TWI403582B - 促使神經幹細胞增生及／或分化的培養基 - Google Patents
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Description
本發明關於一種培養基，尤指一種促使神經幹細胞增生及/或分化的培養基。
維持細胞(cell maintenance)不僅是實驗室的基礎工作，在某些特定領域中，如幹細胞研究，其更是科學上亟需突破的研究重點。細胞培養基一般係指提供物理性支持及/或養分支持以維持細胞的物質，這一類的物質多數為液態或是半固態(凝膠)。目前實驗室常用的細胞培養基包括DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI培養基或Eagle’s培養基等。隨著研究成果的累積，細胞培養基的發展可分為兩大類：維持細胞存活及促進細胞生長的培養基以及促進細胞分化的培養基，其成分與配方隨著研究經驗的累積而有了越來越多的嘗試。
胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)是細胞培養基中常用的成分，其主要功用為提供細胞養分。此外，研究指出在沒有胎牛血清的狀況下，將無法建立胚幹細胞株，顯見胎牛血清於幹細胞研究中促使幹細胞增生的重要性；然而，同時，研究亦顯示胎牛血清促進神經幹細胞分化的特質。換言之，胎牛血清可能同時富含各式促進增生及/或分化的生長因子。由於胎牛血清具有複雜的成分組成，再加上存在批次差異，使得使用胎牛血清來調控幹細胞增生或分化變得困難。有鑑於此，科學界開始研發各種不同的無血清培養基系統，例如，在培養基中加入不同的生長因子(growth factor)以製造出一個合適於增生或分化目的的微環境。這樣的培養基系統由於添加的成分較為單純且明確，因此較易於調控環境及維持實驗再現性。然而，這些生長因子價格不斐，反而大幅度增加實驗預算，並不理想。
綜上所述，發展一種易於調控神經幹/前驅細胞增生及/或分化且價格低廉的培養基確有其必要性。
爰是，本發明之一目的為提供一種培養基，其具有易於調控神經幹/前驅細胞增生或分化的優點。
本發明之又一目的為提供一種用於培養神經幹/前驅細胞的培養基，其減少習用昂貴之生長因子的使用，而具有降低實驗成本的優點。
為達到上述目的，本發明提供一種促使神經幹細胞及/或神經前驅細胞增生的培養基，其包含：0.1~99.9%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；及0.1~99.9%(v/v)的胎牛血清衍生物(FBS-derived substance，簡稱FDS)，其係由胎牛血清中分子量≦100 kDa的成分所組成。
較佳地，前述基礎培養基為DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基或Eagle’s培養基。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量在50~100 kDa的成分所組成。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量≦50 kDa的成分所組成。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量在3~50 kDa的成分所組成。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量≦3kDa的成分所組成。
較佳地，前述培養基進一步包含0.1~20 ng/mL的生長因子。
較佳地，前述生長因子為酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、上皮細胞生長因子、血管內皮生長因子或其組合。
較佳地，前述無血清營養添加劑係為N2營養添加劑(N2 supplement)、B27營養添加劑(B27 supplement)或其組合。
本發明更提供一種促使神經幹細胞及/或神經前驅細胞分化的培養基，其包含：0.1~99.9%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；0.1~99.9%(v/v)的胎牛血清衍生物，其係為胎牛血清中分子量≦100 kDa的成分所組成；及0.1~20 ng/mL的生長因子。
較佳地，前述基礎培養基為DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基或Eagle’s培養基。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量在50~100 kDa的成分所組成。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量≦50 kDa的成分所組成。
較佳地，前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量在3~50 kDa的成分所組成。
