC管柱，以及所有化學品及試劑得自Sigma或Aldrich公司。

靈芝萃取物之純化

將粗製靈芝粉末(6g)(得自Pharmanex公司)溶於120ml之ddH₂ O，於沸水(100℃)中攪拌2小時並離心(1000 rpm)1小時，以移除不溶的物質。將生成之溶液在約40℃與約50℃之間濃縮以得到小體積，然後冷凍乾燥，產生5g(83%)暗褐色之粉末(靈芝多醣體；GLPS)。將該水溶性殘餘物貯存於-20℃直至進一步純化。

靈芝多醣體之F3部分之標準化-單離

自靈芝多醣體之水溶性殘餘物之暗色粉末單離靈芝多醣體部分3(下文稱為“GLPS F3”及“F3”)。所有層析步驟在冷凍室中於4℃進行。將樣品(2.1g)溶於小體積之含0.1N疊氮化鈉之Tris緩衝液(pH 7.0,0.1 N)中，並藉由凝膠過濾層析純化，其中使用Sephacryl S-500管柱(95 X 2.6 cm)及以0.1 N Tris緩衝液(pH 7.0)做為溶析劑。將流速設定為0.6 mL/分鐘並每管收集6.0 mL。層析後，各部分以酚-H₂ SO₄ 法檢測各試管中之糖含量。收集5部分(部分1-5)。將部份3(F3)在旋轉蒸發器中於約40至50℃濃縮以得到小體積，然後將其用6000-8000道爾頓MWCO膜進行透析，以移除過多的鹽及疊氮化鈉。透析後，將F3冷凍乾燥，得到520 mg固體。

來自冬蟲夏草之多醣體之製備

為了純化來自冬蟲夏草之多醣體，將樣品切成0.2 cm³ 片，在去離子化沸水(100℃)中培育60分鐘，然後冷卻至室溫，接著通過0.2μm濾器，繼而藉由加入等體積之乙醇以沉澱出多醣體。將沉澱物用冷凍乾燥器乾燥並貯存於4℃。多醣體之總糖分析藉由酚-H₂ SO₄ 法，測量485 nm之OD而測定；而多醣體之純度藉由使用Thermo Bio-Basic SEC-1000管柱進行HPLC而測定，其中使用RI檢測器於280 nm進行UV檢測。

來自霍山石斛之多醣體之製備

將風乾之霍山石斛壓碎、磨成粉末、在蒸餾水中均質化並於4℃攪拌整夜。不溶之物質藉由離心收集。將上清液濃縮成小體積，然後加入1體積乙醇，以得到沉澱物(O)及上清液(N)。將TSK G-5000 PW尺寸排除管柱用於高效液相層析以進行多醣體分析，並使用具有界定分子量之標準普魯籣多醣(pullulan)部分。據評估，上清液(N)中之多醣體之分子量在1.2x10⁵ 至4.1x10⁵ 道爾頓之間，而沉澱物(O)中多醣體之分子量在1.0x10⁶ 至2.2x10⁵ 道爾頓之間。碳水化合物總含量藉由酚-硫酸法測量。在沉澱物(O)中之多醣體為83%，而在上清液(N)中之多醣體為77%。沉澱物(O)及上清液(N)二者之碘反應試驗皆為陽性(λmax 440 nm，深藍色)，此暗示在此等部分中之多醣體主要為α-D-葡聚糖。

來自蘑菇之多醣體之製備

將風乾之蘑菇(Lentinus edodes)壓碎、磨成粉末、在蒸餾水中均質化及於4℃攪拌整夜。殘餘物藉由離心移除並將上清液濃縮成小體積，然後冷凍乾燥，得到粗製之多醣體L。之後，將0.25N NaOH溶液加至不溶於水之殘餘物中(該殘餘物藉由離心單離)，將該混合物於室溫攪拌整夜，之後加入2體積之乙醇以沉澱出多醣體。然後將蒸餾水加至沉澱出之多醣體中，接著加入乙酸中和pH值。將生成之溶液離心及冷凍乾燥，得到多醣體M。然後使用TSK G-5000 PW尺寸排除管柱進行HPLC，以分析多醣體。碳水化合物總含量藉由酚-硫酸法測量，結果L包含79%碳水化合物且M包含90%碳水化合物。與來自蘑菇之多醣體部分之數據之比較暗示多醣體L及M主要為β-1,3-D-葡聚糖。

β-1,3-葡聚糖、D-葡萄糖及D-半乳糖之製備

為了製備競爭性檢定分析用之樣品，將100 mg之β-1,3-葡聚糖(Fluka,Japan)懸浮於7.5 ml水中，並加入50 μl之40%(w/w)氫氧化鈉水溶液。將該混合物回流加熱1.5小時並冷卻。然後加入甲醇以沉澱出β-1,3-葡聚糖。將β-1,3-葡聚糖沉澱物溶於水，對4 L dd-H₂ O透析4次，並於減壓下濃縮，得到水溶性β-1,3-葡聚糖。將D-葡萄糖(Sigma)及D-半乳糖(Sigma)溶於dd-H₂ O(100 mg/ml)並貯存於4℃。

生物素基-F3之製備

將靈芝多醣體-F3使用生物素以「單槽」(onepot)反應標記。特定而言，使在0.2 N NaHCO₃ /Na₂ CO₃ (10 mL)中之靈芝多醣體-F3(100 mg)與在DMF(1 mL)中之生物素醯胺基己醯基-6-胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(生物素-XX-NHS)1.0 mg反應。將該混合物於室溫攪拌12小時。反應完成後，使用MWCO為6000-8000道爾頓之管狀膜於4℃透析48小時(5 x 500 mL)。透析後，將生物素基-F3冷凍乾燥，得到褐色粉末90 mg(90%)。生物素基-F3之純化藉由HPLC監測並使用鏈黴抗生物素蛋白-FITC進行結合檢定分析。

實施例3：純化受體：Fc融合蛋白質之西方轉漬分析

使實施例1之純化受體.Fc融合蛋白質進行電泳，移至硝基纖維素膜上(Hybond-C extra,Amersham Pharmacia Biotech)，並與(1：3000)之在TBST緩衝液(5%脫脂乾燥牛奶，在含有0.02% Tween 20之Tris緩衝鹽水中)中之綴合有過氧化酶之山羊抗人類IgG Ab(Jackson,PA,USA)反應。用TBST沖洗後，將吸漬物與強化化學發光試劑(Amersham Pharmacia Biotech)一起培育以顯現。

實施例4：免疫吸附點結合法定分析

生物素化F3於5倍系列稀釋後，使用Bio-Dot顯微過濾裝置TM(Bio-Rad,CA,USA)將其轉漬在經甲醇活化之PVDF膜(2 μL/點)上。在空氣中乾燥後，將轉漬片在TBST中培育，繼而與100 μL綴合有鏈黴抗生物素蛋白之辣根過氧化酶(HRP)(1：2000稀釋)(Chemicon,CA,USA)一起培育。結合反應用強化化學發光(ECL)試劑(Amersham Pharmacia Biotech)來顯現。

亦將未生物素化之多醣體固定在經甲醇活化之PVDF膜上，繼而與100μL受體.Fc融合蛋白質(1 μg/ml，在2 mMCaCl₂ /TBST中)在Bio-Dot顯微過濾裝置TM(Bio-Rad,CA,USA)上於室溫培育1小時，然後與(1：3000)之在TBST緩衝液(5%脫脂乾燥牛奶，在含有0.02% Tween 20之Tris緩衝鹽水中)中之綴合有HRP之山羊抗-人類IgG抗體(Jackson,PA,USA)反應。用TBST沖洗後，將吸漬物與強化化學發光試劑(Amersham Pharmacia Biotech)一起培育以顯現。

實施例5：重組受體.Fc融合蛋白質之表現

來自免疫細胞之數種先天性免疫受體之細胞外區域依照實施例1之方法藉由反錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)選殖。將經擴增之DNA片段與pcDNA3/hIgG1-突變質體所含之人類IgG1之Fc部分融合。將經選殖之融合基因轉染入293 FREESTYLE哺乳動物細胞中，而分泌之蛋白質依照實施例1之方法藉由蛋白質珠粒純化。如圖1所示，選殖16種C-型凝集素基因(圖1A)。特定而言，圖1A顯示藉由RT-PCR擴增，然後在0.8%瓊脂糖上分成各部分並藉由溴化乙錠染色而顯現之先天性免疫受體之DNA片段。圖1B顯示在12%SDS-PAGE凝膠上電泳後之經表現之重組受體.Fc融合蛋白質。在圖1A及圖1B二者中，使用下列行之命名：第1行：CLEC2B/AICL，第2行：CLEC4C/BDCA-2，第3行：CLEC13A/BIMLEC，第4行：CLEC1A/CLEC-1，第5行：CLEC4D/CLEC-6，第6行：CLEC12A/CLL-1，第7行：CLEC4A/DCIR，第8行：CLEC4L/DC-SIGN，第9行：CLEC4M/DC-SIGNR，第10行：CLEC7A/樹狀細胞凝集素-1，第11行：CLEC6A/樹狀細胞凝集素-2，第12行：CLEC4H2/HBVxAgBP，第13行：CLEC4K/郎罕細胞特異蛋白(Langerin)，第14行：KLRG/MAFAL，第15行：DLVR1/CLEC5A(MDL-1)，第16行：CLEC4E/MINCLE。此外，亦以類似策略選殖及表現人類TREM(在骨髓細胞上表現之激發受體)-1、-2及類TREM轉錄體(TLT)-1、-2(Bouchon et al.,2000,J Immunol 164,4991-5；Daws et al.,2003,J Immunol 171,594-9；Washington et al.,2002,Blood 100,3822-4)。

實施例6：固定之多醣體與受體.Fc融合蛋白質間之劑量依存性交互作用

多醣體與受體.Fc融合蛋白質間之交互作用依照實施例4之方法使用點-結合檢定分析測試。靈芝多醣體之水溶性部分3(F3)(參見實施例3)含有活性成分以刺激產生細胞激素之細胞(Waang et al.,2002,Bioorg Med Chem 10,1057-62；Chen et al.,2004,Bioorg Med Chem 12,5595-601；Chien et al.,2004,Bioorg Med Chem 12,5603-9；Hsu et al.,2004,J Immunol 173,5989-99)。已知靈芝醣類含有具β-1,3-鍵結之多醣體骨架及具α-1,4-鍵結之聚甘露糖骨架中之任一者(Usui et al.,1983,Carbohydr.Res.,273；Miyazaki and Nishijime,1982,Carbohydr.Res.109,290；Bao et al.,2002,Phytochemistry 59,175-81)。已證明樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1)受體(C型凝集素家族之成員)會與β-1,3-D-葡聚糖交互作用(Brown and Gordon,2001,Nature 413,36-7)。已證明樹狀細胞凝集素-1受體媒介β-葡聚糖之生物作用(Brown et al.,2003,J Exp Med 197,1119-24)。因此使用實施例4之點-結合檢定分析測試靈芝之F3部分是否會與樹狀細胞凝集素-1受體交互作用。

將生物素化F3部分(圖2A中之“生物素-GLPS F3”)(依照實施例2製備)於5倍系列稀釋後固定在PVDF膜上並與綴合有鏈黴抗生物素蛋白之辣根過氧化酶(HRP)一起培育，再使用強化的化學發光試劑檢測生成之結合反應(參見實施例4)。如圖2A所示，點-結合檢定分析之靈敏度高於約0.08 μg。圖2A亦顯示當未生物素化之F3(圖2A中之“GLPS-F3”)固定在PVDF膜上，然後與綴合有鏈黴抗生物素蛋白之辣根過氧化酶(HRP)接觸時，未見到背景值。

將未生物素化之F3部分於系列稀釋後亦固定在PVDF膜上，並與100μL之1μg/mL樹狀細胞凝集素-1.Fc融合蛋白質或人類IgG1(做為陰性對照組)一起培育，繼而與綴合有HRP之山羊抗-人類IgG一起培育(參見實施例4)。如圖2B所示，樹狀細胞凝集素-1.Fc在點-結合檢定分析中可檢測到低於約1ng之F3之存在。在與人類IgG1而非樹狀細胞凝集素-1.Fc接觸之轉漬區無可見到之背景值。

