TWI388569B - 抗窖蛋白-１多株抗體、其製備用之抗原胜肽序列、及其製備方法 - Google Patents

Description

抗窖蛋白－1多株抗體、其製備用之抗原胜肽序列、及其製備方法

本發明係關於一種具高度專一性的抗窖蛋白－1多株抗體、其製備方法及所使用的抗原、以及一種用於檢測檢體中窖蛋白－1之套組。

窖蛋白－1(caveolin－1)為一膜蛋白，其包含178個胺基酸，分子量約在21至24 kDa之間。窖蛋白－1會聚集在細胞膜上富含膽固醇與訊息傳遞因子的倒袋狀結構胞膜窖(caveolae)裡；其中親水性的N端與C端暴露於細胞質內，中間疏水性的片段則埋入細胞膜中。窖蛋白－1之N端(第82－101個胺基酸)是它與訊息傳遞因子產生交互作用所必需的片段，而其C端(第135－178個胺基酸)則是窖蛋白－1單體(monomer)形成二聚體(dimer)、以及使它與細胞膜結合所必需的片段。在哺乳動物懷孕晚期和泌乳期，窖蛋白－1的表現會因泌乳素相關的訊息傳遞而減少，而若在乳腺上皮細胞株HC11中使重組窖蛋白－1過度表現，會抑制由泌乳素所引發的β－酪蛋白表現，此外，窖蛋白－1基因剔除小鼠的乳腺發育也會比正常小鼠來得早(Parket al .,2001)。因此，窖蛋白－1會在乳腺發育和泌乳期間扮演負調控子(negative regulator)的角色，若能檢測中大型經濟泌乳動物乳腺中的窖蛋白－1表現，可能有助於瞭解窖蛋白－1在乳腺中的功能。

在病理研究方面，現已在許多癌化組織(如乳癌、卵巢癌、前列腺癌及結腸癌)中發現窖蛋白－1會有喪失表現或表現量降低的情形，是以窖蛋白－1被視為有關癌症病程的標記蛋白(Sloanet al .,2004；Wikmanet al .,2004)。前人研究係利用mRNA雜交扣除(mRNA subtractive hybridization)的方式來比較正常與癌化之人類乳腺上皮細胞株，發現兩者的窖蛋白－1基因表現有顯著的差異(Sageret al .,1994)。另外，亦已發現窖蛋白－1在乳腺腺癌細胞株(mammary adenocarcinoma－derived cells)中的表現量遠比其在正常乳腺細胞株中的表現量低，且若在這些癌化之細胞株中過量表現窖蛋白－1，即可降低該細胞株的癌化程度(Parket al .,2001)。此外，利用轉染細胞而使之表現重組窖蛋白－1蛋白質的方式，使過量表現窖蛋白－1時，人類乳腺腺癌細胞的轉移能力會顯著地降低(Zhanget al .,2000)。這些研究業已證實窖蛋白－1具有對抗腫瘤生成的活性，並可作為用來診斷某些癌症進展歷程的分子標記。

目前用來檢測組織或細胞中窖蛋白－1蛋白的方法均為免疫化學或免疫螢光染色法，而現今市面上有數十種抗窖蛋白－1抗體可供選擇。然而，市面上的抗窖蛋白－1抗體大多是以窖蛋白－1之N端第1－20個胺基酸或第30－44個胺基酸作為抗原來產製的，少數則利用窖蛋白－1之C端胜肽作為抗原來產製的。Bush等人(Bushet al .,2006)曾利用別的團隊開發出之五種不同抗窖蛋白－1抗體，來檢測窖蛋白－1在MDCK細胞中表現的位置，結果發現，不同的抗體在細胞中所檢測的窖蛋白－1位置是不同的，顯示所用之各種抗窖蛋白－1抗體的檢測性質不同，且其所能檢測到在細胞中不同位置的窖蛋白－1也是不同的。

因此，若能設計出對窖蛋白－1具有更高專一性的抗窖蛋白－1抗體，對癌症研究與癌症醫學的相關發展當有極大的助益。

為了解決上述問題，本發明目的之一在於提供一種抗窖蛋白-1多株抗體，其係將一段包含窖蛋白-1胜肽序列片段SEQ ID NO：1之胜肽序列作為抗原，經皮下注射將之注入兔子體內所產生。前述抗窖蛋白-1多株抗體可辨識多種哺乳類動物之窖蛋白-1，且可用於檢測多種癌症進程的癌症標記。