較佳地，前述生長因子為酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、鹼性成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、血管內皮生長因子或其組合。
較佳地，前述無血清營養添加劑係為N2營養添加劑、B27營養添加劑或其組合。
綜上所述，本發明關於一種用於促使神經幹細胞及/或神經前驅細胞的培養基。在本發明的配方中，藉著使用胎牛血清中具適當分子量的成分，以避免胎牛血清中複雜組成造成不易控制前述細胞增生或分化的缺點，同時，並可減少使用價格昂貴的生長因子，而具有節省實驗成本的優點。
本發明關於一種利用離心分離技術，以自胎牛血清的複雜組成成分中分離出不同分子量的成分，並進而測試該不同分子量的成分以了解其促進神經幹細胞及/或神經前驅細胞之增生或分化的能力。
所謂「神經幹細胞(neural stem cell)」係指一群具自我更新(self-renewal)能力而可不斷增生、同時具多元分化潛力(multipotent)而可分化為多種特異之神經細胞的細胞。部分科學家亦將神經幹細胞稱作神經前驅細胞(neural precursor cell)，但部分科學家則將神經前驅細胞定義為分化能力較神經幹細胞而言進一步地減少(換言之，已經部分特異化)，但仍保有多元分化能力的細胞。為便於敘述，與本發明之說明書中所提到之神經幹細胞即包括神經幹細胞、神經前驅細胞或其組合。
本發明所述之「增生(proliferation)」意旨一細胞群體在發育過程中，整體細胞數量增加但細胞之間不產生穩定差異的過程。
本發明所述之「分化(differentiation)」意旨一細胞群體在發育過程中，細胞之間產生穩定差異的過程。
本發明所述之「基礎培養基」係指一般實驗室常規用於維持細胞的培養基；更明確地，係指一般實驗室常規用於增生神經幹/前驅細胞及/或誘導神經幹/前驅細胞分化的培養基，包括，但不限於DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI 1640培養基或Eagle’s培養基。前述培養基所含成分屬於已習知之知識，舉例來說，前述DMEM/F12培養基的成分為8 mM葡萄糖、麩醯胺酸(glutamine)、20 mM碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)和15 mM HEPES。
本發明所述之「無血清營養添加劑(serum-free supplement)」係指用於促進神經幹/前驅細胞生長且不含血清的營養添加劑。於所屬領域中常用的無血清營養添加劑包括，但不限於：N2營養添加劑(N2 supplement)。前述N2營養添加劑所含成分屬於已習知之知識，例如，包含25 μg/mL的胰島素、100 μg/mL的人類原運鐵蛋白(human apotransferri)、20 nM的黃體酮(progesterone)和30nM的亞硒酸鈉(sodium selenite)。
本發明所述之「生長因子(growth factor)」係指習知有利於神經幹/前驅細胞生長的因子，包括，但不限於：酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)或其組合。
本發明的一個實施態樣係一種用於促使神經幹細胞及/或神經前驅細胞增生的培養基，其包含：0.1~99.9%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；及0.1~99.9%(v/v)的胎牛血清衍生物；較佳地，包含10~90%(v/v)的前述基礎培養基及10~90%(v/v)的前述胎牛血清衍生物；更佳地，包含20~80%(v/v)的前述基礎培養基及20~80%(v/v)的前述胎牛血清衍生物。
前述胎牛血清衍生物(FBS-derived substance，簡稱FDS)係由胎牛血清中分子量≦100 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量在50~100 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量≦50 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量在3~50 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量≦3 kDa的成分所組成。
本發明的另一個實施態樣係一種促使神經幹細胞及/或神經前驅細胞分化的培養基，其包含：0.1~99.9%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；0.1~99.9%(v/v)的胎牛血清衍生物；及0.1~20 ng/mL的生長因子；較佳地，包含10~90%(v/v)的前述基礎培養基、10~90%(v/v)的前述胎牛血清衍生物及0.1~10 ng/mL的生長因子；更佳地，包含20~80%(v/v)的前述基礎培養基、20~80%(v/v)的前述胎牛血清衍生物及0.1~5 ng/mL的生長因子。