圖2B之轉漬片(blot)之點密度藉由密度計(ImageQuant)測定，而該結果顯示樹狀細胞凝集素-1.Fc結合信號以劑量依存方式增加(參見圖2C)。

為了測定其他多醣體是否抑制F3與樹狀細胞凝集素-1間之交互作用，將F3(10μg/點)固定在PVDF膜上，然後於β-葡聚糖、D-葡萄糖及D-半乳糖(0.1μg-1000μg)之系列稀釋溶液存在下，與100 μL樹狀細胞凝集素-1.Fc(1μg/mL)接觸，繼而與綴合有HRP之山羊抗-人類IgG一起培育。圖2D顯示就競爭者β-葡聚糖而言之轉漬片之點密度，圖2E顯示所有競爭者之轉漬像。由此等可見到樹狀細胞凝集素-1.Fc與F3部分間之交互作用被β-1,3-葡聚糖抑制，但不會被D-葡萄糖或D-半乳糖抑制。此表示樹狀細胞凝集素-1.Fc與F3間之交互作用係經由β-1,3-葡聚糖識別。

實施例7：能與F3部分交互作用之受體之鑑定

檢定分析F3與C-型凝集素家族之其他成員或與類Ig受體之交互作用。將未生物素化之F3及未生物素化之F3C(衍生自通過100 kDa MWCO離心管之F3)(10μg/點)固定在PVDF膜上(參見實施例4)，然後與100μL之25種不同重組受體.Fc融合蛋白質(包括19種凝集素受體及8個TREM及TLT家族成員)以及做為對照之人類IgG1的1μg/mL溶液一起培育。使用綴合有HRP之山羊抗-IgG抗體及ECL試劑檢測結合。結果以表格形式示於圖3中(相對點強度以“+”記號表示，而未檢測到結合以“-“記號表示)而轉漬片之影像示於圖4A中。圖3中之探針編號系統保留於圖4A中。

此等結果顯示除了樹狀細胞凝集素-1.Fc(圖3及圖4A中之14號探針)之外，F3亦與KCR.Fc(圖3及圖4A中之7號探針)、DC-SIGNR.Fc(圖3及圖4A中之11號探針)及TLT-2.Fc(圖3及圖4A中之21號探針)交互作用。有趣的是，F3C(其係衍生自通過100 kDa MWCO離心管之F3)卻具有較低之對於TLT2之結合親和力。此暗示TLT2可區辨F3與F3c間之微小差異。

凝集素受體家族成員在交互作用上依存於Ca⁺⁺ ；所以研究EDTA(乙二胺四乙酸)抑制與F3結合之能力。已發現EDTA(10mM，在TBST中)完全去除F3與KCR.Fc及與DC-SIGNR.Fc之交互作用，但不會去除F3與樹狀細胞凝集素-1.Fc及TLT2.Fc之交互作用。圖4B係圖示存在及不存在Ca⁺⁺ 下所製得之轉漬片之影像(左格只有TBST；右格為10mM EDTA+TBST)。使用綴合有HRP之山羊抗-IgG抗體及ECL試劑檢測結合。該結果與先前觀察到之配體與KCR間之交互作用一致(Hoyle and Hill,1988,J Biol Chem 263,7487-92)，且DC-SIGNR為Ca⁺⁺ -依存性(Soilleux et al.,2000,J Immunol 165,2937-42)，而Ca⁺⁺ 對於樹狀細胞凝集素-1與β-1,3-葡聚糖間之交互作用而言非為必要(Herre et al.,2004,Mol Immunol 40,869-76)。因此，F3顯然含有豐富的葡聚糖，其可與免疫細胞上之多個受體同時交互作用。

圖4C圖示使用β-葡聚糖做為多醣體(10μg/點)及使用100μL之1μg/mL樹狀細胞凝集素-1.Fc、DC-SIGN.Fc、mKCR.Fc及TLT2.Fc之轉漬點。使用綴合有HRP之山羊抗-IgG抗體及ECL試劑檢測結合。四種受試之受體.Fc融合蛋白質中，只有樹狀細胞凝集素-1.Fc可與β-1,3-葡聚糖結合。此表示其他三種受體.Fc融合蛋白質結合於β-1,3-葡聚糖以外之糖成分。

實施例8：來自各種來源之多醣體之獨特細微特徵 (fingerprints)

用樹狀細胞凝集素-1.Fc、mKCR.Fc、DC-SIGNR.Fc及TLT2.Fc融合蛋白質進行實施例4之點-結合檢定分析，以指紋辨識單離自冬蟲夏草及市場上之其他來源之多醣體之獨特細微特徵。如上所述將各多醣體組合物固定在PVDF膜上，然後與100μL之1μg/mL融合蛋白質溶液接觸。使用綴合有HRP之山羊抗-IgG抗體及ECL試劑檢測結合。圖5A顯示各融合蛋白質之個別轉漬點而圖5B以表格形式顯示樣品編號及相對點強度。靈芝粗製萃取物(圖5中之5號點)只與樹狀細胞凝集素-1.Fc及DC-SIGNR.Fc交互作用，而來自粗製萃取物之純化F3(1號點)與所有四種受體交互作用。此表示F3純化過程可使能與免疫受體交互作用之成分富化。來自冬蟲夏草之多醣體(7號點)會與樹狀細胞凝集素-1.Fc強力地交互作用，此表示該多醣體含有β-1,3葡聚糖，但其與其他三種受體之交互作用與F3相較則弱許多。單離自霍山石斛之多醣體在碘試驗反應(見實施例2)中為陽性，此暗示此等部分主要包含α-D-葡聚糖。與單離自真菌者相反，霍山石斛之多醣體之混合物(6號點)不會與四種受體.Fc融合蛋白質之任一種反應。藉由ddH₂ O自蘑菇多醣體單離之多醣體(部分L，8號點)及用0.25N NaOH自蘑菇多醣體單離而得之多醣體(部分M，9號點)與樹狀細胞凝集素-1.Fc及DC-SIGNR.Fc之結合程度不同。因此，該法可查明單離自不同來源及製備之多醣體之獨特細微特徵(fingerprints)。

實施例6-8說明F3與樹狀細胞凝集素-1.Fc、mKCR.Fc、DC-SIGNR.Fc及TLT2.Fc之交互作用。庫佛氏(Kupffer)細胞受體(KCR)對於D-半乳糖及N-乙醯基半乳糖胺具有高親和力(Fadden et al.,2003,Glycobiology 13,529-37)，並能清除血清之以D-半乳糖或D-岩藻糖為終端之醣蛋白(Lehrman et al.,1986,J Biol Chem 261,7426-32)。F3之免疫調節功能依存於岩藻糖之存在，且藉由α1,2-岩藻糖苷酶進行之醣裂解會使F3失去活性。因此該四種受體是否可與醣裂解後之F3交互作用令人感到興趣。DC-SIGNR/L-SIGN在結構上與DC-SIGN近似(77%相同)，但其只在肝竇、淋巴結及胎盤之內皮細胞中表現(Van Liempt et al.,2004,J BiOl Chem 279,33161-7)。DC-SIGN及DC-SIGNR二者皆可與N-鍵結有高量甘露糖之寡糖(Man₉ GlcNAc₂ Asn醣肽)結合。不過，只有DC-SIGN可與具終端岩藻糖殘基之聚醣結合，而DC-SIGNR則否(Guo et al.,2004,Nat Struct Mol Biol 11,591-8)。縱使與DC-SIGN相較，DC-SIGNR係與較窄範圍之配體結合，但只有DC-SIGNR可與F3交互作用。此暗示F3可能含有與Fucα1-4GlcNAc、Lewis^X 、Lewis^a 及血型糖抗原決定部位(blood group sugar epitopes)(DC-SIGN之已知配體)不同之獨特結構。

TLT-2為類TREM轉錄體家族之成員，其含有獨特的單一V-組免疫球蛋白(Ig)區域及細胞質長尾部，該細胞質長尾部含脯胺酸富化區及免疫受體酪胺酸系抑制性基序(immune receptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，已知該ITIM用於與蛋白質酪胺酸磷酸酶之交互作用(Washington et al.,2002,Blood 100,3822-4；Washington et al.,2004,Blood 104,1042-7)。既然F3具有強力的免疫刺激功能，因而在未來研究是否藉由親和性層析從F3移除TLT2.Fc.結合性成分可進一步增強F3之刺激功能將可能為有趣的。或者可藉由使用樹狀細胞凝集素-1.Fc、KCR.Fc及DC-SIGNR.Fc進行親和性層析進一步純化F3，以移除F3中之其他成分。

F3與F3c之間、F3與靈芝1-3之間、以及蘑菇多醣體部分L及M之間之微細差異暗示本文所例示之此四種受體.Fc融合蛋白質可被用於使純化步驟達最佳化並監測來自不同來源或來自不同發酵條件之多醣體之差異。

實施例9：可與GLPS-F3交互作用之人類凝集素受體在微量滴定平皿上藉由酶鍵連免疫檢定分析之鑑定

多醣體與受體.Fc融合蛋白質間之交互作用藉由進行酶-鍵連免疫檢定分析(EIA)而進一步研究，其係依據將GLPS-F3經由親水力量及疏水力量固定於微量滴定平皿(聚苯乙烯)上。以此方式，供剖析之不同受體.Fc融合蛋白質之數目與實施例7相較增加。為了使GLPS-F3之固定量最佳化，將各種量(3-1000ng/孔，用100mM Tris緩衝液(pH9.5)稀釋)之生物素化GLPS-F3(生物素-GLPS-F3)塗佈在MaxiSorp StarWell微量滴定平皿(50μL/孔；Nunc)上。將該等平皿於4℃培育整夜，然後將此等孔用TBST沖洗二次，繼而用200 μL封阻緩衝液(2% BSA/TBST)於室溫封阻1小時。然後使用綴合有過氧化酶之抗生物素蛋白(稀釋度1：5000，Vector Laboratories)及TMB(四甲基聯苯胺)受質來檢測經固定之生物素化GLPS-F3。如圖6A所示，塗佈平皿之生物素-GLPS-F3之量為100 ng/孔時達到恆穩狀態，所以在EIA中選用該量進行未生物素化之GLPS-F3之固定。

然後測試GLPS-F3與受體.Fc間之交互作用。如上所述以100 ng/孔將未生物素化之GLPS-F3固定，再將100μL受體.Fc融合蛋白質(1 μg/ml，在2 mM MgCl₂ /2 mM CaCl₂ /1% BSA/TBST中)加至各孔中並於室溫培育1小時。用TBST沖洗後，將此等孔與綴合有過氧化酶之山羊抗-人類IgG Ab在封阻緩衝液中於室溫一起培育30分鐘(稀釋度為1：5000，Jackson ImmunoResearch Laboratories)。此等孔用TBST沖洗後，與100 μL TMB受質一起培育15分鐘並在融合平皿讀數器(Perkin Elmer)中於450 nm測量。將結果用Fc.樹狀細胞凝集素-1結合度為基準予以歸一化(樹狀細胞凝集素-1為已知能與β-1,3-葡聚糖結合之凝集素受體，該β-1,3-葡聚糖為在GLPS-F3中所發現之骨架)。圖6B圖示相較於樹狀細胞凝集素-1，各受體對於GLPS-F3之親和力。結果顯示觀察到Fc.郎罕細胞特異蛋白、Fc.DC-SIGN、MMR.Fc、TLR2.Fc、TLR4.Fc、Fc.CLEC-2(CLEC1B)及Fc.CLEC-6(CLEC4D)對於GLPS-F3有高親和力(在本檢定分析中，高親和力被定義與Fc.樹狀細胞凝集素-1相較，結合強度>50%)。值得注意的是TLR2及TLR4[已證明其在GLPS-誘生之細胞活化上扮有角色(Hsu et al.,J Immunol 173：5989-5999(2004)；Shao et al.,Biochem Biophys Res Commun 323：133-141(2004))]在EIA中亦會與GLPS-F3結合。在Fc.NKG2D、Fc.MINCLE、Fc.mKCR、DCAL1.Fc、DEC205.Fc、Endo180.Fc及NKp30(NCR3).Fc中亦發現較弱，但為陽性之GLPS-F3結合能力(與Fc.樹狀細胞凝集素-1相較，結合強度為25-50%)。其他凝集素受體，包括Fc.AICL、Fc.BDCA2、Fc.CLEC1、Fc.CLL1、Fc.DCIR、Fc.DC-SIGNR、Fc.樹狀細胞凝集素-2、Fc.MDL-1及Fc.ML2，如同對照組人類IgG1，對於GLPS-F3具有極小的結合能力。

