TWI389892B - 愛拉斯汀（ｅｒａｓｔｉｎ）和愛拉斯汀結合蛋白質，及其用途 - Google Patents

愛拉斯汀（ｅｒａｓｔｉｎ）和愛拉斯汀結合蛋白質，及其用途 Download PDF

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Rechenberg Moritz Von
Yuejun Zhen
Raj Gopal Venkat
Longwu Qi
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Description

愛拉斯汀(erastin)和愛拉斯汀結合蛋白質，及其用途 政府資金
本文所描述的內容係全部或部分由國家癌症協會補助金(National Cancer Institute Grant 1R01CA97061－01)所資助。美國政府對於本發明有一定程度的權利。
本發明係關於用愛拉斯汀及相關的化合物或衍生物之試劑和方法來有效殺死癌細胞。本發明也關於篩選愛拉斯汀之結合搭檔的方法。
許多用來治療疾病的藥物是著眼於罹病細胞和正常細胞之間的一般差異。例如用來治療卵巢癌及乳癌並抑制微管功能的太平洋紫杉醇(paclitaxel)，就被認為展現了腫瘤細胞專一性，其係基於腫瘤細胞與正常細胞相較有較快的增生速度(Miller與Ojima,Chem.Rec. 1：195－211,2002)。然而，儘管有這一致的看法，但是對於不同的腫瘤細胞系，太平洋紫杉醇的試管內 活性卻差異很大(Weinstein等人,Science 275：343－349,1997)，顯示基因因素可改變腫瘤細胞對太平洋紫杉醇的敏感性，還有，腫瘤細胞的反應性不是單純由其增生速度來決定的。
分子標靶療法代表了一種抗癌藥物發現之有前景的新方法(Shawver等人,Cancer Cell 1：117－23,2002)。使用這個方法，小分子被設計來直接抑制在特定腫瘤細胞種類中突變或過度表現的致癌蛋白質。藉由將腫瘤細胞中所發現的特定分子缺陷作為標的，這個方法最終會產生為各個腫瘤基因構成所量身訂做的療法。兩個最近成功的分子標靶抗腫瘤療法是基利克(甲磺酸伊馬替尼)(Gleevec(imatinib mesylate))，其是一種在費城染色體－陽性慢性骨髓性白血病中發現的斷裂點叢集區－阿貝爾森激酶(BCR－ABL)癌蛋白質的抑制劑(Capdeville等人,Nat Rev Drug Discov 1：493－502,2002)，以及賀癌平(曲妥珠單抗)(Herceptin(trastuzumab))，是一種以在轉移性乳癌中所發現的HER2/NEU癌蛋白質為標的的單株抗體(Mokbel與Hassanally,Curr Med Res Opin 17：51－9,2001)。
有一種涉及搜尋基因型－選擇性之抗腫瘤劑的互補策略，該抗腫瘤劑只有在特定癌蛋白質存在下或沒有特定腫瘤抑制劑存在下會對腫瘤細胞有致命性。這種基因型－選擇性化合物可能會直接以癌蛋白質為標的或可能以牽涉與癌蛋白質相關聯之訊息網絡系統之其他關鍵性蛋白質為標的。已被報導有合成致命性的化合物包括(i)在缺乏PTEN的骨髓瘤細胞中的雷帕黴素(rapamycin)相似物CCI－779(Shi等人,Cancer Res 62：5027－34,2002)、(ii)在經BCR－ABL轉型之細胞中的基利克(Druker等人,Nat Med 2：561－6,1996)以及(iii)許多較未被詳加定性的的化合物(Stockwell等人,Chem Biol 6：71－83,1999；Torrance等人,Nat Biotechnol 19：940－5,2001)。
雖然有上述的研究，但對於發展及/或鑑認可選擇性地以腫瘤細胞為標的的化合物仍有強烈的需求。
 發明簡述
使用一種合成致命性的篩選方法，尤其是一種合成的致命性高效篩選方法，該方法對於鑑認治療或防止症狀或疾病(例如腫瘤或其他特徵在於細胞過度增生的症狀(例如 白血病)的出現或發展)之藥劑或藥物是有助益的，申請人已鑑認出一些有益於治療或防止個體(諸如需要治療或防止的人類)癌症(例如 腫瘤或白血病)的化合物/藥劑/藥物。本發明也提供了可直接或間接結合一些經鑑認之醫療價值之化合物/藥劑的細胞蛋白質。這些細胞蛋白質提供了治療特徵在於細胞過度增生(例如 白血病)之疾病或症狀的額外方法。
在本文中，術語「藥劑」以及「藥物」是交替使用的；他們可以是化合物或分子。
在一方面，本發明是鑑認候選抗腫瘤藥劑的方法，該方法包括步驟：a)在適合的條件下將細胞與足量的試驗藥劑接觸；以及b)測定該試驗藥劑是否增加了或抑制了愛拉斯汀結合蛋白質或編碼有愛拉斯汀結合蛋白質之核酸的含量。
該方法可進一步包括步驟：a)將試驗藥劑與腫瘤細胞接觸(試管內 或體內 )；以及b)測定該試驗藥劑是否抑制該腫瘤細胞的生長。
在另一方面，本發明是鑑認候選抗腫瘤藥劑的方法，該方法包括：a)將愛拉斯汀結合蛋白質或表現愛拉斯汀結合蛋白質的細胞與試驗藥劑接觸，其中該愛拉斯汀結合蛋白質或該試驗藥劑是視需要的被可偵測到的標識物所標記；以及b)測定該試驗藥劑是否結合至該愛拉斯汀結合蛋白質。
該方法可進一步包括：a)將試驗藥劑與腫瘤細胞接觸(體內 或試管內 )；以及b)測定該試驗藥劑是否抑制腫瘤細胞的生長。
上述兩方法可使用許多不同的試驗藥劑來重複之。
在進一步方面，本發明係關於鑑認會殺死或抑制致腫瘤細胞生長的化合物之篩選方法，該致腫瘤細胞係例如經基因改造的致腫瘤細胞，但不是其同源正常細胞的對應物。該方法已被用於鑑認已知的和新穎的具有基因型選擇性活性的化合物，包括已知的化合物多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜樹鹼(camptothecin)、桑吉瓦黴素(sangivamycin)、棘黴素(echinomycin)、波瓦汀(bouvardin)、NSC146109以及本文所提及的新穎化合物愛拉斯汀。這些化合物通常在一或更多種如下者存在時有增加的活性：hTERT癌蛋白質、SV40大T癌蛋白質(LT)、小T癌蛋白質(ST)、人類乳突狀病毒第16型(HPV)E6癌蛋白質、HPV E7癌蛋白質、以及致癌HRAS、NRAS和KRAS。申請人確定了hTERT和E7或LT之一的過度表現會增加拓撲異構酶2a的表現以及在表現hTERT的細胞中過度表現RASV 1 2 和ST兩者會增加拓撲異構酶1的表現並使細胞對愛拉斯汀所啟動的非凋亡細胞死亡程序敏感化。
本發明係關於鑑認對致腫瘤細胞有選擇性毒性(例如殺死 或抑制其生長)之藥劑(例如 藥物)的方法，該致腫瘤細胞例如經基因改造的致腫瘤細胞，包括人類致腫瘤細胞(例如 經基因改造的人類致腫瘤細胞及/或腫瘤細胞)。在一具體實例中，本發明係關於鑑認藥劑(例如 藥物)的方法，該藥劑會選擇性殺死或抑制經基因改造之人類致腫瘤細胞的生長(對其有毒)，該方法包含將試驗細胞(係經基因改造的人類致腫瘤細胞)與候選藥劑接觸；測定與候選藥劑接觸之試驗細胞的存活性；以及將試驗細胞的存活性與適當控制組的存活性相比較。在所有的具體實例中，存活性是評估來藉以測定藥劑(例如 藥物)殺死細胞或抑制細胞生長/增生、或兩者之能力的。如果試驗細胞的存活性比控制組細胞的存活性小，則會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性(殺死或抑制其生長)的藥劑(例如 藥物)就被鑑認出來了。適當的控制組細胞是與試驗細胞相同種類的細胞，但是該控制組細胞沒有被基因改造成為致腫瘤的。例如，控制組細胞可以是試驗細胞所衍生自的親代原代細胞。控制組細胞是在和試驗細胞相同的條件下與候選藥劑接觸的。過當的控制組可以是同時進行的，或可以是預先建立好的(例如預先建立好的 標準品或參考組)。
在一具體實例中，鑑認能選擇性地對致腫瘤細胞有毒的藥劑之方法包含進一步評估藥劑的毒性，該藥劑係在適當的動物模式或在其他細胞為基或非細胞為基的系統或試驗中篩選經基因改造的人類致腫瘤細胞而被鑑認出的。例如，可以評估如此被鑑認之藥劑或藥物對於腫瘤細胞(諸如從個體獲得之腫瘤細胞或白血病細胞)的毒性，或對於(一或更多種)癌症(腫瘤)細胞系的毒性。例如，該方法可包含進一步在適當的小鼠模式或非人類靈長類中評估藥劑(例如 藥物)對致腫瘤細胞的選擇性毒性。本發明進一步係關於製造由本發明方法所鑑認之藥劑(例如 藥物)的方法，例如會對經基因改造的人類致腫瘤細胞有選擇性毒性的藥劑(例如 藥物)。顯示會對致腫瘤細胞有選擇性毒性的藥劑(例如 藥物)是用已知的方法合成的。
本發明額外係關於鑑認藥劑(例如 藥物)的方法，該藥劑係對經基因改造的致腫瘤細胞(諸如經基因改造的人類致腫瘤細胞)有毒性的。在一具體實例中，本發明係關於鑑認會殺死或抑制經基因改造的人類致腫瘤細胞生長(對其有毒性)的藥劑(例如 藥物)的方法，該方法包含將試驗細胞(經基因改造的人類致腫瘤細胞)與候選藥劑接觸；測定與候選藥劑接觸之試驗細胞的存活性；以及將試驗細胞的存活性與適當控制組的存活性相比較。如果該試驗細胞的存活性小於控制組細胞存活性，則對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性(殺死或抑制其生長)之藥劑(例如 藥物)就被鑑認出來了。在此，適當的控制組細胞是與試驗細胞相同種類的細胞(例如 經基因改造的人類致腫瘤細胞)，但是該控制組細胞沒有與候選藥劑接觸。適當的控制組可以是同時進行的，或可以是預先建立好的(例如預先建立好的 標準品或參考組)。例如，可以評估如此被鑑認之藥劑或藥物對腫瘤細胞(諸如從個體得到之腫瘤細胞或白血病細胞)的毒性，或其對於(一或更多種)癌症(腫瘤)細胞系的毒性。
在一具體實例中，鑑認對經基因改造的致腫瘤細胞有毒性之藥劑的方法包含進一步評估藥劑的毒性，該藥劑係在適當的動物模式或在其他細胞為基或非細胞為基的系統或試驗中篩選經基因改造的人類致腫瘤細胞而被鑑認出的。例如，該方法可包含進一步在適當的小鼠模式或非人類靈長類中評估藥劑(例如 藥物)對致腫瘤細胞的毒性。本發明進一步係關於製造由本發明方法所鑑認之藥劑(例如 藥物)的方法，例如會對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性的藥劑(例如 藥物)。顯示會對致腫瘤細胞有毒性的藥劑(例如 藥物)是用已知的方法合成的。
在另一具體實例中，本發明是減少腫瘤生長速度的方法，該方法包含給藥足夠降低腫瘤生長速度之量的醫療藥劑，其中該醫療藥劑是：(a)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；(b)增加或抑制VDAC蛋白質活性的藥劑；(c)結合至VDAC蛋白質的藥劑；(d)結合及/或調節蛋白質複合物的藥劑，該複合物含有至少一個VDAC及視需要一或更多個其他蛋白質；(e)含有VDAC多肽或其功能性變異物的藥劑；或(f)含有編碼有VDAC多肽或其功能性變異物之核酸的藥劑。
適合的藥劑以在所存在的形式下或完全或部分代謝之後可具有所述的活性。
在一方面，本發明是治療罹患癌症之患者的方法，該方法含有給藥給患者選自下列之醫療藥劑：(a)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；(b)增加或抑制VDAC蛋白質活性的藥劑；(c)結合至VDAC蛋白質的藥劑；(d)結合及/或調節蛋白質複合物的藥劑，該複合物含有至少一個VDAC及視需要一或更多個其他蛋白質；(e)含有VDAC多肽或其功能性變異物的藥劑；以及(f)含有編碼有VDAC多肽或其功能性變異物之核酸的藥劑。
適合的藥劑以在所存在的形式下或完全或部分代謝之後可具有所述的活性。
適合用於降低腫瘤生長速度以及治療罹患癌症之患者的藥劑包括(但不限於)小的有機分子、肽類、蛋白質、類肽(peptidomimetic)、核酸、抗體及其組合。這些藥劑典型的是與醫藥上可接受的載劑調配在一起的，且可以藉由靜脈、口服、頰、非經腸胃、藉由吸入噴霧劑、藉由局部施用或經皮膚給藥。藥劑也可以藉由局部施用來給藥。藥劑可額外與至少一種抑制腫瘤細胞之其他抗腫瘤化療藥劑合併給藥，其等之作用係呈加成或協同的方式。
在另一方面，本發明是增加腫瘤細胞對化療藥劑敏感性的方法，其中腫瘤細胞是與增加或降低愛拉斯汀結合蛋白質含量之化合物接觸。在一相關的方面，本發明是降低正常細胞對化療藥劑敏感性的方法，其中正常細胞是與降低或增加愛拉斯汀結合蛋白質含量之化合物接觸。
在本發明的一些具體實例中，候選藥劑的鑑認是藉由篩選經註解的化合物資料庫、組合的資料庫、或其他包含未已知或已知化合物(例如 藥劑、藥物)或兩者的資料庫。
在一些具體實例中，本發明是鑑認用於抑制不想要之細胞增生的候選醫療藥劑的方法，該方法包括：a)將試驗藥劑與VDAC蛋白質或含有至少一個VDAC蛋白質及視需要一或更多個其他蛋白質的蛋白質複合物混合；b)測定該試驗藥劑是否結合至該VDAC蛋白質；以及c)如果該試驗藥劑結合至該VDAC蛋白質，將試驗藥劑與細胞接觸(體內 或試管內 )並測定該試驗藥劑是否改變了細胞增生。
該VDAC蛋白質與該試驗藥劑的結合可以藉由(例如)物理性結合分析而偵測之，諸如免疫結合分析、酵母菌二雜交分析、螢光偏振分析、表面電漿共振或螢光共振能量轉移(FRET)分析。
在一些具體實例中，本發明係關於化合物愛拉斯汀以及一群愛拉斯汀相關的化合物(例如本發明的化合物)。
在額外的具體實例中，本發明係關於化合物愛拉斯汀B以及其相關的化合物。
在額外的具體實例中，本發明係關於化合物愛拉斯汀A以及其相關的化合物。
在本發明進一步的具體實例中，本發明係關於愛拉斯汀的相似物，該相似物會選擇性地殺死或抑制經基因改造的人類致腫瘤細胞的生長(對其有毒性)。視需要的，這些本發明的化合物是與醫藥上可接受的載劑調配在一起成為醫藥上組成物的。
本發明進一步係關於鑑認涉及致腫瘤之細胞成分的方法。細胞成分包括例如蛋白質(例如 酵素、受體)、核酸(例如 DNA、RNA)、以及脂質(例如 磷脂質)。在一具體實例中，本發明係關於鑑認涉及致腫瘤之(一或更多種)細胞成分的方法，其中(a)細胞(諸如經基因改造的人類致腫瘤細胞)是與愛拉斯汀接觸；以及(b)與愛拉斯汀直接或間接互相作用的細胞成分被鑑認出來。被鑑認出來的細胞成分是涉及致腫瘤之細胞成分。在額外的具體實例中，本發明係關於鑑認與愛拉斯汀互相作用之(一或更多種)細胞成分的方法，其中(a)細胞(諸如經基因改造的人類致腫瘤細胞、組織、器官、有機體或溶解物或上述之一的萃取物)是與愛拉斯汀接觸的；以及(b)與愛拉斯汀直接或間接互相作用的細胞成分被鑑認出來。被鑑認出來的細胞成分是與愛拉斯汀直接或間接互相作用的細胞成分。
本發明額外係關於治療或防止癌症的方法。在一具體實例中，本發明係關於治療或防止癌症的方法，其中醫療上有效量的化合物諸如(例如)愛拉斯汀或其相似物、或下式I－V的化合物是被給藥至需要治療癌症的個體中。在一些具體實例中，該癌症的特徵在於細胞的RAS路徑是活化的。在一些進一步的具體實例中，該癌症的特徵在於細胞表現了SV40小T癌蛋白質，或表型相似於表現ST、及/或致癌HRAS細胞。在一些較佳的具體實例中，該細胞表現了實質上野生型的Rb含量(例如 至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、或150%等等)。
本發明也關於鑑認與一或更多種細胞成分互相作用之藥劑(例如 藥物)的方法，該細胞成分係與愛拉斯汀直接或間接互相作用者。在一具體實例中，本發明係關於鑑認與細胞成分互相作用之藥劑的方法，其中該細胞成分係與愛拉斯汀互相作用，該方法包含(a)將細胞、組織、器官、有機體或溶解物或上述之一的萃取物與愛拉斯汀接觸；(b)鑑認與愛拉斯汀(直接或間接)互相作用的細胞成分；(c)將細胞、組織、器官、有機體或溶解物或上述之一的萃取物與候選藥劑接觸，其中該候選藥劑是被評估與細胞成分互相作用之能力的藥劑或藥物，該細胞成分係與愛拉斯汀互相作用者；以及(d)測定該藥劑是否(直接或間接)與(b)中的細胞成分互相作用。如果該藥劑與(b)中的細胞成分互相作用，則該藥劑是會與愛拉斯汀互相作用之細胞成分互相作用的藥劑。
在一相關的方面，本發明也關於鑑認會與一或更多種細胞成分互相作用之藥劑(例如 藥物)的方法，其中該些細胞成分是已知會直接或間接與愛拉斯汀互相作用者，該方法包含：(a)將細胞、組織、器官、有機體或溶解物或上述之一的萃取物與候選藥劑接觸，其中該候選藥劑是被評估與細胞成分互相作用之能力的藥劑或藥物，該細胞成分係已知會與愛拉斯汀互相作用者；以及(b)測定該藥劑是否(直接或間接)與(a)中的細胞成分互相作用。如果該藥劑與(a)中的細胞成分互相作用，則該藥劑就是會與愛拉斯汀互相作用之細胞成分互相作用的藥劑。
在一些具體實例中，細胞是經基因改造的人類致腫瘤細胞。在進一步的具體實例中，本發明係關於會直接或間接與(一或更多種)細胞成分互相作用的化合物，其中該些細胞成分是會與愛拉斯汀互相作用的。在一些具體實例中，與愛拉斯汀會互相作用的細胞成分涉及了致腫瘤作用。顯示能與細胞成分互相作用的藥劑(例如 藥物)是使用已知的方法合成的，其中該細胞成分是會與愛拉斯汀互相作用者。
本發明進一步係關於鑑認會誘發腫瘤細胞死亡(諸如藉由凋亡(apoptotic)或非凋亡機制)之藥劑(例如 藥物)的方法。在一具體實例中，鑑認藉由非凋亡機制誘發腫瘤細胞死亡之藥劑的方法包含(a)將試驗細胞(腫瘤細胞、(或含有腫瘤細胞之器官或組織))與誘發腫瘤細胞死亡之候選藥劑接觸；(b)評估(a)的藥劑是否誘發試驗細胞凋亡；以及(c)將(b)中之細胞凋亡誘發與適當的控制組相比較。如果控制組細胞被誘發凋亡但試驗細胞沒有，則誘發腫瘤細胞死亡是藉由非凋亡機制的藥劑(例如 藥物)就被鑑認出來了。適當的控制組是與試驗細胞相同種類的細胞者，但是控制組細胞是與已知會誘發細胞凋亡之藥劑接觸的。適當的控制組可以是同時進行的，或可以是預先建立好的(例如預先建立好的 標準品或參考組)。在一些具體實例中，該試驗細胞是經基因改造的人類致腫瘤細胞。
在本文中，「一(a)」以及「一(an)」是指一或更多所指的事物。
在一些方面，本發明提供了進行藥物研發事業的方法。在一具體實例中，本發明係關於進行藥物研發事業的方法，該方法包含：(a)鑑認會選擇性對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性的藥劑(例如 藥物)；(b)評估(a)中所鑑認之藥劑或其相似物對動物的功效和毒性；以及(c)調配包括了一或更多種(b)所評估的藥劑之醫藥製劑。所評估的功效可以是藥劑在動物中選擇性地誘發致腫瘤細胞死亡的能力。在進一步的具體實例中，進行藥物研發事業的方法包含建立銷售系統以銷售該醫藥製劑。視需要的，銷售群是建立來在市場上交易該醫藥製劑的。在額外的具體實例中，本發明係關於進行蛋白質體事業的方法，該方法包含鑑認會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒的藥劑(例如 藥物)，並且授權給第三者對該會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒的藥劑作進一步的藥物發展的權利。
在其他具體實例中，本發明係關於進行藥物研發事業的方法，該方法包含：(a)鑑認對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒之(一或更多種)藥劑(例如藥物)；(b)評估(a)所鑑認之藥劑或其相似物對動物的功效和毒性；以及(c)調配包括了一或更多種(b)所評估的藥劑之醫藥製劑。例如，所鑑認的藥劑是愛拉斯汀。所評估的功效可以是藥劑選擇性誘發改變對動物致腫瘤細胞之細胞生長、毒性或細胞死亡的能力。在進一步的具體實例中，該進行藥物研發事業的方法包含建立銷售系統以銷售該醫藥製劑。視需要的，銷售群是建立來行銷該醫藥製劑的。在額外的具體實例中，本發明係關於進行蛋白質體事業的方法，該方法包含鑑認會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒的藥劑(例如 藥物)，並且授權給第三者對該會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒的藥劑作進一步的藥物發展的權利。
在進一步的具體實例中，本發明係關於進行藥物研發事業的方法，該方法包含：(a)鑑認會與細胞成分互相作用之(一或更多種)藥劑(例如藥物)，其中該細胞成分會與愛拉斯汀互相作用者；(b)評估(a)所鑑認之藥劑或其相似物對動物的功效及毒性；以及(c)調配包括了一或更多種(b)所評估的藥劑之醫藥製劑。所評估的功效可以是藥劑選擇性誘發動物致腫瘤細胞之細胞死亡的能力。在進一步的具體實例中，該進行藥物研發事業的方法包含建立銷售系統以銷售該醫藥製劑。視需要的，銷售群是建立來行銷該醫藥製劑的。在額外的具體實例中，本發明係關於進行蛋白質體事業的方法，該方法包含鑑認會與細胞成分互相作用之(一或更多種)藥劑(例如藥物)，其中該細胞成分會與愛拉斯汀互相作用者，並且授權給第三者對該會與細胞成分互相作用之藥劑作進一步的藥物發展的權利，其中該細胞成分係會與愛拉斯汀互相作用者。
在另一具體實例中，本發明是進行醫藥事業的方法，該方法包括：(a)鑑認用於抑制細胞增生之候選醫療藥劑，其中該候選醫療藥劑是(i)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；(ii)增加或抑制VDAC蛋白質活性的藥劑；(iii)結合至VDAC蛋白質的藥劑；(iv)結合及/或調節蛋白質複合物的藥劑，該複合物含有至少一個VDAC及視需要一或更多個其他蛋白質；(v)含有VDAC多肽或其功能性變異物的藥劑；(vi)含有編碼有VDAC多肽或其功能性變異物之核酸的藥劑；或(vii)本文所揭露的化合物，(b)對步驟(a)所鑑認之候選醫療藥劑進行醫療分析，分析其對動物的功效和毒性；以及(c)調配包括了一或更多種步驟(b)所鑑認之該候選醫療藥劑的醫藥製劑使成為具有可接受的醫療概況(profile)。
取而代之的或除了步驟(b)和(c)中的一或兩個步驟之外，該方法還可包括授權給第三者進一步發展該候選醫療藥劑的權利。在進一步的具體實例中，進行藥物研發事業的方法包含建立銷售系統以銷售該醫藥製劑。視需要的，銷售群是建立來行銷該醫藥製劑的。
在進一步的具體實例中，本發明是進行醫藥事業的方法，該方法包括：(a)鑑認用於抑制細胞增生之候選醫療藥劑，其中該候選醫療藥劑是(i)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；或(ii)增加或抑制VDAC蛋白質與第二蛋白質之間的互相作用的藥劑，以及(b)授權給第三者進一步發展該候選醫療藥劑的權利。
在進一步的具體實例中，進行藥物研發事業的方法包含建立銷售系統以銷售該醫藥製劑。視需要的，銷售群是建立來行銷該醫藥製劑的。
本發明的另一方面是進行醫藥事業的方法，該方法包括一或更多的行銷、製造、授權給第三人行銷的權利以及授權給第三人生產套組的權利，其中該套組包含：(a)一或更多種用以測定生物樣本中愛拉斯汀結合蛋白質含量、愛拉斯汀結合蛋白質活性、或兩者的試劑；以及(b)解讀分析結果的說明書。
通常，說明書說明了相對於其所想要的含量及/或活性之愛拉斯汀結合蛋白質的含量及/或活性是否正常、增加或降低，使使用者可決定是否要改變含量及/或活性或預測(部分)取決於含量及/或活性的治療(例如癌症化療)是否成功。
在一些具體實例中，該說明書包括了關於愛拉斯汀結合蛋白質之含量或活性正常、降低以及升高的一或更多者的指引。
在一些具體實例中，說明書包括了關於後續處理的指引，該些處理係使用一或更多種：(i)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；(ii)增加或抑制VDAC蛋白質活性的藥劑；(iii)結合至VDAC蛋白質的藥劑；(iv)結合、調節、或結合和調節蛋白質複合物的藥劑，該複合物含有至少一個VDAC及視需要一或更多個其他蛋白質；(v)含有VDAC多肽或其功能性變異物的藥劑；(vi)含有編碼有VDAC多肽或其功能性變異物之核酸的藥劑；以及(vii)本文所揭露的化合物，其係根據愛拉斯汀結合蛋白質的含量、愛拉斯汀結合蛋白質的活性、或兩者。
在一些具體實例中，該說明書包括了關於用一或更多種下述者治療是否會成功的指引：(i)增加或抑制VDAC蛋白質含量的藥劑；(ii)增加或抑制VDAC蛋白質活性的藥劑；(iii)結合至VDAC蛋白質的藥劑；(iv)結合、調節、或結合和調節蛋白質複合物的藥劑，該複合物含有至少一個VDAC及視需要一或更多個其他蛋白質；(v)含有VDAC多肽或其功能性變異物的藥劑；(vi)含有編碼有VDAC多肽或其功能性變異物之核酸的藥劑；以及(vii)本文所揭露的化合物，其係根據愛拉斯汀結合蛋白質的含量、愛拉斯汀結合蛋白質的活性、或兩者。
在一些具體實例中，該說明書包括了關於癌症治療成功之可能性的指引，係根據愛拉斯汀結合蛋白質的含量、愛拉斯汀結合蛋白質的活性、或兩者。
鑑認能增加人類細胞對特定化合物敏感性之基因改變最終可作為致癌訊號網絡的機轉研究，並且使化療能依照特定的腫瘤種類量身訂做。申請人已發展了一種有系統的程序以在具有特定基因改變之細胞中發現活性增加的小分子。使用這個系統，他們確定了一些臨床使用的抗腫瘤藥劑在特定基因成分的存在下是更有效且更有活性的。此外，他們鑑認出會選擇性地殺死會表現小T癌蛋白質以及致癌RAS之細胞的新穎化合物。這些以基因為標的的小分子也可以作為發展具有理想治療指數之抗腫瘤藥物的榜樣。
本發明進一步提供經套組化的醫藥品。在一具體實例中，該經套組化的醫藥品包含：(i)會選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性之醫療有效量的藥劑；以及(ii)用於施用該藥劑來治療患有癌症之患者的說明書及/或標籤。在特定的具體實例中，該藥劑是愛拉斯汀。在另一個具體實例中，該經套組化的醫藥品包含：(i)對經基因改造的人類致腫瘤細胞有毒性之醫療有效量的藥劑；以及(ii)用於施用該藥劑來治療患有癌症之患者的說明書及/或標籤。在另一個相關的具體實例中，該經套組化的醫藥品包含：(i)會與細胞成分互相作用之醫療有效量的藥劑，其中該細胞成分會與愛拉斯汀互相作用；以及(ii)用於施用該藥劑來治療患有癌症之患者的說明書及/或標籤。
該說明書或標籤可以被存放在諸如CD、DVD、軟碟、記憶卡等等的電子媒體中，可藉由電腦來讀取。
本發明進一步提供本發明所鑑認之任何藥劑的用途，係用於製造治療癌症的醫藥品，例如，愛拉斯汀或其相似物用於製造治療癌症之醫藥品的用途。
在一些具體實例中，本發明的方法進一步包含共同給藥一或更多種藥劑，諸如典型的透過凋亡機制來殺死細胞的化療藥劑。適合用來降低腫瘤生長速度並治療罹患癌症之患者的藥劑包括但不限於小的有機分子、肽類、蛋白質、類肽、核酸、抗體、及其組合。本發明的所有具體實例是預期可以與一或更多個其他具體實例結合的。
在另一方面，本發明係關於鑑認化合物的篩選方法，該化合物係抑制經基因改造的細胞中之蛋白質(但非其同源正常細胞對應物)的細胞毒性。這些方法已被用於鑑認已知的以及新穎的具有基因選擇性活性之化合物。視需要的，這些化合物在突變蛋白質存在下活性增加。
本發明係關於鑑認藥劑(例如 藥物)的方法，該藥劑會在經基因改造的細胞中選擇性地抑制細胞毒性。在一具體實例中，本發明係關於鑑認藥劑(例如藥物)的方法，該藥劑會抑制經基因改造的細胞中突變蛋白質的細胞毒性，該方法包含將試驗細胞(例如 表現突變蛋白質之經基因改造的細胞)與候選藥劑接觸；測定與該候選藥劑接觸之試驗細胞的存活性；以及將試驗細胞的存活性與適當控制組的存活性相比較。如果試驗細胞存活性比控制組細胞存活性高，則會選擇性抑制細胞毒性的藥劑(例如藥物)就被鑑認出來了。適當的控制組是與試驗細胞相同種類的細胞，但是控制組細胞沒有被基因改造以表現會造成毒性的蛋白質。例如，控制組細胞可以是試驗細胞所衍生自的親代原代細胞。控制組細胞是在與試驗細胞相同條件下與候選藥劑接觸的。適當的控制組可以是同時進行的，或可以是預先建立好的(例如 預先建立好的標準品或參考組)。
在一些方面，本發明提供治療哺乳動物症狀的方法，該方法包含給藥給哺乳動物醫療有效量的愛拉斯汀相似物，例如 一般式I所表示的化合物：