本發明之另一目的在於提供一種製備前述抗窖蛋白-1多株抗體的方法。

本發明之又一目的在於提供一種用來製備前述抗窖蛋白-1多株抗體的胜肽序列。

本發明之再一目的在於提供一種用於檢測檢體中窖蛋白-1之套組，其包含前述抗窖蛋白-1多株抗體，並可進一步包含一帶有訊號之二級抗體，可用來檢測多種哺乳類動物之窖蛋白-1，且可用於檢測多種癌症進程的癌症標記。

為達上述目的，本發明提供一種抗窖蛋白-1多株抗體，其係由下列步驟所製備出來：(1)提供一段包含窖蛋白-1胜肽序列片段SEQ ID NO：1之胜肽序列作為抗原；以及(2)將前述抗原經皮下注射注入兔子體內，使該兔子產生抗窖蛋白-1多株抗體。

在本發明之較佳實施態樣中，前述抗原為胜肽序列片段SEQ ID NO：2，且SEQ ID NO：2之結構如下圖所示：

在本發明之較佳實施態樣中，前述抗窖蛋白-1多株抗體會辨識哺乳類動物之窖蛋白-1，更佳為會辨識人類、牛、山羊、大鼠或小鼠之窖蛋白-1，最佳為會辨識人類、山羊或小鼠之窖蛋白-1。

在本發明之較佳實施態樣中，前述抗窖蛋白-1多株抗體係一可檢測癌症進程的癌症標記，更佳為可檢測乳癌或結腸癌之癌症進程的癌症標記。

本發明另提供一種製備抗窖蛋白-1多株抗體的方法，其包含下列步驟：(1)提供一段包含窖蛋白-1胜肽序列片段SEQ ID NO：1之胜肽序列作為抗原；以及(2)將前述抗原經皮下注射注入兔子體內，使該兔子產生抗窖蛋白-1多株抗體。

在本發明之較佳實施態樣中，前述步驟(1)中的抗原係胜肽序列片段SEQ ID NO：2，且SEQ ID NO：2之結構如下圖所示：

本發明並提供一種用來製備如前文所述之抗窖蛋白-1多株抗體的抗原，其包含胜肽序列片段SEQ ID NO：1。

在本發明之較佳實施態樣中，前述抗原係胜肽序列片段SEQ ID NO：2，且SEQ ID NO：2之結構如下圖所示：

本發明還提供一種用於檢測檢體中窖蛋白-1之套組，其包含如前文所述之抗窖蛋白-1多株抗體。

在本發明之較佳實施態樣中，前述套組進一步包含一帶有訊號之二級抗體；更佳為前述訊號包括螢光標記及酵素；最佳為前述酵素為辣根過氧化酶(HRP)，前述螢光標記為FITC或Texas-Red。

在本發明之較佳實施態樣中，前述檢體為組織切片或細胞；較佳為癌症組織切片；更佳為乳癌或結腸癌組織切片；最佳為人類乳癌或結腸癌組織切片。

在本發明之較佳實施態樣中，前述檢體係取自人類、牛、山羊、大鼠或小鼠；更佳為取自人類、山羊或小鼠。

在本發明之較佳實施態樣中，前述套組係用以檢測癌症組織切片中的窖蛋白-1；更佳為用以檢測乳癌或結腸癌組織切片中的窖蛋白-1。

本發明且提供一種抗窖蛋白-1多株抗體，其可與窖蛋白-1結合，但不與窖蛋白-2或窖蛋白-3結合。

在本發明之較佳實施態樣中，前述窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3係取自人類、牛、山羊、大鼠或小鼠。

綜上所述，本發明係提供一種抗窖蛋白-1多株抗體，其係以包含由人類窖蛋白-1之N端的第50-65個胺基酸所組成的胜肽序列作為抗原所得出的兔子多株抗體，其中前述胜肽序列係具高親水性及高免疫原性(immunogenicity)，且高度保留在人類、猴、猩猩、牛、羊、馬、山羌、犬、貓、大鼠及小鼠等不同物種的窖蛋白-1胜肽序列中，故可廣泛辨識人類、牛、山羊、大鼠或小鼠等不同物種細胞或組織中的窖蛋白-1。此外，本發明之抗窖蛋白-1多株抗體可辨識並區分結腸或乳房之正常和癌化組織當中的窖蛋白-1表現差異，可作為腫瘤癌化進程的分子標記，對相關癌症研究有極大的助益。