實施例10：與先天性免疫受體交互作用之GLPS-F3之競爭性檢定分析

為了解GLPS-F3與特異性先天性免疫受體之交互作用，將多醣體甘露聚糖及β-葡聚糖以及單醣體D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙醯基-葡萄糖胺(GlcNAc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc)、L-岩藻糖(Fuc)及唾液酸用於競爭性檢定分析。檢定對於GLPS-F3顯示較高結合能力之先天性免疫受體，包括Fc.樹狀細胞凝集素-1、Fc.郎罕細胞特異蛋白、Fc.DC-SIGN、TLR4.Fc、MMR.Fc、Fc.CLEC-2(CLEC1B)及Fc.CLEC-6(CLEC4D)。檢定分析如同實施例9進行，其中加入1mg/ml之各多醣體或單醣體。

如圖7(圖示各受體/醣組合，相對於醣不存在時所見到之結合度之結合%)及表1(以表格形式提供來自圖7之數據)所示，GLPS-F3與Fc.樹狀細胞凝集素-1間之交互作用可被β-葡聚糖封阻，其抑制度為58%，此符合已發表之結果(Palma et al.,J Biol Chem 281：5771-5779(2006)；Willment et al.,J Biol Chem 276：43818-43823(2001))。唾液酸之加入(抑制度83%)會干擾Fc.樹狀細胞凝集素-1與GLPS-F3之結合。Fc.郎罕細胞特異蛋白與GLPS-F3間之交互作用會被甘露聚糖、Man及GlcNAc阻擾(抑制度分別為95%,26%及84%)，據報告該等為郎罕細胞特異蛋白之糖配體(Stambach & Taylor,Glycobiology 13：401-410(2002))；亦觀察到唾液酸(抑制度為95%)會干擾Fc.郎罕細胞特異蛋白與GLPS-F3之結合。至於Fc.DC-SIGN與GLPS-F3之結合，甘露聚糖、Man、Fuc及唾液酸顯示強力的封阻活性(抑制度98%,72%,92%及90%)，而Glc及GlcNAc在封阻交互作用上具有較弱的作用(抑制度分別為45%及27%)。甘露聚糖、Man、Glc、GlcNAc、Gal、Fuc及唾液酸封阻GLPS-F3與MMR.Fc間之交互作用(抑制度分別為98%,87%,45%,78%,36%,88%及93%)，其中該MMR.Fc已知為會與Man、Fuc、GlcNAc及唾液基Lewis x(sLex)結合之重要凝集素受體(Letuex et al.,J Exp Med 191：1117-1126(2000)；Stahl,Am J Respir Cell Mol Biol 2：317-318(1990))。Fc.CLEC-2與GLPS-F3間之交互作用會藉由加入唾液酸而封阻(抑制度55%)。對Fc.CLEC-6而言，未觀察到受試之糖顯示明顯之封阻作用。顯然地，甘露聚糖及Fuc對於TLR4.Fc與GLPS-F3之交互作用顯示封阻作用(抑制度分別為72%及44%)。此處得到之數據與對於樹狀細胞凝集素-1、郎罕細胞特異蛋白、DC-SIGN及MMR所報告之糖配體研究之結果一致。亦顯示許多凝集素受體可經由不同的糖成分以多價與GLPS-F3結合。

表1：於存在糖競爭者下，先天性免疫受體.Fc融合蛋白質與CLPS-F3之結合度，相對於不存在糖競爭者下所見到之結合度之百分率。

實施例7至10所呈示之系統為以高通量剖析(profiling)GLPS以及其他醣蛋白混合物(包括目前使用之許多中藥)之有用工具。藉由使用不同表面(PVDF及聚苯乙烯)進行多醣體之固定，得到GLPS-F3的不同剖析結果。此可能係由於混合物中某些多醣體偏好結合於不同表面。從該二互補形式(format)得到之結果提供多醣體混合物之「指紋(獨特細微特徵)」。可將此等指紋辨識多醣體混合物之獨特細微特徵之方法用於，例如，監測在不同條件下，來自不同來源或來自不同批號之草藥萃取物之含量。再者，從特定多醣體混合物之剖析收集到之資料在了解其於活體內之生物作用之分子機制上具有重要性。

實施例11:DVLR1/CLEC5A(MDL-1)與登登革熱病毒之交互作用之檢測

下列實施例顯示本發明之融合蛋白質及方法如何用於鑑定可與病原體交互作用之先天性免疫受體，以及該等資料如何隨後用於測定與先天性免疫受體結合之病原體之下游作用，並亦用於設計治療病原體感染之治療劑。

登革熱為侵犯人類之最重要蚊傳病毒疾病之一。其全球分布與瘧疾之分布相當，且據估計活在有流行傳染之虞地區之人達2.5億。登革熱病毒(DV)感染後之臨床症候群包括登革熱(DF)及出血性登革熱(DHF)/登革熱休克症候群(DSS)。不過，導致DHF及DSS之分子機制仍未獲得充分釐清。

已知DC-SIGN媒介人類樹狀細胞之登革熱(DV)感染(Tassaneetrithepet al.,J Exp Med,2003.197(7)：p.823-9)。為了解DV之致病原因，測定DV是否與來自樹狀細胞、巨噬細胞、天然殺手細胞及周圍血液單核細胞(PBMCs)之其他膜-結合性C-型凝集素受體及類C型凝集素受體交互作用頗為重要。為達成此，將DVLR1/CLEC5A(MDL-1)、樹狀細胞凝集素-1、KCR及DC-SIGN(做為陽性對照阻)之細胞外區域與人類IgG1之Fc部分融合。更特定而言，使用DC-SIGN之引子(序列編號：17及序列編號：18)、DVLR1/CLEC5A之引子(序列編號：21及序列編號：22)、樹狀細胞凝集素-1之引子(序列編號：25及序列編號：26)以及KCR之引子(前向：5'-CAGCCTTGGAGACCTGAGT-3'序列編號：37；逆向5'-TAGCCTACTCTGGCCGC-3’序列編號：38)產生經擴增之cDNA片段。各前向引子具有額外的BamH1部位，且各逆向引子具有額外的EcoRI部位，以加速經擴增之cDNA次選殖入含人類IgG1 Fc部分之pCDNA3.1(Invitrogen)哺乳動物表現載體。然後將生成之載體轉染入293 FreeStyle細胞(lnvitrogen)，以產生可溶性重組蛋白質。所有重組受體.Fc融合蛋白質藉由蛋白質A瓊脂糖(Sepharose)珠粒(Pharmacia)純化並用0.1M甘胺酸-HCl(pH0.3)溶析。

將1μg各受體.Fc融合蛋白質塗佈在微量滴定平皿上並置於4℃整夜。然後將在結合緩衝液(1%BSA,2 mM CaCl₂ ,2 mM MgCl₂ ,50 mM Tris-HCl pH 7.5,150 mM NaCl)中之DV病毒株16681(DEN2系)(5x10⁶ 個粒子)加至平皿中以及將該平皿培育2小時。沖洗除去未結合之病毒後，施用生物素化抗-DEN2套膜蛋白質抗體(Wu et al.,J Virol,2002.76(8)：p.3596-604)，使其與病毒進行結合1小時。然後將經稀釋之綴合有辣根過氧化酶之鏈酶抗生物素蛋白加至平皿中，繼而進行1小時之培育。然後加入TMB受質並將平皿用ELISA讀數器在OD450 nm測量。

結果示於圖8A中(**表示p<0.01；***表示p<0.001(學生t試驗))。結果顯示除了DC-SIGN(陽性對照組)之外，DV亦與DVLR1/CLEC5A結合。為了確證該結果，用人類IgG1(陰性對照組)、DC-SIGN.Fc、KCR.Fc及DVLR1.Fc進行免疫沉澱研究。更特定而言，將5x10⁶ 個登革熱病毒粒子與5 μg之各蛋白質一起培育，然後加入蛋白質A珠粒。將生成之免疫複合物沖洗，藉由SDS-PAGE分離並移至硝基纖維素膜上。然後將該膜用生物素化之抗-DEN2套膜蛋白質抗體偵測並用綴合有辣根過氧化酶之鏈黴抗生物素蛋白顯色。此等結果示於圖8B中。此等結果顯示只有DC-SIGN.Fc即及DVLR1/CLEC5A.Fc能免疫沉澱登革熱病毒。

於存在能螯合Ca⁺⁺ 陽離子之EDTA(10 mM)下重覆進行微量滴定平皿之檢定分析。此等結果(圖8C)顯示與登革熱病毒之DVLR1/CLEC5A結合為Ca⁺⁺ 非依存性，而DC-SIGN結合為Ca⁺⁺ 依存性(***表示p<0.001，學生t試驗)。

亦反覆進行微量滴定平皿檢定分析，以測定DVLR1/CLEC5A.Fc融合蛋白質與DV粒子(5x10⁶ )之結合，其中該DV粒子曾接受下列處理：1)與500U糖苷酶PNGaseF(New England Biolabs,Inc.)於37℃預處理整夜；或2)用二硫蘇糖醇(DTT)(0.1M)處理；或3)於95℃預培育5分鐘；或4)進行UV照射5分鐘。結果顯示於圖8D中(星號表示DVLR1/CLEC5A.Fc融合蛋白質之結合親和力藉由病毒之修改，而與未經處理之病毒相較發生改變)；**p<0.01，***p<0.001，學生t試驗)。結果顯示DV用PNGaseF預處理會顯著抑制與DVLR1/CLEC5A.Fc之交互作用，以及用熱或二硫蘇糖醇之任一者預處理幾乎會完全抑制DVLR1/CLEC5A.Fc結合，但不會抑制DC-SIGN.Fc與DV之結合。此暗示DV之糖抗原決定部位及三次元組態對於與DVLR1/CLEC5A之結合頗為重要。

為了評估在免疫細胞上DVLR1/CLEC5A之表現，對於人類多核(PMN)細胞(嗜中性球)、PBMCs、巨嗜細胞及樹狀細胞進行流動式細胞計數。PMNs及PBMCs分別藉由先前所述之聚葡萄糖(dextran)沉降(Kuan et al.,Br.J.Pharmacol.,2005,145(4)：460-468)並用Ficoll-Paque(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)進行標準密度梯度離心而自健康人類捐血者之全血單離。將純化嗜中性球再懸浮於磷酸鹽水緩衝液(PBS,pH 7.4)中，以使紅血球低張溶裂。繼而藉由採用抗-CD14微珠(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany)之VARIOMACS技術進行高梯度磁性篩選，以從PBMCs純化CD14+細胞，然後在添加有10 ng/ml人類M-CSF(R&D Systems,Minneapolis,MN)之完全RPMI-1640培養基(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中培養6日(Chang et al.,J.Leukoc Biol,2004,75(3)：486-494)。藉由在添加10%牛胎血清、800 U/ml人類GM-CSF(Leucomax；Schering-Plough,Kenilworth,NJ)及500 U/ml人類IL-4(R&D Systems)之RPMI 1640培養基中培養6日，從吸附之PBMCs產生樹狀細胞(DC)(不成熟DCs)。為了製備成熟的經活化DCs，將不成熟的DCs與經γ射線照射(5500 rad)之CD40配體(CD40L)-表現性L細胞(DNAX Research Institute,Palo Alto,CA)以3：1之比率一起培育36小時(Hsu et al.,J Immunol.,2002,168(10)：4846-4853)。

對於上述細胞類型進行流動式細胞計數，其中使用綴合有FITC之抗-DVLR1/CLEC5A單株抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)或綴合有FITC之抗-DC-SIGN單株抗體(ED PharMingen)，連同綴合有藻紅素(PE)之抗CD3、CD19、CD56、CD14及CD66抗體，以進行雙重染色(BD PharMingen)。亦對相配之同種型(isotype)對照組(就DVLRI mAb而言為IgG2b；就DC-SIGN而言為IgG 1；Sigma)進行該表面染色，以提供背景值資料。藉由FACSCalibur流動式細胞計數器(Becton Dickinson)及CellQuest軟體(Becton Dickinson)來分析螢光，選通(gate)CD標記陽性細胞以測定DVLR1/CLEC5A或DC-SIGN之表現。該等結果示於圖9A(DVLR/CLEC5A)及圖9B(DC-SIGN)(陰影區域代表同種型對照組)。此等結果表示DC-SIGN主要在不成熟樹狀細胞上表現以及在巨噬細胞上微弱表現。該等結果亦顯示DVLR1/CLEC5A在CD14+衍化之巨噬細胞(MΦ)、CD66+ PMNs及剛單離之CD14+ PBMCs之表面上檢測到，但未在CD14+衍化的不成熟及成熟樹狀細胞上檢測到。此與先前所觀察到之「DVLR1/CLEC5A mRNA在人類單核球及巨噬細胞中表現，但不在樹狀細胞中表現」一致(Bakker et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,1999,96(17)：9792-9796)。