其中該症狀的特徵在於細胞的Ras訊號活性增加且SV40小t抗原之細胞標靶蛋白質的活性改變(例如降低或增加)；以及Rb活性視需要實質上是野生型的程度；以及其中：R1 是選自H、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 每次的出現都是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是在相同的N原子上且不是兩者都為H時，它們是不同的，以及當R2 和R4 兩者是在相同的N且R2 或R4 其一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、和雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自、、以及；Q是選自O和NR2 ；以及Z每次的出現是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團，則雙鍵或三鍵較佳的不是位在基團端點(因此排除例如烯醇醚、炔醇醚、烯胺及/或炔胺)。
在一些具體實例中，W是選自或。在一些這類具體實例中，R1 是選自－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基。
在一些具體實例中，W是。在一些這類具體實例中，R1 是選自－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基。
在一些具體實例中，R1 是選自－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基。
在一些具體實例中，R4 是選自C1 － 4 芳烷基以及醯基。在一些這類具體實例中，R4 是醯基。
在一些具體實例中，其中R4 是醯基，R4 是－C(O)－C1 － 3 烷基－Y，以及Y是選自H、烷基、烷氧基、芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基、以及環烷基。在一些這類具體實例中，Y是選自芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基以及環烷基。在較佳的這類具體實例中，Y是選自芳氧基和雜芳氧基。在更佳的這類具體實例中，C1 － 3 烷基－Y是－CH2 O－苯基，其中苯基是視需要的被鹵素所取代，較佳的被氯取代。在一些較佳的具體實例中，其中Y是－CH2 O－苯基，其餘部分的選擇是使得愛拉斯汀從具體實例中被排除者。
在一些具體實例中，芳基是視需要的被選自C1 － 6 烷基、CF3 、羥基、C1 － 4 烷氧基、芳基、芳氧基、鹵素、－NR2 R4 、硝基、羧酸、羧酯、以及磺醯基的基團所取代的。
適合的藥劑在其所存在的形式下或經過完全或部分代謝之後可具有所述活性。
在一些具體實例中，症狀的特徵在於細胞具有實質上野生型程度的Rb活性。在一些這類具體實例中，該細胞進一步特徵在於Ras訊號活性增加及/或SV40小t抗原之細胞標靶蛋白質活性改變(例如降低或增加)。
在一些具體實例中，化合物是藉由非凋亡(non－apoptotic)機制殺死細胞的。
在一些具體實例中，化合物是藉由非凋亡機制以外的機制殺死細胞的。
在一些具體實例中，細胞具有增加的Ras路徑活性(例如RasV12)、過度表現SV40小t抗原、具有實質上降低的磷酸酶PP2A活性、及/或受調節(例如增加或抑制)的VDAC含量或活性，諸如VDAC2或VDAC3。
在一些具體實例中，該症狀是癌症。
在一些具體實例中，該細胞是被誘發以表現SV40小t抗原者，例如 藉由過度表現SV40小t抗原之病毒載體(諸如反轉錄病毒載體或腺病毒載體)來感染該細胞。
在一些具體實例中，該病毒載體是反轉錄病毒載體或腺病毒載體。
在一些具體實例中，該方法進一步包含將會經由凋亡機制殺死該細胞的藥劑(諸如化療藥劑)共同給藥給該哺乳動物。在一些具體實例中，共同給藥的藥劑是選自：EGF－受體拮抗劑、硫化砷、阿德力黴素(adriamycin)、順鉑、卡鉑、西咪替丁(cimetidine)、洋紅黴素(carminomycin)、鹽酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)、五甲基密胺(pentamethylmelamine)、塞替哌(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、去甲氧基竹紅菌甲素(demethoxyhypocrellinA)、美法崙(melphalan)、異環磷醯胺(ifosfamide)、曲磷胺(trofosfamide)、曲奧舒凡(Treosulfan)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、依托泊苷(etoposide)、異長春鹼(leurosidine)、環氧長春鹼(leurosine)、長春地辛(vindesine)、9－胺基喜樹鹼(9－aminocamptothecin)、抗癌妥(camptoirinotecan)、crisnatol、甲地孕酮(megestrol)、甲喋呤(methopterin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、海鞘素743(ecteinascidin 743)、白消安、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、洛伐他汀(lovastatin)、1－甲基－4－苯基吡啶鎓離子、司莫司汀(semustine)、星形孢菌素(staurosporine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、鈦菁(phthalocyanine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、胺基喋呤(aminopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)、硫代鳥嘌呤(thioguanine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氟達拉濱(fludarabine)、五史達汀(pentastatin)、克拉屈濱(cladribin)、阿糖胞苷(cytarabine，ara C)、紫菜黴素(porfiromycin)、5－氟尿嘧啶、6－巰基嘌呤、鹽酸多柔吡星(doxorubicin hydrochloride)、亞葉酸(leucovorin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、柔紅黴素(daunorubicin)、去鐵胺(deferoxamine)、氟脲苷(floxuridine)、脫氧氟脲苷(doxifluridine)、雷替曲塞(raltitrexed)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubican)、吡柔比星(pirarubican)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)、放線菌素D(actinomycin D)、沙弗拉素(safracin)、沙申拉黴素(saframycin)、季諾卡星(quinocarcin)、discodermolides、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞賓酒石酸(vinorelbine tartrate)、維替泊芬(vertoporfin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、三苯氧般(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、太唑呋喃(tiazofuran)、硫代鳥嘌呤(thioguanine)、雷巴威林(ribavirin)、EICAR、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、氟他胺(flutamide)、必卡他胺(bicalutamide)、布舍瑞林(buserelin)、亮丙瑞林、喋啶(pteridines)、烯二炔、左旋咪唑(levamisole)、阿佛拉康(aflacon)、干擾素、介白素、阿地介白素、非格可亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、美羅華(rituximab)、BCG、維生素A酸(tretinoin)、臨德隆(betamethosone)、鹽酸吉西他濱、維拉帕米(verapamil)、VP－16、六甲基嘧胺(altretamine)、毒胡蘿蔔素(thapsigargin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、異丙鉑(iproplatin)、四氯環己鉑(tetraplatin)、洛鉑(lobaplatin)、DCP、PLD－147、JM118、JM216、JM335、賽特鉑(satraplatin)、多烯紫杉醇、去氧太平洋紫杉轉、TL－139、5'－nor－脫水長春鹼(本文之後稱為：5'－nor－長春鹼)、喜樹酸(camptothecin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)(伊立替康(Camptosar)，CPT－11)、托泊替康(topotecan，Hycamptin)、BAY 38－3441、9－硝基喜樹鹼(Orethecin，魯比替康(rubitecan))、依喜替康(exatecan，DX－8951)、勒托替康(lurtotecan，GI－147211C)、吉馬替康(gimatecan)、高喜樹鹼代夫洛莫替康(homocamptothecins diflomotecan，BN－80915)以及9－胺基喜樹鹼(IDEC－13’)、SN－38、ST1481、卡蘭替星(karanitecin)(BNP1350)、吲哚咔唑(indolocarbazole，例如 NB－506)、原小、檗鹼(protoberberine)、茚托利辛(intoplicine)、茚異喹啉酮(idenoisoquinolone)、苯并－吩嗪(benzo－phenazine)以及NB－506。
本發明另一方面提供殺死細胞、促進細胞死亡或抑制細胞增生的方法，該方法包含給藥給該細胞：(1)有效量之一般式I所表示的化合物：
其中：R1 是選自H、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 每次的出現是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是在相同的N原子上且不是兩者都為H時，它們是不同的，以及當R2 和R4 兩者是在相同的N上且R2 或R4 其中之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自審、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z每次的出現是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、和C2 － 6 炔基(當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點)；以及(2)會增加細胞中VDAC(例如 VDAC2、VDAC3)含量之藥劑。
本發明另一方面提供殺死細胞的方法，該方法包含給藥給細胞：(1)有效量之由一般式I所表示的化合物：
其中：R1 是選自H、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是在相同的N原子上且不是兩者都為H時，它們是不同的，以及當R2 和R4 兩者是在相同的N上且R2 或R4 其中之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基(當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點)；以及(2)會降低細胞中VDAC(例如 VDAC2、VDAC3)含量之藥劑。
在另一具體實例中，本發明是促進細胞死亡的方法，該方法包括給藥給細胞有效量的式(I)化合物。
在一些具體實例中，該化合物是如上所述。
在一些具體實例中，該細胞是癌細胞。
在一些具體實例中，該藥劑包含編碼有VDAC(諸如VDAC3)的多核苷酸。
在一些具體實例中，該藥劑是被修改以被送入細胞內的VDAC蛋白質(例如 VDAC3)，例如 與異源內化功能部位稠合。
在一些具體實例中，該藥劑是含有VDAC蛋白質(例如 VDAC3)的脂質體製劑。
在一些具體實例中，該藥劑增加或抑制內生性VDAC(例如 VDAC3)的表現、刺激或抑制VDAC(例如 VDAC3)的表現或增加或抑制VDAC(例如 VDAC3)抑制劑的功能。
在一些方面，該方法也涉及施用會增加細胞VDAC(例如VDAC1、VDAC2、VDAC3)含量之藥劑。在一些方面，該方法也涉及施用會降低細胞VDAC(例如VDAC1、VDAC2、VDAC3)含量之藥劑。
在另一方面，本發明是(例如加成的或協同的)增加腫瘤細胞對化療藥劑之敏感性的方法，其中腫瘤細胞是與本文所揭露的化合物接觸。在一相關的方面，本發明是降低正常細胞對化療藥劑之敏感性的方法，其中正常細胞是與本文所揭露的化合物接觸。
在一具體實例中，本發明是鑑認可能會對本發明化合物之治療有反應的患者之方法。使用已知技藝中的標準定性方法，被鑑認出有腫瘤形成之展現下列一或更多種特徵的患者被認為是有反應的：由一或更多個路徑成員(例如磷酸化Erk1/2、磷酸化MEK等等)的活化所認定的異常Ras訊號路徑活性、及/或表現VDAC蛋白質(1、2或3)及/或相似或相同基因型之細胞系當被(試管內 或體內 )曝露於本發明之化合物時有敏感性。
本發明的另一方面提供由一般式I所表示之化合物：
其中：R1 是選自H、Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是在相同的N原子上時，它們是不同的(但在一些具體實例中R2 和R4 兩者均為H)，以及當R2 和R4 兩者是在相同的N上且R2 或R4 其中之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自、、和；Q是選自O和NR2 ；以及Z是各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基，以及當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點，或其醫藥上可接受的鹽。
本發明的另一方面提供由一般式I所表示之化合物II：
其中Ar是經取代的苯基；R1 是選自H、C1 － 8 烷基、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是位在相同N上且R2 或R4 其中之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點。
本發明的另一方面提供由一般式I所表示之化合物III：
其中Ar是經取代的或未經取代的苯基；R1 是選自H、C1 － 8 烷基、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是位在相同N原子上時，它們是兩者均為H或是不相同的，且當R2 和R4 兩者是位在相同N上且R2 或R4 其中之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是選自、、、、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點。
本發明的另一方面提供由一般式IV所表示之化合物：
其中Ar是經取代的或未經取代的苯基；R1 是C1 － 8 烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H以及C1 － 8 烷基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是選自、、、、、或；以及Q是選自O和NR2 。
本發明的另一方面提供由一般式V所表示的化合物：
其中R1 是選自H和C1 － 8 烷基；R2 是選自H和C1 － 8 烷基；R3 是選自鹵素、C1 － 8 烷氧基和C1 － 8 烷基；R4 是選自H、鹵素、C1 － 8 烷氧基和C1 － 8 烷基；R5 是選自H、鹵素和硝基；以及n是1或2。
任何由上式I－V所表示的化合物都被認為可用於1)治療哺乳動物症狀的方法，該方法包含將醫療上有效量的該化合物給藥給該哺乳動物、2)殺死細胞的方法，該方法包含將a)有效量的該化合物、和b)會增加細胞內VDAC(例如VDAC2、VDAC3)含量之藥劑給藥給該細胞、或3)殺死細胞的方法，該方法包含將a)有效量的該化合物、與b)會降低細胞內VDAC(例如VDAC2、VDAC3)含量之藥劑給藥給該細胞。
本發明所有的具體實例是被認為可與一或更多個其他具體實例混合的，甚至是描述於本發明不同方面的具體實例。在本發明的一些具體實例中，化合物或藥劑不是揭露於表2的化合物。
 發明詳述
基因型選擇性化合物作為分子探針的能力是基於化學遺傳學的前提，即小分子可被用於鑑認造成生物影響之蛋白質及路徑(Schreiber,1998,Bioorg.Med.Chem.6, 1127－1152；Stockwell,2000,Nat Rev Genet 1,116－25；Stockwell,2000,Trends Biotechnol18, 449－55)。例如，觀察到天然產物雷帕黴素會延遲細胞的生長，促使發現雷帕黴素的哺乳動物標靶(mTOR)是調控細胞生長的蛋白質成為可能(Brown 等人, 1994,Nature369, 756－758；Sabatini等人, 1994,Cell78, 35－43)。申請人已結合這兩種方法(化學及分子遺傳學)來發現被與人類疾病諸如癌症有關之突變所影響的路徑。
申請人已用經定義的基因片段來基因改造一系列的人類腫瘤細胞，用於鑑認那些中斷會造成致腫瘤表型(phenotype)的關鍵路徑(Hahn等人, 1999,Nat Med 5,1164－70；Hahn等人, 2002,Nat Rev Cancer 2,331－41；Lessnick等人, 2002,Cancer Cell 1,393－401)。申請人假設這些實驗轉型的細胞會使從已知的以及新穎的化合物來源中鑑認出基因型選擇性藥劑成為可能，該化合物在特定的腫瘤相關對偶基因存在下會顯現出合成的致命性。具有基因型選擇致命性的化合物可作為存在於腫瘤細胞中之訊號網絡的分子探針，並作為後續發展具有較佳治療指數之臨床有效藥物的榜樣及/或作為有效藥物。
使用這個方法，申請人對天然和合成的化合物群進行了許多高效篩選研究，並且鑑認出顯現有強健的殺死腫瘤之活性的化合物。這些化合物中之一類是愛拉斯汀和愛拉斯汀相似物，諸如愛拉斯汀B和愛拉斯汀A。然而，有許多試驗藥劑或化合物可被用於本文所述之篩選研究中(例如 鑑認抗腫瘤候選物的方法)。這類試驗藥劑包括(但不限於)小的有機分子、肽類、類肽、蛋白質(包括抗體)、核酸、碳水化合物。
因此，本發明提供了會殺死癌細胞之式I化合物，尤其是對基因型專一的癌細胞，例如那些Ras訊號活性增高、SV40小t抗原標靶活性改變、及/或實質上完整之Rb活性的細胞。
申請人也鑑認出一些會直接或間接與愛拉斯汀及/或其相似物結合的細胞蛋白質。這些蛋白質包括：電壓依賴性陰離子通道(VDAC1、VDAC2、和VDAC3)、抗增殖蛋白、核糖體結合糖蛋白、Sec61a以及Sec22b。定量RT－PCR也說明了對於愛拉斯汀的殺害作用有敏感性的細胞有升高含量(例如 2－6倍高，典型的是2－2.5倍高)的VDAC3表現。不想被任何特定理論所限制，這些實驗說明了高含量的VDAC(尤其是VDAC3和VDAC2)表現會促進愛拉斯汀(及其相似物)介導的細胞殺害作用，而且可能甚至是有效性所必須的。
因此，本發明的一個方面提供了選擇性殺死癌細胞的方法，尤其是那些Ras活性增高、SV40小t抗原標靶活性改變、以及較佳的是實質上Rb及/或p53活性完整的癌細胞，該方法包含將醫療有效量之由一般式I所表示的化合物給藥給需要治療的哺乳動物患者：
其中：R1 是選自H、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者位在相同N原子上且兩者不全是H時，它們是不同的，以及當R2 和R4 兩者是位在相同N上且R2 或R4 之一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點。
在一些具體實例中，式I化合物不包括愛拉斯汀或愛拉斯汀A。
就如技藝中所熟知的，Ras本質的活化作用是人類癌細胞惡性生長的一個重要因子。雖然在腫瘤類型的發生率上有很大的差異，RAS原致癌基因的突變(H－RAS、N－RAS、K－RAS)是20%至30%之所有人類腫瘤中常見的基因異常(Bos,Cancer Res. 49 ：4682－4689,1989)。RAS突變在胰腺癌(90%)、結腸腺癌(50%)、以及肺腺癌(30%)中偵測到最多。在濾泡性及未分化之甲狀腺癌中，RAS突變的發生率也是相當常見的(50%)。最常看到的RAS突變發生在Ras調控的關鍵區域－即密碼子12、13、以及61。每個這些突變都會造成正常Ras之GTP酶活性喪失。Ras活化也常常在血液惡性腫瘤(例如骨髓性白血病以及多發性骨髓瘤)中觀察到。在大約三分之一的骨髓增生異常症候群(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)中，RAS基因是突變地被活化的。RAS突變發生在最近診斷的多發性骨髓瘤患者約40%中，且發生率隨疾病惡化而增加。
在另一方面，多瘤病毒會感染許多脊椎動物(12個成員現在已知)。鼠科多瘤病毒是Ludwig Gross於1953以鼠類研究白血病時分離出來的，該病毒的命名是因其會在多處造成固態腫瘤。此家族的第二個成員猴空泡病毒40(SV40)是Sweet和Hilleman在1960從用於得到沙賓減毒活疫苗的原代猴腎臟細胞培養物中分離出來的(Hilleman,Dev Biol Stand 94：183－190,1998)。cBK病毒(BKV)以及JC病毒(JCV)兩種人類多瘤病毒在1971被分離出來。
多瘤病毒編碼有涉及細胞轉型的三種稱為大腫瘤抗原(LT)、中T抗原(mT)、以及小腫瘤抗原(sT)之蛋白質。這三種蛋白質是來自於早期區域轉錄物的差異剪接且包含了同源序列。多瘤病毒的大T抗原會與腫瘤抑制蛋白質pRb互相作用，並且能夠使培養物中的原代纖維母細胞不死。位於N端的Dna J功能域(尤其是在殘基42和47之間找到的HPDKYG序列)對於Rb家族蛋白質的功能性不活化作用而言是關鍵性的，SV40大T抗原也是一樣。LT的表現並不足以產生完全轉型的細胞表型－這需要多瘤病毒主要的轉型蛋白質mT。鼠類多瘤中T包含421個胺基酸，而且可以被分為三個功能域，當中有一些是被LT和sT所共享的。胺基端功能域包含了最先的79個胺基酸，而且也存在於LT和sT中。在它旁邊，在殘基80－192之間，是也存在於多瘤sT中的功能域，而且包括了兩個富含半胱胺酸的區域Cys－X－Cys－X－X－Cys，該區域在SV40小t中也已被鑑認出來。這些半胱胺酸的突變會使mT喪失轉型細胞的能力。剩餘的229個胺基酸是mT特有的，且包含了鼠類mT主要的酪胺酸磷酸化區域以及涉及此蛋白質之細胞膜定位的疏水性區域(在羧基端的大約20個胺基酸)，該定位對於其轉型活性是必要的。
SV40的小t抗原包含了174個胺基酸。介於殘基97－103之間的區域會與蛋白質磷酸酶2A(PP2A)互相作用。這個互相作用會降低PP2A不活化ERK1和MEK1蛋白質激酶的能力，導致靜止的猴腎臟細胞被刺激增生。小t抗原依賴性試驗也鑑認出了具有增加細胞轉型之能力的其他區域。這些區域位於N端部分，被SV40的小t以及大T抗原所共享，而且可以潛在的作為Dna J功能域。小t抗原也可以與微管蛋白結合，這已被認為在其生物功能中扮演了一個角色。
申請人發現具有活化的Ras活性以及表現小t抗原兩者之細胞(且因此降低了小t抗原標靶蛋白質的活性，例如 降低的PP2A等等，或增加了ERK1以及MEK1)可以被愛拉斯汀及其相似物選擇性地殺死，很可能經由非凋亡機制。在一較佳的具體實例中，該細胞會表現實質上野生型之Rb及/或p53(或其他E6/E7蛋白質標靶)含量。
因此，在一些具體實例中，一些特定基因型的癌細胞可以被本發明的化合物選擇性地殺死。這些可包括具有組成性活化的Ras突變或Ras訊號路徑突變、以及增加的ERK1、MEK1活性或降低的PP2A活性之癌細胞。
在一些其他的具體實例中，標靶細胞的基因型可以選擇性地被改變(例如 用來表現SV40的小t抗原、表現ERK1或MEK1、或抑制PP2A等等)，使得原本對愛拉斯汀和愛拉斯汀相似物之殺害作用不敏感的標靶細胞現在對這個殺害作用敏感。
尤其，本發明提供了選擇性地殺死癌細胞的方法，其中該癌細胞具有升高的Ras活性以及小t抗原表現(或改變的小t抗原標靶蛋白質活性，諸如PP2A活性，增加的ERK1或MEK1活性或類似sT影響的機制，包括但不限於PP2A調控性次單元中有突變)，卻保護了不具有升高之Ras活性的相當正常細胞，甚至當這些細胞也表現小t抗原時。這可以是有益的，因為許多癌細胞具有體RasV12或造成癌細胞中Ras訊號活性升高的其他相似突變，然而同一患者/個體的正常細胞通常不具有相同的RasV12或其他Ras路徑突變。如果該癌細胞也表現小t抗原(或具有改變的小t抗原標靶蛋白質活性)，愛拉斯汀及其相似物可被用來選擇性地殺死這些癌細胞。即使個體/患者的其他正常細胞也會表現小t抗原，本方法仍然可有效殺死癌細胞，因為正常細胞很可能並不具有升高的Ras訊號活性。即使個體不表現小t抗原，小t抗原可以(以蛋白質或編碼有DNA的載體)被遞送到該患者，使癌細胞(但不是正常細胞)對愛拉斯汀/愛拉斯汀相似物的殺害作用敏感化。
因為小t抗原本身不被認為足以對患者誘發不良影響，所以此治療的副作用(提供小t抗原給患者)會是最少的或不存在的。事實上，多達3千萬美國人被認為在1955和1963年間的小兒麻痺疫苗接種中已被暴露於SV40。SV40透過用於生長小兒麻痺病毒之獼猴腎臟細胞找到了進入疫苗的路徑。那個方法已不再被使用，而小兒麻痺疫苗從1963年開始已不再含有該病毒。1990年代的DNA研究在一些人類腫瘤中發現到SV40。然而，病毒DNA與腫瘤組織中分裂之細胞的關聯並未證實該病毒會造成腫瘤的形成。在2002年10月，來自美國醫學協會的科學小組下了結論說無法確定數十年前廣泛使用被猴病毒SV40所污染的小兒麻痺疫苗是否會導致人類癌症率增加。
在一些具體實例中，升高的Ras活性是由在胺基酸位置12、13、及/或61之組成性活化的Ras(N－、H－、或K－Ras)突變所顯露出來的。
在一些其他的具體實例中，升高的Ras活性是由一或更多種Ras路徑蛋白質的下游成分(包括但不限於Raf、MEK、MAPK等等)活性增加來顯現的。
在其他的具體實例中，小t抗原的表現可以藉由用載體來感染標靶細胞而達成，諸如表現有SV40小t抗原的腺病毒或反轉錄病毒載體(參見下面)。
或者，小t抗原可以直接被提供給標靶細胞。例如，可以使用技藝中已知的多種方法將小t抗原置入標靶細胞裡(細節參見下面)。在一具體實例中，可以藉由將小t抗原放入表面具有正電荷的脂質體(例如 脂質素(lipofectin))中，將小t抗原提供給標靶細胞，且該脂質體視需要的被標記有抗體，該抗體係針對標靶組織的細胞表面抗原，例如 針對癌細胞表面抗原的抗體。在另一具體實例中，可以藉由胞吞轉運作用(transcytosis)將小t抗原提供給標靶細胞，其係使用任何可介導此作用的「內化肽類(internalizing peptide)」，包括但不限於HIV蛋白質Tat的N端功能域(例如 Tat的殘基1－72或其可促進胞吞轉運作用之更小片段)、全部或一部分的果蠅觸角足蛋白質(Drosophila antenopedia III protein)、肥大細胞脫粒肽(mastoparan)的足夠部分等等(參見下面)。
