TWI343949B - - Google Patents

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1343.949 4 九、發明說明： , 【發明所屬之技術領域】 * 本發明係關於一種新穎副乾酪乳桿菌副乾酪亞種 ㈣咖⑽· subsp. ⑽^/) SG96菌株，特別是指一種可以抑制大腸桿菌 co/i)及沙門氏菌抑咖·等病原菌之新穎副乾 ’路乳㈣副祕亞種微生物株，以及含有關祕乳桿_祕亞種之抑 菌組合物及該組合物之用途。 【先前技術】 近幾十年來’由於人口快速增加'物f生活水準大幅提昇，人們對肉 品的需求量大增’為了滿足市場需求，許多經濟動物的飼養逐漸具規模， 尤其是落後國家對於食物進口的能力較低，因而大量高密度或大面積飼養 經濟動物’導致許多疾病在動物間快速散播。為了改善經濟動物生病問題， 或讓經濟動物快速生長，長期以來的作法是在飼料中添加抗生素，或對動 •物施打抗生素，結果導致大量耐藥菌株的產生。 】960年代末期，抗生素的出現，使人類在治療細菌性感染的領域上獲 传二則勝利，許多原本致命的傳染病不再可怕。然而近幾年，具抗藥性細 菌的出現，人類對傳染性疾病的憂心與恐懼又再度升高，因為抗生素已經 不再是控伽情的萬$丹，具抗細菌散播速度更是超出我們的想像。 細菌耐藥性帶來的不僅是療效的下降甚至無效，而且已經嚴重影響到人類 的健康。时年前全世界每年死於感軸的人數約為萬，而到了 1343949 現在，醫學科學取得了很大的進步，每年死於感紐赫的人數卻上升到 2,〇〇〇萬。當人們長期食用含有抗生賴留的肉、蛋、奶等畜禽食品時這 些抗生素殘留會對人體產生有㈣用，並在人體中蓄積，導致抗藥性菌株 不斷的發生。 肉品安全的問触近十轉最受職費者、農漁畜社產者及政府所 關注’消費者對肉品安全的持續高度·’起因於過錢年_外發生數 起令人驚恐的肉品安全事件，例如英國發生的狂牛症'東南亞與中國大陸 發生H5N1纽麟事件。為了顧及肉品食用的安全性，世界各國對抗生 素殘留引起不良後果問題也相當重視。為了延緩具抗藥性菌株問題的發 生，199〇年中期，—些歐湖家_在醫療上及農業上約束、管制抗生素 使用，希冀以此方式來降低抗藥性菌株產生的速率。歐盟從1995年開始， 陸續禁用某些抗生素麟飼料中，並且收到良好的成效，例如，哥本哈根 的丹麥獸4實驗至研究人員表示，當㈣安巴素㈣啊_)的抗生素後丹 麥嫩雞消化道中的腸球菌伽騰觸伽叫對安巴素的抗藥性，從西 π I"5年的现，至2_降為抓。德國與荷蘭在同時期的五年内禁用安 巴素後，亦顯示於動物及人體中的抗藥性菌株均減少了，所以，歐盟已於 2〇〇6年1月開始禁止添加抗生素於飼料中。 在飼料中添加抗生素的目的是促進生長，減少粗補，可以提高畜禽 的生長效率’但疋由於畜禽的生長職縮短，營養物質的沉殿必然減少， 使得畜禽產品特有的風味和品fT降；更為嚴重的是藥物的殘留對人類的 徤康’特狀對兒t在生長_健康造成嚴重的危害。因此，於經濟動物 1343949 的飼料中禁用抗生素或逐漸減少抗生素使用種類、用量，係為世界之潮流。 * 但當抗生素逐步禁用後，也會衍生許多問題，為使畜牧業能正常生產，業 ‘ 者現已此接受利用益生菌劑(Probiotics)作為抗生素代用品的觀念，進而採用 作為飼料添加劑(feed additives)。 