本發明係經過長期研發及試驗，設計出一段包含窖蛋白-1胜肽序列片段SEQ ID NO：1之胜肽序列作為抗原，經皮下注射將之注入兔子體內以產生抗窖蛋白-1多株抗體。前述抗窖蛋白-1多株抗體可辨識多種哺乳類動物之窖蛋白-1，且可用作檢測多種癌症進程的癌症標記。本發明之操作方式及技術特徵，係透過下列具體實施例並配合圖式詳細說明，但以下實施態樣係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制本發明之申請專利範圍。

實施例 抗原的製備

利用DNAstar軟體(DNASTAR,Inc.)從人類窖蛋白-1胜肽序列(GenBank編號Hs.74034；NP_001744)中選擇出一段胜肽序列，前述胜肽序列係人類窖蛋白-1之第50至65個胺基酸所形成的片段，亦即DLVNRDPK HLNDDVVK(SEQ ID NO：1)，該片段位於窖蛋白表面，與其他已知會與窖蛋白-1產生交互作用之蛋白的結合區不同，且具有高親水性及高免疫原性等特性。此外，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的資訊中搜尋至少十六個物種的窖蛋白-1胜肽序列，再利用DNAstar軟體比對各物種的序列相似度，發現窖蛋白-1之第50-65個胺基酸係高度保留在人類、猴、猩猩、牛、羊、馬、山羌、犬、貓、大鼠及小鼠等不同物種之間的共同序列

合成一段包含前述SEQ ID NO：1之胜肽片段，並 利用多抗原胜肽系統(multiple antigen peptide system)將之修飾成為下列窖蛋白-1抗原(SEQ ID NO：2)，其結構參見第一圖：[(H₂ N-(DLVNRDPKHLNDDVVK))₂ -Lys]₄ -Lys₂ -Lys-βAla-OH

多株抗體之製備

選擇體重約1.5 kg的紐西蘭白兔(New Zealand semi-lop white rabbit)來進行抗體的製備。首先收集兔子在引發免疫反應前的兔子血清，再將1 mg前述窖蛋白-1抗原與佛蘭氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)(Sigma-Aldrich Fine Chemical,Inc.)混合，經皮下注射至兔子體內，引發最初免疫反應(primary immune response)。四週後，將0.5 mg前述窖蛋白-1抗原與佛蘭氏非完全佐劑(Sigma-Aldrich Fine Chemical,Inc.)混合，經皮下注射至兔子體內，進行第一次補強(boost)。之後，每四週補強一次，共進行三次補強，並於第二次補強注射後三週開始採血，取得含有本發明之多株抗體的免疫血清。後續試驗皆以第三次補強後所採得之含多株抗體免疫血清進行。

質體構築

將得自C57BL/6J成年小鼠之窖蛋白-1的全長cDNA利用RT-PCR放大(前置引子：CTCGAGATGTCTGGGGGCAAATACGTG(SEQ ID NO：3)，反置引子：TCTAGATATCTCTTTCTGCGTGCTGATGCG(SEQ ID NO：4))，將所得PCR產物送入pGEM-T easy載體(Promega Inc.USA)。再利用限制酶消化作用，將前述 PCR產物送入pcDNA4/myc-His^© A載體(Invitrogen Inc,USA)，得出在窖蛋白-1之C端帶有myc標記之pcDNA4-窖蛋白-1構築體。

將得自ICR小鼠泌乳期第15天之乳腺之全長窖蛋白-2利用RT-PCR放大(前置引子：GAATTCGGTACCATGGGGCTGGAGACCGAGAAGGC(SEQ ID NO：5)，反置引子：AAGCTTTCTAGAGTCGTGGCTCAGTTGCATGC(SEQ ID NO：6))，將所得PCR產物送入pGEM-T easy載體，再利用限制酶截切作用，將前述PCR產物送入pcDNA4/myc-His^© A載體，得出pcDNA4-窖蛋白-2構築體。

此外，將得自ICR小鼠肌肉之全長窖蛋白-3利用RT-PCR放大(前置引子：CGGCAGCGGCACGAGTC(SEQ ID NO：7)，反置引子：CTCCCGCACCAAGTTTTCCCATCT(SEQ ID NO：8))，所得cDNA再利用巢式PCR(nested PCR)放大(前置引子：GGATCCCTCGAGATGATGACCGAAGAGCACACGG(SEQ ID NO：9)，反置引子：AAGCTTTCTAGAGCCTTCCCTTCGCAGCACCACC(SEQ ID NO：10))，之後利用限制酶消化作用，將所得PCR產物送入pcDNA4/myc-His^© A載體，得出pcDNA4-窖蛋白-3構築體。