在其他的具體實例中，可以藉由遞送針對此標靶蛋白質之抗體、RNAi(siRNA，短的髮夾型RNA等等)、反義序列、或小分子抑制劑使得PP2A(及/或其他小t抗原標靶蛋白質)降低。
將此蛋白質拮抗物遞送至標靶細胞中是技藝中所熟知的。參見例如WO04078940A2、EP1439227A1、WO04048545A2、US20040029275A1、WO03076592A2、WO04076674A1、WO9746671A1，全部在此併入作為參考。
本發明的另一方面提供聯合的醫療方法，係使用愛拉斯汀/愛拉斯汀相似物以及一或更多種可以透過凋亡機制殺死細胞的藥劑或治療(例如 放射線治療)。這些藥劑包括許多下述的化療藥物。
一般相信在愛拉斯汀敏感性細胞中，有些蛋白質有升高的表現量。例如，這些蛋白質其中之一的VDAC3當曝露於愛拉斯汀時含量會升高2－2.5倍，而申請人不想被理論所限制住，它的存在或甚至是含量增加是被認為對愛拉斯汀介導的殺害作用是不可或缺的。
因此，在本發明的另一方面中，提供了一種殺死或減緩具有升高含量之VDAC(諸如VDAC2或VDAC3)的細胞增生速度的方法，該方法包含將標靶細胞與愛拉斯汀及/或式I－IV之愛拉斯汀相似物接觸。
在一些具體實例中，標靶細胞被操作成會表現更高含量的VDAC(諸如VDAC2或VDAC3)，以藉由愛拉斯汀及其功能性相似物來增加對殺害作用的敏感性或減緩增生速度。
例如，VDAC蛋白質可以使用多種技藝中已知的方法被置入標靶細胞中(參見下面細節)。在一具體實例中，可以藉由將VDAC蛋白質放進表面具有正電荷的脂質體(例如 脂質素(lipofectin))中，將VDAC蛋白質提供給標靶細胞，且該脂質體視需要的被標記有抗體，該抗體係針對標靶組織的細胞表面抗原，例如 針對癌細胞表面抗原的抗體。在另一具體實例中，可以藉由胞吞轉運作用(transcytosis)將VDAC蛋白質提供給標靶細胞，其係使用任何可介導此作用的「內化肽類(internalizing peptide)」，包括但不限於HIV蛋白質Tat的N端功能域(例如 Tat的殘基1－72或其可促進胞吞轉運作用之更小片段)、全部或一部分的果蠅觸角足蛋白質(Drosophila antenopedia III protein)、肥大細胞脫粒肽(mastoparan)的足夠部分等等(參見下面)。
或者，編碼有功能性VDAC的板酸可以被放進此標靶細胞中，使用例如表現VDAC的腺病毒或反轉錄病毒載體。
此外，可以藉由會刺激VDAC表現、或抑制VDAC抑制劑活性(轉錄或轉譯抑制劑、或促進細胞內VDAC更新的抑制劑)的藥劑來刺激內生性VDAC(例如VDAC3)的活性。
在一些方面，本發明的方法也涉及給藥一種會增加細胞內VDAC(例如VDAC1、VDAC2、VDAC3)含量之的藥劑。這種會增加VDAC含量之藥劑可(例如)包括編碼有VDAC(諸如VDAC3)的多核苷酸；被修改以被轉送到細胞中的VDAC蛋白質(例如VDAC3)，例如與異源內化功能域稠合或調配在脂質體製劑中。
在一些方面，本發明的方法也涉及給藥一種會降低細胞內VDAC(例如VDAC1、VDAC2、VDAC3)含量之藥劑。這種會降低VDAC含量之藥劑可以(例如)抑制內生性VDAC(例如VDAC3)表現、抑制VDAC(例如VDAC3)表現或增加VDAC(例如VDAC3)抑制劑的功能。
下面描述一些本發明例示的具體實例，這些具體實例是被希望能彼此相結合的。此外，這些具體實例僅僅是作為描述目的的，不應在任何方面被認為是限制。
經基因改造的細胞系
在一方面，本發明係關於經基因改造的致解瘤細胞系。
先前的報導已指出將原代入類細胞轉變成致腫瘤細胞是可能的，其係藉由置入會表現hTERT的載體和致癌RAS蛋白質以及其他會中斷p53、RB和PP2A功能者(Hahn等人, 2002,Mol Cell Biol22, 2111－23；Hahn等人, 1999,Nature400, 464－8；Hahn與Weinberg,2002,Nat Rev Cancer 2,331－41；Lessnick等人, 2002,Cancer Cell 1,393－401)。申請人使用了一系列經基因改造的人類致腫瘤細胞及其前趨物，其製造是藉由將特定的基因物質放入原代人類包皮纖維母細胞中(圖1)。這些經基因改造的致腫瘤細胞的許多特徵都已在先前報導過了，包括其加倍的時間、其對於複製性衰老(replicative senescence)和培養中的危機的抗性、其對於伽瑪射線的反應、其以附著依賴(anchorage－independent)的方式生長的能力還有其在免疫缺乏鼠中形成腫瘤的能力(前述的Hahn等人, 1999；前述的Hahn等人, 2002；前述的Lessnick等人, 2002)。
在經基因改造之細胞的一個系列中，下面基因物質被依序放進原代BJ纖維母細胞中：人類酵素端粒酶的催化次單元(hTERT )、編碼有猴病毒40大(LT)和小T(ST)癌蛋白質的基因組構築體、以及HRAS 致癌對偶基因(RAS V12 )。所得到的經轉型的細胞系分別被命名為：BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST、以及BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 。在第二個系列中，細胞系的製造是用編碼有LT和ST的互補DNA(cDNA)構築體來取代編碼有這兩種病毒蛋白質的SV40基因組構築體。在後者中，ST是在最後一個階段被置入的，讓申請人可以在ST存在或不存在下測試化合物。後者經基因改造的人類致腫瘤細胞系命名為BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST。
在第三個系列中，使用源自獨立製造的人類TIP5包皮纖維母細胞之細胞系，其等是藉由置入編碼有hTERT、LT、ST和RASV 1 2 的cDNA構築體所製造的(Lessnick等人, 2002,Cancer Cell 1,393－401)。這些細胞系分別被稱為：TIP5/TERT、TIP5/TERT/LT、TIP5/TERT/LT/ST、以及TIP5/TERT/LT/ST/RASV 1 2 。在第四個系列中，使用源自TIP5纖維母細胞的細胞系，其等係藉由置入編碼有hTERT、E6、E7、ST和RASV 1 2 的cDNA構築體所製造的。這些細胞系分別被稱為：TIP5/TERT/E6、TIP5/TERT/E6/E7、TIP5/TERT/E6/E7/ST、以及TIP5/TERT/E6/E7/ST/RASV 1 2 。在這個系列中，分別不活化p53和RB的HPV E6以及E7扮演了與前系列中LT相似的功能。然而，藉由使用HPV E6和E7，申請人能夠觀察(分別地及獨立地)不活化之p53和RB的影響。大規模的化合物篩選結果描述在後面的實施例中，其中該化合物展現了選擇性殺死這些經基因改造的致腫瘤細胞系。
篩選基因型選擇性之化合物的方法
在一些具體實例中，本發明係關於大規模篩選化合物，該化合物係展現了選擇性殺死或抑制經基因改造的致腫瘤細胞系之生長(選擇性地對其有毒)者。在本文中，術語藥劑及藥物是交替使用的。在本文中，術語「對...有毒」是指藥劑或化合物殺死或抑制致腫瘤細胞生長/增生的能力。大規模篩選包括以高效形式篩選會選擇性對經基因改造的致腫瘤細胞有毒的數百或數千種化合物。在本發明的一個具體實例中，選擇性毒性是在與候選藥劑接觸之後藉由比較試驗細胞(即經基因改造的致腫瘤細胞)與控制組細胞的細胞存活性而測定的。適當的控制組是與試驗細胞同種類細胞的細胞，但是控制組細胞沒有經基因改造成致腫瘤。例如，控制組細胞可以是試驗細胞所源自之親代原代細胞。控制組細胞是在與試驗細胞相同的條件下和候選藥劑接觸的。適當的控制組可以是同時進行，或可以是預先建立好的(例如 預先建立好的標準品或參考組)。在一些具體實例中，候選藥劑是選自化合物資料庫，諸如綜合的資料庫。細胞存活性可以藉由許多技藝中已知方法的任一種來測定之，包括使用染劑，諸如鈣黃綠素乙醯氧甲基酯(鈣黃綠素AM)以及愛拉馬爾藍。在一些本發明的具體實例中，染劑諸如鈣黃綠素AM是在以候選藥劑處理之後用來測試及控制細胞的。在活細胞中，鈣黃綠素AM會被細胞內酯酶切割，會形成陰離子螢光衍生物鈣黃綠素，該衍生物無法擴散到活細胞外。所以，當與鈣黃綠素AM培養時，活細胞會顯現綠色螢光，但是死細胞就不會。可以偵測活細胞所展現的綠色螢光並藉以提供細胞存活性的測量。
在本發明的一些具體實例中，已被鑑認會選擇性誘發經基因改造之致腫瘤細胞細胞死亡的藥劑被進一步在動物模式中被定性。動物模式包括小鼠、大鼠、兔子、以及猴，可以是非基因轉殖的(例如 野生型)或經基因轉殖的動物。會選擇性誘發經基因改造的致腫瘤細胞之細胞死亡的藥劑之影響可以在動物模式中評估任何數量的影響，諸如其在動物致腫瘤細胞中選擇性誘發細胞死亡的能力以及其對於動物的一般性毒性。例如，該方法可包含進一步評估在適當的鼠類模式中藥劑(藥物)對於致腫瘤細胞的選擇性毒性。
會誘發經基因改造的致腫瘤細胞死亡之藥劑的影響可以在動物模式評估任何的影響，諸如其在動物致腫瘤細胞中誘發死亡的能力以及其對於動物的一般性毒性。例如，該方法可包含進一步評估在適當的鼠類模式中藥劑(藥物)對於致腫瘤細胞的毒性。用以說明，可使用腫瘤生長試驗進一步分析此藥劑，該試驗係評估所試驗之藥劑在小鼠中抑制經建立之固態腫瘤生長的能力。該試驗可藉由將腫瘤細胞植入裸鼠脂肪墊中來進行。然後，在給藥之前，讓腫瘤細胞生長至一定大小。在指定週數內(例如 三週)監測腫瘤的體積。在試驗期間也監測受試動物的一般健康狀況。
在本發明的額外具體實例中，被鑑認為會選擇性殺死或抑制經基因改造之致腫瘤細胞的生長/增生的藥劑是進一步用細胞為基的試驗評估其作用機制來定性。例如，該藥劑可以用凋亡試驗分析以評估其藉由前凋亡路徑方式誘發細胞死亡的能力。在本發明進一步的具體實例中，分析會誘發腫瘤細胞死亡的藥劑藉由非凋亡路徑誘發致腫瘤細胞死亡的能力。例如，該藥劑可以用凋亡試驗來分析，以評估其是否無法藉由前凋亡路徑方式誘發細胞死亡。
在其他具體實例中，本發明係關於鑑認藥劑(藥物)的方法，該藥劑係會選擇性抑制經基因改造細胞的細胞毒性者。在一具體實例中，本發明係關於鑑認會抑制細胞毒性之藥劑(藥物)的方法，該方法包含將試驗細胞與候選藥劑接觸；測定與候選藥劑接觸之該試驗細胞的存活性；以及將試驗細胞的存活性與適當之控制組的存活性相比較。如果試驗細胞的存活性比控制組細胞的存活性高，則會選擇性抑制細胞毒性的藥劑(藥物)就被鑑認出來了。適當的控制組是與試驗細胞相同種類的細胞，但是控制組細胞是並未經基因改造以表現會造成毒性之蛋白質者。例如，控制組細胞可以是試驗細胞所衍生自的親代原代細胞。控制組細胞是在與試驗細胞相同條件下與候選藥劑接觸的。適當的控制組可以是同時進行的，或可以是預先建立好的(例如預先建立好的 標準品或參考組)。
在一些具體實例中，本發明之基因型選擇性化合物(抗腫瘤藥劑)可以是任何化學物(元素、分子、化合物、藥物)，不論是合成製造的、藉由重組技術製造的、或是從天然來源分離出的。例如，這些化合物可以是肽類、多肽、類肽(peptoid)、糖類、荷爾蒙、或核酸分子(諸如反義或RNAi核酸分子)。此外，這些化合物可以是小分子或是藉由(例如)組合化學所製造之更複雜的分子，並且被收集到資料庫裡。這些資料庫可包含(例如)醇、鹵烷、胺、醯胺、酯、醛、醚以及其他種類的有機化合物。這些化合物也可以是天然的或遺傳上經基因改造的產物，係從細胞－－細菌、動物或植物－－的溶解物或生長培養物中分離出來的，或可以是該細胞溶解物或生長培養物本身。這些化合物可以經分離的形式或以化合物之混合物送交試驗系統，尤其是一開始的篩選步驟。
本發明之基因型選擇性化合物
申請人的結果證明了在特定基因物質存在下鑑認具有增加的功效及活性之化合物是可能的。雖然先前的報導指出在一種感興趣的基因物質的情況下，鑑認這類基因型選擇性化合物是可能的(Simons等人, 2001,Genome Resll,266－73；Stockwell等人, 1999,Chem Biol 6,71－83；Torrance等人, 2001,Nat Biotechnol 19,940－5)，但本文所述之工作提供了合成致命性的系統性測試，使用了大於23,000種化合物及一或更多種腫瘤相關的基因元素。
九種被鑑認出來的選擇性化合物幫助決定了將TERT以及一或更多個LT、ST、E6、E7和致癌RAS置入正常人類細胞中的結果。這些基因改變的其中一個影響就是增加了細胞增生速度以及使其對於抑制DNA合成的小分子有敏感性。雖然這類藥劑會優先以快速複製的腫瘤細胞為標靶是早已確立的，但是從這個公正的篩選方法中顯現出這個原理則被再次證實了。此外，方法論使其可容易的分辨具有基因選擇性之清楚基礎的化合物以及那些沒有該基礎的化合物。
結果顯示hTERT以及E7或LT其一之表現會使細胞對拓撲異構酶II毒性敏感。由於在大多數人類腫瘤中會發現到RB減少或不活化(Sellers與Kaelin,1997,J Clin Oncol15, 3301－12；Sherr,2001,Nat Rev Mol Cell Biol2, 731－7)以及端粒酶活化(Hahn與Weinberg,2002,Nat Rev Cancer 2,331－41；Harley,1994,Pathol Biol(Paris)42, 342－5)，因此這些觀察可(部分)解釋在廣泛種類的人類腫瘤中這些藥劑的活性。
申請人發現喜樹鹼會選擇性地對具有ST 以及致癌RAS 兩者的細胞有致命性，是因為這兩個基因對於拓撲異構酶I表現的結合影響。快速分裂的腫瘤細胞係使用拓撲異構酶I來解開超螺旋DNA以進行持續且快速的細胞分裂。當這兩個路徑同時被改變時，拓撲異構酶I會被調升(也許是間接的)，且這腫瘤細胞會對拓撲異構酶I毒性有敏感性。
這些觀察說明了ST加上RASV 1 2 、LT和hTERT來轉型人類細胞的能力一方面可能是ST和RASV 1 2 對於拓撲異構酶I之表現的影響。HRAS 以及KRAS 的突變已在許多種類的人類腫瘤中被描述到。此外，PPP2R1B (是PP2A的一部分)的不活化最近已在結腸腫瘤以及肺部腫瘤中被報導(Wang等人, 1998,Science282, 284－7)，而不同PP2A次單元的突變已被描述在黑色素瘤、肺癌、乳癌以及結腸癌中(Calin等人, 2000,Oncogene19, 1191－5；Kohno等人, 1999,Cancer Res59, 4170－4；Ruediger等人, 2001,Oncogene20, 1892－9；Ruediger等人, 2001,Oncogene20, 10－5)。目前，仍然不清楚這兩個路徑的同時改變是否在人類腫瘤中高頻率的發生，或者在這兩路徑被混亂的腫瘤中是否顯現了對於這些化合物的敏感性增加。
此外，申請人鑑認出新穎的化合物，稱為愛拉斯汀(參見圖8)，是對於表現ST和RASV 1 2 兩者的細胞有致命性的。即使使用了八倍於要觀察到對表現了RASV 1 2 以及ST兩者之細胞產生影響所需的濃度，用這個化合物處理細胞無法殺死缺乏RASV 1 2 以及ST的細胞，表示有一定程度的專一性。愛拉斯汀的致命影響一旦存在就是快速且無法回復的。
愛拉斯汀可被用於誘發任何腫瘤細胞的細胞死亡，其中腫瘤細胞與愛拉斯汀接觸會導致細胞死亡。可以藉由愛拉斯汀的活性來產生致命性的致腫瘤細胞不只包括了經基因改造的致腫瘤細胞，諸如表現ST和RASV 1 2 兩者之經基因改造的細胞，還包括了具有與ST和RASV 1 2 表現無關之經活化的RAS路徑的致腫瘤細胞。
申請人額外測試了135種愛拉斯汀相似物之活性以及對於腫瘤細胞和正常細胞的選擇性。這些相似物中有134種是不活性的。有一種是有活性的並且被選取，但是比愛拉斯汀功效差。這個化合物被稱為愛拉斯汀B(參見圖8)。在一些本發明的具體實例中，本發明係關於化合物愛拉斯汀。在進一步的具體實例中，本發明係關於化合物愛拉斯汀的相似物，該相似物顯現了對於經基因改造的致腫瘤細胞(諸如經基因改造的人類致腫瘤細胞)有選擇性毒性。在一具體實例中，顯現了對於經基因改造的人類致腫瘤細胞有選擇性毒性的愛拉斯汀的相似物是愛拉斯汀B。在一些具體實例中，本發明係關於本發明化合物的消旋混合物，該混合物顯現了對於經基因改造的致腫瘤細胞有選擇性毒性。
對於喜樹鹼(CPT)及愛拉斯汀兩者，申請人鑑認出由RASV 1 2 和ST表現而改變的路徑之間有協同作用。RASV 1 2 的表現會造成一些特點已詳知之訊號路徑活化，該些路徑包括RAF－MEK－MAPK訊號級聯反應、磷脂醯肌醇3－激酶(PI3K)訊號路徑以及Ra1－鳥苷酸解離離因子路徑(Ra1－GDS)。每個這些路徑都被指出與人類癌症相牽連，而近來的研究證實這些路徑在這個細胞轉型系統中協同作用(Hamad等人, 2002,Genes Dev16, 2045－57)。此外，ST會結合至PP2A且不活化之，PP2A是廣泛表現的絲胺酸－羥丁胺酸磷酸酶。雖然仍不知道因ST表現而受擾亂之PP2A的特定酵素標靶，受PP2A和RAS改變之路徑之間有相當多的重疊(Millward等人, 1999,Trends Biochem Sci24, 186－91)。進一步了解愛拉斯汀誘發具有這兩個訊號路徑改變之細胞死亡的機制可為這兩個路徑之間的功能性重疊之本質和程度提供線索。
除了愛拉斯汀B以及愛拉斯汀A，本發明的愛拉斯汀相似物是由一般式I所表示：
其中R1 是選自H、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是位在相同N上且R2 或R4 其一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；W是選自、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z是各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團的端點。
在一些較佳的具體實例中，當R2 和R4 兩者是位在相同的N原子上時，它們是都為H或者是不相同的。
在一些具體實例中，R1 是H。
在一些具體實例中，W是。
在一些具體實例中，R4 是選自H或經取代的或未經取代的較低碳數烷基。
在一些具體實例中，R1 是H，W是，以及R4 是選自H或經取代的或未經取代的較低碳數烷基。
例示的式I化合物包括：
本發明其他的愛拉斯汀相似物是由一般式II所表示：
其中Ar是經取代的苯基；R1 是選自H、C1 － 8 烷基、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是位在相同N上且R2 或R4 其一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z是各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點。
在一些具體實例中，R5 代表1－4個取代基，諸如鹵素或硝基。在一些具體實例中，R5 代表一個取代基，諸如鹵素或硝基，尤其是氯，是位在喹唑啉酮環之羰基的對位。在其他的具體實例中，R5 代表沒有取代基在環上(即所有的取代基都是氫原子)。
在一些具體實例中，Ar是經單一取代的，其中該取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。在一些具體實例中，在Ar鄰位有一取代基，其中該取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。在一些具體實例中，Ar是2,6－二取代的，使得一個取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基，而第二個取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。
在一些具體實例中，式II化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵之鄰位之取代基是乙氧基者。在進一步的具體實例中，式II化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵之鄰位不具有較低碳數的烷氧基或較低碳數的烷基取代基者。
在一些式II化合物的具體實例中，Ar具有至少一個鹵素取代基。在一些具體實例中，Ar的鄰位具有鹵素取代基。在較佳的具體實例中，式II化合物包括那些Ar是2,6－二取代的苯環，其中該取代基是鹵素原子。
例示的式II化合物包括：
本發明其他的愛拉斯汀相似物是由一般式III所示：
其中Ar是經取代的或未經取代的苯基；R1 是選自H、C1 － 8 烷基、－Z－Q－Z、－C1 － 8 烷基－N(R2 )(R4 )、－C1 － 8 烷基－OR3 、3－至8－員的碳環或雜環、芳基、雜芳基、以及C1 － 4 芳烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、雜芳基、醯基、烷基磺醯基、以及芳基磺醯基，前提是當R2 和R4 兩者是位在相同N原子上時，它們是兩者均為H或者是不相同的，且當R2 和R4 兩者是位在相同的N上且R2 或R4 其一是醯基、烷基磺醯基、或芳基磺醯基時，則另一個是選自H、C1 － 8 烷基、芳基、C1 － 4 芳烷基、以及雜芳基；R3 是選自H、C1 － 4 烷基、C1 － 4 芳烷基、芳基、以及雜芳基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是選自、、、、、或；Q是選自O和NR2 ；以及Z是各次出現時是獨立的選自C1 － 6 烷基、C2 － 6 烯基、以及C2 － 6 炔基。當Z是烯基或炔基基團時，雙鍵或三鍵較佳的不是位在該基團端點。
在一些具體實例中，R5 代表其所連接之環上的從1－4個取代基，諸如鹵素或硝基。在一些具體實例中，R5 代表一個取代基，諸如鹵素或硝基，尤其是氯，係位在喹唑啉酮環之羰基的對位。在其他的具體實例中，R5 代表沒有取代基在環上(即所有的取代基都是氫原子)。
在一些具體實例中，式III化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵的鄰位之取代基是乙氧基者。在進一步的具體實例中，式III化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵的鄰位不具有較低碳數的烷氧基或較低碳數的烷基取代基者。
在本發明較佳的具體實例中，Ar是經取代的苯基。在一些式III化合物的具體實例中，Ar有至少一個鹵素取代基。在一些具體實例中，Ar在鄰位有鹵素取代基。在較佳的具體實例中，式III化合物包括那些其中Ar是2,6－二取代的苯環，其中該取代基是鹵素原子。
例示的式III化合物包括：
本發明其他的愛拉斯汀相似物是由一般式IV所表示：
其中Ar是經取代的或未經取代的苯基；R1 是C1 － 8 烷基；R2 和R4 各次出現時是各自獨立的選自H和C1 － 8 烷基；R5 代表其所連接之環上的0－4個取代基；W是選自、、、、、或；以及Q是選自O和NR2 。
在一些具體實例中，R5 代表其所連接之環上的從1－4個取代基，諸如鹵素或硝基。在一些具體實例中，R5 代表一個取代基，諸如鹵素或硝基，尤其是氯，係位於喹唑啉酮環之羰基的對位。在其他具體實例中，R5 代表沒有取代基在環上(即所有的取代基都是氫原子)。
在本發明較佳的具體實例中，Ar是經取代的苯基。在一些具體實例中，Ar是經單一取代的，其中該取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。在一些具體實例中，Ar在鄰位有取代基，其中該取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。在一些具體實例中，Ar是2,6－二取代的，使得一個取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基，而第二個取代基是鹵素、較低碳數的烷氧基、或較低碳數的烷基。
在一些具體實例中，式IV化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵的鄰位之取代基是乙氧基者。在進一步的具體實例中，式IV化合物不包括那些Ar上接至喹唑啉酮環之氮的鍵的鄰位不具有較低碳數的烷氧基或較低碳數的烷基取代基者。
在一些式IV化合物的具體實例中，Ar有至少一個鹵素取代基。在一些具體實例中，Ar在鄰位具有鹵素取代基。在較佳的具體實例中，式IV化合物包括那些其中Ar是2,6－二取代的苯環，其中該取代基是鹵素原子。
例示的式IV化合物包括：
本發明其他的愛拉斯汀相似物是由一般式V所表示：
其中R1 是選自H和C1 － 8 烷基；R2 是選自H和C1 － 8 烷基；R3 是選自鹵素、C1 － 8 烷氧基以及C1 － 8 烷基；R4 是選自H、鹵素、C1 － 8 烷氧基以及C1 － 8 烷基；R5 是選自H、鹵素和硝基；以及n是1或2。
例示的式V化合物包括：
任何式I－V的化合物都可被用於本文所述之用於愛拉斯汀以及愛拉斯汀相似物的任何方法。
涵蓋在本發明中的化合物包括本文揭露之化合物的鏡像異構物及非鏡像異構物。本發明也包括了鹽類，尤其是本文揭露之化合物的醫藥上可接受的鹽類。此外，本發明包括本文所揭露之化合物的溶劑合物(solvate)、水合物以及同質異形的結晶形式。
適合的藥劑可在所存在的形式下或完全或部分代謝之後具有所述之活性。
本發明也提供來合成或製造本發明之化合物。
在一些具體實例中，本發明提供了化合物A的製造，其中R5 和R1 係如結構II－V中的所述。在一些具體實例中，合成化合物A之步驟是化合物B與化合物C的反應。
在一些具體實例中，化合物B與化合物C的反應是在極性非質子性溶劑中進行的，該溶劑諸如乙腈、DMSO、二乙醚、丁酮、環己酮、苯乙酮、四氫呋喃、丙酮、二氯甲烷、環丁碸、或二甲基甲醯胺。在較佳的具體實例中，該溶劑是二氯甲烷或二甲基甲醯胺。在一些具體實例中，反應是在氮氣壓下進行的。在一些具體實例中，有機鹼諸如吡啶、二異丙基胺、2,6－二甲基吡啶、三烷基胺(例如三乙基胺)、吡咯啶、咪唑或哌啶被添加至化合物B的溶液中，然後添加化合物C成為結果溶液。在較佳的具體實例中，該有機鹼是胺鹼，諸如三烷基胺，例如三乙基胺。在較佳的具體實例中，反應是在0－10℃的範圍內進行的。
本發明進一步提供了結構D化合物的製造，其中R5 、R1 以及Ar如結構II－V中所述的。在一些具體實例中，合成D的步驟是化合物A與化合物E，Ar－NH2 ，的反應。
在一些具體實例中，化合物A與化合物E的反應是在極性非質子性溶劑中進行的，該溶劑諸如乙腈、DMSO、二乙醚、丁酮、環己酮、苯乙酮、四氫呋喃、丙酮、二氯甲烷、環丁碸、或二甲基甲醯胺。在較佳的具體實例中，該溶劑是乙腈。在一些具體實例中，該反應是在氮氣壓下進行的。在一些具體實例中，反應是在三氯膦存在下進行的。在一些具體實例中，該反應是維持在40－60℃範圍一段時間，諸如5－15個小時。在其他具體實例中，三氯化磷醯被添加至攪拌的A和E的溶液中，而將所得到的混合物加熱迴流一段時間，諸如1－5個小時。
本發明也提供結構F化合物的製造，其中R5 、R1 、Ar以及W是如結構II－V中所述。在一些具體實例中，合成化合物F的步驟是化合物D與HNR2 的反應，其中HNR2 是相當於HW。在一些具體實例中，反應是在極性非質子性溶劑中，在碳酸鉀以及碘化物來源存在下進行的，該碘化物例如碘化銅、碘化鉀、碘化銫、碘化鈉、或碘化四丁基銨。在一些具體實例中，化合物D和碳酸鉀是被混合的，且添加了HNR2 ，然後添加碘化物來源。在較佳的具體實例中，該溶劑是乙腈。在一些具體實例中，該碘化物試劑是碘化四丁基銨；在一些具體實例中，該碘化物試劑是碘化鈉。在一些具體實例中，該混合物是維持在50－70℃範圍一段時間，例如5－15個小時。