在該實施例中呈現之結果顯示本文所揭示之以受體.Fc融合蛋白質為主體之方法可用於測定能與特異性病原體諸如登革熱病毒結合之先天性免疫受體之種類。其最終允許鑑定可與病原體交互作用之細胞類型，並進一步提供治療或預防病原體感染之新穎標的。舉例言之，本文所揭示之結果暗示防止DV與DVLR1/CLEC5A結合之藥劑可用於預防或治療目的。舉例言之，對抗DVLR1/CLEC5A之單株抗體可由熟悉本技術人士製造，以防止DV與DVLR1/CLEC5A結合。再者，既然DV為黃病毒科家族之成員，該結果暗示DVLR1/CLEC5A可與在相同家族中之其他病毒交互作用，該等病毒例如為黃熱病毒屬中之病毒(諸如西尼羅熱病毒、日本腦脊髓炎病毒(JEV)、黃熱病毒及蜱傳腦脊髓炎病毒)或肝炎病毒屬中之病毒(諸如C型肝炎病毒)。所以DVLR1/CLEC5A亦可做為此等病毒之治療或預防標的。此外，既然DVLR1/CLEC5A為模式識別受體，DVLR1/CLEC5A可做為其他具套膜病毒之治療或預防標靶。

實施例12：登革熱病毒誘導之DAP12磷醯化由 DVLR1/CLEC5A媒介

DVLR1/CLEC5A(MDL-1)為包含187個胺基酸長之第II型穿膜蛋白質，其包括在穿膜區能使其與DAP12(具12 kDa之DNAX活化蛋白質)配對之帶電殘基(Bakker et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,1999,96(17)：9792-9796)。DAP12為以二硫鍵鍵結之同元二聚穿膜蛋白質，其具有極小的細胞外區域，在穿膜區域具有帶電的天冬胺酸以及在其細胞質尾部具有ITAM(免疫受體酪胺酸系活化基元)。由於在CD14+巨噬細胞上DV與DVLR1/CLEC5A結合且由於DAP12具有ITAM，因此引發測定在CD14+巨噬細胞中DV是否會誘生DAP12磷醯化之興趣。所以，在使用Chen等人(J.Virol.2002,76(19)：9877-9887)所揭示之方法並經略微修改下，將CD14+巨噬細胞以DV感染。簡言之，將終末分化之巨噬細胞用不完全的RPMI培養基沖洗一次，以移除培養基中之牛胎血清。然後將細胞用DV以不同的感染重複數(MOI)感染。將該等病毒與細胞在不含血清之RPMI中於37℃培育2.5小時，以允許病毒吸附。將培養平皿每30分鐘溫和攪動1次，以達成最佳的病毒-細胞接觸。之後，未吸收的病毒藉由用不含血清之RPMI沖洗細胞單層2次，然後進行培育1次而移除，分別收取不含細胞之上清液並分成數份貯存於-80℃，直至進行感染病毒製造及細胞激素分泌之檢定分析(見實施例13)。感染病毒滴度藉由在BHK-21細胞上之成斑檢定分析而測定。於結晶紫覆蓋後7日，藉由目視檢查計算斑數目，以測定每毫升上清液中之成斑單位(PFU)之數目(Lin et al.,J.Virol.,1998,72(12)：9729-9737)。為了檢測細胞內之DV抗原，將經感染之細胞用1%三聚甲醛固定並用0.1%皂素可通透化，繼而用NS3 mAb(Lin et al.,J.Virol.,1998,72(12)：9729-9737)或相配之同種型對照組(IgG1；Sigma)染色。培育1小時後，加入綴合有PE之山羊F(ab)'抗-鼠IgG二次抗體以進行螢光檢測，並藉由FACSCalibur流動式細胞計數器及CellQuest軟體來分析螢光。

結果示於圖10A-D中。於以MOI=5感染後48小時，在巨噬細胞之細胞溶質中DV非結構性蛋白質3(NS3)藉由流動式細胞計數法檢測(圖10A；灰色組織圖為同種型抗體對照組)。細胞外病毒滴度於感染後各種時間測量，且其顯示當巨噬細胞以活DV感染時，病毒粒子釋出至培養上清液，但以經UV-照射之DV(UV-DV；於相距5至10cm處，在冰上接受254 nm輻射照射15分鐘)感染時則否(圖10B)。

以各種MOIs感染後2小時(MOI=0.05-30，感染後2小時)，以及以固定MOI(MOI=5)感染一段時程(感染後2至48小時)後，研究DAP12之磷醯化。特定而言，為了檢測磷-DAP12，將巨噬細胞用DV以適當的MOI刺激一段適當的時間，然後在溶裂緩衝液(50mM Tris-HCI[pH7.5]、150mM NaCI、1% Triton X-100、0.1% SDS、5mM EDTA、10mM NaF、1mM原釩酸鈉及蛋白酶抑制劑混合錠[Roche])中進行溶裂。將等量的全細胞萃取物用DAP12兔多株抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc,CA)及蛋白質A瓊脂糖(Sepharose)(Amersham Biosciences AB)於4℃進行免疫沉澱4小時。培育後，將免疫複合物沖洗3次以及藉由SDS-PAGE分離，繼而移至硝基纖維素膜及用抗-磷醯酪胺酸抗體(4G10；Upstate Biotechnology,Inc)偵測。將免疫轉漬片用綴合有HRP之二次抗體及增強之化學發光(Amersham)顯色。為了進行再偵測，將膜用強再偵測套組剝除並用DAP12抗體轉漬。

將在各種MOIs下得到之結果示於圖10C中，而時程實驗結果示於圖10D中。此等結果顯示在DV感染後2小時，DAP12磷醯化強度之增加自MOI=0.05開始升高，在MOI=5時到達尖峯值(圖10C)。於DV感染後2小時檢測DAP12磷醯化，於12小時達到峯值，並持續至少48小時(圖10D)。縱使UV-DV在CD14+巨噬細胞中無法複製且在斑檢定分析中顯示沒有活性(圖10B)，DAP12於2小時亦被磷醯化，且磷醯化之DAP12於12小時仍可檢測得到，惟其強度遠比活DV所誘生者弱許多(圖10D；UV-DV)。此暗示DV所誘生之DAP12磷醯化具有二期：第I期(最初6小時)為複製-非依存性，而第II期(12小時後)為複製-依存性。

為了確證DAP12磷醯化係經由DVLR1/CLEC5A，用短髮夾狀RNA(shRNA)進行之RNA干擾(RNAi)抑制在CD14+巨噬細胞中DVLR1/CLEC5A之表現並如上述檢定分析DAP12之磷醯化。特定而言，人類DVLR1/CLEC5A之編碼區用下列DVLR1/CLEC5A siRNA定標：5'-TTGTTGGAATGACCTTAT-3'

序列編號：39

此段係用得自Brummelkamp et al.,Science,2002,296(5567)：550-553之環形序列(TTCAAGAGA)修改以建立shRNA。此處所使用之聚合酶III終止子段為TTTTTT。將shRNA選殖入pLL3.7基因沉默載體(Rubinson et al.,Nat.Genet.,2003,33(3)：401-406)，該載體含有loxP部位、驅動增強之綠色螢光蛋白質(EGFP)之表現之CMV(巨細胞病毒)啟動子以及具有下游限制部位(HpaI及XhoI)之U6啟動子。DC-SIGN shRNA構築體亦藉由將構築體pSUPER-siDC-SIGN(Tassaneetrithep et al.,如同上文)所含之shRNA次選殖入經HpaI/XhoI消化之pLL3.7載體而構築。依照製造商之說明書，將構築體用Amaxa套組(Gaithersburg,MD)電穿孔入巨噬細胞中。簡言之，將巨噬細胞(6x 10⁶ )如上述收取並再懸浮於100 μL之核因子溶液。加入siRNA(5μg)或載體對照組後，將細胞用Amaxa程式Y-001電穿孔並經16小時讓其復原。藉由分別使用抗-DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN單株抗體(R&D Systems)進行免疫轉漬而轉染後24小時，分析DVLR1及DC-SIGN沉默之效率。

結果示於圖11中。藉由電穿孔導入對照載體pLL3.7或DC-SIGN-shRNA之CD14+巨噬細胞以DV感染後，未顯示DAP12磷醯化降低。相對照地，在DV感染之前先藉由電穿孔導入DVLR1/CLEC5A-shRNA之CD14+巨噬細胞中，DAP12磷醯化急遽降低。所以，可以獲得下述結論：DV-誘導之DAP12磷醯化係經由DVLR1而發生。

實施例13:DVLR1/CLEC5A涉及DV-媒介之TNF-α釋出，但不涉及進入CD14+巨噬細胞

於DV感染時，CD14+巨噬細胞分泌促發炎性細胞激素及化學激素，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、α-干擾素(IFN-α)、MIP-1α及IL-8(Chen et al,如同上文)。使用市售ELISA套組測量經DV-感染之CD14+巨噬細胞之培養上清液中之TNF-α濃度。針對活DV及UV-DV二者，於不同MOIs及於感染後不同時間進行測量。結果示於圖12A-C(誤差長條圖代表與複製三份之平均值之標準誤差，而星號表示細胞激素產量之統計學上差異值，*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001)。此等結果顯示感染後6小時，活DV及DV-UV二者在0.05-30之MOI範圍內對於TNF-α分泌具有相似的作用(圖12A)。於感染後12小時，只有活DV之TNF-α分泌以劑量依存(增加MOI)方式增加。就感染後12小時之感染有UV-DV之細胞而言，TNF-α濃度在所有MOIs均保持相同(圖12B)。圖12C顯示TNF隨著時程之測量值。此等值顯示當用活DV以MOI=5感染時，TNF-α分泌量由於6小時之8 pg/ml迅速增至於12小時之85 pg/ml，並在48小時達到高峰(350 pg/ml)。不過，當與UV-DV一起培育時，TNF-α分泌從8 pg/ml(於6小時)降至5 pg/ml(於12小時)。此暗示初始反應(於6小時)與病毒複製無關，而TNF-α分泌之較後期(12小時後)與DV複製有關。

先前已證明DC-SIGN會與DV交互作用，以媒介病毒進入樹狀細胞。使用先前實施例之RNAi方法及試劑，研究在經DV-感染之CD14+巨噬細胞中DC-SIGN-shRNA及DVLR1/CLEC5A-shRNA對於NS3表現之作用。圖13A顯示DC-SIGN-shRNA及DVLR1/CLEC5A-shRNA可分別使其對應蛋白質表現減少(knock down)(pWTSI及pLL3.7為無插子對照組)。圖13B圖示流動式細胞計數分析之結果並例示說明只有DC-SIGN-shRNA能使CD14+巨噬細胞中之DVNS3表現減少。該結果藉由使用抗-DS3抗體進行免疫螢光共軛焦顯微鏡檢而確證。圖13C例示說明在藉由電穿孔導入shANA構築體之細胞之上清液中，病毒滴度之即時PCR分析。該等結果表示只有DC-SIGN-shRNA能減少經DV感染之細胞之上清液中之病毒滴度。