細胞培養

本說明書中所使用的細胞均購自美國菌種中心(ATCC)。小鼠的纖維母細胞株NIH 3T3(ATCC CRL-1658)和人類表皮細胞株A431(ATCC CRL 1555)係使用DMEM培養基(內含10%胎牛血清、2 mM L-麩醯胺酸、以及青黴素和鏈黴素各100單位/mL)加以 培養；人類乳腺上皮細胞株MCF-7(ATCC HTB-22)係使用α-MEM培養基(內含10%胎牛血清、2 mM L-麩醯胺酸、以及青黴素和鏈黴素各100單位/mL)加以培養；大鼠腦下垂體腺瘤細胞株GH3(ATCC CCL-82.1)係使用F12K培養基(內含2.5%胎牛血清、15%馬血清、2 mM L-麩醯胺酸、以及青黴素和鏈黴素各100單位/mL)加以培養；以上培養基、血清、L-麩醯胺酸和抗生素係購自Life Technologies(Gaithersburg,MD,USA)。此外，山羊乳腺上皮初代細胞GMEC係使用添加了乳腺上皮生長補充物(MEGS，Cascade Biologics Com.)的MCDB 171培養基來加以維持。小鼠肌肉係直接自鼠體取下，浸泡於RIPA緩衝液[50 mM Tris-HCl(pH 7.0)、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉、150 mM NaCl、1 mM PMSF、56 μg/mL抑胰肽(aprotinin)、10 μg/mL亮肽素(leupeptin)、1 μg/mL抑胃肽(pepstatin)、1 mM Na₃ VO₄ 、1 mM NaF、10 mM Na₄ P₂ O₇ ]中，利用均質機(Model 212 Type Ⅱ)於4℃、20,000 rpm之轉速將之均質化2分鐘。隨後，將均質化之產物靜置冰上20分鐘，再以KUBOTA1700離心機於14,000 rpm轉速離心5分鐘，離心後之上層液體即為窖蛋白-3主要來源。

細胞轉染

第二圖B的大鼠腦下垂體腺瘤細胞株GH3細胞和第三圖的人類乳腺上皮細胞株MCF-7係使用Lipofectamine Plus^TM Reagent套組(Life Technologies)進行轉染。首先將3×10⁵ 個細胞種入35 mm培養盤，培養隔夜，之後將1 μg待轉染之DNA和6 μL Plus^TM 試劑混合，以無血清之培養基稀釋成100 μL，再與4 μL Lipofectamine混合，在室溫靜置15分鐘，使DNA、Plus^TM 及Lipofectamine共同形成一複合物。之後將DNA-Plus^TM -Lipofectamine複合物與800 μL無血清之培養基混合，加到培養盤中，於細胞培養箱(37℃、5% CO₂ )內靜置3小時，之後將無血清之培養基換成新鮮的完全培養基，於細胞培養箱(37℃、5% CO₂ )內靜置48小時，完成轉染程序。

轉染後48小時萃取細胞總蛋白，以Bio-Rad蛋白測試套組(Bio-Rad,Hercules,CA)加以定量，之後進行西方墨點法之蛋白分析。

以點漬法(dot blotting)進行抗體力價測試

如第二圖A所示，使用點漬法(dot blotting)來進行抗體力價測試。首先用去離子水對前述窖蛋白-1抗原進行序列稀釋，將其濃度調整至每1 μL溶液中分別具有10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng與1 μg的抗原，而後將各濃度的抗原溶液以少量多次的方式點在硝基纖維素(nitrocellulose)膜上，乾燥後，先以含5%脫脂乳粉(安佳)的TBST溶液進行封阻程序(blocking)，於室溫下反應1小時。以TBST溶液潤洗硝基纖維素膜3次，每次5分鐘。再將前述含有本發明之多株抗體的免疫血清以TBST溶液依不同的倍率加以稀釋，與硝基纖維素膜上的抗原於4℃環境進行抗原-抗體反應12小時，同時分別使用引發免疫反應前的兔子血清與市售抗體做為陰性與陽性對照組。最後利用ECL方式呈色，並以X光片顯相。第二圖A中的測試結果顯示，在前述免疫血清中的多株抗體於1：10,000(數據未顯示)的稀釋比例下可辨識10 pg之前述窖蛋白-1抗原，具有很 高的敏感度。