在一些具體實例中，HNR2 (HW)包括了其上有胺保護基團的第二個氮原子。在一些具體實例中，該保護基團可以是第三丁氧羰基、苯甲基氧羰基、烯丙基氧羰基、9－芴基甲氧羰基、2－(三甲基矽烷基)乙氧羰基、或2,2,2－三氯乙氧羰基。在一些具體實例中，反應是在極性非質子性溶劑中在鹼以及碘化物來源存在下進行的，該鹼例如碳酸鉀、碳酸鈉、吡啶、二異丙基胺、2,6－二甲基吡啶、三乙基胺、吡咯啶、咪唑、或哌啶。在一些具體實例中，該鹼是碳酸鉀或三乙基胺。在一些具體實例中，化合物D以及該鹼是被混合的，且添加了HNR2 ，然後添加碘化物來源。在較佳的具體實例中，該溶劑是乙腈或丙酮。在一些具體實例中，該碘化物試劑是碘化四丁基銨；在一些具體實例中，該碘化物試劑是碘化鈉。在一些具體實例中，該混合物是維持在70－90℃範圍一段時間，諸如1－10個小時。在完成加成反應之後，可以藉由適合的去保護反應將保護基團從所得到的產物中移除。例如，當保護基團是第三丁氧羰基時，可以藉由添加酸至化合物溶液中來移除保護基團(例如將於二烷中的4N HCl溶液添加至在二烷中的產物溶液中)。在一些具體實例中，然後在中和混合物之前，用水以及有機溶劑稀釋該反應物。在一些具體實例中，藉由添加飽和的碳酸鈉水性溶液將該混合物變成鹼性的。
應預期到所有本發明中的具體實例可以與一或更多個其他具體實例合併，甚至是那些描述在本發明不同方面的具體實例。
術語「醯基」是技藝中所能理解的，是指由一般式烴基C(O)－所表示的基團，較佳的是烷基C(O)－。
術語「醯胺基」是技藝中所理解的，是指經醯基基團所取代的胺基基團，可以由(例如)烴基C(O)NH－化學式來表示。
術語「醯氧基」是技藝中所理解的，是指由一般式為烴基C(O)O－所表示的基團，較佳的是烷基C(O)O－。
術語「烷氧基」是指有氧連結於其上之烷基基團。代表性的烷氧基基團包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、第三丁氧基以及類似物。
術語「烷氧基烷基」是指經烷氧基基團取代的烷基基團，可以是由一般式為烷基－O－烷基來表示。
在本文中術語「烯基」是指含有至少一個雙鍵的脂肪族基團，且意欲包括「未經取代的烯基」以及「經取代的烯基」兩者，後者是指烯基部分有取代基取代了烯基基團之一或更多個碳上的氫。這類取代基可發生在包括在或不包括在一或更多個雙鍵之一或更多個碳上。此外，這類取代基包括了所有那些烷基基團中所想到的，如下所述，除了其中安定性係被禁止者。例如，烯基基團被一或更多個烷基、碳環基、芳基、雜環基、或雜芳基基團所取代是是預期中的。
術語「烷基」是指飽和的脂肪族基團，包括直鏈烷基基團、支鏈烷基基團、環烷基(脂環族)基團、烷基經取代的環烷基基團、以及環烷基經取代的烷基基團。在較佳的具體實例中，直鏈或支鏈烷基在其骨架中有30或更少個碳原子(例如直鏈是C1 －C3 0 、支鏈是C3 －C3 0 )，較佳的是20或更少個。同樣的，較佳的環烷基在其環結構中有從3－10個碳原子，較佳的在其環結構具有5、6或7個碳。
此外，本說明書、實施例、以及申請專利範圍中所用的術語「烷基」(或「較低碳數的烷基」)是意欲包括「未經取代的烷基」以及「經取代的烷基」，後者是指烷基部分有取代基將碳氫化合物骨架中的一或更多個碳上的氫取代了。這類取代基可包括(例如)鹵素、羥基、羰基(諸如羧基、烷氧基羰基、甲醯基、或醯基)、硫代羰基(諸如硫酯、硫代醋酸根、或硫代甲酸根)、烷氧基、磷酸基、磷酸根、膦酸根、亞膦酸根(phosphinate)、胺基、醯胺基、脒基、亞胺基、氰基、硝基、疊氮基、硫氫基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺醯基、磺醯胺基、磺醯基、雜環基、芳烷基、或芳香族或雜芳香族部分(moiety)。熟習此技藝的人能了解到(如果適當的話)取代在碳氫化合物鏈上的部分(moiety)本身是可以被取代的。例如，經取代的烷基之取代基可包括經取代及未經取代形式的胺基、疊氮基、亞胺基、醯胺基、磷酸基(包括膦酸根和亞膦酸根)、磺醯基(包括硫酸根、磺醯胺基、氨磺醯基和磺酸根)、以及矽烷基基團、還有醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸、以及酯)、－CF3 、－CN和類似物。例示的經取代的烷基描述於下。環烷基可以進一步經烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、胺基烷基、經羰基取代的烷基、－CF3 、－CN、以及類似物所取代。
當術語「Cx － y 」與化學部分(moiety)諸如醯基、醯氧基、烷基、烯基、炔基、或烷氧基一起使用時是包括鏈中含有從x至y個碳的基團。例如，術語「Cx － y 烷基」是指經取代的或未經取代的飽和碳氫化合物基團，包括鏈中含有從x至y個碳的直鏈烷基以及支鏈烷基基團，包括鹵化烷基基團諸如三氟甲基和2,2,2－三氟乙基等等。當C0 烷基位於終端位置時是指氫，當位於內部時是指鍵結。術語「C2 － y 烯基」以及「C2 － y 炔基」是指經取代的或未經取代的未飽和脂肪族基團，與上述之烷基有相似的長度和可能取代，但是分別包括至少一個雙鍵或三鍵。
本文所用的術語「烷基胺基」是指經至少一個烷基基團取代的胺基基團。
本文所用的術語「烷硫基」是指經烷基基團取代的硫醇基基團，且可以由一般式烷基S－來表示。
在本文中的術語「炔基」是含有至少一個三鍵的脂肪族基團，且意欲包括「未經取代的炔基」以及「經取代的炔基」兩者，後者是指炔基部分有取代基取代了炔基基團之一或更多的碳上的氫。這類取代基可發生於包括在或不包括在一或更多個三鍵中的一或更多個碳上。此外，這類取代基包括了所有在烷基基團中能預期到的那些，如上所述，除了其中安定性係被禁止者。例如，炔基基團被一或更多個烷基、碳環基、芳基、雜環基、或雜芳基基團取代是可預期的。
在本文中術語「醯胺」是指基團，其中R9 和R1 0 各自獨立代表氫或烴基基團，或R9 和R1 0 以及其所連接的N原子一起形成環結構具有從4至8個原子的雜環。
術語「胺」以及「胺基」是技藝中所認知的，是指未經取代的和經取代的胺兩者以及其鹽類，例如，部分(moiety)可被表示為
其中R9 、R1 0 、和R1 0 ’ 各自獨立代表氫或烴基基團，或R9 和R1 0 以及其所連接的N原子一起形成環結構具有從4至8個原子的雜環。
在本文中術語「胺基烷基」是指經胺基基團取代的烷基基團。
在本文中術語「芳烷基」是指經芳基基團取代的烷基基團。
在本文中術語「芳基」包括經取代的或未經取代的單環芳香族基團，其中環中的各個原子是碳。該環較佳的是5－至7－員環，更佳的是6－員環。術語「芳基」也包括具有二或更多個環狀環的多環狀環系統，其中有兩個或更多個碳是兩相鄰的環所共用的，其中至少一個環是芳香族，例如，其他的環狀環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、及/或雜環基。芳基基團包括苯、萘、菲、酚、苯胺、以及類似物。
術語「胺基甲酸根」是技藝中所認知的，是指或基團，其中R9 和R1 0 獨立的代表氫或烴基基團。
在本文中術語「碳環」、「碳環基」、以及「碳環狀」是指非芳香族飽和的或未飽和的環，其中環中的各個原子是碳。碳環狀環較佳的包括從3至10個原子，更佳的從5至7個原子。
在本文中術語「碳環基烷基」是指經碳環基團取代的烷基基團。
術語「碳酸根」是技藝中所認知的，是指－OCO2 －R9 基團，其中R9 代表烴基基團。
在本文中術語「羧基」是指由－CO2 Ha式所表示的基團。
在本文中術語「酯」是指－C(O)OR9 基團，其中R9 代表烴基基團。
在本文中術語「醚」是指烴基基團透過氧而與另一個烴基基團相連結。所以，烴基基團的醚取代基可以是烴基－O－。醚可以是對稱的或不對稱的。醚的例子包括(但不限於)雜環－O－雜環以及芳基－O－雜環。醚包括「烷氧基烷基」基團，其可以由一般式烷基－O－烷基所表示。
在本文中術語「鹵」以及「鹵素」是指鹵素，並且包括了氯、氟、溴、和碘。
在本文中術語「雜芳烷基(hetaralkyl)」以及「雜芳烷基(heteroaralkyl)」是指經雜芳基基團取代的烷基基團。
術語「雜芳基(heteroaryl)」以及「雜芳基(hetaryl)」包括經取代的或未經取代的芳香族單環結構，較佳的是5－至7－員環，更佳的是5－至6－員環，其環結構包括了至少一個雜原子，較佳的一至四個雜原子，更佳的一或二個雜原子。術語「雜芳基(heteroaryl)」以及「雜芳基(hetaryl)」也包括具有二或更多個環狀環的多環狀環系統，其中有兩個或更多個碳是兩鄰接的環所共用，其中至少有一個環是雜芳香族，例如，其他的環狀環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、及/或雜環基。雜芳基基團包括(例如)吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪、和嘧啶、以及類似物。
在本文中術語「雜原子」是指碳或氫以外的其他原子。較佳的雜原子是氮、氧、以及硫。
術語「雜環基」、「雜環」、以及「雜環的」是指經取代的或未經取代的非芳香族環結構，較佳的是3－至10－員環，更佳的是3－至7－員環，其環結構包括至少一個雜原子，較佳的是一至四個雜原子，更較佳的是一或二個雜原子。術語「雜環基」以及「雜環的」也包括具有二或更多個環狀環的多環狀環系統，其中有二個或更多個碳是兩相鄰之環所共用的，其中至少一個環是雜環，例如，其他環狀環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、及/或雜環基。雜環基基團包括(例如)哌啶、吡、吡咯啶、嗎啉、內酯、內醯胺、以及類似物。
在本文中術語「雜環基烷基」是指經雜環基團取代的烷基基團。
在本文中術語「烴基」是指透過碳原子而相鍵結的基團，不具有＝O或＝S取代基，且典型的具有至少一個碳－氫鍵以及初級碳骨架，但是可視需要包括雜原子。因此，像甲基、乙氧乙基、2－吡啶基、以及三氟甲基基團為了本申請案的目的而被認為是烴基，但諸如乙醯(其在連接碳上具有＝O取代基)以及乙氧(其是透過氧而非碳連接)取代基則不是。烴基基團包括但不限於芳基、雜芳基、碳環、雜環、烷基、烯基、炔基、以及其組合。
在本文中術語「羥烷基」是指經羥基團取代的烷基基團。
當術語「較低數目的(lower)」與化學部分(moiety)諸如醯基、醯氧基、烷基、烯基、炔基、或烷氧基連接使用時，是指包括在取代基中有十個或更少個非氫原子的基團，較佳的是六個或更少個。例如，「較低碳數的烷基」是指包含了十個或更少個碳原子的烷基基團，較佳的為六個或更少個。在一些具體實例中，醯基、醯氧基、烷基、烯基、炔基、或烷氧基取代基在本文中分別是定義為較低碳數的醯基、較低碳數的醯氧基、較低碳數的烷基、較低碳數的烯基、較低碳數的炔基、或較低碳數的烷氧基，不論它們是單獨出現或與其他取代基一同出現，例如詳述為羥烷基以及芳烷基(在這個例子中，例如，當計數烷基取代基的碳原子時，並沒有計數芳基基團中的原子)。
術語「多環基」、「多環」、以及「多環的」是指二或更多的環(例如環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳基、及/或雜環基)，其中有二個或更多個原子是被相鄰之環所共用，例如，該環是「稠合環」。多環的各環可以是經取代的或未經取代的。在一些具體實例中，多環的各個環包括了環有從3至10個原子，較佳的從5至7個原子。
術語「經取代的」是指有取代基取代了部分(moiety)之碳骨架上的一或更多個氫。應了解「取代」或「經...取代的」包括了隱含的前提是這類取代是遵照經取代之原子和取代基的可允許的效價，以及該取代會造成穩定的化合物，例如該化合物不會諸如藉由再排列、環化、脫去反應等等自發性進行轉換作用。在本文中，術語「經取代的」是預期包括有機化合物的所有可允許的取代基。在一廣泛方面，可允許的取代基包括非環狀及環狀、分支的和未分支的、碳環的以及雜環的、芳香族的和非芳香族的有機化合物取代基。可允許的取代基可以是一或更多個以及相同的或不同的適當的有機化合物。基於本發明的目的，雜原子(例如氮)可具有氫取代基及/或任何描述於本文符合該雜原子效價之有機化合物可允許的取代基。取代基可包括任何描述於本文中的取代基，例如鹵素、羥基、羰基(諸如羧基、烷氧基羰基、甲醯基、或醯基)、硫代羰基(諸如硫酯、硫代醋酸根、或硫代甲酸根)、烷氧基、磷酸基、磷酸根、膦酸根、亞膦酸根、胺基、醯胺基、脒基、亞胺基、氰基、硝基、疊氮基、硫氫基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺醯基、磺醯胺基、磺醯基、雜環基、芳烷基、或芳香族或雜芳香族部分(moiety)。熟習此技藝的人會了解到碳氫化合物鏈上經取代的部分本身可以是經取代的，如果適當的話。
除非特定說明是「未經取代的」，否則本文提及化學部分(moiety)時是理解成包括經取代的變異物。例如，當提到「芳基」基團或部分(moiety)時是隱含包括了經取代的以及未經取代的變異物兩者。
術語「硫酸根」是技藝中所認知的，是指－OSO3 H基團、或其醫藥上可接受的鹽類。
術語「磺醯胺」是技藝中所認知的，是指由一般式或所表示的基團，其中R9 和R1 0 獨立代表氫或烴基。
術語「亞碸(sulfoxide)」是技藝中所認知的，是指－S(O)－R9 基團，其中R9 代表烴基。
術語「磺酸根」是技藝中所認知的，是指SO3 H基團、或其醫藥上可接受的鹽類。
術語「碸(sulfone)」是技藝中所認知的，是指－S(O)2 －R9 基團，其中R9 代表烴基。
在本文中術語「硫代烷基」是指經硫醇基基團取代的烷基基團。
在本文中術語「硫酯」是指－C(O)SR9 或－SC(O)R9 基團，其中R9 代表烴基。
在本文中術語「硫代醚」是相當於醚，其中氧被硫所取代。
術語「尿素」是技藝中所認知的，可以是由一般式所表示，其中R9 和R1 0 獨立的代表氫或烴基。
術語「小的有機分子」是指分子量小於2000 amu的非聚合化合物。典型的，這類分子的分子量小於1000 amu，例如小於500 amu。
鑑認基因型選擇性化合物之標靶的方法
在一些具體實例中，本發明係關於主題基因型選擇性化合物(在本文中也稱為「配位子(ligand)」，例如 愛拉斯汀)的用途，其係用於鑑認出牽涉到造成疾病細胞表現型之標靶(在本文中也稱為「細胞成分」，例如 蛋白質、核酸、或脂質)。
在一具體實例中，本發明提供了鑑認涉及致腫瘤之細胞成分的方法，其中致腫瘤細胞(例如經基因改造的人類致腫瘤細胞、組織、器官、有機體或其溶解物或萃取物)被與主題抗腫瘤化合物相接觸；而接觸之後，鑑認出與愛拉斯汀(直接或間接)互相作用的細胞成分，導致鑑認出涉及致腫瘤之細胞成分。在另一具體實例中，本發明提供了鑑認出涉及致腫瘤之細胞成分的方法。在這個方法中，(a)將致腫瘤細胞(諸如經基因改造的人類致腫瘤細胞、組織、器官、有機體或其溶解物或萃取物)與愛拉斯汀抑制劑相接觸並與愛拉斯汀相接觸；以及(b)鑑認出與愛拉斯汀抑制劑(直接或間接)互相作用的細胞成分，該細胞成分係涉及致腫瘤作用。細胞可以依序或同時與愛拉斯汀和愛拉斯汀抑制劑接觸。與愛拉斯汀或本發明之任何藥劑互相作用的細胞成分可以藉由已知的方法來鑑認。
如本文所描述，這些方法的主題化合物(配位子)可以由任何化學方法來製造。或者，主題化合物可以是體內 或試管內 合成之天然生成的生物分子。配位子可以視需要的用另一化合物來衍生。此改造的一個優點是(例如 )在分離配位子以及標靶之後，衍生的化合物可以被用來幫助配位子標靶複合物的收集或配位子收集。衍生基團之非限制的例子包括生物素、螢光素、地谷新配質(digoxygenin)、綠色螢光蛋白質、同位素、聚組胺酸、磁珠、麩胱甘肽S轉移酶、光活化性交聯物或任何其組合。衍生基團也可以與標靶(例如 愛拉斯汀結合蛋白質)一同使用以促進其偵測作用。
根據本發明，標靶(細胞成分)可以是體內 或試管內 合成的天然生成的生物分子。標靶可以包含胺基酸、核酸、糖、脂質、天然產物或任何其組合。本發明的優點是不需要對標靶的身分或功能先有認識。
配位子和標靶之間的互相作用可以是共價或非共價的。視需要的，配位子－標靶對的配位子可以對或不對其他標靶展現有親和性。配位子－標靶對的標靶可以對或不對其他配位子展現有親和性。
例如，配位子和標靶之間的結合可以在蛋白質層次使用試管內 生化方法鑑認之，包括光交聯、經放射線標定的配位子之結合、以及親和性層析法(Jakoby WB等人, 1974,Methods in Enzymology 46：1)。或者，小分子可以被固定在適合的固體支持物或親和性基質上，諸如瓊脂基質，並用來篩選多樣細胞種類及有機體的萃取物。同樣的，小分子可以與細胞、組織、器官、有機體或其溶解物或萃取物接觸，而可以稍後添加固體支持物以得到該些小分子並與標靶蛋白質結合。
表現選殖(expression cloning)可被用在小群蛋白質中來測試標靶(King RW等人,1997,Science 277：973)。肽類(Kieffer等人,1992,PNAS 89：12048)、核苷衍生物(Haushalter KA等人,1999,Curr.Biol.9：174)、以及藥物－牛血清白蛋白(藥物－BSA)複合物(Tanaka等人,1999,Mol.Pharmacol.55：356)已被用於表現選殖中。
另一個可仔細的將配位子結合與編碼有標靶之DNA相連結的有用技術是噬菌體展現技術(phage display)。噬菌體展現技術已被普遍用在單株抗體領域中，在該技術中，肽或蛋白質庫被產生在病毒表面並篩選其活性(Smith GP,1985,Science 228：1315)。對噬菌體篩選結合在固相上的標靶(Parmley SF等人, 1988,Gene 73：305)。噬菌體展現技術的一個優點是cDNA在噬菌體裡，因此不需要有分開的選殖步驟。
非限制性的例子包括了結合反應條件，其中該配位子包含了標識物諸如生物素、螢光素、地谷新配質、綠色螢光蛋白質、放射線同位素、組胺酸標籤、磁珠、酵素或其組合。在本發明的一個具體實例中，標靶可以用機制為基礎的試驗來篩選，諸如用來偵測會與標靶結合之配位子的試驗。這可包括固相或液相結合事件，其中配位子或蛋白質之一或其一之指示劑被偵測。或者，編碼有先前未定義功能之蛋白質的基因可用報導子系統(例如 β－半乳糖酶、螢光素酶、或綠色螢光蛋白質)來轉染進細胞內，並針對該資料庫篩選，較佳的是藉由高效篩選或用資料庫中的個別成員篩選。可以使用其他機制為基礎的結合試驗，例如量測對於酵素活性之影響的生化試驗、標靶和報導系統(例如 螢光素酶或β－半乳糖酶)已被置入細胞中的細胞為基礎的試驗、以及偵測自由能改變之結合試驗。結合試驗的進行可以使用固定在孔洞(well)、珠粒或晶片上的標靶、或被固定化之抗體所抓取的標靶或藉由毛細管電泳解析的標靶。被結合的配位子通常可以用比色法或螢光或表面電漿共振法來偵測。
在一些具體實例中，本發明進一步涵蓋了治療或防止疾病(例如 癌症)的方法，係藉由調整根據本發明所鑑認之標靶(細胞成分)的功能(例如 活性或表現)。用以描述，如果標靶被鑑認會促進腫瘤生長，則可使用醫療藥劑來修改或降低標靶的功能(活性或表現)。或者，如果標靶被鑑認會抑制腫瘤生長，則可使用醫療藥劑來增加標靶的功能(活性或表現)。該醫療藥劑包括但不限於抗體、核酸(例如 用於RNA干擾之反義寡核苷酸或小的抑制性RNA)、蛋白質、小分子(例如本發明之化合物)或類肽。
愛拉斯汀標靶
在一些具體實例中，本發明提供了愛拉斯汀以及愛拉斯汀相似物之標靶，通常在本文中稱為愛拉斯汀標靶。愛拉斯汀標靶可如上述直接或間接結合至愛拉斯汀或愛拉斯汀相似物。視需要的，愛拉斯汀標靶可在細胞內調節化合物(諸如愛拉斯汀或愛拉斯汀相似物)之抗腫瘤活性。例示的愛拉斯汀標靶包括(但不限於)VDAC1、VDAC2、VDAC3、抗增殖蛋白、核糖體結合糖蛋白、Sec61a、以及Sec22b。
電壓依賴性陰離子通道(VDAC)是由不同基因所編碼之孔洞形成蛋白質的家族成員，有至少三種蛋白質產物(VDAC1、VDAC2、以及VDAC3)表現在哺乳動物組織內。VDAC主要被認識的功能性角色是允許對粒線體外膜(ODF)幾乎是自由穿透。參見例如Shoshan－Barmatz等人,2003,Cell Biochem Biophys 39：279－92。VDAC2以及VDAC3在ODF可能比在粒線體中具有替代的結構組織和不同的功能(Hinsch等人,2004,J Biol Chem.279：15281－8)。許多物種之代表性的VDAC序列已被存放在GenBank中。例如，人類VDAC1胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_003365以及NM_003374找到；人類VDAC2胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_003366以及NM_003375找到；還有人類VDAC3胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_005653以及NM_005662找到。
抗增殖蛋白是演化保留之普遍表現的基因。它被認為是細胞增生的負調控子，且可以是一種腫瘤抑制劑(例如Fusaro等人,2003,J.Biol.Chem.278：47853－47861；Fusaro等人,2002,Oncogene 21：4539－4548)。許多物種之代表性的抗增殖蛋白序列已被存放在GenBank裡。例如，人類抗增殖蛋白胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_002625以及NM_002634找到。
核糖體結合糖蛋白(例如I以及II)是似乎涉及到核糖體結合的蛋白質。它們是含量豐富、高度保守性的醣蛋白質，只位於粗面內質網的膜中(例如Fu等人,2000,J.Biol.Chem.275：3984－3990；Crimaudo等人,1987,EMBO J.6：75－82)。許多物種之代表性的核糖體結合糖蛋白序列已被存放在GenBank裡。例如，人類核糖體結合糖蛋白I胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_002941以及NM_002950找到；以及人類核糖體結合糖蛋白II胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_002942以及NM_002951找到。
Sec61－阿法蛋白質被認為在將分泌性和膜多肽嵌入內質網中扮演了角色(參見例如Higy等人,2004,Biochemistry 43：12716－22)。許多物種之代表性的Sec61阿法序列已被存放在GenBank裡。例如，人類Sec61－阿法－I胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_037468以及NM_013336找到；以及人類Sec61－阿法－II胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_060614以及NM_018144找到。
Sec22－貝塔蛋白質被認為在ER－高基氏體蛋白質運輸上扮演了角色，並且與SNARE複合(例如Parlati等人,2000,Nature 407：194－198；Mao等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8175－8180)。許多物種之代表性的Sec61－貝塔序列已被存放在GenBank裡。例如，人類Sec61－貝塔胺基酸和核酸序列可以GenBank編號NP_004883以及NM_004892找到。
在一些具體實例中，本發明係關於藉由愛拉斯汀標靶來鑑認候選抗腫瘤醫療藥劑的方法。在此方法中，與愛拉斯汀標靶結合的或增加或降低愛拉斯汀標靶之功能(例如活性或表現或互相作用)的試驗藥劑可被鑑認為候選抗腫瘤醫療藥劑。該候選抗腫瘤醫療藥劑可進一步在體內或試管內測試其抗腫瘤活性。鑑認候選抗腫瘤醫療藥劑的方法可藉由上述之篩選方法來相似的進行。
遞送方法
本發明的一些具體實例使用了將蛋白質(例如 小t抗原、VDAC、PP2A抑制劑等等)或編碼有此類蛋白質之DNA遞送至標靶細胞的方法，這些可藉由任何標準分子生物學和及分子醫藥技術來達成。下述的具體實例是可被用於此目的之此類技術的一小部分。
在本發明的一個方面，主題蛋白質的表現構築體、或用於產生反義分子的表現構築體，可以被置入任何生物有效的載劑中，例如 能夠有效在體內 將重組的基因轉染進細胞中的任何 調配物或組成物。方法包括將主題基因插入病毒載體中，該載體包括重組反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(adeno－associated virus)、以及單純皰疹病毒－1、或重組的細菌或真核質體。病毒載體可被用來直接轉染細胞；質體DNA可藉由(例如)陽離子脂質體(例如 脂質素(lipofectin))或其衍生物(例如 抗體複合的)、聚離胺酸複合物、葛馬西丁S(gramacidin S)、人工的病毒被膜或其他這類細胞內載體的幫助來遞送，以及直接注射基因構築體或體內進行CaPO4 沉澱。吾人能意識到因為轉導適當的標靶細胞代表了基因治療關鍵的第一個步驟，特定基因遞送系統的選擇會取決於例如預期標靶之表現型以及給藥途徑(例如 局部或全身性)這類因子。
在體內 將編碼有主題蛋白質之一的核酸置入細胞內的較佳方法是藉由使用含有編碼有該基因產物之核酸(例如 cDNA)的病毒載體。用病毒載體感染細胞的優點是大部分的標靶細胞可接收該核酸。此外，編碼在病毒載體中的分子(例如 藉由包括在病毒載體中的cDNA)會在取得了病毒載體核酸的細胞中有效的表現。
反轉錄病毒載體以及腺相關病毒載體通常被認為是用於體內 轉移外生基因之重組基因遞送系統的選擇，特別是轉移進人類。這些載體提供了有效的基因遞送至細胞內，且該轉移的核酸會安定的嵌入宿主之染色體DNA內。因為在嵌入作用之後有長的休眠期而被稱為「慢病毒(lentivirus)」的反轉錄病毒家族亞群是以人類免疫缺乏病毒(HIV)以及貓免疫缺乏病毒(FIV)為代表。衍生自這兩病毒之載體系統已被有效用於臨床前模式，而且顯現出醫療應用上的優秀前景(Humeau等人,Mol Ther.2004,9(6)：902－13；Curran等人,Mol Ther.2000,1(1)：31－8；Engel與Kohn,Front Biosci.199,4：e26－33)。不像大多數的反轉錄病毒，HIV和FIV(以及其所衍生的載體)有轉導非分裂細胞的能力(Humeau等人,Mol Ther.2004,9(6)：902－13；Curran等人,Mol Ther.2000,1(1)：31－8)。這個特質可以是優越的，取決於標靶細胞種類。此外，FIV可藉由其增加的轉基因(transgene)攜帶能力來與其他的反轉錄病毒相區別(Curran等人,Mol Ther.2000,1(1)：31－8)。使用反轉錄病毒的主要先決條件是確保其使用的安全性，尤其是關於野生型病毒在細胞族群之間散佈的可能性。發展只會產生複製缺陷之反轉錄病毒的專門細胞系(稱為「包裝細胞(packaging cell)」)增加了反轉錄病毒在基因治療的效用，而且缺陷反轉錄病毒已被充分定性來用於基因治療目的之基因轉移(回顧請參見Miller,A.D.,Blood 76：271,1990)。因此，可以用編碼有主題多肽的核酸來取代部份的反轉錄病毒編碼序列(gag 、pol 、env )以構築重組的反轉錄病毒，使得該反轉錄病毒有複製缺陷。該複製缺陷的反轉錄病毒然後被包裝進病毒粒子中，藉由標準技術，透過輔助病毒的使用，該病毒粒子可用來感染標靶細胞。製備重組反轉錄病毒以及試管內 或體內 用此病毒感染細胞的流程可在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.M.等人, (eds.),John Wiley & Sons,Inc.,Greene Publishing Associates,(2001),Sections 9.9－9.14和其他標準的實驗室手冊中找到。適合的反轉錄病毒的例子包括pLJ、pZIP、pWE以及pEM，是熟習此技藝的人所熟知的。用於製造親嗜性(ecotropic)和雙嗜性(amphotropic)反轉錄病毒系統之適合的包裝病毒系的例子包括ψ Crip、ψ Cre、ψ 2以及ψ Am。反轉錄病毒已被用來在試管內 及/或體內 將許多基因置入許多不同的細胞種類中，包括神經細胞、上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、肌母細胞、肝細胞、骨髓細胞(參見例如Eglitis等人, Science 230：1395－1398,1985；Danos與Mulligan,PNAS USA 85：6460－6464,1988；Wilson等人, PNAS USA 85：3014－3018,1988；Armentano等人, PNAS USA 87：6141－6145,1990；Huber等人, PNAS USA 88：8039－8043,1991；Ferry等人, PNAS USA 88：8377－8381,1991；Chowdhury等人, Science 254：1802－1805,1991；van Beusechem等人, PNAS USA 89：7640－7644,1992；Kay等人, Human Gene Therapy 3：641－647,1992；Dai等人, PNAS USA 89：10892－10895,1992；Hwu等人, J.Im munol.150：4104－4115,1993；美國專利第4,868,116號；美國專利第4,980,286號；PCT申請案WO 89/07136；PCT申請案WO 89/02468；PCT申請案WO 89/05345；以及PCT申請案WO 92/07573)。