實施例14:DVLR1/CLEC5A涉及DV所誘導之促發炎性細胞激素從CD14+巨噬細胞之釋出

就以DV(MOI=5)感染之CD14+巨噬細胞而言，於依照先前實施例之方法(2.5小時轉染)使DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN基因表現下調(knock down)後，使用ELISA評估細胞激素釋出模式。在最初12小時，DC-SIGN-shRNA不會影響TNF-α、MIP-1α、IFN-α、IL-6或IL-8之分泌。參見圖14A-B(誤差長條圖代表與複製三份之平均值之標準誤差，而星號表示與對照實驗相較，在統計學上有顯著之差異；*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001)。48小時後，DC-SIGN-shRNA對於TNF-α、MIP-1α、IFN-α及IL-6分泌具有輕微的抑制作用(少於20%)；IL-8分泌則不受影響。既然DC-SIGN參與病毒進入及複製，該觀察暗示初始細胞激素分泌(最初12小時)與DV複製無關。相對地，DVLR1/CLEC5A基因表現下調急遽地壓制(p<0.005)TNF-α、MIP-1α、IFN-α及IL-8之分泌，但不會壓制IL-6之分泌。此暗示DVLR1/CLEC5A主導DV所誘導之細胞激素來自CD14+巨噬細胞之釋放。所以防止DV與DVLR1/CLEC5A結合之治療劑可用於在人類中防止DV所誘導之細胞激素釋放之不良作用。舉例言之，防止DVLR1/CLEC5A與DV交互作用之單株抗體將可用於預防或治療DV所誘導之登革熱休克症候群(DSS)或出血性登革熱(DHF)。

實施例15：拮抗性抗-DVLR1/CLEC5A單株抗體(mAbS)遏止因登革熱病毒(DV)血清型1、2、3及4造成之發炎性細胞激素釋出

用標準技術產生對抗DVLR1/CLEC5A之單株抗體。簡言之，將小鼠用DVLR-1.Fc融合蛋白質免疫，且雜交瘤藉由將得自小鼠之脾臟細胞與P3/NSI/1-Ag4-1[NS-1]骨髓瘤細胞(ATCC TIB-18)融合而形成。在所產生之mAbs中，9B12株、3E12亞株(3E12A2株、3E12C1株、3E12G9株)及8H8F5株於用DEN1(766733A系)、DEN2(PL046系)、DEN3(H-87系)及DEN4(866146A系)感染後，會以劑量-依存方式壓制TNF-α從巨噬細胞之釋出。參見圖15，其顯示由感染DV之CD14+巨噬細胞分泌入培養上清液之TNF-α之ELISA測量值。依照標準命名法，各抗體以分泌其之雜交瘤之株編號稱之。所以本發明亦提供分泌上述單株抗體之雜交瘤。

該等結果證明抗-DVLR1/CLEC5A抗體在人類中將可做為治療劑，防止促發炎性細胞激素從DV所感染之CD14+巨噬細胞釋出。特定而言，但非限制性地，本實施例之單株抗體、或其片段、或與本實施例之抗體結合相同抗原決定部位之抗體(或其片段)可被調配成醫藥組合物，然後依照本文所提供之方法投與，以用於治療或預防人類DV感染。

實施例16：測定免疫細胞上由登革熱病毒活化之模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)

樹狀細胞(DC)及巨噬細胞係DV感染之主要標靶(Halstead et al.,J.Exp.Med.1977,146：201-217；Palucka,Nat.Med.2000,6：748-749；Wu et al.,Nat.Med.2000,6：816-820)。雖然經感染之DCs會進行脫噬(任憑旁觀之DCs分泌促發炎性細胞激素)(Palmer et al.,J.Virol.2005,79,2432-2439)，經感染之巨噬細胞卻會存活至少45天並自感染後6小時起分泌多種細胞激素及化學激素(Chen et al.,J.Virol.2002,76：9877-9887)。此種情形暗示巨噬細胞為DV感染後之促發炎性細胞激素的主要來源，其中病毒粒子可能會藉由活化模式識別受體(PRRs)而啟動發炎反應。在此內容中，類鐸受體(TLRs)、C-型凝集素及類免疫球蛋白(類Ig)受體(如TREMs及類TREM受體(TIL))已經暗示為潛在之PRRs(Cook et al.,Nat.Immunol.2004,5,975-979；Klesney-Ttait et al.,Nat.Immunol.2006,7,1266-1273；Rovinson et al.,Nat.Immunol.2006,7,1258-1265)。

為判定登革熱病毒是否可結合並活化免疫細胞上之後選PRRs，使二十二種融合蛋白質在哺乳動物細胞中表現，並篩選其與DV2之交互作用(表2)。該等融合蛋白包含人類IgG1.Fc片段結合C-型凝集素及類Ig受體之胞外域。

表2：重組受體.Fc融合蛋白質之構築

如圖16所示，DV與DLVR1/CLEC5A具有交互作用。特定言之，圖16a顯示由ELISA所測定之DV(5x10⁶ PFU)與DLVR1/CLEC5A(1 μg)之交互作用。在圖16b中，其以對抗DV套膜(E)蛋白質之mAb對DV(5x10⁶ PFU)與受體.Fc(5 μg)之複合物進行免疫沈澱並以西方轉漬偵測。圖16c顯示由ELISA所測定之EDTA(10 mM)對DLVR1/CLEC5A-DV交互作用的抑制。圖16d及16e顯示糖競爭檢定分析，其中DC-SIGN(CLEC4L)及DLVR1/CLEC5A兩者皆可增加DV對於人類293T細胞的結合(圖16d)，而糖之添加則以劑量-依存性之方式抑制生物素化DV對於經DC-SIGN-(左格)或DLVR1/CLEC5A-(右格)轉染之293T細胞的結合，如以流動式細胞計量術測定(圖16e)。根據圖16e，MFI表示平均螢光強度。單醣體(甘露糖及岩藻糖)及多糖體(甘露聚糖)之單位(U)分別為mM及mg/ml。圖16f顯示PNGaseF(500U)、DTT(0.1 M)、熱(95℃ 5分鐘)或UV(10 J/cm² )對於DLVR1/CLEC5A-DV交互作用的效應，如以ELISA所測定。數據係以三次獨立試驗之平均值±s.d.表示。進行雙尾學生t試驗。

在所試驗之受體中，DC-SIGN已於先前顯示可與位於DV套膜(E)蛋白質上之聚醣產生交互作用(Pokidysheva,E.et al.,Cell 124：485-93(2006))。使用ELISA，DLVR1/CLEC5A.Fc(在DC-SIGN.Fc及DC-SIGNR.Fc之外)顯示可捕捉DV2(圖16a)。為確認DLVR1/CLEC5A與DV間交互作用之特異性，以蛋白質A瓊脂糖(Sepharose)珠粒免疫沈澱複合物，接著以抗-DV套膜(抗-E)單株抗體(mAb)進行探測。在DC-SIGN.Fc及DLVR1/CLEC5A.Fc之免疫沈澱物中偵測到E蛋白，因此確認DLVR1/CLEC5A可與登革熱病毒粒子產生交互作用(圖16b)。然而，儘管DC-SIGN對DV之結合為Ca⁺⁺ -依存性，EDTA(一種Ca⁺⁺ 螯合劑)對於DLVR1/CLEC5A-DV交互作用則並無效應(圖1c)。再者，以DC-SIGN及DLVR1/CLEC5A轉染293T細胞造成生物素化DV對該等細胞的結合增加(圖1d)。

在E蛋白質之Asn-67及Asn-153共有兩個保守性之N-連結性糖基化位點(Pokidysheva,E.et al.,Cell 124：485-93(2006))，且該等連附之聚醣已被證實涉及細胞連附及病毒進入(Modis,Y.et al.,J.Virol.79：1223-2131(2005))。為研究聚醣在DLVR1/CLEC5A與DV連結中之參與情形，使病毒粒子與岩藻糖、甘露糖、或甘露聚糖共同培育；其中至少兩種糖為DC-SIGN之配體(Mitchell te al.,J.Biol.Chem.276：28939-28945(2006))。如所預期，甘露糖及甘露聚糖造成DC-SIGN-DV交互作用之劑量-依存性抑制(圖16e)，而DLVR1/CLEC5A對DV之結合則在岩藻糖存在下顯著降低(p<00001)，且在甘露聚糖存在下有較低程度之降低(p=0.0005)。以PNGaseF對DV進行預處理亦顯著降低DLVR1/CLEC5A-DV交互作用(圖16f)，其建議存在於病毒E蛋白上之聚醣為結合所必要者。亦發現熱處理或二硫蘇糖醇(DTT)可遏止DLVR1/CLEC5A-DV交互作用(圖16f)，此建議聚醣在登革熱病毒粒子上之正確拓樸分布係重要的。

實施例17：DC-SIGN及DVLR1/CLEC5A與登革熱病毒之交互作用

圖17顯示DC-SIGN及DVLR1/CLEC5A在人類PBMCs中之表現模式。以綴合有PE之抗-CD標記抗體(BD PharMingen)以及綴合有FITC之抗-DC-SIGN mAb(根據圖17a所示之具體例)或綴合有FITC之抗-DVLR1/CLEC5A mAb(R&D Systems)(根據圖17b所示之具體例)，對剛單離之PBMCs進行雙重染色。選通(gate)CD標記陽性細胞以測定DC-SIGN及DVLR1/CLEC5A(虛線)之表現。陰影區域代表同種型對照組。

DC-SIGN(其係表現於DCs及巨噬細胞上(圖17a))在其細胞質尾部含有三種基序，該等基序咸信涉及細胞吞噬作用或胞內運輸(Lozach et al.,J.Biol.Chem.2005,280,23698 23708)。相對的，DVLR1/CLEC5A則原始經辨識為僅表現在單核細胞及巨噬細胞上之DAP12-相關分子(圖17b)，然其配體及生物功能仍待測定(Bakker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,9792 9796)。

實施例18:DVLR1/CLEC5A對於DV誘導之DAP12磷醯化具必要性，但對於登革熱病毒之複製則不具必要性

根據圖18所示之具體例，DVLR1/CLEC5A對於DV誘導之DAP12磷醯化具必要性，但對於登革熱病毒之複製則不具必要性。特定言之，在圖18中，其在西方轉漬分析上使用針對磷醯酪胺酸及DAP12之抗體，測定人類巨噬細胞中之DV誘導之DAP12磷醯化(2 h p.i.)。圖18b說明由DV及經UV-失活之DV(UV-DV)誘導之DAP12磷醯化的動力學。圖18c說明shRNAs使DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN之表現下降(knock down)以及抑制DV-媒介(m.o.i.=5)之DAP12磷醯化的能力。圖18d顯示shRNAs對於巨噬細胞中之DV進入及複製的效應，如以流動式細胞計量術所測定。圖18e說明以共軛焦顯微鏡所檢驗到之抗-DVLR1/CLEC5A mAb、抗-DC-SIGN mAb、及小鼠IgG(50 μg/ml)對於非結構蛋白質NS3(紅色；經Cy3標記)表現的效應(Tassaneetrithep,B.etal.,J Exp Med 197：823-29(2003))。以Hoechst 33342(藍色)對比染色細胞。在圖18d及圖18e兩者中，巨噬細胞經DV感染(m.o.i.=5)以測定感染後48小時之NS3表現。圖18f顯示shRNAs對於經感染巨噬細胞之DV滴度的效應。

發現以DV感染巨噬細胞可以劑量-依存性之方式誘發DAP12磷醯化(圖18a)。在活DV存在下，DAP12磷醯化在感染後(p.i.)12小時達到峰值並持續至少48小時，而經UV-失活之登革熱病毒(UV-DV)則只可啟動僅持續12小時之有限DAP12磷醯化(圖18b)，此指出在感染最初之2-6小時，DAP12磷醯化係與DV複製無關。DVLR1/CLEC5A之下降(knock down)(使用shRNA pLL3.7/DVLR1/CLEC5A會造成DAP12磷醯化之顯著減少，但DC-SIGN之下降(由pLL3.7/DC-SIGN造成)則否(圖18c)，此建議由DV引發之DAP12磷醯化係經由DVLR1/CLEC5A媒介。

已知DC-SIGN涉及DV對於DCs之感染(Navarro-Sanchez et al.,EMBO Rep.4：723-28(2003)；Tassanetrothep et al.,J.Exp.Med.197：823-829(2003))。因此，藉由監測DV非結構蛋白質3(NS3)之表現(其係在DV於巨噬細胞中複製時表現)，試驗DVLR1/CLEC5A是否涉及DV進入巨噬細胞。與DC-SIGN相反，以shRNA使DVLR1/CLEC5A下降(圖18d)或是以抗-DVLR1/CLEC5A Ab阻斷DVLR1/CLEC5A-DV交互作用(圖18e)並不會抑制巨噬細胞中之NS3表現，如以流動式細胞計量術及共軛焦顯微鏡檢所分別檢驗。shRNA pLL3.7/DVLR1/CLEC5A亦無法抑制登革熱病毒粒子釋出至經感染巨噬細胞之上清液中，如以成斑檢定分析而測定(圖18f)。此等結果指出，DC-SIGN會中介DV感染及複製，而DV與DVLR1/CLEC5A之交互作用則會啟動細胞信號傳導。