萃取蛋白質樣本

使用RIPA緩衝液[50 mM Tris-HCl(pH 7.0)、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉、150 mL NaCl、1 mM PMSF、56 μg/mL抑胰肽(aprotinin)、10 μg/mL亮肽素(leupeptin)、1 μg/mL抑胃肽(pepstatin)、1 mM Na₃ VO₄ 、1 mM NaF、10 mM Na₄ P₂ O₇ ]來收取下列經轉染或未轉染之細胞，再於4℃在12,000 rpm離心10分鐘，取其上清液，亦即細胞總蛋白；其中前述細胞包含：不會表現窖蛋白-1的GH3細胞(陰性對照組)、轉染有Myc標記窖蛋白-1構築體之GH3細胞(陽性對照組)、轉染有前述pcDNA4-窖蛋白-1、pcDNA4-窖蛋白-2、或pcDNA4-窖蛋白-3構築體的MCF-7細胞、會大量表現窖蛋白-1的NIH 3T3細胞(陽性對照組)、小鼠肌肉(陽性對照組)、以及人類表皮細胞株A431和山羊乳腺上皮初代細胞GMEC。

以西方墨點法(Western blotting)進行蛋白分析

計量前述各細胞的細胞總蛋白溶液後，將要進行蛋白分析的細胞總蛋白溶液各取20 μg蛋白樣本與一倍(1×)之Laemmli緩衝液[2% SDS、10%甘油、100 mM DTT、60 mM Tris-HCl(pH6.8)及0.01%溴酚藍(bromophenol blue)]混合，在95℃作用5分鐘，使蛋白變性，之後於10-15%的SDS-PAGE膠片和1×蛋白電泳緩衝液(25 mM Tris-HCl(pH 8.3)、192 mM甘胺酸、20%甲醇)中進行蛋白膠體電泳。電泳完成後，將膠片中的 蛋白於1×蛋白電泳緩衝液中轉印至PVDF膜上。轉印完成後，將PVDF膜置入醯胺黑(amido black)溶液(溶於去離子水中的40%甲醇、10%醋酸及0.1%醯胺黑)染色5分鐘，檢驗轉印效率並作標記，再用褪染液(溶於去離子水中的40%甲醇及10%醋酸)褪染3次，每次5分鐘，之後以去離子水將PVDF膜清洗至表面無油性物質存在。接下來，在PVDF膜上加入50 mL封阻液(blocking solution)(溶於TBST緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、150 mM NaCl、0.05% Tween-20)之5%脫脂奶粉(安佳))，於室溫進行封阻程序1.5小時，之後用TB ST緩衝液清洗。於PVDF膜上加入後文所述之一級抗體(1：3,000，以TBST緩衝液稀釋)，於4℃反應12小時，再以TBST緩衝液清洗三次，之後於PVDF膜上加入與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體(Amersham Biosciences)作為二級抗體(1：3,000，以TBST緩衝液作稀釋)，於室溫旋轉反應2小時，再以TBST緩衝液清洗三次，最後加入ECL呈色基質(Amersham Biosciences)，進行X光底片曝光顯影。

a.以西方墨點法進行抗體敏感度測試

將依照前述程序從經Myc標記窖蛋白-1構築體轉染之GH3細胞、GH3細胞(陰性對照組)與NIH 3T3細胞(陽性對照組)取得之蛋白樣本在12% SDS-PAGE膠片中進行蛋白電泳，之後分別以誘發免疫反應前的兔子血清、與含有本發明之多株抗體的免疫血清作為一級抗體，並以與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體作為二級抗體，來進行西方墨點分析，結果見第二圖B。另外，將前述蛋白樣本在10%聚丙醯胺膠片中進行蛋白電泳， 之後分別以含有本發明之多株抗體的免疫血清、以及抗人類窖蛋白-1之N端第1至105個胺基酸的兔子多株抗體(Chemicon International Inc.)作為一級抗體，並以與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體作為二級抗體，來進行西方墨點分析，結果見第二圖C，其中以含有本發明之多株抗體的免疫血清作為一級抗體所得之X光片係曝光約5秒的結果，而以前述市售抗體作為一級抗體所得之X光片則係曝光約5分鐘的結果。由第二圖B、C的結果可知，本發明之多株抗體不僅可以辨識出人工合成之窖蛋白-1及NIH 3T3細胞中的內源性窖蛋白-1(含窖蛋白-1α和窖蛋白-1β)，且其敏感度較市售抗體為高。