此外，已顯示藉由修改病毒顆粒表面之病毒包裝蛋白質來限制反轉錄病毒的感染範圍並因而限制反轉錄病毒為基礎之載體的感染範圍是可能的(參見例如PCT公開案WO93/25234、WO94/06920、以及WO94/11524)。例如，改造反轉錄病毒載體之感染範圍的方式包括：將對於細胞表面抗原有專一性的抗體與病毒env 蛋白質耦合(Roux等人, PNAS USA 86：9079－9083,1989；Julan等人, J.Gen Virol 73：3251－3255,1992；以及Goud等人, Virology 163：251－254,1983)；或將細胞表面配位子與病毒env蛋白質耦合(Neda等人, J.Biol.Chem.266：14143－14146,1991)。耦合可以是與蛋白質或其他變種之化學交聯形式(例如 乳糖，將env蛋白質轉換成去唾液酸糖蛋白質)，以及藉由產生融合蛋白質(例如 單鏈抗體/env融合蛋白質)。此技術可用於限制或以其他方式主導感染一些組織種類，也可以被用來將親嗜性載體轉換成雙嗜性載體。
另一個可用於本發明的病毒基因遞送系統使用了腺病毒衍生的載體。腺病毒的基因體可被處理成使其編碼有想要的基因產物，但是就其在正常病毒溶解生命週期的複製能力而言是不活性的(參見例如Berkner等人, BioTechniques 6：616,1988；Rosenfeld等人, Science 252：431－434,1991；和Rosenfeld等人,Cell 68：143－155,1992)。衍生自腺病毒株Ad第5型d1324或其他腺病毒株(例如 Ad2、Ad3、Ad7等等)之適合的腺病毒載體是熟習此技藝的人所熟知的。重組腺病毒在一些情況下是優越的，因為它們不能夠感染非分裂的細胞而且可以用來感染許多的細胞種類，包括呼吸道上皮細胞(上述的Rosenfeld等人, (1992))、內皮細胞(Lemarchand等人, PNAS USA 89：6482－6486,1992)、肝細胞(Herz與Gerard,PNAS USA 90：2812－2816,1993)以及肌肉細胞(Quantin等人, PNAS USA 89：2581－2584,1992)。此外，該病毒顆粒是相當穩定、經得起純化和濃縮的，而且如上所述可被改造來影響感染的範圍。此外，被置入的腺病毒DNA(以及其中所包含的外來DNA)並沒有嵌入宿主細胞的基因體中，仍維持游離的，因此避免了因為被置入的DNA嵌入了宿主基因體(例如 反轉錄病毒DNA)中而導致插入性突變誘發而有的潛在問題發生。此外，相對於其他載體遞送系統，腺病毒基因體攜帶外來DNA的能力大(高達八千個鹼基)(前述Berkner等人；Haj－Ahmand與GrahamJ.,Virol.57：267,1986)。現在所使用且因此適用於本發明的大多數複製缺陷腺病毒載體都被刪除了所有的或部分的病毒E1以及E3基因，但保留了80%的腺病毒基因物質(參見例如 Jones等人, Cell 16：683,1979；前述Berkner等人；以及Graham等人, 於Methods in Molecular Biology, E.J.Murray,Ed.(Humana,Clifton,NJ,1991)vol.7.pp.109－127)。插入的主題基因之表現可以在例如E1A啟動子、主要晚期啟動子(MLP)以及相連的領導序列、病毒E3啟動子、或外生性添加啟動子序列的控制之下。
用於遞送主題基因的再一個病毒載體系統是腺相關病毒(AAV)。腺相關病毒是天然生成的缺陷病毒，它需要另一個病毒(諸如腺病毒或皰疹病毒)作為輔助病毒來有效的複製以及多產的生命週期。(回顧請參見Muzyczka等人,Curr.Topics in Micro.Immunol. (1992)158：97－129,1992)。它也是少數幾種可以將其DNA插入非分裂細胞的中的病毒之一，而且顯現了高次數的穩定插入作用(參見例如Flotte等人, Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349－356,1992；Samulski等人, J.Virol.63：3822－3828,1989；以及McLaughlin等人, J.Virol.62：1963－1973,1989)。含有如300鹼基對之AAV一樣少的載體可以被包裝並插入。給外生DNA的空間被縮限到約4.5 kb。如Tratschin等人, Mol.Cell.Biol.5：3251－3260,1985中所描述的AAV載體可以用來將DNA置入細胞中。有許多核酸已利用AAV載體而被置入不同的細胞種類中(參見例如Hermonat等人, PNAS USA 81：6466－6470,1984；Tratschin等人, Mol.Cell.Biol.4：2072－2081,1985；Wondisford等人, Mol.Endocrinol.2：32－39,1988；Tratschin等人, J.Virol.51：611－619,1984；以及Flotte等人, J.Biol.Chem.268：3781－3790,1993)。
其他可在基因治療中被應用的病毒載體系統已從皰疹病毒、牛痘病毒、以及一些RNA病毒來衍生。尤其，皰疹病毒載體可提供一種獨特的策略來維持主題重組基因在中樞神經系統以及眼組織細胞中存留(Pepose等人, Invest Ophthalmol Vis Sci 35：2662－2666,1994)。
除了例如上述之病毒轉移方法之外，非病毒的方法也可以用來使主題蛋白質在動物組織中的表現。基因轉移的大部分非病毒方法是依賴哺乳動物細胞攝取以及在細胞內運送大分子的正常機制。在較佳的具體實例中，本發明之非病毒基因遞送系統是依賴標靶細胞攝取主題基因的胞攝(endocytic)路徑。例示的此類基因遞送系統包括脂質體所衍生的系統、聚離胺酸複合物、以及人工的病毒被膜。
在代表性的具體實例中，編碼有主題多肽的基因可以被包入表面具有正電荷以及(視需要的)用針對標靶組織細胞表面抗原的抗體標示(Mizuno等人, No Shinkei Geka 20：547－551,1992；PCT公開案WO91/06309；日本專利申請案1047381；以及歐洲專利公開案EP－A－43075)之脂質體中(例如 脂質素)。例如，神經膠質瘤細胞的脂質體轉染可以用脂質體來進行，該脂質體上標示有針對神經膠瘤相關抗原之單株抗體(Mizuno等人, Neurol.Med.Chir.32：873－876,1992)。
在又一描述的具體實例中，基因遞送系統包含抗體或與基因結合藥劑交聯之細胞表面配位子(諸如聚離胺酸)(參見例如PCT公開案WO93/04701、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749、以及WO92/06180)。例如，主題基因構築體可被用來體內 轉染特定的細胞，其係使用含有與聚陽離子(例如 聚離胺酸)複合之抗體的可溶性多核苷酸載劑(參見美國專利第5,166,320號)。應了解透過肽類介導的胞攝作用之有效的主題核酸構築體遞送可以藉由使用會增加基因從內涵體結構中逃離的藥劑而被改善。例如，全部的腺病毒或流行性感冒HA基因產物的融合肽類可被用作遞送系統的一部分來誘發含DNA之內涵體的有效破裂(Mulligan等人, Science 260－926,1993；Wagner等人, PNAS USA 89：7934,1992；以及Christiano等人, PNAS USA 90：2122,1993)。
臨床上，基因遞送系統可用許多方法之任何一種來施用於患者，每個方法都是技藝中所熟知的。例如，基因遞送系統的醫藥製劑可被全身性施用，例如藉由靜脈注射，而構築體於標靶細胞之專一性轉導主要是因基因遞送載體、細胞種類或組織種類表現、或其組合所提供之轉染的專一性而發生的，該表現是起因於控制基因表現之轉錄調控序列。在其他的具體實例中，重組基因的起始遞送是較受限的，置入動物中是相當局部的。例如，可藉由導管(參見美國專利第5,328,470號)或藉由立體定位注射(stereotactic injection)(例如 Chen等人, PNAS USA 91：3054－3057,1994)將基因遞送載體置入。
此外，主題蛋白質可以呈與會促進「轉胞吞作用(transcytosis)」(例如 標靶細胞攝取肽類)的第二個肽在一起的融合肽之形式被提供。用以描述，主題蛋白質可以呈融合肽的部分之形式來被提供，該融合肽具有HIV蛋白質Tat之N－端功能域的全部或片段，例如 Tat的1－72個殘基或其可促進轉胞吞作用之更小片段。在其他具體實例中，主題多肽可以呈具有全部或部分觸角足III(antennapedia III)蛋白質的融合多肽之形式被提供。合成的肽類也已被有效的用來運輸蛋白質、肽類以及小分子通過包括血腦障壁在內的生物膜，所以，可以被用在本申請案中。(Rothbard等人,Nat Med.2000,6(11)：1253－7；Rothbard等人,J Med Chem.2002,45(17)：3612－8)。雖然所提供的合成的蛋白質轉導序列例子的特徵在於高密度的精胺酸殘基，但是其他功能相似但結構不相似的分子或序列是可以被取代。
為進一步說明，主題多肽(類肽)可以呈包括了異源肽序列(「內化肽(internalizing peptide)」或「內化功能域(internalization domain)」)的嵌合肽之形式而被提供，而該異源肽序列驅動了細胞外形式的主題多肽序列通過細胞膜的運輸作用，以加速主題多肽在細胞內的定位。就此而言，該醫療主題多肽是細胞內活性的。該內化肽本身能夠藉由例如 轉胞吞作用(transcytosis)以相當快的速度通過細胞膜。該內化肽是與主題多肽複合的(conjugated)，例如 是呈融合蛋白質，視需要的是呈可分割的形式。所得到的嵌合肽會以比單獨的活化子多肽還快的速度被輸送到細胞裡，因此可以提供一種提高其進入所施用之細胞內的方法，例如 增進主題多肽的局部應用。除了蛋白質以及類肽之外，藥劑還可以與會增加物質遞送的化合物相耦合(例如 受體介導的化合物，如維生素B1 2 )。
在一具體實例中，該內化肽是衍生自果蠅觸角足蛋白質、或其同源物。六十個胺基酸長度之同源蛋白質觸角足的同源功能域已被證明會穿過生物膜移動，而且可以加速其所耦合之異源多肽的運輸。參見例如Derossi等人 (1994)J Biol Chem 269：10444－10450；以及Perez等人 (1992)J Cell Sci 102：717－722。已證明了小如16個胺基酸長度的此蛋白質片段已足以驅動內化。參見Derossi等人 (1996)J Biol Chem 271：18188－18193。
本發明也提供了本文所述之多肽(小t抗原或VDAC)或類肽序列，以及足以增加嵌合蛋白質之膜運輸的至少一部分的觸角足蛋白質(或其同源物)，其相對於主題多肽或類肽而言，有統計上顯著的增加。這類多肽或其類肽可被用於主題方法中以促進有效的以及專一性的殺死腫瘤細胞。
另一個內化肽的例子是HIV反式激活蛋白(transactivator；TAT)。這個蛋白質似乎是分成四個功能域(Kuppuswamy等人 (1989)Nuc1.Acids Res.17：3551－3561)。經純化的TAT蛋白質在組織培養中被細胞所攝取(Frankel以及Pabo,(1989)Cell 55：1189－1193)，而肽類(諸如對應於TAT殘基37－62的片段)則在試管內 被細胞快速攝取(Green以及Loewenstein,(1989)Cell 55：1179－1188)。高度鹼性的區域調節了內化作用，並且使該內化的部分(moiety)以細胞核為標靶(Ruben等人, (1989)J.Virol.63：1－8)。
另一個例示的穿越細胞的多肽可以被生成，其包括了足夠增加嵌合蛋白質穿膜運輸的肥大細胞脫粒肽之部分(T.Higashijima等人, (1990)J.Biol.Chem.265：14176)。
不想被任何理論所限制，應注意到親水性多肽也可以藉由將多肽與可運送的肽相耦合或複合來生理運輸通過膜屏障，該可運送的肽是能夠藉由受體介導的轉胞吞作用(transcytosis)穿越膜者。可以使用所有的或部分的例如 組織蛋白、胰島素、運鐵蛋白、鹼性白蛋白、泌乳素以及類胰島素生長因子I(IGF－I)、類胰島素生長因子II(IGF－II)或其他生長因子來產生此種類之適合的內化肽類。例如，已發現對毛細管細胞胰島素受體顯示有親和性而且在血糖降低作用中比胰島素效果差的胰島素片段能夠藉由受體介導的轉胞吞作用(transcytosis)來穿膜運輸，因此可以作為主題穿越細胞肽類以及類肽的內化肽。較佳的生長因子衍生的內化肽類包括EGF(表皮生長因子)衍生的肽類，諸如CMHIESLDSYTC以及CMYIEALDKYAC；TGF－貝塔(轉型生長因子貝塔)衍生的肽類；衍生自PDGF(血小板衍生的生長因子)或PDGF－2的肽類；衍生自IGF－I(類胰島素生長因子)或IGF－II的肽類；以及FGF(纖維母細胞生長因子)衍生的肽類。
另一類的移位/內化肽類顯現了pH依賴性的膜結合。對於內化肽而言(在酸性pH中假定為螺旋狀構形)，內化肽具有兩親性的特性，例如 具有疏水性以及親水性兩界面。特定而言，在大約5.0－5.5的pH範圍內，內化肽會形成阿法螺旋狀的兩親性結構，會促進將部分(moiety)插入標靶膜內。誘發阿法螺旋的酸性pH環境可以在(例如)低pH值的細胞內涵體中找到。此內化肽類可用來促進主題多肽及類肽(是藉由胞攝機制所攝取的)從內涵體區到細胞質的運輸。
較佳的pH依賴性膜結合內化肽包括了高百分比的形成螺旋的殘基，諸如麩胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸以及白胺酸。此外，較佳的內化肽序列包括了pKa's在pH 5－7範圍內的可離子化的殘基，使得足夠的未帶電荷的膜結合功能域會在pH 5存在於肽中而得以插入標靶細胞膜中。
就這一點而言，尤其較佳的pH依賴性膜結合內化肽是aa1－aa2－aa3－EAALA(EALA)4－EALEALAA－醯胺，代表了Subbarao等人 之肽序列的改造(Biochmistry 26：2964,1987)。在這個肽序列中，第一個胺基酸殘基(aa1)較佳的是會加速內化肽化學複合至標靶蛋白質複合物的獨特殘基，諸如半胱胺酸或離胺酸。胺基酸殘基2－3可以選擇來調節內化肽對於不同膜之親和性。例如，如果殘基2以及3兩者都是lys或arg，則內化肽會具有結合至具有負的表面電荷的脂質膜或膜片的能力。如果殘基2－3是中性的胺基酸，則內化肽會插入中性的膜裡。
另一其他較佳的內化肽類包括載脂蛋白A－1以及B的肽類；肽毒素如蜂毒素(melittin)、bombolittin、達爾塔溶血素(delta hemolysin)以及抗菌肽(pardaxin)；抗生素肽類如阿拉黴素(alamethicin)；肽荷爾蒙如降鈣素、促腎上腺皮質激素釋放因子、貝塔安多芬(beta endorphin)、升糖素、副甲狀腺激素、胰多肽；以及對應於許多分泌蛋白之訊號序列的肽類。此外，例示的內化肽類可以透過取代基的連接來改造，該取代基會在酸性pH中增加內化肽之阿法螺旋狀特徵。
又另一類適合用於本發明的內化肽類包括了在生理pH時是「隱藏」的但在標靶細胞內涵體之低pH環境時卻曝露出來的疏水性功能域。當pH誘發展開(unfolding)以及疏水性功能域曝露出來時，該部分(moiety)會結合至脂質雙層並使得共價連接的多肽移位到細胞質去。此內化肽類可以在例如 綠膿桿菌外毒素A、網格蛋白(clathrin)、或白喉毒素中鑑認的序列為樣板。
形成孔洞的蛋白質或肽類也可作為本文的內化肽類。形成孔洞的蛋白質或肽類可以獲得自或衍生自例如C9補體蛋白質、溶細胞T細胞分子或NK細胞分子。這些部分(moieties)能夠在膜中形成類環結構，因而使附著的多肽能被運輸通過膜並進入細胞內部。
僅僅膜插入內化肽就可足夠使主題多肽或類肽移位，通過細胞膜。然而，可以藉由將細胞內酵素的受質(即「附屬肽(accessory peptide)」)連接到該內化肽上來改善移位作用。較佳的，附屬肽是連接到突出細胞膜到細胞質面的內化肽之部分。該附屬肽可以有益的連接到移位/內化部分(moiety)或錨定肽的一端。本發明的附屬部分(moiety)可包括一或更多個胺基酸殘基。在一具體實例中，附屬部分(moiety)可提供了用以進行細胞磷酸化的受質(例如，該附屬肽可包括酪胺酸殘基)。
就這一點而言，例示的附屬部分(moiety)會是N－肉豆蔻醯基轉移酶的肽受質，例如GNAAAARR(Eubanks等人, in：Peptides.Chemistry and Biology,Garland Marshall(ed.),ESCOM,Leiden,1988,pp.566－69)。在這個構築體中，內化肽會被連接到附屬肽的C－端，因為N－端的甘胺酸對於附屬部分(moiety)的活性是關鍵性的。當C－端連接到E2肽或類肽時，這個雜合的肽就被N－肉豆蔻醯化，並進一步固定在標靶細胞膜了，例如 它用來增加細胞膜中該肽的局部濃度。
為進一步描述附屬肽的用途，可被磷酸化的附屬肽先是共價連接到內化肽的C－端，然後將主題多肽或類肽併入融合蛋白質中。融合蛋白質的肽成分插入標靶細胞的細胞膜中，使得附屬肽移位通過膜並且突出到標靶細胞的細胞質中。在細胞膜的細胞質那一側，附屬肽在中性pH值被細胞激酶磷酸化。一旦被磷酸化，附屬肽起作用使融合蛋白質不可逆的固定在膜中。定位至細胞表面的膜可增加多肽移位進入細胞質。
適合的附屬肽類包括了是激酶受質的肽類、具有單一正電荷的肽類、以及包含了被固定在膜上的糖轉移酶糖化之序列的肽類。被固定在膜上的糖轉移酶糖化之附屬肽類可包括x－NLT－x序列，其中「x」可以是(例如)另一個肽、胺基酸、耦合劑或疏水性分子。當這個疏水性三肽與微粒體小泡一起培養時，它會通過小泡的膜、在內腔該側被糖化、以及因為其親水性而被包埋入小泡裡(C.Hirschberg等人, (1987)Ann.Rev.Biochem.56：63－87)。含有x－NLT－x序列的附屬肽類因此會增加對應多肽之標靶細胞停留。
在本發明這一方面的另一具體實例中，附屬肽可被用來增加多肽或類肽與標靶細胞的互相作用。就這一點而言，例示的附屬肽類包括了衍生自含有「RGD」序列之細胞附著蛋白質的肽類、或衍生自含有CDPGYIGSRC序列之層黏蛋白(laminin)的肽類。細胞外間質糖蛋白質如纖維連接蛋白(fibronectin)以及層黏蛋白會透過受體介導的程序結合至細胞表面。三肽序列RGD已被被鑑認為是結合至細胞表面受體所必須的。這個序列是出現在纖維連接蛋白、玻連蛋白(vitronectin)、補體的C3bi、溫韋伯氏因子(von－Willebrand factor)、EGF受體、轉型生長因子貝塔、膠原第I型、大腸桿菌(E.Coli)的λ受體、血織維蛋白元以及辛德比外殼蛋白質(Sindbis coat protein)(E.Ruoslahti,Ann.Rev.Biochem.57：375－413,1988)。會辨認RGD序列之細胞表面受體已被分類到稱為「黏合素(integrin)」相關蛋白質的超家族裡。「RGD肽類」與細胞表面黏合素的結合會促進多肽在細胞表面停留，並且最後移位。
如上所述，內化和附屬肽類可藉由化學交聯或融合蛋白質的形式各自獨立的被加到多肽或類肽上。在融合蛋白質的例子裡，無特定結構的多肽連接子可以被包括在各個肽部分(moieties)之間。
通常來說，內化肽是足以直接輸出多肽的。然而，當有附屬肽時(如RGD序列)，就可能需要包括分泌訊號序列來從其宿主細胞直接輸出融合蛋白質。在較佳的具體實例中，分泌訊號序列是位在N端末端，而且是(視需要的)與介於分泌訊號以及其餘融合蛋白質之間的蛋白水解區相鄰。
在例示的具體實例中，多肽或類肽被基因改造成包括了黏合素結合RGD肽/SV40細胞核定位訊號(參見例如Hart S L等人, 1994；J.Biol.Chem.,269：12468－12474)，例如由Nde1－EcoR1片段所提供之核苷酸序列所編碼的：catatggutgactgccgtggcgatatgttcggttgcggtgctcctccaaaaaagaagagaaaggtagctggattc，它編碼了RGD/SV40核苷酸序列：MGGCRGDMFGCGAPPKKKRKVAGF。在另一具體實例中，蛋白質可用HIV－1 tat(1－72)多肽來基因改造，其中HIV－1 tat(1－72)多肽係例如 由Nde1－EcoR1片段所提供的：catatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtgtttcataacaaaagcccttggcatctcctatggcaggaagaagcgagacagcgacgaagacctcctcaaggcagtcagactcatcaagtttctctaagtaagcaaggattc，它編碼了HIV－1 tat(1－72)肽序列：MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ。又另一具體實例中，融合蛋白質包括了由Nde1－EcoR1片段所提供的HSV－1 VP22多肽(Elliott G.,O'Hare P(1997)Cell,88：223－233)。在又一具體實例中，融合蛋白質包括了VP22蛋白質的C－端功能域例如 核苷酸序列(Nde1－EcoR1片段)。
在一些情況裡，將細胞核定位訊號包括作為主題多肽的一部分也可能是所欲的。生成含有多肽的融合多肽時，可能需要包括無特定結構的連接子來確保各肽的功能域適當的摺疊。許多合成的以及天然的連接子是技藝中已知的，而且可以適用於本發明，包括(Gly3 Ser)4 連接子。
治療方法
在一些具體實例中，本發明提供治療或防止個體之癌症的方法。術語「癌症」、「腫瘤」、以及「腫瘤形成」在本文中是可交替使用的。在本文中，癌症(腫瘤或腫瘤形成)的特徵在於一或更多個下面性質：細胞生長不受環境之正常生化以及物理影響所調控；退行發育(anaplasia)(例如 缺乏正常協調的細胞分化)；以及在一些情況裡，轉移(metastasis)。癌症包括例如肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、慢性淋巴球白血病、慢性骨髓性白血病、子宮內膜癌、毛狀細胞白血病、頭頸癌、肺(小細胞)癌、多發性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、卵巢癌、腦腫瘤、直腸癌、肝細胞癌、卡波西氏肉瘤、肺部(非小細胞癌)、黑色素瘤、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、以及軟組織癌。其他癌症可以在例如Isselbacher等人 (1994)Harrison's Principles of Internal Medicine 1814－1877中找到，併入本文作為參考。
典型的，上述且可以藉由本文所述之方法治療的癌症顯現有無調控的的VDAC表現。在一具體實例中，上述的腫瘤包括了在Ras訊號路徑的突變，導致升高的Ras訊號活性。例如，該突變可能是Ras基因中之組成性活性的突變，例如Ras V12。在其他具體實例中，該腫瘤可包括PP2A的功能缺失突變、及/或MEK1及/或ERK1的活化突變。在一些進一步的具體實例中，該癌症的特徵在於細胞表現SV40小t癌蛋白質、或細胞表現型相似於表現ST、及/或致癌HRAS的細胞。在一些較佳的具體實例中，細胞表現了實質上野生型含量的Rb(例如至少約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、或150%等等)。
在一具體實例中，本發明係關於治療或防止個體癌症的方法，該方法包含將醫療有效量的化合物給藥給個體，該化合物是選擇性地對經基因改造的人類致腫瘤細胞、或特定基因型(或特定改變的基因型)之腫瘤細胞有毒。在一些具體實例中，該癌症的特徵在於細胞含有經活化的RAS路徑。在一些進一步的具體實例中，該腫瘤的特徵在於細胞表現了SV40小T癌蛋白質、或顯現了調節的標靶sT及/或致癌RAS。
在相關的具體實例中，本發明涵蓋將本發明的方法與其他抗腫瘤治療(如習知的直接針對固態腫瘤及用於控制轉移形成的化療)一同實施。本發明的化合物可以在化療期間或之後施用。此藥劑典型的是與醫藥上可接受的載劑調配在一起，而且可以藉由靜脈內、口服、經頰的、非經腸胃的、藉由吸入性噴霧劑、藉由局部施用或經皮膚給藥。藥劑也可以藉由局部給藥。較佳的，與抗腫瘤化療藥劑一同施用的一或更多種其他藥劑(例如本發明之化合物)會以加成或協同的方式抑制癌細胞。
有許多習知的化合物已被顯示具有抗腫瘤的活性。這些化合物已被用來作為化療之醫藥藥劑以使固態腫瘤縮小、防止轉移及進一步生長、或降低白血病或骨髓惡性腫瘤的惡性細胞數目。雖然化療已可有效治療多種惡性腫瘤，但是有許多抗腫瘤化合物會誘發不想要的副作用。在許多例子裡，當結合兩種或更多種不同的治療時，該些治療會協同作用並且使各個治療的劑量降低，因此降低了由各化合物在較高劑量時所產生之有害副作用。在其他例子中，對一治療有抗性的惡性腫瘤可能會對二或更多種不同治療組合的療法有反應。
所以，本發明的化合物及醫藥上組成物可以與習知的抗腫瘤化合物共同給藥。習知的抗腫瘤化合物包括(只用於描述)：氨鲁米特(aminoglutethimide)、安莎克林(amsacrine)、阿納托唑(anastrozole)、天門冬醯胺酶、bcg、必卡他胺、博萊黴素(bleomycin)、布舍瑞林、白消安、喜樹鹼、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽(Clodronate)、秋水仙素(colchicine)、環磷醯胺、賽普特(cyproterone)、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素、柔紅黴素、雙烯雌酚、己烯雌酚、多烯紫衫醇、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦(exemestane)、非格司亭、氟達拉濱、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他濱(gemcitabine)、大豆異黃酮(Genistein)、戈舍瑞林(goserelin)、羥尿素、伊達比星、異環磷醯胺、依麥替尼布(imatinib)、干擾素、愛萊諾迪肯、伊立替康(ironotecan)、來曲唑(Letrozole)、亞葉酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、甲基乙醯氧孕前酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮、美法崙、巰基嘌呤、美司那(mesna)、甲氨喋呤、絲裂黴素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、諾考達唑(nocodazole)、奧曲肽(octreotide)、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米膦酸(pamidronate)、噴司他丁(pentostatin)、普卡黴素(plicamycin)、卟非姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞、美羅華、鏈脲佐菌素、蘇拉明(suramin)、三苯氧胺、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睪丸固酮(testosterone)、硫代鳥嘌呤、塞替哌、二氯鈦烯(titanocene dichloride)、托泊替康、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、維生素A酸、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、以及長春瑞賓。