前述胎牛血清衍生物係由胎牛血清中分子量≦100 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量在50~100 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量≦50 kDa的成分所組成；可行地，係由胎牛血清中分子量在3~50 kDa的成分所組成。
簡單來說，前述胎牛血清衍生物的取得包含以下步驟：取得一市場可取得之胎牛血清，進行熱失活步驟(heat-inactivation)後備用。然後取得一具篩選功能的離心管(Ultra,Millipore,MA)，使用0.1N NaOH去除掉離心管中的甘油(glycerine)後，再以70%的酒精滅菌。接著將前述胎牛血清置入前述離心管，調整適當的離心條件，以取得所需之胎牛血清中分子量為≦100 kDa、50~100 kDa、≦50 kDa、3~50 kDa或 ≦3 kDa的成分。前述離心條件無須限制，依據所欲分離之成分的分子量，所屬領域具有通常知識者當可視其使用的設備規劃出合適的離心條件。
以下實施例係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制本發明之申請專利範圍。
本實施例中所使用的培養基包含90%(v/v)的DMEM/F12培養液(含N2營養添加劑)為基礎培養液，以及10%(v/v)的≦100 kDa、50~100 kDa、≦50 kDa、3~50 kDa或≦3 kDa之胎牛血清衍生物(FDS)。將所製得的培養基用於培養神經幹細胞，並觀察細胞的增生情況。
請參下表一，為本實施例的各個培養基成分：
培養中未分化的神經幹細胞會漂浮並彼此聚集於培養基中，又稱神經幹細胞球。觀察第一圖~第六圖可知本實施例中培養的神經幹細胞皆維持於未分化狀態。再比較第二圖(FDS 100組)、第三圖(FDS 50-100組)、第四圖(FDS 50組)、第五圖(FDS 3-50組)和第六圖(FDS 3組)與第一圖(控制組)中的細胞數量可知，FDS 100組、FDS 50-100組和FDS 50組中的細胞數量較控制組中的細胞數量略為增加，而FDS 3-50組和FDS 3組的細胞數量則顯著較控制組的細胞數量來得多。
綜合上述圖式可知，本實施例各培養基配方具有促使神經幹細胞增生的效果，其中又以含有3~50 kDa或≦3 kDa之胎牛血清衍生物的組別最為顯著。
於本實施例中所使用的培養基包含90%(v/v)的DMEM/F12培養液(含N2營養添加劑及20 ng/mL的bFGF)為基礎培養液，以及10%(v/v)的≦100 kDa、50~100 kDa、≦50 kDa、3~50 kDa或≦3 kDa之胎牛血清衍生物(FDS)。將所製得的培養基用於培養神經幹細胞，並觀察細胞的分化情況。
請參下表二，為本實施例的各個培養基成分：
培養中開始分化的神經幹細胞會貼附於培養盤的底部，並呈現突出的細胞型態。首先參第七圖，由圖中可知，本實施例控制組的培養基雖然含有bFGF，但未能促使神經幹細胞分化。在分別比較第八圖(FDS 100組)、第九圖(FDS 50-100組)、第十圖(FDS 50組)、第十一圖(FDS 3-50組)和第十二圖(FDS 3組)與第七圖中所顯示的細胞型態。FDS 3組中的細胞仍呈現懸浮及未貼附的狀態，顯示≦3 kDa之胎牛血清衍生物並不能促使神經幹細胞分化。從第九~十一圖可知，FDS 50-100組、FDS 50組和FDS 3-50組的細胞都已貼附並開始呈現突出的細胞型態，顯示分化的進行。分化的情況最為顯著的是FDS 100組，圖中細胞已貼附並具有大量延伸的突出細胞型態。
接著，再以免疫螢光染色法(immunofluorescence labeling method)標定本實施例之FDS 100組的細胞中的神經元(Neuron)和星狀細胞(Astrocytes)，並使用螢光顯微鏡觀測。簡單地說，於星狀細胞的免疫螢光染色中，使用的一級抗體為：抗神經膠質酸性蛋白(anti-Glial Fibrillary Acidic Protein，簡稱GFAP，廠牌：Millipore，型號：AB5804)；使用的二級抗體為：螢光黃結合親合性純化二級抗體(Fluorescein conjugated affinity purified secondary antibody，廠牌：chemicon，型號：AP182F)。於神經元的免疫螢光染色中，使用的一級抗體為：抗微小管結合蛋白(anti-Microtubule-Associated Protein 2，簡稱MAP2，廠牌：Millipore，型號：MAB3418)；使用的二級抗體為：若丹明結合親合性純化二級抗體(Rhodamine conjugated affinity purified secondary antibody，廠牌：chemicon，型號：AP181R)。