b.以西方墨點法進行抗體專一性測試

另外，將分別從經前述pcDNA4-窖蛋白-1、pcDNA4-窖蛋白-2及pcDNA4-窖蛋白-3構築體轉染之MCF-7細胞、經Myc標記窖蛋白-1構築體轉染之GH3細胞、MCF-7細胞(陰性對照組)、以及NIH 3T3細胞和小鼠肌肉(陽性對照組)收取下來之蛋白樣本進行蛋白電泳，之後分別以含有本發明之多株抗體的免疫血清、以及市售窖蛋白-1單株抗體(選殖株2297)、窖蛋白-2單株抗體(選殖株65)、窖蛋白-3單株抗體(選殖株26)(以上單株抗體購自BD Biosciences)作為一級抗體，並以與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體作為二級抗體，來進行西方墨點分析，結果見第三圖A。由此結果可知，本發明之多株抗體對窖蛋白-1具有專一性，不會檢測到窖蛋白-2及窖蛋白-3。

c.以西方墨點法進行跨物種測試

將從小鼠NIH 3T3細胞、人類A431細胞、以及山羊GMEC細胞收取下來之蛋白樣本在10%聚丙醯胺膠片中進行蛋白電泳，之後分別以引發免疫反應前的兔子血清(陰性對照組)、以及含有本發明之多株抗體的免疫血清作為一級抗體，並以與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體作為二級抗體，來進行西方墨點分析，結果見第三圖B。由此結果可知，本發明之多株抗體可檢測到多個物種的窖蛋白-1，具有進行跨物種測試的能力。

以細胞免疫染色測試檢測細胞內源性窖蛋白-1

分別將3×10⁵ 個細胞/mL之小鼠NIH 3T3與人類A431細胞培養液加到22×22 mm蓋玻片上培養24小時後，以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定15分鐘，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘；之後加入0.5% Triton X-100並於室溫靜置10分鐘，進行細胞穿孔程序，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。接下來，以溶於1×PBS之10%正常山羊血清(Jackson Immunoresearch Laboratories,USA)於室溫封阻一小時，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。之後在覆有細胞的蓋玻片上加入含有本發明之多株抗體的免疫血清(1：300，以PBS稀釋)，於4℃反應隔夜，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。接著，在前述蓋玻片上加入與FITC共軛結合之驢抗兔IgG二級抗體(Jackson Immunoresearch Laboratories,USA)(1：300，以PBS稀釋)，避光靜置2小時，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。之後，以10 ng/mL Hoechst 33342染劑(Sigma-Aldrich Fine Chemical,Inc.)、以及2.5 μg/mL與Texas- red共軛結合之鬼筆環肽(phalloidin)(Sigma-Aldrich Fine Chemical,Inc.)於室溫進行對比染色10分鐘，再以PBS清洗3次。最後，將染色完成的細胞封於封片液Mowiol 4-88(Calbiochem,Germany)，並以透明指甲油固定封邊，用雷射掃描共軛焦顯微鏡(LSM 510，Zeiss)進行觀察。以上細胞染色結果見於第四圖，由此結果可知，本發明之多株抗體可檢測到人類與小鼠細胞中自然產生的窖蛋白-1。

抗體免疫沉降能力試驗

使用人類A431細胞的蛋白萃取物來進行免疫沉降試驗。首先利用500 μL RIPA緩衝液來萃取3×10⁶ 人類A431細胞的細胞總蛋白，將其蛋白濃度調整為1 μg/μL，並各取500 μL前述蛋白，與1 μL誘發免疫反應前的兔子血清、或與含有本發明之多株抗體的免疫血清混合，於4℃旋轉混合30分鐘，再加入20 μL蛋白A-Sepharose(Protein A-Sepharose)漿體，於4℃再次旋轉混合30分鐘。接下來，於4℃在12,000 rpm離心5分鐘，吸去上清液，再以NET緩衝液[(150 mM NaCl,1 mM EDTA,50 mM Tris(pH 8)]清洗3次，每次清洗後均於4℃在12,000 rpm離心5分鐘，最後一次清洗後，徹底吸去上清液，並加入50 μL二倍濃度(2×)之Laemmli緩衝液混合均勻，於95℃作用5分鐘。再於室溫在12,000 rpm離心5分鐘，並吸出上清液作為樣本，進行西方點墨法分析，結果見第五圖。由此結果可知，本發明之多株抗體對窖蛋白-1可以成功地將A431細胞中的內源性窖蛋白-1沈降下來。

由於本發明之多株抗體可成功地以免疫沉降方法 來純化窖蛋白-1，故可依照與本發明之多株抗體結合之抗原胜肽序列的位置，來推測由該抗原序列所製備的抗體是否可經由免疫沉降或免疫吸附的方式來純化窖蛋白-1、或作為研究會與窖蛋白-1產生交互作用之蛋白的共免疫沉降工具。