實施例19：DVLR1/CLEC5A-登革熱病毒交互作用之抑制可壓抑經感染巨噬細胞之發炎反應而不影響病毒清除反應

為測定DVLR1/CLEC5A是否涉及DV誘導之發炎反應，檢驗巨噬細胞在DV感染後之發炎性細胞激素分泌。

根據圖19所示之具體例，DVLR1/CLEC5A對於DV-媒介之TNF-α分泌相當必要，但對INF-α分泌則否。更特定言之，圖19a說明巨噬細胞之DV及UV-DV誘導性TNF-α分泌的劑量-依存性，如以ELISA在6 h及12 h p.i.測量。圖19b說明DV感染(m.o.i.=5)後之INF-α表現的動力學。圖19c說明DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN shRNA對於TNF-α、IL-6、MIP1-α、IL-8、IP-10及INF-α自經DV感染(m.o.i.=5)之巨噬細胞分泌的效應。在圖19d中，以受體特異性shRNA所進行之下降(knock down)實驗說明，DV誘導之INF-α分泌係經由TLR7-MyD88途徑而TNF-α分泌係經由DVLR1/CLEC5A-TLR7-MyD88途徑。圖19e說明可抑制反應DV血清型1-4之TNF-α分泌的桔抗性抗-DVLR1/CLEC5AmAbs受到抑制(參見表3)。

表3：抗-人類DVLR1/CLEC5A mAbs之特徵。"*"-p<0.05；"**"-p<0.01；"***"-p<0.001。抗體(10 μg/樣本)可抑制由人類巨噬細胞之DV誘導性TNF-α分泌。進行雙尾學生t試驗並將數據與各個適當之同種型控制組抗體比較。可啟動由人類巨噬細胞之TNF-α分泌(相較於同種型控制組)的抗體定義為催動性。特異性由使用pLL3.7/DVLR1/CLEC5A-shRNA遏止TNF-α分泌而確認(pLL3.7載體及pLL3.7/DC-SIGN對於抗體-媒介之TNF-α分泌並無效應)。ELISA，酶鍵連免疫吸附檢定分析；WB，西方轉漬；FACS，螢光活化細胞分選。抗體係不含疊氮化物、經無菌過濾、且具有低於每毫克0.1EU之內毒素量。

使用M.R.mAb(抗-甘露糖受體mAb；mIgG1)及小鼠IgM(mIgM)作為陰性控制組。在圖19d及圖19e兩者中，以DV感染巨噬細胞(m.o.i.=5)，並在36 h p.i.收集進行細胞激素檢定分析。數據係以三次獨立試驗(使用來自至少三位不同捐血者之材料進行)之平均值±s.d.表示。進行雙尾學生t試驗。"ND"表示未偵測。

在6 h p.i.，偵測到劑量-依存性之TNF-α分泌，其中經DV或UV-DV感染之巨噬細胞分泌類似量之細胞激素(圖19a，左格)。然而，在12 h p.i.，DV會進一步增加TNF-α分泌，而UV-DV則不會(圖19a，右格)。在48 h之時程中，經DV感染之巨噬細胞的TNF-α分泌持續增加，而在以UV-DV感染後24 h-48 h，此種細胞激素幾乎無法偵測到(圖19b)。此等數據符合DAP12之動力學(圖18b)，因而建議DV媒介之TNF-α分泌係與DAP12之活化相關。其亦觀察到，DVLR1/CLEC5A下降(knock down)會以大於DC-SIGN下降之程度，抑制TNF-α、IL-6、IL-8、MIP1-α、及IP-10自經DV感染之巨噬細胞釋出(圖19c)。然而，pLL3.7/DC-SIGN可輕微抑制INF-α之分泌(p=0.048)，而pLL3.7/DVLR1/CLEC5A則對INF-α無作用(圖19c)。

為進一步了解導致細胞激素分泌之由DV活化之信號傳導途徑，在DV感染之前，以shRNAs轉染巨噬細胞，以使DVLR1/CLEC5A、DC-SIGN、TLR4、TLR7或MyD88下降。所得之數據指出，DV誘導之INF-α分泌係經由TLR7-MyD88途徑產生(p=0.0016)，而TNF-α分泌則係由DVLR1/CLEC5A(p=0.0013)及TLR7-MyD88(p=0.013)兩者媒介(圖19d)。產生一組抗-DVLR1/CLEC5A mAbs，其對於DV之四種血清型具有不同之拮抗效應(見上文表3)，如以自經DV感染之巨噬細胞之TNF-α分泌的抑制所測定(圖3e)。此等數據指出，儘管DVLR1/CLEC5A之不同抗原決定部位似乎媒介個別之交互作用，能夠抑制DVLR1/CLEC5A之抗體卻可壓抑經相關DV血清型感染之巨噬細胞的發炎反應。抗-DVLR1/CLEC5A mAbs之不同桔抗效應可能係與各DV血清型係和DVLR1/CLEC5A之迥異抗原決定部位結合的事實有關，而抗-DVLR1/CLEC5A mAb可抑制結合位點與抗-DVLR1/CLEC5A mAb之結合位點重疊之特異DV血清型的結合。

實施例20：由抗體依存性增強(antibody-dependent enhancement,ADE)媒介之INF-α分泌與DVLR1/CLEC5A無依存性

先前已經證明，非中和性抗-DV Abs可促進DV經由FcR受體進入標靶細胞，並因而增進細胞激素釋放(Halstead et al.,J.Exp.Med.146：201-217(1977)；Goncalvez et al.,Proc Natl Acad Sci USA 104：=9422-9427(2007))，此係稱為感染之抗體依存性增強(ADE)的現象。舉例而言，抗-prM及抗-E mAb已經顯示可在試管內誘導此效應(Huang et al.,J Immuno 176：2825-2832(2006))。在此，針對DVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻是否可抑制ADE而進行研究。

根據圖20所示之具體例，DVLR1/CLEC5A對於ADE媒介之TNF-α分泌具必要性，但對於INF-α分泌則不具必要性。更特定言之，在圖20a中，其以DV(m.o.i.=5)、DV/抗-E、或DV/抗-prM免疫複合物(ADE)感染巨噬細胞36h，接著以抗-NS3 mAb偵測DV複製。在拮抗性抗-DVLR1/CLEC5A mAb(1 μg；純系9B12H4)或同種型控制組存在下，以DV2(圖20b)、或是DV/抗-prM或DV/抗-E複合物(圖20c)感染取自10名個體之巨噬細胞。以ELISA測定TNF-α及INF-α分泌。進行雙尾學生t試驗。

在抗-DVLR1/CLEC5A mAb(或同種型控制組)存在下，單以DV或是結合抗-prM/DV或抗-E/DV免疫複合物而感染原代人類巨噬細胞36 h。發現相較於僅使用DV者，抗-PrM/DV或抗-E/DV免疫複合物(ADE)可增加NS3之表現(圖20a)以及TNF-α及INF-α之分泌量(圖20b及20c)。然而，在抗-DVLR1/CLEC5A mAb顯著抑制由經DV、抗-prM/DV、及抗-E/DV免疫複合物感染之巨噬細胞的TNF-α分泌時(圖20c)，INF-α之分泌卻不受影響，因此建議由ADE媒介之INF-α分泌與DVLR1/CLEC5A無依存性(與上文關於DV誘導之INF-α生產所註記者相同)。

實施例21:DVLR1/CLEC5A在登革熱病毒誘導之血管滲漏中的參與

DHF及DSS之特點係血漿滲漏以及皮下及生命器官(vital organ)出血。此等症狀係由免疫細胞釋出諸多可溶性媒介分子及細胞激素而增加血管通透性所造成(Green et al.,Curr.Opin.Infect.Dis.19：429-436(2006))。為測定DVLR1/CLEC5A是否涉及DV誘導之血管滲漏，將人類真皮微血管內皮細胞(HMEC-1)之單層用於通透性檢定分析中(Carr et al.,J.Med.Virol.69：521-528(2003))。

根據圖21所示之具體例，桔抗性抗-DVLR1/CLEC5A mAbs可拯救經DV感染之巨噬細胞上清液對內皮細胞單層所造成之通透化。更特定言之，圖21a說明在與取自經DV或DV/抗-PrM複合物(ADE)感染之巨噬細胞的上清液進行培育後，由HRP遷移測量所測定之HMEC-1單層之通透性隨時間之變化。上清液中之TNF-α含量以ELISA測量。如圖21b所示，測定TNFR2.Fc(5 μg/ml)及抗-DVLR1/CLEC5A(純系9B12H4；5 μg/ml)對於內皮細胞單層通透化之抑制作用。數據係以三次獨立試驗之平均值±s.d.表示。進行雙尾學生t試驗。

發現取自經DV或抗-prM/DV免疫複合物感染之巨噬細胞的上清液可誘導HMEC-1單層之通透性；其中在感染之最初36 h-48 h，免疫復合物(ADE)可產生較單獨之DV更為顯著之效應(圖21a，左)。再者，盡管重組TNFR2.Fc之TNF-α中和亦可部分抑制由DV或抗-prM/DV所啟動之通透性誘導(p<0.005)(圖21b)，抗-DVLR1/CLEC5A mAb在此方面卻更為有效(圖21b)。其觀察到，在TNF-α之外，抗-DVLR1/CLEC5A尚可封阻巨噬細胞之其他發炎性細胞激素分泌，此可能可解釋此種現象。

實施例22：拮抗性mAbs與登革熱病毒誘導之TNF-α分泌問的劑量-依存性交互作用

針對DV-CLEC5A交互作用的封阻是否可在活體內拯救小鼠不受DV誘導之死亡而進行進一步之研究。根據圖22所示之具體例，其顯示mDVLR1/CLEC5A與DV之交互作用(圖22a)以及mDVLR1/CLEC5A在小鼠細胞中之表現模式(圖22b及22c)。更特定言之，圖22a顯示由ELISA所測定之DV(5x10⁶ PFU)與人類及小鼠DLVR1/CLEC5A.Fc(1 μg)的交互作用。選通(gate)F4/80及CD標記陽性細胞以測定mDVLR1/CLEC5A在小鼠脾細胞(圖22b)、小鼠骨髓(BM)-衍生性巨噬細胞及小鼠似巨噬細胞Raw264.7細胞(圖22b及22c)中之表現。

發現小鼠DVLR1/CLEC5A(mDVLR1/CLEC5A)可以類似人類DVLR1/CLEC5A之親和力結合DV(圖22a)，且mDVLR1/CLEC5A表現於骨髓細胞譜系(CD11b+，F4/80+)、骨髓衍生性巨噬細胞及小鼠似巨噬細胞Raw264.7細胞(圖22b及22c)。

實施例23：mDVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻可壓抑自Raw264.7細胞之DV誘導性TNF-α分泌

根據圖23所示之具體例，mDVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻可壓抑自Raw264.7細胞之DV誘導性TNF-α分泌。更特定言之，圖23a顯示人類DC-SIGN可增加DV與小鼠巨噬細胞細胞系Raw264.7之結合，並增強DV感染之刺激效應。以ELISA測定TNF-α之釋出。圖23b顯示拮抗性mAbs對於小鼠DVLR1/CLEC5A之辨識。在mAbs之存在下，使之存在下，使穩定表現人類DC-SIGN之Raw264.7細胞與DV2(PL046；m.o.i.=30)共同進行培育。以ELISA測定上清液中之TNF-α量(在48 h p.i.)。圖23c顯示抗-DVLR1/CLEC5A mAbs(純系：3D2H6及10D7H3)可以劑量-依存性之方式抑制DV2-(NGC-N；m.o.i.=30)誘導之TNF-α釋出。以mIgG1作為同種型相符之陰性控制組。

DV會刺激穩定表現人類DC-SIGN之Raw264.7細胞(Raw264.7/DC-SIGN)分泌TNF-α(圖23a)，而以拮抗性mAbs(表4)封阻mDVLR1/CLEC5ADV交互作用可以劑量-依存性之方式遏止Raw264.7/DC-SIGN細胞之DV誘導性TNF-α分泌(圖23b及23c)。