在其他具體實例中，本發明的化合物和醫藥組成物可以與選自下列之習知抗腫瘤化合物共同給藥：EGF－受體拮抗物、硫化砷、阿德力黴素、順鉑、卡鉑、西咪替丁、洋紅黴素、鹽酸氮芥、五甲基密胺、塞替哌、替尼泊苷、環磷醯胺、苯丁酸氮芥、去甲氧基竹紅菌甲素、美法崙、異環磷醯胺、曲磷胺、曲奧舒凡、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、依托泊苷、異長春鹼、環氧長春鹼、長春地辛、9－胺基喜樹鹼、抗癌妥、crisnatol、甲地孕酮、甲喋呤、絲裂黴素C、海鞘素743、白消安、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、洛伐他汀、1－甲基－4－苯基吡啶離子、司莫司汀、星形孢菌素、鏈脲佐菌素、鈦菁、達卡巴嗪、胺基喋呤、甲氨喋呤、三甲曲沙、硫代鳥嘌呤、巰基嘌呤、氟達拉濱、五史達汀、克拉屈濱、阿糖胞苷(ara C)、紫菜黴素、5－氟尿嘧啶、6－巰基嘌呤、鹽酸阿黴素、亞葉酸、黴酚酸、柔紅黴素、去鐵胺、氟脲苷、脫氧氟脲苷、雷替曲塞、伊達比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、硫酸博來黴素、放線菌素D、沙弗拉素(safracin)、沙弗拉黴素、季諾卡星(quinocarcin)、discodermolides、長春新鹼、長春鹼、長春瑞賓酒石酸、維替泊芬、太平洋紫杉醇、三苯氧胺、雷洛昔芬、太唑呋喃(tiazofuran)、硫代鳥嘌呤、雷巴威林、EICAR、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸鈉、氟他胺、必卡他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、喋啶、烯二炔、左旋咪唑、阿佛拉康(aflacon)、干擾素、介白素、阿地介白素、非格司亭、沙格司亭、美羅華、BCG、維生素A酸、臨德隆、鹽酸吉西他濱、維拉帕米、VP－16、六甲基嘧胺、毒胡蘿蔔素、奧沙利鉑、異丙鉑、四氯環己鉑、洛鉑、DCP、PLD－147、JM118、JM216、JM335、賽特鉑、多烯紫衫醇、去氧太平洋紫杉醇、TL－139、5'－正－脫水長春鹼(之後稱為5'－正－長春鹼)、喜樹鹼、愛萊諾迪肯(伊立替康，CPT－11)、托泊替康(Hycamptin)、BAY38－3441、9－硝基喜樹鹼(Orethecin、魯比替康)、依喜替康(DX－8951)、勒托替康(GI－147211C)、吉馬替康、高喜樹鹼代夫洛莫替康(BN－80915)以及9－胺基喜樹鹼(IDEC－13’)、SN－38、ST1481、卡蘭替星(karanitecin)(BNP1350)、吲哚咔唑(例如 NB－506)、原小檗鹼、茚托利辛、茚異喹啉酮、苯并－吩嗪或NB－506。
在另一個相關的具體實例中，本發明涵蓋了與其他抗腫瘤療法諸如放射線一起實施本方法。在本文中，術語「放射線」是指包括任何藉由光子、中子、電子、或其他種類之離子化放射線的瘤細胞或個體治療。這些放射線包括(但不限於)X－射線、伽瑪射線、或重離子粒子，諸如阿法或貝塔粒子。此外，此放射線可以是放射性的。用射線照射個體之瘤細胞的方法是技藝中所熟知的，且包括例如體外放射線治療、及近接放射治療(brachytherapy)。
測定癌症(腫瘤或腫瘤形成)是否已被治療的方法是熟習此技藝的人所熟知的，且包括(例如)腫瘤細胞數目下降(例如 細胞增生減少或腫瘤尺寸變小)。應認清本發明的治療可以是持續的及完全的反應或可以包含部分的或短暫的臨床反應。參見例如Isselbacher等人 (1996)Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed.,1814－1882，在此併入作為參考。
用來測試敏化作用(sensitization)或腫瘤細胞死亡增加的試驗法是技藝中所熟知的，包括例如評估細胞存活性的標準劑量反應試驗；DNA萃取物的瓊脂凝膠電泳或流式細胞儀測定DNA片段化－一種細胞死亡的特徵；測定牽涉凋亡之多肽活性的試驗；以及細胞死亡形態學徵兆的試驗。關於這些試驗的詳述會在本文中別處說明。其他試驗包括染色質分析(例如 計數經聚集的(condensed)細胞核染色質頻率)或藥物抗性分析，如(例如)Lowe等人 (1993)Cell 74：957－697中所述，併入本文作為參考。也參見美國專利第5,821,072號，也併入本文作為參考。
醫藥組成物
可以對未來的醫療藥劑做概況了解以決定其放在醫藥組成物中的適當性。一種用於此藥劑之常用的方法是治療指數，它是醫療劑量對毒性劑量的比例。醫療劑量(功效)以及毒性劑量的閾值可以調整成適當的(例如 醫療反應所需或最小化毒性反應所需)。例如，醫療劑量可以是醫療有效量的藥劑(關於治療一或更多種病症)，而毒性劑量可以是會造成死亡的劑量(例如 LD5 0 )或在受治療之群體中造成不想要之影響的比例。較佳的，藥劑的治療指數至少是2，更佳的至少是5，又更佳的至少是10。對醫療藥劑做概況了解也可以包括測量該藥劑的藥物動力學，以決定當該藥劑被以各種調配物及/或經由多種途徑給藥時的生物可利用性及/或吸收性。
本發明的化合物(如愛拉斯汀或微管蛋白抑制劑)可以給藥給需要的個體。在一些具體實例中，該個體是哺乳動物例如人類、或非人類哺乳動物。當給藥給個體時，本發明的化合物可以含有(例如)本發明之化合物和醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物來給藥。醫藥上可接受的載劑是技藝中所熟知的，且包括(例如)水性溶液例如水或生理緩衝的鹽水或其他溶劑或基礎劑如乙二醇、甘油、油類如橄欖油或可注射的有機酯。在較佳的具體實例中，當這些醫藥組成物是用於給藥給人類時，該水性溶液是無熱源質(pyrogen)的，或實質上無熱源質的。賦形劑可以被選用來例如使藥劑延遲釋放或選擇性地以一或更多個細胞、組織或器官為標靶。
醫藥上可接受的載劑可包括生理可接受的藥劑，該藥劑的作用會例如安定或增加化合物如愛拉斯汀或微管蛋白抑制劑的吸收。這些生理可接受的藥劑包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐、抗氧化劑如抗壞血酸或麩胱甘肽、螯合劑、低分子量蛋白質或其他安定劑或賦形劑。醫藥上可接受的載劑(包括生理可接受的藥劑)的選擇是取決於例如組成物的給藥途徑。醫藥上組成物(製劑)也可以是將(例如)本發明的化合物併入其中之脂質體或其他聚合物體。例如，含有磷脂質或其他脂質的脂質體是相當容易製造及給藥的且無毒的、生理可接受的以及可代謝的載劑。
含有本發明化合物之醫藥組成物(製劑)可以藉由許多給藥途徑中任一種來給藥至個體，包括(例如)口服；肌肉內；靜脈內；肛門；陰道；非經腸胃的；經鼻的；腹腔內；皮下；及局部。組成物可以藉由注射或藉由培養來給藥。
在一些具體實例中，本發明的化合物(例如 愛拉斯汀)可以單獨使用或與其他種類的抗腫瘤醫療藥劑共同給藥。在本文中，術語「共同給藥」是指組合了二或更多種不同醫療化合物之任何形式的給藥，使得第二種化合物給藥時先前給藥的醫療化合物在身體裡仍是有效的(例如 兩種化合物在患者中是同時有效的，可包括兩化合物的協同作用)。例如，不同的醫療化合物可以同一調配物或分開的調配物來給藥，可同時或先後給藥。因此，接受此治療的個體可以從不同醫療化合物之組合效用中受惠。
本發明的化合物(例如 愛拉斯汀)是預期以醫療有效量(劑量)來給藥至個體(例如 哺乳動物，較佳的是人類)。「醫療有效量」是指化合物的濃度足以引起想要的醫療效果(例如 症狀治療、瘤細胞死亡)。通常可以認知到的是化合物的有效量會因個體的體重、性別、年齡、以及醫療歷史而有所差異。其他會影響有效量的因子可包括(但不限於)患者症狀的嚴重性、所要治療的疾病、化合物的安定性、以及(如果需要的話)與本發明化合物一起給藥的另一類的醫療藥劑。典型的，對於人類個體而言，有效量的範圍是從約0.001毫克/公斤體重至約50毫克/公斤體重。較大的總劑量可以藉由多次給藥該藥劑來遞送之。決定功效以及劑量的方法是熟習此技藝的人已知的。參見例如Isselbacher等人 (1996)Harrison’s Principles of Internal Medicine 13 ed.,1814－1882，併入本文作為參考。
本發明現已經一般性描述，參考下面的實施例可以更容易理解本發明，下面被包括在本文中的實施例只是作為描述本發明一些方面及具體實例的目的，並非用來限制本發明。
實施例1鑑認在特定癌症相關的對偶基因存在下具有增加之功效或活性的化合物
這裡所描述的工作是用來鑑認在hTERT 、LT 、ST 、E6 、E7 或RAS V12 存在下具有增加之功效或活性的化合物。雖然描述於本文中的工作是使用hTERT、LT、ST、E6、E7和RASV 1 2 作為轉型基因，將來的研究可利用本方法學使用許多癌症相關的對偶基因來定義涉及許多致癌基因及腫瘤抑制劑的訊號網絡。具有這些基因物質之經基因改造的細胞系被用來篩選23,550種化合物，包括來自組合資料庫中的20,000種化合物、來自國家癌症機構多樣性樣本中的1,990種化合物、以及1,540種由申請人選取和購買並編排成可篩選之樣本的生物活性之已知化合物。初級篩選是試驗(四重複)治療致腫瘤BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 基因改造致腫瘤細胞之功效，各個化合物進行48小時，濃度為4微克/毫升，相當於分子量400的化合物10 μM，大約是資料庫的分子量中位數。細胞存活性是用染劑鈣黃綠素乙醯氧甲基酯(鈣黃綠素AM)測量的(Wang等人, 1993,Hum.Immunol.37, 264－270)，其是一種可自由擴散進入細胞的非螢光化合物。在活細胞中，鈣黃綠素AM被細胞內酯酶切割，形成陰離子螢光衍生物鈣黃綠素，無法擴散出去活細胞。所以，當與鈣黃綠素AM培養在一起時，活細胞會顯現綠色螢光，而死細胞不會。在BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中展現了50%或更大的存活性染劑鈣黃綠素AM染色之抑制的化合物隨後在BJ和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中以二倍稀釋系列測試，以鑑認展現合成致命性的化合物，其是在致腫瘤細胞中有致命性但在同源原代細胞中沒有。計算各個化合物在各細胞系的IC5 0 值(抑制50%的鈣黃綠素AM訊號所需濃度)(表1)。這個結果鑑認出九種在BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 致腫瘤細胞中比在BJ原代細胞中至少四倍有效的化合物(圖2)(在BJ原代細胞需要至少四倍濃度的化合物以相同地獲得鈣黃綠素AM訊號50%抑制的化合物)。下面是對於這九種化合物更詳細的分析。
這些化合物當中的三種(多柔比星、柔紅黴素以及米托蒽醌)係在目前的臨床上被作為抗癌藥物，一種(喜樹鹼)是臨床使用之抗癌藥物(托泊替康以及愛萊諾迪肯)的天然產物相似物，而一種(棘黴素)是現在在進行第II期臨床試驗。所有九種化合物隨後都以多重劑量在各組經基因改造的細胞中重複測試，以確認所觀察之選擇性會在多種獨立衍生之細胞系中看到(圖1和表1)。
申請人發展出一種選擇性公式，其量測在兩種不同的細胞系中化合物IC5 0 (抑制存活性訊號50%所需之濃度)的偏移。計算兩種細胞系的此選擇性分數時，將其中一種細胞系中的化合物IC5 0 除以同一化合物在第二種細胞系中的IC5 0 。因此，在一種細胞系中必需使用比在第二種細胞系中四倍濃度化合物者的選擇性分數為4。計算每個化合物的「腫瘤選擇性分數」，其係藉由將在親代、原代BJ細胞中之化合物IC5 0 值除以在經基因改造而含有所有四種需要用來製造致腫瘤細胞的基因物質的BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中化合物的IC5 0 值(表1)。
這些經基因改造的致腫瘤細胞使用顯性作用的病毒癌蛋白質如LT、ST、E6以及E7。這些病毒蛋白質可能涉及特定形式腫瘤之細胞轉型，即猴病毒40誘發的惡性間皮細胞瘤(Testa與Giordano,2001,Semin Cancer Biol11, 31－8)以及人類乳頭狀瘤病毒誘發的子宮頸癌(Bosch等人, 2002,J Clin Pathol55, 244－65)，而且已被用來破壞p53和pRB功能以在試管內 及體內 轉型細胞(Elenbaas等人, 2001,Genes Dev15, 50－65；Jorcyk等人, 1998,Prostate34, 10－22；Perez－Stable等人, 1997,Cancer Res57, 900－6；Rich等人, 2001,Cancer Res61, 3556－60；Sandmoller等人, 1995,Cell Growth Differ6, 97－103)。申請人使用了這兩種不同的方法來不活化細胞蛋白質(他們測試了pRB以及p53之LT和E6/E7為基的不活化作用兩者的影響)，以控制特定病毒蛋白質可能會觀察到的特性影響。這些化合物的選擇性也在表現有不是衍生自病毒物質之p53以及pRB顯性抑制抑制劑的細胞系中確認。這個細胞系表現了(i)會破壞內生性p53四聚合作用之被截短形式的p53(p53DD)、(ii)對於p16I N K 4 A 以及p15I N K 4 B (CDK4主要的抑制調控因子)抑制作用有抗性的CDK4R 2 4 C 突變以及(iii)細胞週期素D1(cyclin D1)。在這些細胞中以一系列濃度測試這九種基因型選擇性化合物的影響，該些細胞是指BJ－TERT/p53DD/cDK4R 2 4 c /D1/ST/RASV 1 2 細胞(表1)。當在這些細胞中進行測試時，結果顯示所有化合物的活性都有總體適度減少。然而，在此細胞系中使用非病毒蛋白質的分析之總體結果未改變(表1)。
實施例2決定化合物選擇性的基因基礎
申請人想要決定各個化合物選擇性的基因基礎。即，對於各個化合物，他們試圖定義出使細胞對於化合物有敏感性的基因或基因的組合(表1)。結果顯示這九種化合物可以被分為三群，即(i)沒有展現單純基因選擇性的化合物、(ii)對於含有TERT和不活性RB之細胞展現有選擇性的化合物、以及(iii)需要致癌RAS和ST兩者的存在來顯現致命性的化合物。
第(i)群中的化合物，桑吉瓦黴素、波瓦汀(bouvardin)、NSC146109以及棘黴素的致腫瘤細胞選擇性沒有清楚的基因基礎。例如，當放入每個基因物質時，棘黴素變得稍微更有活性(圖3a)。申請人觀察到當各個這些基因物質被放入時細胞增生速度增加。因此，第(i)群中的化合物可能是單純的選擇快速分裂的細胞。支持這個解讀的事實是所有這些化合物都被報導係藉由抑制DNA或蛋白質合成來作用的，該合成對於快速分裂的細胞而言更為重要。例如，棘黴素是被報導作為DNA雙嵌入劑(DNA bis－intercalator)(Van Dyke與Dervan,1984,Science225, 1122－7；Waring與Wakelin,1974,Nature252, 653－7)，波瓦汀是被報導作為蛋白質合成抑制劑(Zalacain等人, 1982,FEBS Lett148, 95－7)，桑吉瓦黴素是核苷酸相似物(Rao，1968,J Med Chem 11,939－41)，而NSC146109結構上類似DNA嵌入劑(圖2)。應注意桑吉瓦黴素已被報導作為PKC抑制劑(Loomis與Bell,1988,J Biol Chem263, 1682－92)，雖然這個活性看起來與本文沒有關係，因為其他PKC抑制劑在這個系統中沒有展現選擇性。申請人能夠鑑認出會單純在快速分裂的細胞中更有活性的化合物，如這些第(i)群的化合物，因為它們沒有顯現出選擇性之清楚的基因基礎。對於這些化合物並沒有做進一步的研究。因此，他們能夠專注在展現了選擇性之第(ii)及(iii)群化合物的機制研究。
第(ii)群化合物，米托蒽醌、多柔比星以及柔紅黴素是拓撲異構酶II毒藥，會結合至拓撲異構酶II和DNA並防止由拓撲異構酶II所產生之雙股DNA缺口再黏合(religation)。雖然申請人並沒有觀察到在這三種化合物存在下這些經基因改造細胞的反應性氧類(ROS)形成，但是這些化合物、以及蒽環黴素(anthracycline)一般也已被報導會在一些細胞種類裡誘發ROS形成(Laurent與Jaffrezou,2001,Blood98, 913－24；Muller等人, 1998,Int J Mol Med1, 491－4；Richard等人, 2002,Leuk Res26, 927－31)。當置入hTERT 以及當RB是藉由置入LT或HPV E7而不活化時，他們發現到這些化合物會變得更有效(在較低濃度有活性)。在細胞中，E7是在E6之後被置入，所以在具有E7之細胞中這些化合物功效增加可能也依賴E6的存在，雖然E6本身並沒有使這些化合物增加功效。置入hTERT 以及不活化RB造成了拓撲異構酶IIα表現增加(圖5A)，而且只有非常適度的拓撲異構酶IIα表現增加。雖然申請人沒有在致癌RAS存在下觀察到對拓撲異構酶II毒性進一步的敏感性，置入致癌RAS會造成拓撲異構酶IIα表現進一步增加(圖5A)。
第(iii)群化合物是喜樹鹼(CPT)以及來自組合資料庫中的新穎化合物，申請人稱之為愛拉斯汀(erastin)，意思是表現RAS和ST之細胞的根除者( E radicator of RA S and ST －expression cells)(圖2)。有效的CPT誘發的及愛拉斯汀誘發的細胞死亡需要ST和RASV 1 2 兩者的存在(圖3和4以及表1)。雖然CPT和愛拉斯汀具有相似的基因基礎選擇性，它們有不同的作用機制。CPT在缺乏RB功能(透過E7的表現)的細胞中是部分活性的，而愛拉斯汀不是，而且CPT需要兩天來造成BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞死亡，但愛拉斯汀在18小時之內就100%有效(圖3以及4)。磷酸酶抑制劑岡田酸能夠使有抗性的BJ原代細胞對CPT有敏感性(圖5E)，可能是因為岡田酸調升了TOP1(圖5F)。岡田酸並不會使BJ或BJ－TERT細胞對愛拉斯汀有敏感性，與CPT和愛拉斯汀經由不同機制作用的模式相符。此外，申請人發現致命性化合物鬼臼毒素(一種微管蛋白抑制劑)並不會使BJ或BJ－TERT細胞對CPT有敏感性，確認了BJ細胞藉由岡田酸而對CPT有敏感性是專一性的，而不是兩個具有加成效果但功能上無關之弱細胞死亡刺激的結果。
為了了解RASV 1 2 以及ST－表現細胞對CPT敏感性增加的分子基礎，申請人測定了拓撲異構酶I(TOP1)(是CPT的推定標靶)在經基因改造的細胞中的表現量(Andoh等人, 1987,Proc Natl Acad Sci U S A84, 5565－9；Bjornsti等人, 1989,Cancer Res49, 6318－23；Champoux,2000,Ann N Y Acad Sci922, 56－64；D'Arpa等人, 1990,Cancer Res50, 6919－24；Eng等人, 1988,Mol Pharmacol34, 755－60；Hsiang等人, 1989,Cancer Res49, 5077－82；Hsiang與Liu,1988,Cancer Res48, 1722－6；Liu等人, 2000,Ann N Y Acad Sci922, 1－10；Madden與Champoux,1992,Cancer Res52, 525－32；Tsao等人,1993,Cancer Res53, 5908－14)。他們發現表現RASV 1 2 以及ST兩者的細胞會調升TOP1(圖5B)。由於CPT在其他細胞種類中的推定作用機制涉及獲得功能，即是以TOP1依賴性的方式產生雙股DNA缺口(Liu等人, 2000,Ann N Y Acad Sci 922,1－10)，TOP1的調升可以解釋表現RASV 1 2 以及ST的細胞對於CPT敏感性增加。這個解讀的支持是他們發現在BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中以小的干擾RNA(siRNA)來使TOP1基因不活化時會給予對CPT有部分的抗性(圖5C、D)。
申請人額外測試了相對於正常細胞對腫瘤細胞有活性與選擇性的愛拉斯汀其他相似物。有另一種相似化合物被鑑認出是有活性及選擇性的，但是比愛拉斯汀效果差。這個化合物被稱為愛拉斯汀B(參見圖8)。BJELR細胞是BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞，而BJEH是BJ－TERT細胞。
被在BJELR以及BJEH細胞中測試的進一步化合物如下：
實施例3定細胞死亡的特性
申請人想要在致腫瘤BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中定性由CPT和愛拉斯汀誘發之細胞死亡的種類。在其他文獻中，CPT已被發現會誘發凋亡細胞死亡(Traganos等人, 1996,Ann N Y Acad Sci803, 101－10)，其特徵在於細胞核形態改變，包括核濃縮(pyknosis)、核碎裂(karyorhexis)及/或染色質著邊(margination of chromatin)(Majno與Joris,1995,Am J Pathol146, 3－15)。為了測定愛拉斯汀或CPT在申請人的系統中是否會誘發凋亡，申請人使用螢光顯微鏡監測經CPT及愛拉斯汀處理的致腫瘤細胞的細胞核形態。雖然在經CPT處理的細胞中可清楚看見核碎裂以及染色質著邊，但是在愛拉斯汀處理的細胞中則看不到這樣的形態改變(圖7A)。由於細胞核形態改變是凋亡細胞所必備，因此申請人斷言愛拉斯汀誘發的細胞死亡是非凋亡的。進一步支持此結論的是觀察到CPT會誘發DNA片段化(形成DNA梯狀物)，但愛拉斯汀不會，觀察到泛天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶抑制劑(pan－caspase inhibitor)(50 μM Boc－Asp(Ome)－氟甲基酮，Sigma #B2682(Chan等人, 2001,Neuroreport12, 541－545))部分阻斷由CPT誘發的細胞死亡，但不是由愛拉斯汀所誘發的，以及觀察到CPT會造成膜聯蛋白V(Annexin V)染色增加(圖7B)和出現被切割的活性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3，但是愛拉斯汀不會(圖7C)。此外，在經愛拉斯汀處理過的腫瘤細胞的細胞核仍維持完整(圖9)。
愛拉斯汀誘發非凋亡細胞死亡的能力係對表現ST和RASV 1 2 的細胞選擇性的。以愛拉斯汀用較長時間及較高濃度處理對於缺乏RASV 1 2 或ST之細胞的存活性影響很小，這確認了愛拉斯汀選擇性的性質本質(圖6A、C)。由於經愛拉斯汀處理的細胞不會進行凋亡作用，所以申請人想要確認愛拉斯汀是真正誘發細胞死亡，而不是細胞脫離(detachment)。他們用愛拉馬爾藍(Alamar Blue)在愛拉斯汀存在下測定細胞的存活性(Ahmed等人, 1994,J.Immunol.Methods170, 211－224)，這是一種存活性染劑，其測定細胞內還原電位。相對於BJ－TERT細胞，在這個同質的愛拉馬爾藍存活性試驗中，愛拉斯汀在致腫瘤BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中顯現了選擇性的致命性(圖6B)。經愛拉斯汀處理18小時之BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞鼓起(round－up)且脫離(圖6C)，無法排除表示存活的染劑台盼藍(Trypan Blue)，如同電位染劑JC－1所測的展現出粒線體膜電位消失，以及具有死細胞所有之小細胞尺寸特徵。申請人確定了愛拉斯汀所誘發的存活性喪失一旦完成就不可逆了，因為當再度塗佈在不含愛拉斯汀的培養基時，用愛拉斯汀處理過24小時的BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞鼓起、脫離以及無法復原。因此，愛拉斯汀會以ST－和RASV 1 2 依賴方式誘發快速(12－24小時)、不可逆、非凋亡的細胞死亡。
也做了額外的研究證明愛拉斯汀會誘發反應性氧類的形成(參見圖10)。
進行愛拉斯汀活性的抑制劑(suppressor/inhibitor)的篩選。鑑認出四種會抑制愛拉斯汀活性的抗氧化劑，其中一種抗氧化劑是α－生育酚。
下面的方法和材料被用於本文所述的實施例。
構築體和反轉錄病毒
hTERT、LT、ST、SV40早期區域、和HRASV 1 2 的表現構築體是如先前所述被使用的(前面的Hahn等人, 1999；前面的Hahn等人, 2002)。hTERT－pWZL－Blastε、E6－pWZL－zeoε、以及E6E7－pWZL－Zeoε已在先前描述過(前面的Lessnick等人, 2002)。E6和LT cDNA被選殖入pWZL－Hygroε反轉錄病毒載體中(來自J.Morgenstern,Millenium Pharmaceuticals的贈與)。製備水泡性口炎病毒－G糖蛋白質假型反轉錄病毒，並且如先前描述進行感染(前面的Lessnick等人, 2002)。
細胞系
TIP5原代纖維母細胞(前面的Lessnick等人, 2002)是從丟棄的新生兒包皮製造的，且藉由以hTERTpWZL－blastε或hTERTpBabe－hygro反轉錄病毒感染來使其不朽(immortalized)，以及分別用殺稻瘟菌素(blasticidin)或濕黴素(hygro,ucin)選取。BJ細胞是Jim Smith所贈。用指定的反轉錄病毒感染hTERT不朽化纖維母細胞並選擇適當的標識物。所有BJ衍生物被培養在DMEM以及M199之1：1混合物中，當中添加了15%不活化的胎牛血清、盤尼西林和鏈黴素(pen/strep)。TIP5細胞是生長在含有10%FBS以及pen/strep的DMEM中。所有的細胞培養物都是培養在37℃的含有5% CO2 之潮濕培養箱中。
化合物資料庫
在腫瘤選擇性合成致命性篩選中使用了含有1,540種化合物之經註解的化合物資料庫(annotated compound library，ACL)、得自國家癌症機構之1990種化合物的NCI多樣性組以及含有20,000種化合物之組合資料庫(Comgenex International,Inc.)。所有的化合物資料庫被製造成4毫克/毫升的溶液，在DMSO中，在384孔聚丙烯盤中(第3－22行)，並且儲存在－20℃。喜樹鹼(cat# C9911,MW 348.4)、多柔比星(cat# D1515,MW 580.0)、柔紅黴素(cat# D8809,MW 564.0)、米托蒽醌(cat# M6545,MW 517.4)、岡田酸(cat# O4511,MW 805.0)、棘黴素(cat# E4392,MW 1101)、桑吉瓦黴素(cat# S5895,MW 309.3)是得自Sigma－AldriCh Co。波瓦汀(MW 772.84)以及NSC146109(MW 280.39)是得自國家癌症機構的開發醫療計劃。愛拉斯汀(MW 545.07)是得自Comgenex International,Inc。