活體切片中的窖蛋白-1表現量評估

已知人類乳房或結腸的正常組織會表現窖蛋白-1。因此，在50名乳癌或結腸癌患者身上取得正常及癌化的人類乳房(25組)或結腸(25組)組織(以上檢體得自台大醫院)，其中正常組織係取自同一患者之癌化組織周邊，作為對照組。

將前述正常及癌化的人類乳房或結腸組織製成7 μm厚的冷凍組織切片，以4%多聚甲醛固定，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。之後，以0.3% H₂ O₂ 於室溫下處理切片30分鐘，以去除內源性過氧化酶(peroxidase)活性，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。接下來，將切片樣本於室溫浸泡在10%正常山羊血清中，進行封阻程序1小時，再以1×PBS清洗3次，每次5分鐘。取100 μL含有本發明之多株抗體的免疫血清的稀釋液(1：100，以PBS稀釋)於4℃潮濕的密閉容器中進行雜合反應隔夜(或24小時)，再以1×PBS清洗3次，將處理後的切片浸泡在100 μL含有與HRP共軛結合之抗兔子IgG抗體稀釋液(1：300，以PBS稀釋)中於室溫反應2小時，再以1×PBS於室溫清洗3次，每次5分鐘。之後使用ABC套組(Vectastain Elite)、H₂ O₂ 及二胺基聯苯胺四氫氯酸鹽(diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)試劑顯色，產生紅棕色的沉 澱，顯色後將切片風乾，以90%甘油/PBS封片，並以透明指甲油固定封邊，結果見第六圖A。由此結果可知，本發明之多株抗體能夠辨認窖蛋白-1於正常及癌化組織中的表現量。

此外，在光學顯微鏡下將前述切片中的紅棕色沉澱依其形成時間和顯色強度分成6個等級，經SAS軟體(第9.1版)使用配對T檢定(pairing T test)統計後，顯示本發明之多株抗體能有效區分窖蛋白-1於正常及癌化組織中的表現量，結果見第六圖B。由此結果可知，本發明之多株抗體對窖蛋白-1可用來明確地區分乳房及結腸的正常組織與癌化組織，有助於監測乳癌或結腸癌的疾病進程。

第一圖係本發明之窖蛋白-1抗原(SEQ ID NO：2)的結構圖。

第二圖係使用含有本發明之抗窖蛋白-1多株抗體的兔子免疫血清，來證明本發明之抗窖蛋白-1多株抗體確實可以辨識本發明之窖蛋白-1抗原，且效果優於市售抗窖蛋白-1多株抗體(圖A)；此外，本發明之抗窖蛋白-1多株抗體可辨識經轉染至GH3細胞中的外源性窖蛋白-1和NIH 3T3細胞中的內源性窖蛋白-1(圖B)，且其效價優於市售窖蛋白-1多株抗體(圖C)；其中引發免疫反應前的兔子血清係用作陰性對照組。

第三圖A說明本發明之抗窖蛋白-1多株抗體可專一地辨識窖蛋白-1，而不會產生窖蛋白-2或窖蛋白-3的訊號；其使用本發明之抗窖蛋白-1多株抗體與市售窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3單株抗體對轉染有窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3的人類細胞MCF-7進行西方墨 點測試結果，其中窖蛋白-1及窖蛋白-2的陽性對照組為NIH 3T3細胞，窖蛋白-3的陽性對照組為小鼠肌肉，未轉染的MCF-7細胞則為陰性對照組。第三圖B則使用小鼠NIH 3T3細胞、人類A431細胞及山羊GMEC細胞來說明本發明之抗窖蛋白-1多株抗體對窖蛋白-1具有跨物種之檢測能力，並使用引發免疫反應前的兔子血清作為陰性對照組。

第四圖係以細胞免疫螢光染色說明本發明之抗窖蛋白-1多株抗體可檢測人類A431細胞(A-D)及小鼠NIH 3T3細胞(E-H)中的內源性窖蛋白-1，其中使用本發明之抗窖蛋白-1多株抗體對前述細胞進行內源性窖蛋白-1染色(A及E)，並使用引發免疫反應前的兔子血清作為陰性對照組(C及G)，並以與Texas-red共軛結合之鬼筆環肽進行對比染色(B、D、F、H)。

第五圖係以本發明之抗窖蛋白-1多株抗體對人類A431細胞萃取物進行免疫沉降試驗的結果，說明本發明之抗窖蛋白-1多株抗體可以透過免疫沉降的方式將人類細胞中的內源性窖蛋白-1沉降下來。