表4：抗-小鼠DVLR1/CLEC5A mAbs之特徵。"*"-p<0.05；"**"-p<0.01；"ND"-未進行。抗體可抑制由小鼠巨噬細胞細胞系Raw264.7/DC-SIGN之DV誘導性TNF-α分泌。進行雙尾學生t試驗並將數據與各個適當之同種型控制組抗體比較。ELISA，酶鍵連免疫吸附檢定分析；FACS，螢光活化細胞分選。抗體係不含疊氮化物、經無菌過濾、且具有低於每毫克0.1EU之內毒素量。

實施例24：登革熱病毒(NGC-N)可誘導STAT1-/-小鼠之死亡

根據圖24所示之具體例，以一劑量範圍(自102至105 PFU)之DV2/PL046或DV2/NGC-N系(i.p.及i.c.途徑)挑戰STAT1-/-小鼠(n=5/組)4週。數據以Kaplan-Meier存活曲線表示。

INF-α可作用而抑制經感染及未經感染細胞兩者中之病毒複製，而對於DV感染之INF媒介性反應同時涉及STAT1-依存性途徑(對於病毒複製之控制為必要)及STAT1-無依存性途徑(對於感染之消散為必要)兩者(Shresta et al.,J.Immunol.175：3946-3954(2005))。儘管野生型之小鼠對於DV感染具有抗性，STAT1缺陷(STAT1 ^-/- )(Durbin et al.,Cell 84：443-450(1996))小鼠對於DV2-9(New Guinea C-N系)誘導之死亡則為敏感(圖24)。

實施例25：拮抗性mAbs對抗DVLR1/CLEC5A之潛在治疲效應

針對桔抗性mAbs對STAT1 ^-/- 小鼠之潛在治療效應進行進一步試驗。根據圖25所示之具體例，抗-DVLR1/CLEC5A mAbs可在STAT1缺陷小鼠體內預防DV誘導之血管滲漏及死亡。更特定言之，在圖25a中，對抗小鼠DVLR1/CLEC5A培育之mAb 3D2H6可抑制經DV挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠的皮下及腸道出血。在圖25b中，對抗DVLR1/CLEC5A之mAb(3D2H6及10D7H3)可減少經DV挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠的血漿滲漏進入生命器官，如以Evans藍檢定分析所測定。圖25c說明藉著自器官萃取Evans藍而進行之血管通透性定量。數據係以三次獨立試驗之平均值±s.d.表示：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(學生t試驗)。圖25d說明於有及無抗-DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2.Fc存在下，經DV挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠在p.i.第7天之TNF-α及IP-10之血清含量(n=8；上及中)以及病毒滴度(n=4；下)。進行雙尾學生t試驗。圖25e說明在拮抗性抗-DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2.Fc存在下，經DV2(New Guinea C-N系，1x10⁵ PFU/小鼠，i.p.加i.c.途徑)挑戰之STAT1缺陷小鼠的存活曲線。數據係取自四次獨立試驗(每組各17隻小鼠)，並以Kaplan-Meier存活曲線並使用指數系列法(log rank test)表示。指出對於DVLR1/CLEC5A mAbs及小鼠IgG治療間之顯著差異的p 值。

在p.i.第8天，除皮下及腸道出血之外，經DV挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠尚有毛髮摺皺(Ruffled fur)及輕微之癱瘓(圖25a)，且在感染7-14天內皆死亡(圖25e)。在p.i.第0、1、3、5及7天，投與5劑之Abs(100 μg/小鼠，i.p.)或TNFR2.Fc(100 μg/小鼠，i.p.)。在p.i.第9天，經抗-DVLR1/CLEC5A mAbs治療小鼠體內滲漏進入經DV挑戰小鼠腎臟、肝臟、胃、小腸、大腸、及胰臟之Evans藍量相較於控制組顯著減少(圖25b及25c)。抗-DVLR1/CLEC5A mAbs亦顯著降低TNF-α及IP-10之血清含量(圖25d；上及中)，且在p.i.第7天未壓抑病毒複製(圖25d；下)，並在p.i.第14天保護小鼠不會死亡(70%保護率)。在p.i.第21天所觀察到之經抗-DVLR1/CLEC5A mAbs治療小鼠的整體存活率為48%(圖25e)，且在p.i.第23天DV自存活小鼠之血清中清除(數據未示)。因此，DVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻似乎可防止與DV相關之出血及血漿滲漏併發症，並可壓抑巨噬細胞發炎反應，且不會損害適應性免疫系統之病毒清除。相對的，TNFR2.Fc既不可降低血管通透性(圖25c)，亦不可保護小鼠不會死亡(圖25e)，儘管其可有效降低TNF-α之血清含量(圖25d)。

實施例26：DVLR1/CLEC5A涉及JEV媒介之DAP12磷酸化作用及自人類巨噬細胞之TNF-α分泌

和DV相似，JEV具有類似之病毒感染反應模式，其咸信在所有黃病毒中皆為相同或相似。如圖26a所示，分別以ELISA測定DVLR1/CLEC5A(1 μg)與JEV及DV(5x10⁶ PFU)之交互作用。DV與人類DVLR1/CLEC5A(長度187胺基酸)序列編號：72具交互作用，但與可變剪接形式sDVLR1/CLEC5A(aa 43-65缺失)序列編號：73則否。相對的，JEV僅與sDVLR1/CLEC5A具交互作用，但與全長DVLR1/CLEC5A則否。如圖26b所示，其顯示DV可在人類巨噬細胞中誘導DAP12磷酸化作用(在2 h p.i.)。以抗-DAP12 mAb沈澱經DV感染之巨噬細胞中的DAP12，在SDS-PAGE分離後將其轉漬至硝基纖維素膜上，接著再與對抗磷醯酪胺酸及DAP12之抗體分別進行培育。JEV誘導之DAP12磷酸化作用(m.o.i.=5)由pLL3.7/DVLR1/CLEC5A抑制。如圖26c所示，其顯示人類巨噬細胞反應JEV感染之TNF-α分泌的動力學(左)。JEV誘導之TNF-α分泌由pLL3.7/DVLR1/CLEC5A mAb抑制(右)。數據係以三次獨立試驗之平均值±S.d.表示。

實施例27：mAb 3E12A2之可變重及輕鏈序列

mAb 3E12A2之可變重鏈序列示於下文(序列編號：60)： mAb 3E12A2之可變輕鏈序列示於下文(序列編號：61)：

實施例28：mAb 3E12G9之可變重及輕鏈序列

mAb 3E12G9之可變重鏈序列示於下文(序列編號：62)： mAb 3E12G9之可變輕鏈序列示於下文(序列編號：63)：

實施例29：mAb 8H8F5之可變重及輕鏈序列

mAb 8H8F5之可變重鏈序列示於下文(序列編號：64)： mAb 8H8F5之可變輕鏈序列示於下文(序列編號：65)：

實施例30：mAb 8H8F5、3E12A2、及3E12G9之可變重及輕鏈序列排比之比較 mAb 8H8F5、3E12A2、及3E12G9之可變重鏈排比之比較示於下文(分別為序列編號：66、67、及68)：

mAb 8H8F5、3E12A2、及3E12G9之可變輕鏈排比之比較示於下文(分別為序列編號：69、70、及71)：

DVLR1/CLEC5A可與登革熱病毒直接交互作用，並因而造成DAP12磷酸化。DVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻可壓抑促發炎性細胞激素之分泌，且不影響干擾素-α之釋出。再者，抗-DVLR1/CLEC5A單株抗體可在STAT1-缺陷小鼠體內抑制DV誘導之血漿滲漏以及皮下及生命器官出血，並可撿賞~50%之DV感染發生。該等結果建議，DV啟動之巨噬細胞的細胞因子釋出涉及DVLR1/CLEC5A及TLR7途徑兩者，而DVLR1/CLEC5A-DV交互作用之封阻可使感染減活且不會阻止病毒之清除。然而，TLR7(或MyD88)受體之封阻會抑制促發炎性細胞激素以及病毒清除細胞激素兩者之分泌，其最後會阻止病毒清除以及感染。因此，登革熱病毒以及諸如日本腦脊髓炎病毒之其他黃病毒的有效治療需要減活對於DVLR1/CLEC5A之病毒結合，但不應減活對於TLR7或MyD88受體之病毒結合。因此，以抗-DVLR1/CLEC5A抗體封阻登革熱病毒之結合可提供一種療法對抗DHF/DSS病患體內之嚴重登革熱進展。

上述書面說明被認為足以使熟習本技術人士實施本發明。既然寄存之具體例僅係意欲例示說明本發明之某些態樣以及在功能上對等的任何構築體均在本發明之範圍內，本發明在範圍上不受寄存之雜交瘤所限。物質之寄存非表示承認本文之書面說明不足以實施本發明之任何態樣(包括其最佳方式)，亦不表示將申請專利範圍限於其所代表之特定例示說明例。事實上，本發明之各種修飾，除了本文所例示及說明者外，其餘亦為熟習本技術者所顯而易知以及落在附屬申請專利範圍之範圍內。

本專利或專利申請檔案含有至少一張以彩色製成之圖式。本專利或專利申請公開案(含彩色圖式)之影本將依請求及繳付必要費用後由智財局提供。本說明書揭露之上述特徵及目的將可在參照下列之敘述並結合附呈之圖式閱讀時更為明瞭，該等圖式中之類似參照數目代表類似之元件，且其中：

圖1A顯示藉由RT-PCR擴增，然後在0.8%瓊脂糖上分成各部分及藉由溴化乙錠染色而顯現之先天性免疫受體之DNA片段。圖1B為經表現之重組受體.Fc融合蛋白質在12%SDS-PAGE凝膠上之電泳圖譜。

圖2A顯示固定於膜上之生物素化GLPSF3與綴合有辣根過氧化酶(HRP)之鏈黴抗生物素接觸後之點漬圖。圖2B顯示固定於膜上之生物素化GLPS F3與樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1).Fc融合蛋白質接觸，繼而與綴合有HRP之山羊抗IgG1抗體一起培育後之點漬圖。圖2C顯示圖2B之吸漬圖之點密度分析。圖2D顯示競爭者β-葡聚糖對於樹狀細胞凝集素-1.Fc融合蛋白質與固定於膜之GLPS F3之結合之點密度之影響。圖2E顯示固定之GLPS F3與樹狀細胞凝集素-1：Fc融合蛋白質接觸，繼而於存在各種量之競爭者多醣體(β-葡聚糖、D-葡萄糖及D-半乳糖)下與綴合有HRP之山羊抗IgG1抗體一起培育後之點漬圖。

圖3顯示固定於膜之GLPS F3及GLPS F3C與27種不同的融合蛋白質接觸後之點漬之半定量分析，其中該等融合蛋白質各包含所列之先天性免疫受體之細胞外區域且該細胞外區域與IgG1 Fc偶合。

圖4A顯示用圖3所列之27種融合蛋白質偵測固定於膜之GLPS F3及GLPS F3C之點漬圖。圖4B顯示EDTA對於樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1).Fc、DC-SIGNR.Fc、KCR.Fc及TLT-2.Fc與固定於膜之GLPS F3之結合之影響。圖4C顯示用樹狀細胞凝集素-1(Dectin-1).Fc、DC-SIGNR.Fc、KCR.Fc及TLT-2.Fc融合蛋白質偵測固定於膜之β-葡聚糖之點漬圖。

圖5A顯示用樹狀細胞凝集素-1.Fc、DC-SIGNR.Fc、KCR.Fc及TLT-2.Fc融合蛋白質偵測多醣體樣品之點漬圖。圖5B顯示樣品編號之名稱及以半定量形式提供圖5A之點密度。

圖6A顯示包覆在微量滴定平皿上之生物素化GLPS-F3之量，其係使用過氧化酶-抗生物素蛋白綴合物檢定分析法測量及在OD 450 nm讀數，以檢測黃色反應產物。圖6B係以圖之方式描述各種受體.Fc融合蛋白質對固定於於微量平皿上之GLPS-F3之親和性。各受體.Fc融合蛋白質之絕對結合率記載在左側Y軸(以OD 450nm讀數表示)，以及右側Y軸記載與樹狀細胞凝集素-1.Fc之結合率相較下之相對結合率。

圖7係以圖說明在與為多醣體之甘露聚糖及β-葡聚糖，以及與為單醣之D-甘露糖(Man)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙醯基-葡萄糖胺(GlcNAc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc)、L-岩藻糖(Fuc)及唾液酸之競爭性檢定分析中，各種受體.Fc融合蛋白質與GLPS-F3之結合百分率。