鈣黃綠素AM存活性試驗
鈣黃綠素乙醯氧甲基酯(AM)是可通透細胞膜的非螢光化合物，是被細胞內酯酶切割形成陰離子、不可通透細胞之螢光化合物鈣黃綠素。因為細胞內酯酶的存在，以及因為完整的細胞膜會防止螢光鈣黃綠素洩漏到細胞外，所以活細胞會被鈣黃綠素染色(前面的Wang等人, 1993)。用Zymark Sciclone ALH將細胞接種在384孔盤中，以各個化合物4微克/毫升處理三重複做初級篩選兩天，在Packard Minitrak用384孔清洗器以磷酸緩衝的鹽水清洗之，並且與0.7微克/毫升的鈣黃綠素(Molecular Probes)培養四個小時。各孔洞中的總螢光強度被在Packard Fusion讀盤儀上紀錄，並且藉由減去儀器的背景值以及除以細胞沒有用任何化合物處理而得到的平均訊號來轉換成訊號之抑制百分比。
愛拉馬爾藍存活性試驗
愛拉馬爾藍會被活細胞的粒線體酵素活性所還原，使得比色以及螢光改變(Nociari等人, 1998,J.Immunol.Methods13, 157－167)。以每個孔洞6000個細胞(50微升)的密度用注射式分注器(Zymark)將細胞接種到384孔的黑色、透明底之盤中。用384固定的套頭(384 fixed cannula head)從兩倍系列稀釋的愛拉斯汀盤中(6X終濃度)移除10微升，使孔洞最高濃度終濃度為20微克/毫升。將該盤培養24小時。將愛拉馬爾藍(Biosource International)1：10稀釋添加至各個孔洞中並且37℃培養16小時。用Packard Fusion讀盤儀測定螢光強度，其中激發(excitation)濾波器中心在535 nm以及發射(emission)濾波器中心在590 nm。計算各個濃度下的平均抑制百分比。誤差槓表示一個標準差。愛拉馬爾藍試驗並不需要清洗細胞。
篩選
複製的子盤是用Zymark Sciclone ALH和整合的Twister II製備的，係藉由將貯存盤在缺乏血清以及pen/strep的培養基稀釋50倍，以獲得子盤化合物濃度為80微克/毫升，含2% DMSO。試驗盤的製備是使用注射式分注器將細胞接種在黑色透明底的384孔盤中第1－23行(6000個細胞/孔洞，57微升)。用來自子資料庫盤的化合物處理第3－22行，其係用384位置固定套頭陣列(384－position fixed cannula array)從子資料庫盤中轉移3微升。試驗盤的最終化合物濃度因此是4微克/毫升。試驗盤於37℃含有5% CO2 之潮濕培養箱中培養48小時。將該盤進行鈣黃綠素AM存活性試驗，其係使用來自Packard Bioscience(Perkin Elmer)之整合的Minitrak/Sidetrak自動系統。用磷酸緩衝的鹽水清洗該試驗盤，並且每個孔洞添加20微升的鈣黃綠素AM(0.7微克/毫升)。將該盤在室溫培養4小時。用Fusion讀盤儀測定螢光強度，其中濾波器集中在485 nm的激發區以及535 nm發射區。
於稀釋系列中再測試化合物
再測試用的化合物是購自供應商。儲存液(stock)是製備在DMSO中，濃度為1毫克/毫升，在384孔的聚丙烯盤上，行中各個化合物有16個點、兩倍稀釋劑量曲線，二重複。第1－2行以及第23－24行留空白作為控制組。子再試驗盤是從儲存液再試驗盤製備的，其係藉由在384孔洞深－深孔盤上稀釋66.6倍於DMEM中(將4.5微升加到300微升中)。細胞以每孔洞6000個的密度接種40微升，以及從子再試驗盤添加20微升。將該盤在5% CO2 於37℃培養兩天。
數據分析
計算未經處理之細胞的平均RFU(相對螢光單位)，其係將第1、2、以及23行(有細胞但沒有化合物的孔洞)平均。鈣黃綠素背景值的計算是將第24行(有鈣黃綠素但缺乏細胞的孔洞)平均。各個孔洞的抑制百分比的計算是[1－(RFU－鈣黃綠素控制組)/(未經處理的細胞－鈣黃綠素控制組)*100]。在初級篩選中會造成鈣黃綠素染色至少50%抑制的化合物被測試其對於BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 經基因改造之腫瘤細胞的選擇性，其係在一個範圍的濃度下測試BJ原代以及BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞。選擇性化合物在所有經基因改造的細胞系中被再測試。
細胞核形態分析
將200,000個致腫瘤BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞接種2毫升在有六個孔洞的盤之各個孔洞中之玻璃蓋玻片上，沒用任何物質處理(NT)、用9 μM愛拉斯汀或1.1 μM喜樹鹼(CPT)處理於生長培養基中18小時，於37℃含5% CO2 下培養。用25微克/毫升Hoechst 33342(Molecular Probes)將細胞核染色，並且用油浸100X物鏡的螢光顯微鏡觀察。
測量細胞尺寸
將200,000個BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞接種在六個孔洞的盤中，在只有2毫升的生長培養基裡(沒有處理)，含9 μM愛拉斯汀或含1.1 μM喜樹鹼(CPT)。經過24小時之後，用胰蛋白酶/EDTA將細胞釋放，稀釋到10毫升的生長培養基中，用Coulter Counter測定各個樣本的細胞尺寸分布。
喜樹鹼活性的細胞計數分析
將BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞接種到6個孔洞的盤中(200000個細胞/孔洞；每個孔洞2毫升)，並且用Oligofectamine(Life Technologies)於無血清及無抗生素的培養基中，每個孔洞以100 nM siRNA轉染，總體積一毫升。在轉染之後四小時添加含有30% FBS之500微升的培養基。在轉染之後30小時用所指濃度的喜樹鹼處理細胞。將500微升想要之喜樹鹼濃度的5X溶液添加至各個孔洞中。用胰蛋白酶－EDTA移出細胞，並且在轉染後75小時用血球計計數。控制組實驗顯示轉染效率大約為10%。
西方墨漬分析
天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶－3(Caspase－3) 在60毫米盤實驗之前接種5X105 個細胞BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞。用5微克/毫升的愛拉斯汀(9 μM)處理細胞2、4、6、8或10小時。留一個用作喜樹鹼治療(0.4微克/毫升，24小時)作為正控制組。在各個時間於溶解緩衝液(50 mM HEPES KOH pH 7.4、40 nM NaCl、2 mM EDTA、0.5% Triton X－100、1.5 mM Na3 VO4 、50 mM NaF、10 mM焦磷酸鈉、10 mM貝塔甘油磷酸鈉以及蛋白酶抑制劑錠劑(Roche))中溶解細胞。蛋白質成分是用Biorad的蛋白質分析試劑定量的。將等量的蛋白質解析在16%的SDS－聚丙烯醯胺凝膠中。將經電泳的蛋白質轉移到PVDF膜上，用5%的牛奶阻斷之，並且與抗活性天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶－3多株抗體(BD Pharmingen)一起培養，以1：1500的稀釋，隔夜，4℃。然後將該膜與1：3000稀釋的抗兔子－HRP(Santa Cruz Biotechnology)一起培養1小時，用加強的化學發光混合物(NEN life science,Renaissance)來顯影。為了測驗每個泳道的等量裝填，將墨漬膜上之抗體移除(strip)、阻斷、並且用1：1000稀釋的抗eIF－4E抗體(BD轉導實驗室)探測。
拓撲異構酶－IIα BJ、BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST、BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 、BJ－TERT/LT/RASV 1 2 以及BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST細胞是以60毫米盤每盤1X106 個細胞接種。經過37℃含5% CO2 隔夜培養細胞之後，將細胞如上述溶解之，並且將蛋白質解析在10%的聚丙烯醯胺凝膠上。將該膜與1：1000稀釋的單株抗人類拓撲異構酶IIα p170抗體(TopoGEN)於4℃培養隔夜，然後與抗鼠類HRP(Santa Cruz Biotechnology)培養。
拓撲異構酶1(TOP1) 合成直接針對TOP1之21個核苷酸(第2233－2255個核苷酸，從起始密碼開始編號，Genbank編號為J03250)的雙股siRNA(Dharmacon、純化以及去鹽/去保護)，並且用Oligofectamine(Life Technologies)將之(100 nM)轉染進BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞中，於六個孔洞的盤中。75小時之後，細胞被溶解且藉由西方墨漬法(Topogen，Cat# 2012－2，1：1000稀釋)測定TOP1的表現量。蛋白質裝填量BD是藉由將抗體移除(strip)和用直接針對eIF－4E的抗體(Biosciences，Cat# 610270，1：500稀釋)再探測同一個墨漬膜來測定的。或者，將1x106 個細胞接種到60毫米的盤上，並且在37℃的5% CO2 下生長隔夜，然後用150微升的溶解緩衝液溶解之。用刮刀移出細胞，並且移到微離心管中，培養在冰上30分鐘。用Biorad的蛋白質估計分析試劑定量溶解物中的蛋白質成分。取等量的蛋白質裝填到10%梯度SDS－聚丙烯醯胺凝膠上。將經電泳的蛋白質轉漬到PVDF膜上。以5%奶粉阻斷後，將該膜與鼠類抗人類拓撲異構酶I抗體(Pharmingen)於4℃一起培養隔夜，然後與抗鼠類過氧化酶複合物抗體(Santa Cruz Biotechnology)一起培養。
膜聯蛋白V－FITC凋亡試驗
將BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞以每盤1X106 個細胞接種在100毫米的盤上，並且使其生長隔夜。用愛拉斯汀(5或10微克/毫升)處理細胞6、8或11小時。喜樹鹼處理的(0.4微克/毫升)控制組是在接種時處理的，處理20小時。經過處理之後，用胰蛋白酶/EDTA回收細胞並用新鮮的含血清培養基清洗一次，然後用磷酸緩衝的鹽水清洗兩次。將細胞再懸浮於1X的結合緩衝液(BD Pharmingen)中，濃度為1X106 個細胞/毫升。取100微升(1X105 個細胞)與5微升的膜聯蛋白V－FITC(BD Pharmingen)及碘化丙啶(BD Pharmingen)在暗室室溫培養15分鐘。然後添加400微升的1X結合緩衝液並且用流式細胞儀(Becton－Dickinson)分析細胞數據。取得數據並使用Cellquest軟體分析之。只有分析沒有被碘化丙啶染色之活細胞的膜聯蛋白V－FITC染色，使用FL1管。
ROS分析：使用H2DCF－DA之流式細胞儀分析
2’,7’－二氯二氫螢光素二醋酸(H2DCF－DA)是非螢光的可通透細胞之化合物。細胞裡面的內生性酯酶酵素會切割二醋酸的部分，使得它無法再離開細胞。因此它會累積在細胞裡。然後，H2DCF與ROS反應形成發螢光的二氯螢光素(DCF)，可以被流式細胞儀的FL1頻道偵測到。
1.將細胞以每盤3X105 個細胞接種在60毫米的盤中，並且使其生長隔夜。
2.用試驗化合物處理該細胞不同期間(1－10小時)。
3.每一個時間點取一盤作為未處理的細胞、經化合物處理的細胞以及正控制組盤(過氧化氫處理的)。
4.將細胞與10 μM的H2DCF－DA於37℃培養10分鐘。
5.正控制組細胞則在添加H2DCF－DA五分鐘之後添加500 μM的過氧化氫，並且再培養5分鐘。
6.藉由胰蛋白酶作用回收細胞。
7.用冷PBS清洗兩次。
8.將團塊再懸浮於100微升的PBS中，並且轉移到5毫升的FACS管中。
9.添加5微升的碘化丙啶(50微克/毫升)並且在暗處冰上培養10分鐘。
10.添加400微升的PBS並且用流式細胞儀(Becton－Dickinson)分析。
11.取得數據並且用CellQuest軟體程式分析之。
12.只取碘化丙啶陰性細胞(活細胞)用FL1頻道進行DCF染色分析，PI在FL3頻道，畫象限圖。
從ACL資料庫篩選出可抑制BJELR細胞之愛拉斯汀活性的化合物
方法： ACL資料庫中包含了1,540種化合物，而所有的化合物都是以4微克/毫升製備在DMSO中，在384個孔洞的聚丙烯盤中，並且儲存在－20℃。複製的子盤是用Zymark Scilone ALH為各個資料庫製備。將子盤用DMEM稀釋50倍，子盤的化合物濃度是80微克/毫升，含2% DMSO。試驗盤是將子盤的化合物用細胞懸浮液稀釋20倍，使各個化合物的終濃度是4微克/毫升。
將BJELR細胞以6000個細胞/孔洞(57微升)(共處理篩選)以及5000個細胞/孔洞(57微升)(前處理篩選)使用注射式分注器接種在384個孔洞的黑色、透明底盤。在共處理抑制劑篩選中，細胞是用從ACL資料庫子盤之3微升化合物處理(試驗盤終濃度為4微克/毫升)，並同時用5微克/毫升的愛拉斯汀處理。化合物的轉移是用384固定式套頭(fixed cannula head)進行的。將盤於37℃含5% CO2 的培養箱中培養48小時。在前處理篩選中，細胞是與來自ACL子資料庫盤中的化合物預先培養隔夜，然後用5微克/毫升的愛拉斯汀處理48小時。將盤進行鈣黃綠素試驗，係使用Packard BioScience的MiniTrak/SideTrak自動系統。用PBS清洗試驗盤，並且與鈣黃綠素AM(0.7微克/毫升)室溫培養4小時。用Fusion讀盤儀測定螢光強度，濾波器位在485 nm激發區以及535 nm發射區。BJELR細胞是BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞。
表1顯示腫瘤選擇性化合物在經基因改造之細胞系中的效果。將九種腫瘤選擇性化合物在所有經基因改造的細胞系中再測試16個點、兩倍稀釋劑量曲線。表中列出了各化合物各細胞系達到50%抑制(IC5 0 )鈣黃綠素AM染色所需之濃度(微克/毫升)。將原代BJ細胞的IC5 0 除以BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 致腫瘤細胞的IC5 0 得到各個化合物的腫瘤選擇性比。各個基因物質的化合物選擇性是藉由計算一系列之隨後的各個細胞系對之該選擇性比決定的。小T癌蛋白質選擇性化合物被認為對於PP2A(小T癌蛋白質的標靶)有選擇性，而E6選擇性化合物被認為對於p53缺失有選擇性，而E7選擇性化合物被認為對於RB缺失有選擇性。
表2顯示了腫瘤選擇性化合物對於經基因改造的細胞系的效果。表中列出了各化合物在各細胞系中鈣黃綠素AM染色(IC5 0 )的抑制(負%值)或增加(正%值)。
實施例4 鑑認及定性愛拉斯汀的結合搭檔
使用固定化愛拉斯汀和細胞溶解物的結合分析(pull－down assay)是被用來初步鑑認愛拉斯汀在細胞內的結合搭檔。初步結合實驗是用HEK293、BJEH和BJELR全細胞溶解物來進行的。在那些實驗中，愛拉斯汀的甲基胺基衍生物(ERA－A6)被固定在Affigel 10，並且在標準結合條件下與溶解物培養在一起。清洗珠粒並且用100 μM的愛拉斯汀或0.8%的N－月桂醯基肌胺酸(－沙可西，sarkosyl)洗提。將洗出液進行質譜分析。
分析愛拉斯汀結合試驗的結果發現有高比例的粒線體或ER－膜蛋白質，是在使用HEK293或BJEH和BJELR溶解物的第一組結合實驗鑑認出來的。這說明了膜孔洞可能是愛拉斯汀或其相似物的一種標靶。然而，這個結果並不排除愛拉斯汀可能有在這組結合實驗中尚未被鑑認出來之其他及/或不同標靶的可能性。
在愛拉斯汀或愛拉斯汀相似物的結合實驗中會重複看到許多蛋白質。這些蛋白質包括VDAC1、VDAC2、VDAC3、抗增殖蛋白、核糖體結合糖蛋白、Sec61a以及Sec22b，是愛拉斯汀可能的標靶。
因為全細胞溶解物混合物仍相當複雜，那些蛋白質只在結合實驗的－沙可西洗提物中才會被偵測到。這個可能使質譜分析複雜化。因此，為了簡化混合物，會使用許多分離方法來分離或預先濃縮一些從全細胞溶解物結合實驗中鑑認出的蛋白質。
因為抗增殖蛋白以及VDAC異構體都是粒線體蛋白質，申請人藉由從細胞溶解物中分離出粒線體來濃縮潛在的愛拉斯汀標靶。然後將該分離出的粒線體萃取物用於愛拉斯汀結合實驗。在那些愛拉斯汀與粒線體萃取物的結合實驗中，也用西方墨漬法鑑認抗增殖蛋白、VDAC和核糖體結合糖蛋白。圖14顯示結合的(pull－down)西方墨漬，其中粒線體萃取物是與固定在珠粒上之活性(A6)以及不活性(B1)愛拉斯汀衍生物接觸。結合分析是用0.25毫克的粒線體萃取物之全部蛋白質來進行的。將珠粒與萃取物於4℃培養1.5小時，然後清洗數次。用50微升的0.8% N－月桂醯基肌胺酸溶液將結合到固定化之愛拉斯汀衍生物的蛋白質洗提出來。以西方墨漬法鑑認蛋白質，用抗－核糖體結合糖蛋白、－Sec6、－抗增殖蛋白以及抗－VDAC抗體的混合物。也用MS－分析鑑認蛋白質。
核糖體結合糖蛋白以及抗增殖蛋白是有點酸性的蛋白質，計算出的PI是5.57(抗增殖蛋白)和5.96(核糖體結合糖蛋白I)。申請人是從較鹼性的蛋白質(VDAC異構體、Sec22以及Sec61a)中分離出這兩種蛋白質的，其是藉由在pH為6.8以MonoQ管柱進行離子交換層析法。然後用抗體測試流份(fraction)的抗增殖蛋白或核糖體結合糖蛋白成分。也測試流份與BIACORET M 表面的結合作用，該表面含有固定化的ERA－A6以及ERA－B1化合物。抗增殖蛋白和核糖體結合糖蛋白是在BIACORET M 實驗中顯示有結合作用的流份中發現到的。有趣的是，在銀染SDS－PAGE凝膠，觀察到有一種不與任何所用之抗體反應的未知45 kDa蛋白質會結合至ERA－A6或ERA－B1珠粒。
為了確認那些結果，以ERA－A6和ERA－B1對MonoQ洗提流份進行結合(pull－down)實驗。再一次，從許多流份以會結合至愛拉斯汀珠粒為條件鑑認到抗增殖蛋白和核糖體結合糖蛋白。那些實驗清楚的支持了VDAC異構體、以及抗增殖蛋白和核糖體結合糖蛋白會結合至愛拉斯汀及愛拉斯汀相似物的想法。因此，這些蛋白質是愛拉斯汀體內的潛在標靶/結合搭檔。
實施例5 多種VDAC異構體的表現量
相較於源自BJEH細胞的溶解物，當對BJELR溶解物進行結合作用(pull－down)時，使用愛拉斯汀之ERA－A6相似物的成功結合一貫的得到VDAC3有較高的MS為基礎的鑑認分數。該VDAC異構體有較高的分數是與該異構體在BJELR溶解物(相對於BJEH溶解物)中有較高含量一致的，得到了可比較的總蛋白質含量。標靶蛋白質的這些不同含量可能對愛拉斯汀的選擇性有所影響。
為了說明這一點，申請人使用定量PCR(Q－PCR)測試了多種VDAC異構體的相對表現量。其他可能的方法包括西方墨漬法以及質譜法。
定量PCR(Q－PCR)實驗的進行是用來測定各基因在「正常」BJEH細胞系、以及致腫瘤BJELR系中的mRNA(作為基因表現的替代標識物)相對量。在各VDAC異構體(VDAC1、2以及3)中，有兩個mRNA的區域被作為增幅(amplification)的標的。這些區域分別被稱為1和1－2、2－1與2－2、以及3－1和3－2。將每一個感興趣的基因的mRNA片段增幅之Q－PCR訊號與一系列的內標準品相比較，對源自標靶細胞GAPDH mRNA的訊號畫圖。圖11所畫的結果表示VDAC3的表現在BJELR細胞中(相對於在BJEH細胞中)顯著增加。這個發現與一些其他基因中所觀察到的結果有所不同，後者是觀察到在BJELR細胞(相對於在BJEH細胞)中被抑制。
圖12是使用與圖11相同的Q－PCR數據做成的，但是圖12專門著重在標靶細胞中VDAC異構體的相對表現量。將各個經增幅之mRNA片段的Q－PCR訊號與一系列內標準品相比較，並且以相對於標靶細胞中源自VDAC1 mRNA之訊號(定義為100%)來表示。如圖11，各個VDAC異構體(VDAC1、2以及3)之mRNA的兩個增幅區域是分別稱為1、1－2、2－1、2－2、3－1、以及3－2。結果顯示VDAC3在BJELR細胞中的表現量是在BJEH細胞中之表現量的2至2.5倍。
總體而言，這些發現提出了一種可能的機制來解釋BJELR細胞對於愛拉斯汀的處理有不同的敏感性。
實施例6愛拉斯汀對於多種VDAC異構體之功能性評估
功能性分析會幫助確認所鑑認的蛋白質是愛拉斯汀的功能性標靶。在一些具體實例中，經分離的粒線體可以被用來測定愛拉斯汀是否對於粒線體的功能有任何功能性或表現型的影響。例如，可以藉由顯微鏡來觀察表現型影響，而偵測粒線體膜電位改變、或愛拉斯汀處理時的氧化物釋放可以藉由使用一些染劑來觀察，那些染劑是技藝中已知用來偵測反應性氧物質(ROS)的。
在一些其他的具體實例中，確認實驗可包括用疊氮基－愛拉斯汀衍生物、或與雙配位基親和性－標記的交聯物(諸如SBED)耦合的愛拉斯汀相似物或衍生物、或可被切割的交聯物來將標靶蛋白質進行光親和性標記。
在又一具體實例中，重組的以及過度表現的蛋白質可被用於一些試管內 分析中來評估愛拉斯汀對其功能之任何可能的影響。這些試管內 分析可包括(但不限於)：直接結合(試管內或BIACORET M )、或可測定VDAC異構體路徑性質(channel property)的流出試驗(efflux assay)。
在又一具體實例中，可以使用那些標靶蛋白質的剔除(knockout)突變(細胞或有機體)。與野生型相比較，這些突變可變得對愛拉斯汀有抗性或更敏感。那些剔除細胞系也可被用在高效篩選(HTS)中來測定及/或評估愛拉斯汀或其相似物的專一性。
在又一具體實例中，VDAC、抗增殖蛋白和核糖體結合糖蛋白的RNAi實驗也可用來評估對於愛拉斯汀之治療的任何表現型(例如 對愛拉斯汀有抗性或更敏感)。根據本發明的這個具體實例，分別以VDAC1、VDAC2以及VDAC3為標靶的SMARTPOOLsiRNA可以從Dharmacon(Lafayette,CO)買到。然後將轉染的條件最適化，例如在384個孔洞的盤中使用FUGENET M 以及Oligofectamine、以及經螢光標記的siRNA雙鏈。這個步驟會得到~90%的轉染效率。然後可以用針對VDAC1、VDAC2、或VDAC3的siRNA來轉染ELR腫瘤細胞，可以測量對於愛拉斯汀的劑量反應。
實施例7 細胞生長的抑制
測量化合物抑制BJELR以及BJEH細胞生長的能力。用Sytox初級篩選來分析化合物，Sytox初級篩選是一種監測導因於化合物處理之細胞存活－增生改變的表現型分析。它被設計成是鑑認會專一性改變細胞生長潛能之化合物的高效方法，該細胞具有在腫瘤患者中發現但不會影響正常細胞的生長之成因突變(causative mutation)。該分析是依賴一種價格低廉的、簡單的以及讀出可信的不通透膜之螢光染劑(Sytox，來自Molecular Probes)，它會與核酸結合。在健康細胞中不會偵測到訊號，因為細胞膜是完整的而染劑不會進入。然而，如果細胞膜因凋亡或壞死而損壞時，則會偵測到與類似地受影響之細胞數目成比例的螢光訊號。藉由兩步驟的讀取(最終讀取是在清潔劑存在下使所有細胞被標記)，該分析可鑑認出會產生細胞生長抑制(cytostasis)、細胞毒性及/或有絲分裂的化合物。第一次讀取或「死細胞」讀取藉由指出分析時培養物中死亡或垂死細胞的數目而提供了給定化合物的約略毒性。第二次讀取或「總細胞」讀取記錄了細胞總數降低的細胞毒性累積效應以及當毒性不存在時試驗化合物可能會對測試族群之細胞造成的任何細胞生長抑制或抗增生影響。
為了篩選的目的，先前描述的BJ－TERT系被定義為「正常」的參考細胞系，而BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞是致腫瘤細胞系。細胞被隔夜以在未經處理之情況下72小時後可允許孔洞中有95%匯合的密度接種至96個孔洞的盤中。隔天，將細胞暴露於一系列稀釋之試驗化合物48小時。此培養期間之後，依照供應商建議的濃度將Sytox試劑添加至該培養物中，並且讀取死亡細胞的螢光。完成這個測量之後，將清潔劑Saponin添加至培養物的各個孔洞中以通透細胞膜，使Sytox試劑進入每個細胞，藉此加速測量培養物中剩餘的總細胞數。
實施例8 合成3－(2－乙氧苯基)－2－(吡－1－基甲基)喹唑啉－4(3H)－酮(化合物5)
步驟1：製備2－(氯甲基)－4H－苯并[d][1,3] －4－酮(化合物2)
方法1：在氮氣壓下，將鄰胺基苯甲酸(化合物1，15.3公克)溶於300毫升的二氯甲烷(CH2 Cl2 )中。然後添加三乙基胺(TEA，1.1當量)，將混合物在冰水浴中冷卻。逐滴添加含有氯乙醯氯(1.1當量)的二氯甲烷(150毫升)溶液，攪拌混合物兩小時並且回溫至室溫。(冰浴可以在添加之後移除或者可經過兩小時讓混合物回溫至室溫)。過濾分離出固體並且用冷水清洗(2x)，然後用含5%二乙醚(Et2 O)的己烷清洗，空氣乾燥得到化合物2，為白色粉狀固體(22.5公克，定量產率)。最終產物被定性為LC/MS m/z MH＋ 196.13；純度>95%；1 HNMR。
方法2－使用二甲基甲醯胺(DMF)作為反應溶劑：將10公克的鄰胺基苯甲酸溶於300毫升的DMF中。添加TEA(1.5當量)並且用冰/水浴冷卻混合物。將含有氯乙醯氯(1.3當量)的DMF(100毫升)溶液逐滴添加至冷卻的反應混合物中。移除冰/水浴，並且攪拌反應混合物2小時。將反應混合物倒入冰－冷水(200－300毫升)中，並且用醋酸乙酯(EtOAc，3x萃取)萃取。將有機層混合，用水以及濃鹽水清洗，用硫酸鈉(Na2 SO4 )乾燥。濃縮得到一固體，用100毫升的10% Et2 O/己烷研製得到化合物2，是白色粉末(12公克；產率85%)。用LC/MS定性最終產物。
步驟2：製備2－(氯甲基)－3－(2－乙氧苯基)喹唑啉－4(3H)－酮(化合物3)
方法1－使用三氯膦(PCl3 )：在氮氣壓下，將化合物2(8.8公克)溶於440毫升的乙腈(CH3 CN)中，並添加2－乙氧苯胺(1.5當量)及攪拌。在這個充分攪拌的反應混合物中，逐滴添加PCl3 (2當量)。在50℃將所得到的漿液加熱6－12小時。將反應混合物倒入飽和的Na2 CO3 /冰混合物中，攪拌30分鐘，並且用EtOAc(3x300毫升)萃取。用(最少的)水以及濃鹽水來清洗混合的有機層，並且以Na2 SO4 乾燥。將溶液濃縮，並且用3% Et2 O/己烷(2x 100毫升)研製該粗製的固體/油狀混合物以移除大部分未反應的乙氧苯胺。以過濾來將所得到的固體分離，藉由通過矽膠(20% EtOAc/己烷)管柱來進一步純化之。分離出化合物3，為白色粉末(11公克，75－80%)。最終產物被定性為LC/MS m/z MH＋ 315/317；純度>98%。
方法2－使用氧氯化磷(POCl3 )：在氮氣壓下，將化合物2(1.2公克；6.0毫莫耳；1.0當量)及2－乙氧苯胺(1.2毫升；9.0毫莫耳，1.5當量)溶於30毫升的CH3 CN中。在這個溶液中，逐滴添加POCl3 (1.1毫升，12毫莫耳，2.0當量)，並且加熱該混合物迴流3個小時。將反應物冷卻至室溫，倒入冰的/飽和的NaHCO3 漿液，以及用EtOAc(3x200毫升)萃取。用水以及濃鹽水清洗混合的有機層並且用Na2 SO4 乾燥之。LC/MS分析該粗製的反應混合物確認了想要的產物化合物3(97%)的存在，還有少量的副產物化合物3c(2－3%)。LC/MS的MH＋ m/z(333/334/335)是與化合物3c的二醯胺結構吻合。想要的產物典型的是在矽膠層析法之後分離出來的(如先前方法1的步驟2所述)，得到化合物3，是白色粉末(1.3公克，產率80－85%)。
步驟3：製備3－(2－乙氧苯基)－2－(吡 －1－基甲基)喹唑啉－4(3H)－酮(化合物5)