第六圖A係以本發明之抗窖蛋白-1多株抗體對乳癌患者和結腸癌患者之正常及癌化的人類乳房組織或結腸組織冷凍切片進行DAB染色(a：正常乳房組織；b：癌化乳房組織；c：正常結腸組織；d：癌化結腸組織)，其中癌化組織中的窖蛋白-1表現量較正常組織為低；第六圖B則係在光學顯微鏡下將前述切片中的紅棕色沉澱依其形成時間和顯色強度分級並加以統計後的結果。

參考文獻

Bushet al. Antibody-specific detection of caveolin-1 in subapical compartments of MDCK cells.Cell Biol. 126: 27-34, 2006

Parket al. Prolactin negatively regulates caveolin-1 gene expression in the mammary gland during lactation, via a Ras-dependent mechanism.J. Biol. Chem. 276: 48389-48397, 2001

Sageret al. RNA genetics of breast cancer: maspin as a paradigm.Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 537-546, 1994

Sloanet al. , Caveolin-linhibits breast cancer growth and metastasis.Oncogene 23: 7893-7897, 2004

Wikmanet al. , Caveolins as tumor markers in lung cancer detected by combined use of cDNA and tissue microarrays.J. Pathol. 203: 584-593, 2004

Zhanget al. , Caveolin-1 Inhibits Epidermal Growth Factor-stimulated Lamellipod Extension and Cell Migration in Metastatic Mammary Adenocarcinoma Cells (MTLn3).J. Biol. Chem. 275: 20717-20725, 2004

<110> 國立臺灣大學

<120> 抗窖蛋白-1多株抗體、其製備用之抗原胜肽序列、及其製備方法

<130> 07p0429

<160> 10

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 由窖蛋白-1胜肽所合成之3D抗原

<220>

<221> misc_feature

<222> (135)..(135)

<223> Xaa可為任一自然產生的胺基酸

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<210>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 10

Claims (21)

1. 一種抗窖蛋白-1(Caveolin-1)多株抗體，其係由下列步驟所製備出來：(1)提供一段由一或多個窖蛋白-1胜肽序列片段SEQ ID NO：1所構成之胜肽序列作為抗原；以及(2)將前述抗原經皮下注射注入兔子體內，使該兔子產生抗窖蛋白-1多株抗體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其中前述抗原為胜肽序列片段SEQ ID NO：2，且SEQ ID NO：2之結構如下圖所示：
3. 如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其會辨識哺乳類動物之窖蛋白-1。
4. 如申請專利範圍第3項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其中前述哺乳類動物包括人類、牛、山羊、大鼠或小鼠。
5. 如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其係一可檢測癌症進程的癌症標記。
6. 如申請專利範圍第5項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其中前述癌症包括乳癌或結腸癌。
7. 一種用來製備如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體的抗原，其係由一或多個胜肽序列片段SEQ ID NO：1所構成。
8. 如申請專利範圍第7項所述之抗原，其係胜肽序列片段SEQ ID NO：2，且SEQ ID NO：2之結構如下圖所示：
9. 一種用於檢測檢體中窖蛋白-1之套組，其包含如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體。
10. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其中前述套組進一步包含一帶有訊號之二級抗體。
11. 如申請專利範圍第10項所述之套組，其中前述訊號包括螢光標記或酵素。
12. 如申請專利範圍第11項所述之套組，其中前述酵素為辣根過氧化酶(HRP)。
13. 如申請專利範圍第11項所述之套組，其中前述螢光標記為異硫氰酸螢光素(FITC，Fluorescein isothiocyanate)或德克薩斯紅(Texas-Red)。
14. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其中前述檢體為組織切片或細胞。
15. 如申請專利範圍第14項所述之套組，其中前述檢體為 癌症組織切片。
16. 如申請專利範圍第15項所述之套組，其中前述檢體為乳癌或結腸癌組織切片。
17. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其中前述檢體係取自人類、牛、山羊、大鼠或小鼠。
18. 如申請專利範圍第9項所述之套組，其係用以檢測癌症組織切片中的窖蛋白-1。
19. 如申請專利範圍第18項所述之套組，其中前述癌症包括乳癌或結腸癌。
20. 如申請專利範圍第1項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其可與窖蛋白-1結合，但不與窖蛋白-2或窖蛋白-3結合。
21. 如申請專利範圍第20項所述之抗窖蛋白-1多株抗體，其中前述窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3係取自人類、牛、山羊、大鼠或小鼠。