請參第十三圖和第十四圖，並配合此兩圖之對應彩色圖式(參附件)，圖中紫色的亮點係標示細胞核的位置；紅色的區域(第十三圖)係標示由神經幹細胞分化而得之神經元；綠色的區域(第十四圖)係標示由神經幹細胞分化而得之星狀細胞。由圖中可知，FDS 100組中培養的神經幹細胞已經分化為神經元和星狀細胞，並且，所分化得到的神經元和星狀細胞的比例約略相同。
綜合上述圖式可知，本實施例中含有≦100 kDa、50~100 kDa、≦50 kDa或3~50 kDa之胎牛血清衍生物及鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的培養基具有促使神經幹細胞分化的效果，其中又以含有≦100 kDa之胎牛血清衍生物及鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的組別最為顯著。
結合實施例一和實施例二所得數據，比較第二圖、第六圖、第八圖和第十二圖，意味著胎牛血清中分子量≦3 kDa的成分中可能含有顯著促使神經幹細胞增生，甚至可能是會抑制分化的物質。而在3~100 kDa的分子量之間，以及其中越往100 kDa之分子量較大的成分，則含有較顯著促使神經幹細胞分化的物質。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。
第一圖係顯示實施例一中控制組的細胞。
第二圖係顯示實施例一中FDS 100組的細胞。
第三圖係顯示實施例一中FDS 50-100組的細胞。
第四圖係顯示實施例一中FDS 50組的細胞。
第五圖係顯示實施例一中FDS 3-50組的細胞。
第六圖係顯示實施例一中FDS 3組的細胞。
第七圖係顯示實施例二中控制組的細胞。
第八圖係顯示實施例二中FDS 100組的細胞。
第九圖係顯示實施例二中FDS 50-100組的細胞。
第十圖係顯示實施例二中FDS 50組的細胞。
第十一圖係顯示實施例二中FDS 3-50組的細胞。
第十二圖係顯示實施例二中FDS 3組的細胞。
第十三圖係一螢光顯微鏡影像，其顯示實施例二之FDS 100組中的神經元。
第十四圖係一螢光顯微鏡影像，其顯示實施例二之FDS 100組中的星狀細胞。
Claims (10)
- 一種促使神經幹細胞增生的培養基，其包含：10~90%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；及10~90%(v/v)的胎牛血清衍生物，其係由胎牛血清中分子量≦3 kDa的成分所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中前述基礎培養基為DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基或Eagle’s培養基。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其進一步包含0.1~20 ng/mL的生長因子。
- 如申請專利範圍第3項所述之培養基，其中前述生長因子為酸性成纖維細胞生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、血管內皮生長因子或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基，其中前述無血清營養添加劑係為N2營養添加劑、B27營養添加劑或其組合。。
- 一種促使神經幹細胞分化的培養基，其包含：10~90%(v/v)的基礎培養基，其含有一無血清營養添加劑；10~90%(v/v)的胎牛血清衍生物，其係為胎牛血清中分子量>3~100 kDa的成分所組成；及0.1~20 ng/mL的生長因子。
- 如申請專利範圍第6項所述之培養基，其中前述基礎培養基為DMEM培養基、DMEM/F12培養基、RPMI1640培養基或Eagle’s培養基。
- 如申請專利範圍第6項所述之培養基，其中前述胎牛 血清衍生物係由胎牛血清中分子量在50~100 kDa的成分所組成。
- 如申請專利範圍第6項所述之培養基，其中前述生長因子為酸性成纖維細胞生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、上皮細胞生長因子、血管內皮生長因子或其組合。
- 如申請專利範圍第6項所述之培養基，其中前述無血清營養添加劑係為N2營養添加劑、B27營養添加劑或其組合。
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| CN1435187A (zh) * | 2002-02-01 | 2003-08-13 | 北京科宇联合干细胞生物技术有限公司 | 一种神经干细胞制剂、其制备方法及其用途 |
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