方法1：在氮氣壓下，將化合物3(5公克)溶於CH3 CN(0.08－0.2M化合物濃度)中，以及在該混合物中依序添加碳酸鉀(K2 CO3 ，1.2當量，市售粉末)、吡(2當量)和碘化四丁基銨(0.2當量)。於60℃(水浴溫度)加熱該混合物8－10小時。以下面兩種方式之一來處理該反應物：(a)將80%的溶劑揮發掉，添加水(20毫升)，以及用EtOAc(4x60毫升)萃取混合物；或(b)用400毫升的EtOAc稀釋該反應混合物並且以水(3x20毫升)清洗。用濃鹽水清洗混合的有機層，並濃縮得到微黃色油狀物。藉由矽(10－25% MeOH/二氯甲烷)中壓層析法(CombiFlash)純化之後得到化合物5，是白色粉末(產率80－85%)。用1 HNMR以及LC/MS MH＋ 365定性該產物。
步驟4：製造4－((3－(2－乙氧苯基)－4－氧－3,4－二氫喹唑啉－2－基)甲基)吡 －1－羧酸第三丁酯(化合物4)
方法1：在氮氣壓下，將化合物3(4.0公克，12.7毫莫耳，1.0當量)溶於60毫升的CH3 CN中，以及在這個溶液中，依序添加K2 CO3 固體樣本(2.1公克，15毫莫耳，1.2當量)、Boc－吡(4.73公克，25毫莫耳，2.0當量)以及碘化鈉(NaI，570毫克，3毫莫耳，0.3當量)。於80℃加熱混合物(懸浮液)3－6小時。得到白色懸浮液。用TLC以及LC/MS檢視該反應物顯示化合物3完全轉換成化合物4。藉由低壓蒸餾將大約30毫升的CH3 CN移除，以及在所得到的漿液中，添加60毫升的水，並且用EtOAc(4x60毫升)萃取混合物。用水、飽和的氯化銨溶液(移除未反應的Boc－吡)、飽和的NaHCO3 溶液以及濃鹽水清洗混合的有機層，以及用Na2 SO4 乾燥。過濾濃縮得到固體，用己烷研製得到化合物4，是白色固體(5.6公克，定量產率)。這個物質被用在隨後的去保護步驟，不需進一步純化。用1 HNMR、LCMS定性最終化合物。
步驟5：製備3－(2－乙氧苯基)－2－(吡 －1－基甲基)喹唑啉－4(3H)－酮(化合物5)
方法1：將化合物4(2.7公克，5.8毫莫耳，1.0當量)於室溫懸浮在15毫升的無水二烷中。於室溫逐滴添加4N HCl/二烷(17毫升，12當量)的溶液；經過30分鐘的反應之後，再添加17毫升的4N HCl/二烷，並且用LC/MS監測反應的進行。(這是放熱反應且觀察到氣體釋放。反應系統必須被打開來釋放壓力，同時維持無水條件)。如果還有任何未反應的化合物4留下，則可以進一步添加8－10毫升的4N HCl/二烷來驅使反應完成。反應結束後，將各40毫升的水和CH2 Cl2 添加至反應物中，並且藉由添加足量的飽和水性Na2 CO3 溶液將混合物變成鹼性，以達到pH 8－9。將層分離，並且用CH2 Cl2 (3x60毫升)萃取水層。將有機層混合，用水(4x 10毫升，直到水性萃取物的pH是大約中性的)以及濃鹽水清洗，並且用Na2 SO4 乾燥。濃縮得到微黃色油狀物，藉由矽(10－25% MeOH/二氯甲烷)中壓層析法(CombiFlash)純化，在以含有5－10%的二乙醚的己烷研製之後得到化合物5，是白色粉末(產率85－95%)。用1 H NMR以及LC/MS定性化合物5。
一般性：分析方法 用下面的LC條件來分析化合物5：管柱： XTerra，用於MS；C18，3.5微米尺寸： 2.1x150毫米梯度： 75% CH3 CN(含有0.08%甲酸)/25%水(含有0.1%甲酸)－90% CH3 CN(含有0.08%甲酸)/10%水(含有0.1%甲酸)
以下面的管柱和流動相條件被用於LC/MS分析所有的化合物：管柱： XTerra用於MS；C18，3.5微米尺寸： 2.1x150毫米
實施例9 Sytox初級篩選
Sytox初級篩選是一種表現型分析，是用來監測由化合物處理所造成之細胞存活性－增生的改變。它被設計成是鑑認會專一性改變細胞生長潛能之化合物的高效方法，該細胞具有在腫瘤患者中發現但不會影響正常細胞的生長之成因突變(causative mutation)。
該分析是依賴一種價格低廉的、簡單的以及讀出可信的不通透膜之螢光染劑(Sytox，來自Molecular Probes)，它會與核酸結合。在健康細胞中不會偵測到訊號，因為細胞膜是完整的而染劑不會進入。然而，如果細胞膜因凋亡或壞死而損壞時，則會偵測到與類似地受影響之細胞數目成比例的螢光訊號。藉由兩步驟的讀取(最終讀取是在清潔劑存在下使所有細胞被標記)，該分析可鑑認出會產生細胞生長抑制(cytostasis)、細胞毒性及/或有絲分裂的化合物。第一次讀取或「死細胞」讀取藉由指出分析時培養物中死亡或垂死細胞的數目而提供了給定化合物的約略毒性。第二次讀取或「總細胞」讀取記錄了細胞總數降低的細胞毒性累積效應以及當毒性不存在時試驗化合物可能會對測試族群之細胞造成的任何細胞生長抑制或抗增生影響。
為了篩選的目的，先前描述的BJ－TERT系被定義為「正常」的參考細胞系，而BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞是致腫瘤細胞系。細胞被隔夜以在未經處理之情況下72小時後可允許孔洞中有95%匯合的密度接種至96個孔洞的盤中。隔天，將細胞暴露於一系列稀釋之試驗化合物48小時。此培養期間之後，依照供應商建議的濃度將Sytox試劑添加至該培養物中，並且讀取死亡細胞的螢光。完成這個測量之後，將清潔劑Saponin添加至培養物的各個孔洞中以通透細胞膜，使Sytox試劑進入每個細胞，藉此加速測量培養物中剩餘的總細胞數。
數據評估時，我們沒有區分展現細胞毒性或細胞生長抑制影響的化合物。為了用於進一步的試驗，化合物必須符合兩個嚴格的標準：i.在腫瘤細胞系死細胞或總細胞讀取(或兩者)產生至少兩個標準差程度的訊號改變。
ii.在「正常的」控制組細胞產生少於一個標準差程度的訊號改變。
本發明化合物對應的試管內數據參見表3和4以及圖15－17。
實施例10：HT－1080腫瘤治療研究：評估PRLX化合物6以及PRLX化合物5的抗腫瘤活性
小鼠株 ：裸Balb/c(Nu/Nu株，Charles River Laboratories)，雌性，5－6週大(平均體重~20公克)。
試驗物品的配方： 兩化合物都是用相同的方式調配而成的。以100毫克/公斤的劑量而言，各個化合物是以10.0毫克/毫升的濃度遞送，注射體積為0.2毫升。以50毫克/公斤的劑量而言，各個化合物是以5.0毫克/毫升的濃度遞送，注射體積為0.2毫升。在兩個劑量中，基礎劑(vehicle)包括了0.025%吐溫－80、0.01%苯甲醇、35 mM醋酸(HOAc)、100 mM磷酸鉀緩衝液、以及32 mM蔗糖，pH＝6.5。
研究組別： A：PRLX化合物6@100毫克/公斤，QDx5天，IP，n＝8 B：PRLX化合物6@50毫克/公斤，QDx5天，IP，n＝8 C：PRLX化合物5@100毫克/公斤，QDx5天，IP，n＝8 D：PRLX化合物5@50毫克/公斤，QDx5天，IP，n＝8 E：基礎劑控制組，QDx5天，IP，n＝8 F：未處理的控制組，n ＝8
治療計劃： 開始於平均腫瘤體積達到~200 mm3 ，以及持續5天，每天給藥給各個動物單一IP注射的上述治療之一，總共5劑。
植入腫瘤以及腫瘤發動： 七十隻小鼠每個都被植入1 x 107 HT－1080個細胞，其係藉由SC注射1.1 cc的接種物進入右後脅腹。使用25 G x 5/8”的針尺寸。腫瘤細胞接種物的製造是使用HT－1080細胞(ATCC分離，冷凍庫存的第六次繼代培養)，是培養在DMEM中[Gibco,No.10569－010]＋10% FCS[Gibco,No.F－2442]。回收細胞時，細胞已匯合至95－100%。HT－1080接種物被製備在無菌DMEM培養基＋10% FCS，密度為1.0x108 個細胞/毫升。在腫瘤植入9天後，將動物分為治療組和控制組，各組有8隻小鼠。全部有22隻因為腫瘤太小或太大而被排除在研究之外。這被定為研究的第1天，且治療是從這天開始。
製備注射溶液： 下面的注射溶液是在5天中每次化合物給藥時新鮮製造的：100毫克/公斤的劑(A.組以及C組) 首先，製造各個化合物的100毫克/毫升庫存溶液，其係藉由將35毫克的PRLX化合物6或PRLX化合物5溶於0.35毫升的溶劑中(0.25%吐溫－80、0.1%苯甲醇、以及350mM醋酸)。然後將所得到的庫存溶液以1：10稀釋製備最終注射溶液，係藉由以3.15毫升的稀釋劑(100 mM磷酸鉀緩衝液以及32 mM蔗糖，pH 6.8)與之混合。然後將溶液以過濾除菌(0.45微米的膜)。所得到的溶液包括了PRLX化合物6或PRLX化合物5，最終濃度為10.0毫克/毫升，pH＝6.5。
50毫克/公斤的劑(B組以及D組) 對兩種化合物而言，將1.0毫升的10毫克/毫升注射溶液(上述)以1：2稀釋，其係藉由添加1.0毫升的稀釋劑(100 mM磷酸鉀緩衝液以及32 mM蔗糖，pH 6.8)。所得到的溶液會包括PRLX化合物6或PRLX化合物5最終濃度為5.0毫克/毫升，pH＝6.5。
基礎劑控制組(E組) 基礎劑控制組的製造是藉由使用稀釋劑(100 mM磷酸鉀緩衝液以及32 mM蔗糖，pH 6.8)來1：10稀釋該溶劑(0.25%吐溫－80、0.1%苯甲醇、以及350mM醋酸)。基礎劑控制組的最終組成包括0.025%吐溫－80、0.01%苯甲醇、以及35 mM HOAc，在100 mM磷酸鉀和32 mM蔗糖中，最終pH＝6.8。
劑摘要：
腫瘤測量：從第一天開始，每隔一天將所有動物秤重，並且測量腫瘤尺寸(長度(L)以及寬(W))。然後用下面公式將腫瘤測量結果轉換成腫瘤體積(mm3 )：腫瘤體積＝LxWxW/2
將各個研究組於各時間點所得到的腫瘤體積值平均，然後對時間畫圖。差異是以平均的標準差(±SEM)來表示。這些實驗的結果顯示於圖18－20。
實施例11：PANC－1腫瘤治療研究：評估PRLX化合物6以及PRLX化合物5的抗腫瘤活性
PANC－1異種移植(Xenograft)製備以及植入PANC－1研究的實驗計劃與上面實施例10所述的HT－1080研究基本上是相同的，但是有下述不同：將繼代培養之PANC－1腫瘤組織的大約30－40毫克片段皮下植入免疫缺陷裸鼠的右脅腹。每天監測腫瘤生長，當腫瘤到達大約100mm3 時，將具有相似大小之腫瘤的動物分組，並且開始施以化合物劑量。每天給藥化合物5一次，給藥連續五天，劑量列於下面。在PANC－1異種移植中，施以模式所能忍受之最高劑量的吉西他濱(gemcitabine)作為控制組。吉西他濱攝生法是在九天期間裡的每個第三天以每天三次180毫克/公斤。
這些實驗的結果顯示於圖21－22。
併入作為參考
所有本文所提及的文獻以及專利以其全文併入作為參考，就如同各個個別的文獻或專利是被特定的和個別的指明併入作為參考。當有矛盾時，以本申請案(包括本文的任何定義)為準。
均等物
雖然本發明討論了特定的具體實例，但是上述的說明書是用以描述而非用以限制。讀過本說明書和申請專利範圍之後，本發明的許多改變是熟習此技藝的人所能顯而易知的。本發明的全部範疇應參考申請專利範圍以及其均等物的全部範圍、還有說明書和這些改變而定。
圖1的圖解顯示了實驗轉型(transformed)的人類細胞之間的關係。BJ細胞是原代人類包皮纖維母細胞。BJ－TERT細胞是源自BJ細胞並表現酵素端粒酶的催化次單元hTERT。BJ－TERT/LT/ST細胞是源自BJ－TERT細胞，係藉由置入編碼有猴病毒40大(LT)和小T(ST)癌蛋白質兩者的基因組構築體。BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 腫瘤細胞是源自BJ－TERT/LT/ST細胞，係藉由置入HRAS 的致癌對偶基因(RAS V12 )(Hahn等人, 1999,Nat Med5, 1164－70)。BJ－TERT/LT/RASV 1 2 細胞是源自BJ細胞，係藉由置入編碼有TERT、LT、RASV 1 2 的cDNA構築體以及控制組載體(Hahn等人, 2002,Nat Rev Cancer2, 331－41)。BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST細胞是源自BJ－TERT/LT/RASV 1 2 細胞，是藉由置入編碼有ST的cDNA(Hahn等人, 2002,Nat Rev Cancer2, 331－41)。TIP5細胞是原代原代人類包皮纖維母細胞。製備源自TIP5之細胞系是藉由置入編碼有hTERT、LT、ST、RAS、或乳頭狀瘤病毒E6或E7蛋白質的載體，如所示。E6和E7可共同取代LT(Lessnick等人, 2002,Cancer Cell1, 393－401)。
圖2顯示了九種基因型選擇性化合物的化學結構。
圖3的圖顯示了棘黴素和喜樹鹼對於經基因改造之細胞的影響。所指的細胞是用棘黴素(A)或喜樹鹼(B、C)處理的，在384孔盤48小時。顯示了細胞存活性的抑制百分比，是以鈣黃綠素AM(calcein AM)量測的。誤差槓表示一個標準差。(A)經棘黴素處理的BJ、BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞；(B)經喜樹鹼處理的BJ、BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞；以及(C)經喜樹鹼處理的BJ－TERT/LT/RASV 1 2 、BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞。
圖4的圖顯示了愛拉斯汀對於經基因改造之細胞的影響。所指的細胞是用愛拉斯汀處理的，在384孔盤48小時。顯示了細胞存活性的抑制百分比，是以鈣黃綠素AM量測的。誤差槓表示一個標準差。(A)經愛拉斯汀處理的BJ、BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞；(B)經愛拉斯汀處理的BJ－TERT/LT/RASV 1 2 細胞(缺乏ST)、BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST(致腫瘤細胞)和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 (致腫瘤細胞)；以及(C)獨立衍生的TIP5/TERT、TIP5/TERT/E6、TIP5/TERT/LT、TIP5/TERT/LT/ST以及TIP5/TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞。
圖5顯示在經基因改造的致腫瘤細胞中腫瘤選擇性化合物的蛋白質標靶是調升的。(A－C)是含有直接針對拓撲異構酶II(A)或TOPI(B、C)之抗體的BJ、BJ－TERT、BJ－TERT/LT/ST、BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 、BJ－TERT/LT/RASV 1 2 以及BJ－TERT/LT/RASV 1 2 /ST細胞溶解物的西方點墨(Western blot)。在圖(C)中，細胞是被直接針對TOPI、核纖層蛋白A/C的siRNA所轉染或是被相同長度的控制組雙股DNA雙鏈(TOPI dsDNA)所轉染。在各例子中，該墨點(blot)是用針對eIF－4E之抗體探測的，以分辨所放入之蛋白質含量差異。在各條帶下方定量了其相應含量。(D)在經基因改造的腫瘤細胞中，TOPI siRNA防止了由喜樹鹼所造成的細胞死亡。在用直接針對TOP I的siRNA轉染以及用所示之喜樹鹼濃度處理之後，測定細胞的數目。(E)岡田酸(是一種PP2A和其他細胞磷酸酶的抑制劑)使原代人類細胞對喜樹鹼敏感化。用所示濃度的喜樹鹼和岡田酸來同時處理BJ原代細胞，並測定對於鈣黃綠素AM存活性染色的影響。雖然岡田酸在所測試之最高濃度下會殺死BJ細胞，在3.4 nM時它本身並沒有作用，卻會使得BJ細胞對喜樹鹼敏感。(F)岡田酸會刺激TOP1的表現。用所示濃度之岡田酸處理BJ原代細胞，並用西方點墨法測定TOPI的表現量。相應量被定量在各條帶下方。
圖6顯示愛拉斯汀會以ST/RASV 1 2 依賴性的方式誘發快速的細胞死亡。(A)愛拉斯汀對於BJ－TERT和BJ－TERT/LT/ST/RASV 1 2 細胞之時間依賴性影響。細胞在所示濃度的愛拉斯汀存在下被接種至384孔盤中。在24、48和72小時之後用鈣黃綠素AM測定細胞存活性的抑制。(B)愛拉斯汀對於愛拉馬爾藍(Alamar Blue)存活性染色的影響，BJ-TERT(紅色)以及BJ-TERT/LT/ST/RASV12 (藍色)細胞。(C)用愛拉斯汀處理過之BJ-TERT/LT/ST/RASV12 以及BJ原代細胞的圖片。讓細胞附著一夜，然後用9 μM的愛拉斯汀處理24小時並照相。
圖7顯示喜樹鹼會誘發凋亡的特徵，但愛拉斯汀不會。(A)經喜樹鹼處理(而非經愛拉斯汀處理)的BJ-TERT/LT/ST/RASV12 細胞展現了碎裂的細胞核(全部細胞核的10-20%，紅色以及藍色箭頭)，如所示。(B)經喜樹鹼處理的BJ-TERT/LT/ST/RASV12 細胞展現膜聯蛋白V染色，但經愛拉斯汀處理的不會。在所指M1區域之未處理的、愛拉斯汀處理的(9 μM)以及喜樹鹼處理的(1 μM)細胞百分比分別是6%、6%和38%。(C)經喜樹鹼處理的BJ-TERT/LT/ST/RASV12 細胞具有活化的天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3(caspase 3)，但愛拉斯汀處理的沒有。經喜樹鹼和愛拉斯汀處理之樣本的溶解物是用直接針對活化、經切割形式之天冬胺酸特異性半胱胺酸蛋白酶3的抗體以西方點墨法分析。該墨點用直接針對eIF4E之抗體再探測(reprobed)，以控制裝填的量。
圖8顯示愛拉斯汀以及愛拉斯汀B的化學結構。關於愛拉斯汀結構活性關係，測試135種愛拉斯汀相似物的活性及選擇性(腫瘤vs.正常)，134種是不活性的且1種是活性且有選擇性的，但效果比愛拉斯汀差。
圖9顯示經愛拉斯汀處理之腫瘤細胞的細胞核仍完整。
圖10顯示愛拉斯汀會誘發活性氧形成。用二氫二氯螢 光素進行流式細胞儀分析。
圖11顯示愛拉斯汀A的化學結構。
圖12顯示在致腫瘤的BJELR細胞中VDAC3的表現顯著增加，相較於非致腫瘤的BJEH細胞。
圖13顯示標靶細胞中VDAC異構體(isoform)的相對表現量，係以VDAC-1的量為100%。
圖14顯示了由西方點墨法所鑑認之蛋白質以及結合(pull-down)實驗之SDS-PAGE，係使用具有固定活性(A6)和不活化(B1)之愛拉斯汀衍生物的粒線體萃取物。
圖15顯示MCL試驗中的化合物12、13和5之細胞總讀取，在(a)HCT116細胞、(b)DLD-1細胞、(c)OVCAR-3細胞、以及(d)BT549細胞。
圖16顯示MCL試驗中的化合物12、13和5之細胞總讀取，在(a)MiaPaca2細胞、(b)DU145細胞、(c)SK-MeI 28細胞、以及(d)Malm3M細胞。
圖17顯示MCL試驗中的化合物12、13和5之細胞總讀取，在(a)BT549細胞、(b)MCF-7細胞、(c)HOP-92細胞、以及(d)HOP-62細胞。
圖18顯示化合物6會誘發HT-1080異種移植(xenograft)的腫瘤生長抑制作用。
圖19顯示化合物5會誘發在HT-1080異種移植強健的腫瘤退化(tumor regression)。
圖20顯示化合物5對HT-1080異種移植的體重趨勢。
圖21顯示化合物6會誘發PANC-1異種移植之腫瘤生 長抑制作用。
圖22顯示化合物5會誘發PANC-1異種移植之腫瘤退化。

Claims (39)

  1. 一種具有結構式V之化合物或其醫藥上可接受的鹽類， 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基，其中C1-8 烷基視情況經以下一或多者取代：羥基鹵基、氰基、烷氧基、硝基、羰基、硫代羰基、磷酸基、磷酸根、膦酸根、亞磷酸根(phosphinate)、胺基、醯胺基、脒基、亞胺基、疊氮基、氫硫基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺醯基、磺醯胺基、磺醯基及雜環基；R3 是選自烷氧基以及未經取代之C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及未經取代之C1-8 烷基；R5 是選自H和鹵素；以及n是1或2。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  3. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  4. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該具有結構式V之的化合物為結構12：
  5. 一種具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類之用途，其係用於製備用於殺死乳癌、結腸癌、卵巢癌、 肺癌、前列腺癌或黑色素瘤細胞之細胞、促進該等細胞死亡或抑制該等細胞增生的醫藥品， 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  7. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構6：
  8. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構12：
  9. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  10. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構16：
  11. 一種具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類之用途，其係用於製備用於增加腫瘤細胞對於化療藥劑之敏感性的醫藥品， 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素以及n是1或2。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  13. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構6：
  14. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該具有結構 式V的化合物為結構12：
  15. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  16. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構16：
  17. 一種如申請專利範圍第1項中之化合物或其醫藥上可接受之鹽類的用途，其係用於製備治療哺乳動物癌症之 醫藥品。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  19. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構6：
  20. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構12：
  21. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  22. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構16：
  23. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該腫瘤細胞是乳癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌或前列腺癌或黑色素瘤。
  24. 一種具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類與增加細胞中VDAC含量的藥劑之用途，其係用於製備用於殺死細胞、促進細胞死亡或抑制細胞增生的醫藥品，其中該結構式V為： 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  26. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構6：
  27. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構12：
  28. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  29. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構16：
  30. 一種具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類與降低細胞中VDAC含量的藥劑之用途，其係用於製備用於殺死細胞、促進細胞死亡或抑制細胞增生的醫藥品，其中該結構式V為： (V)其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  31. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構5：
  32. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構6：
  33. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構12：
  34. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構13：
  35. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該具有結構式V的化合物為結構16：
  36. 一種用於殺死乳癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或黑色素瘤細胞之細胞、促進該等細胞死亡或抑制該等細胞增生的醫藥組成物，其包含有效量之具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類， 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基； R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  37. 一種用於增加腫瘤細胞或正常細胞對於化療藥劑之敏感性的醫藥組成物，其包含有效量之具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類， 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  38. 一種用於殺死細胞、促進細胞死亡或抑制細胞增生的醫藥組成物，其包含有效量之具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類及增加細胞中VDAC含量的藥劑，其中該結構式V為： 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
  39. 一種用於殺死細胞、促進細胞死亡或抑制細胞增生的醫藥組成物，其包含有效量之具有結構式V的化合物或其醫藥上可接受的鹽類及降低細胞中VDAC含量的藥劑，其中該結構式V為： 其中R1 是選自H和C1-8 烷基；R2 是選自H和C1-8 烷基；R3 是選自鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R4 是選自H、鹵素、烷氧基以及C1-8 烷基；R5 是選自H、鹵素；以及n是1或2。
TW95102803A 2005-01-25 2006-01-25 愛拉斯汀（ｅｒａｓｔｉｎ）和愛拉斯汀結合蛋白質，及其用途 TWI389892B (zh)

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