圖8A係以圖說明在與人類IgG陰性對照組相較下，受體.Fc融合蛋白質與登革熱病毒之結合率。圖8B顯示登革熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白質及人類IgG陰性對照組之免疫複合物之西方轉漬圖，其中使用對抗登革熱病毒E蛋白質之抗體偵測。圖8C以圖顯示EDTA抑制登革熱病毒與DC-SIGN.Fc融合蛋白質之結合，但不會抑制登革熱病毒與DVLR1.Fc融合蛋白質之結合。圖8D顯示DVLR1.Fc融合蛋白質與用PNGaseF、二硫蘇糖醇(DTT)、熱或UV照射處理之登革熱病毒之結合率以及與未經處理之登革熱病毒(non)之結合率。

圖9A顯示DVLR1在各種免疫細胞類型中之表現，其藉由使用抗-DVLR1抗體之流動式細胞計量術測量。DVLR1之表現被示出，其中DVLR1之圖形輪廓(如虛線所示)與抗體同種型(isotype)對照組(陰影區)不相符。圖9B顯示DC-SIGN在各種免疫細胞類型中之表現，其藉由使用抗-DC-SIGN抗體之流式細胞計量術測量。DC-SIGN之表現被示出，其中DC-SIGN曲線(虛線)與抗體同種型對照組(陰影區)不相符。

圖10A顯示在與活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒(UV-DV)接觸之CD14+巨噬細胞中NS3蛋白質表現之流式細胞計量分析(其中使用抗-NS3抗體)結果，並與匹配之抗體同種型對照組(陰影區)比較。圖10B圖示在以不同感染重複數(multiplicities of infection，MOI)之登革熱病毒感染之CD14+巨噬細胞中或以經UV照射之登革熱病毒感染之CD14+巨噬細胞中，細胞外登革熱病毒滴度之經時變化。圖10C係說明在以不同感染重複數(MOI)登革熱病毒感染之CD14+巨噬細胞中全部DAP12及磷醯化DAP12之免疫轉漬圖。圖10D係說明用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒以MOI=5感染後，於不同時間在該等經登革熱病毒感染之CD14+巨噬細胞中所有DAP12及磷醯化DAP12之免疫轉漬圖。

圖11係例示說明用活登革熱病毒感染之前，藉由電穿孔導入pLL3.7載體(對照組)或DVLR1-shRNA之CD14+巨噬細胞中，所有DAP12及磷醯化DAP12之免疫轉漬圖。

圖12A顯示用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒以指定之MOI感染CD14+巨噬細胞後6小時，TNF-α之分泌。圖12B顯示用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒以指定之MOI感染CD14+巨噬細胞後12小時，TNF-α之分泌。圖12C顯示CD14+巨噬細胞感染後TNF-α分泌隨時程之測量值。

圖13A顯示在DC-SIGN-shRNA或DVLR1-shRNA、或者載體對照組(pWTSI及pLL3.7)轉染之CD14+巨噬細胞中，藉由西方轉漬測得之DC-SIGN及DVLR1之表現。圖13B顯示在用登革熱病毒染之前，藉由電穿孔導入DC-SIGN-shRNA、DVLR1-shRNA、或者pLL3.7載體對照組之CD14+巨噬細胞中，NS3表現之流動式細胞計量分析(使用抗-NS3抗體)。陰影區為NS3抗體之同種型對照組。圖13C係例示說明在用登革熱病毒感染之前(t=0)，藉由電穿孔導入DC-SIGN-shRNA、DVLR1-shRNA或載體對照組之CD14+巨噬細胞之上清液中病毒滴度之時程分析。

圖14A顯示用登革熱病毒感染之前(t=0)，藉由電穿孔導入DC-SIGN-shRNA、DVLR1-shRNA或載體對照組之CD14+巨噬細胞中各種細胞激素之之分泌之時程分析。圖14B顯示於相同條件下細胞激素IFN-α之時程分析。

圖15顯示由感染有登革熱病毒且用對抗DVLR1之指定單株抗體以指定濃度治療之CD14+巨噬細胞分泌入培養上清液中之TNF-α之ELISA測量值。

圖16a圖式說明各種受體.Fc融合蛋白對於登革熱病毒之結合。圖16b顯示登革熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白及一種人類IgG陰性控制組之免疫復合物的西方轉漬，以對抗登革熱病毒E蛋白之抗體探測。圖16c圖示由EDTA可抑制登革熱病毒對DC-SIGN.Fc融合蛋白之結合，但不會抑制對於DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結合。圖16d顯示藉由添加DC-SIGN.Fc及DLVR1/CLEC5A融合蛋白而產生登革熱病毒對人類293T細胞結合之增加。16e圖示各種糖之添加可抑制登革熱病毒對DC-SIGN.Fc融合蛋白之結合。16f圖示PNGaseF對於登革熱病毒對DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結合的效應。

圖17a說明DC-SIGN在人類PBMCs中之表現模式。圖17b說明DVLR1/CLEC5A在人類PBMCs中之表現模式。

圖18a顯示免疫轉漬，其說明使用針對磷醯酪胺酸及DAP12之抗體，測定人類巨噬細胞中之登革熱病毒誘導之DAP12磷醯化(2 h p.i.)。圖18b顯示免疫轉漬，其說明由登革熱病毒及經UV-失活之登革熱病毒誘導之DAP12磷醯化的動力學。圖18c顯示免疫轉漬，其說明shRNAs使DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN.Fc融合蛋白之表現下降(knock down)以及抑制登革熱病毒(m.o.i.=5)-媒介之DAP12磷醯化的能力。圖18d顯示shRNAs對於巨噬細胞中之登革熱病毒進入及複製的效應。圖18e顯示抗-DVLR1/CLEC5A mAb、抗-DC-SIGN mAb、及小鼠IgG對於非結構蛋白質NS3表現的效應。圖18f圖示說明shRNAs對於經感染巨噬細胞之登革熱病毒滴度的效應之時程檢定分析。

圖19a圖示說明巨噬細胞之登革熱病毒及經UV失活之登革熱病毒誘導性TNF-α分泌的劑量-依存性。圖19b說明登革熱病毒感染(m.o.i.=5)後之TNF-α表現的動力學。圖19圖示說明DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN shRNA對於TNF-α、IL-6、MIP1-α、IL-8、IP-10及INF-α自經登革熱病毒感染(m.o.i.=5)之巨噬細胞分泌的效應。在圖19d圖示說明以特異性shRNA對於登革熱病毒誘導性TNF-α及INF-α分泌之各種分泌途徑所進行之下降(knock down)實驗效應。圖19e圖示說明桔抗性抗-DVLR1/CLEC5A mAbs可抑制反應登革熱病毒血清型1-4之TNF-α分泌。使用M.R.mAb(抗-甘露糖受體mAb，mIgG1)及小鼠IgM(mIgM)作為陰性控制組。

圖20a說明經登革熱病毒、登革熱病毒/抗-E、及登革熱病毒/抗-prM免疫複合物感染之巨噬細胞的NS3表現。圖20b說明經DV2感染之巨噬細胞的TNF-α及INF-α分泌量。圖20c說明經抗-prM/登革熱病毒及抗-E/登革熱病毒免疫複合物感染之巨噬細胞的TNF-α及INF-α分泌量。

圖21a圖示說明HMEC-1單層之通透性以及上清液中之TNF-α含量的時程分析。圖21b圖示說明TNFR2.Fc及抗-DVLR1/CLEC5A對於內皮細胞單層通透化的抑制作用。

圖22a圖示說明登革熱病毒與人類及小鼠DVLR1/CLEC5A.Fc融合蛋白的結合親和力。圖22b顯示mDVLR1/CLEC5A在小鼠脾細胞中之表現。圖22c顯示mDVLR1/CLEC5A在小鼠骨髓(BM)-衍生性巨噬細胞及小鼠似巨噬細胞Raw264.7細胞系中之表現。

圖23a圖示說明由登革熱病毒與小鼠巨噬細胞細胞系Raw264.7及穩定表現人類DC-SIGN之Raw264.7細胞之結合所產生之TNF-α釋出比較。圖23b圖示說明在mAb之存在下使穩定表現人類DC-SIGN之Raw264.7細胞與DV2共同進行培育所產生之TNF-α分泌。圖23c圖示說明抗-DVLR1/CLEC5A mAbs(3D2H6及10D7H3)可以劑量-依存性之方式抑制DV2-誘導之TNF-α釋出。

圖24說明經DV2/PL046或DV2/NGC-N系挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。

圖25a說明對抗小鼠DVLR1/CLEC5A培育之mAb 3D2H6及10D7H3對於經登革熱病毒挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠的皮下及腸道出血之效應。圖25b說明對抗DVLR1/CLEC5A之mAb(3D2H6及10D7H3)對於經登革熱病毒挑戰之STAT1 ^{-/ -} 小鼠的血漿滲漏進入生命器官之效應。圖25c圖示說明藉著自器官萃取Evans藍顯示之生命器官血管通透性。圖25d說明於有及無抗-DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2.Fc存在下，經登革熱病毒挑戰之STAT1 ^-/- 小鼠之TNF-α及IP-10之血清含量以及病毒滴度。圖25e圖示說明在桔抗性抗-小鼠DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2.Fc存在下，經DV2挑戰之STAT1缺陷小鼠的存活。

圖26說明DVLR1/CLEC5A涉及JEV媒介之DAP12磷酸化作用及自人類巨噬細胞之TNF-α分泌。在圖26a中，分別以ELISA測定DVLR1/CLEC5A(1 μg)與JEV及登革熱病毒(DV)(5x10⁶ PFU)之交互作用。DV與人類DVLR1/CLEC5A(長度188胺基酸)具交互作用，但與可變剪接形式sDVLR1/CLEC5A(aa 43-65缺失)則否。相對的，JEV僅與sDVLR1/CLEC5A具交互作用，但與全長DVLR1/CLEC5A則否。在圖26b中，登革熱病毒可在人類巨噬細胞中誘導DAP12磷酸化作用(在2 h p.i.)。以抗-DAP12 mAb沈澱經DV感染之巨噬細胞中的DAP12，在SDS-PAGE分離後將其轉漬至硝基纖維素膜上，接著再與對抗磷醯酪胺酸及DAP12之抗體分別進行培育。JEV誘導之DAP12磷酸化作用(m.o.i.=5)由pLL3.7/DVLR1/CLEC5A抑制。在圖26c中，其顯示人類巨噬細胞反應JEV感染之TNF-α分泌的動力學(左)。JEV誘導之TNF-α分泌由pLL3.7/DVLR1/CLEC5A mAb抑制(右)。數據係以三次獨立試驗之平均值±s.d.表示。

<110> 中央研究院

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<210> 69

<211> 104

<212> PRT

<213> 人類

<400> 69

<210> 70

<211> 106

<212> PRT

<213> 人類

<400> 70

<210> 71

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類

<400> 71

<210> 72

<211> 187

<212> PRT

<213> 人類

<400> 72

<210> 73

<211> 164

<212> PRT

<213> 人類

<400> 73

Claims (7)

1. 一種經純化的抗登革熱病毒凝集素受體1/C-型凝集素5A(DVLR1/CLEC5A)單株抗體，其中該單株抗體包括選自由以下所組成之群組之序列組合：(i)序列編號：66之可變重鏈序列及序列編號：69之可變輕鏈序列之組合；(ii)序列編號：67之可變重鏈序列及序列編號：70之可變輕鏈序列之組合；及(iii)序列編號：68之可變重鏈序列及序列編號：71之可變輕鏈序列之組合。
2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該單株抗體包括(i)序列編號：66之可變重鏈序列及序列編號：69之可變輕鏈序列之組合。
3. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該單株抗體包括(ii)序列編號：67之可變重鏈序列及序列編號：70之可變輕鏈序列之組合。
4. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該單株抗體包括(iii)序列編號：68之可變重鏈序列及序列編號：71之可變輕鏈序列之組合。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之單株抗體，其中該單株抗體為人類化抗體。
6. 如申請專利範圍第5項之單株抗體，其中該單株抗體可用於抑制受登革熱病毒病毒感染之巨噬細胞之促發炎性細胞激素的分泌。
7. 如申請專利範圍第6項之單株抗體，其中該促發炎性細胞激素包含TNF-α。