益生菌主要是乳酸菌，因為乳酸菌可以維持和恢復畜禽消化道的菌群 平衡’/肖除畜禽的應激狀態(stress)，提高畜禽的免疫抗病能力，降低發病率。 提倡使用乳酸菌醱酵的青貯飼料和液體醱酵飼料，因為乳酸菌醱酵飼料既 鲁可以有效的保持飼料的營養成分，提高消化利用率，又可以在酿酵過程中 消除可致病的腸道病原菌和某些引起人畜共患病的微生物。乳酸菌已被公 認為是抗生素非常理想的替代品。 益生菌在畜禽體内的有益作用包括： 1·維持和恢《禽消化勒以乳_群為優錢群的_平衡。消除畜禽 處於應激狀態⑽ess，如_、更換飼料、高溫、寒冷、運輸、驚嚇、疾 病等），而造成的消化道内環境失調。抑制有害菌的異常增殖及致病菌的 鲁續和定殖’麵和治療賴、τ辦消化道疾病，減少或消除體内毒 素的產生。對於微生物體系尚未建立的幼畜、離禽，補充乳酸菌的作用 尤其顯著。 2·產生非特異性免疫調節因子，提高畜禽免疫抗病能力，降低疾病感染率 和死亡率有效替代抗生素和化學藥物，減少藥物殘留的機率，提升人 類的食物品質。 3·補充營養成分，促進畜金4且 產生>肖化每’增強消化吸收能力，顯著 1343949 提高養殖業的產量和效益。 ，4·減少畜禽糞便中臭味物質，改善養殖場的環境。 * &顯著提高奶、肉、蛋的產量，增加了養殖業的效益。 食品安全問題已經引起世界各國政府的高度重視。目前各國政府正積 •極推廣綠色畜牧業’在政策、財力、物力上支援綠色產品的發展。建立綠 .色養殖的示範基地，扶植綠色畜牧產品的品牌，讓綠色產品的經營者能夠 得到實惠’讓消費者能麟到高品質、無公害的安全、綠色畜禽食品造 ^福於人類。 由此可見’上述習㈣經濟動物施打抗生素之方法仍有諸多缺失實 非一良善之設計者，而亟待加以改良。 本案發明人鑑於上述施狀生素騎生的各項缺點，乃亟思加以改良 創新，並經多年苦心孤言旨潛心研究後，終於成功研發完成本件新賴副乾路 乳桿菌副乾酪亞種(l_w/卿·_ subsp_·) SG%、含彼之抑 菌組合物及其用途。 籲【發明内容】 本發明之目的即在於提供一種新穎副乾路乳桿菌副乾路亞種s⑽菌 株’該_與料之路乳桿g BCRC9繼0(細_滿^紐_.)、 以及副乾酪乳桿菌副乾酪亞種BCRC14001、BCRC16l〇〇細▲伽 評騰…’^聽舰·)之種係關係具有明顯差異，為一新顆之副乾酿乳 桿菌副乾酪亞種微生物株。 本發明之次-目的係在於提供一種含有新穎副乾路乳桿菌副乾酿亞種 1343949 SG96之抑菌組合物，該組合物具有可抑制大腸桿菌(編及沙門 AM(Salmonella typhimurium)專痪增H叙的致朱。 本發明之另-目的係在於提供_種含有副祕乳桿_魏酿亞種 SG96之抑g組合物的麵，騎齡合物可料動物鑛、飲水之添加 物以增進動物抵抗病原菌之能力；該抑菌組合物更可進一步作為人類食 品、飲品添加物或食品，以增進人體抵抗病原菌之能力。 可達成上述發明目的之新穎副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96、含彼之抑 菌，.且β物及其用途’包括有：一新賴副乾路乳桿菌副乾酿亞種sg96菌株， 該菌株係_自豬隻腸道排錄’經過革蘭氏染色分析、W %弧分析、 〗6S rDNA定序分析、譜系分析後確認為一新顆之副乾絡乳桿菌副乾酷亞種 微生物株’該副乾酪乳桿菌副乾酪 亞種SG% _已«躲新竹食品工展研究触物資聽存及研究 中心，寄存編號為BCRC910398,寄存日期為2008年8月2〇曰。 將本發明所篩選到之副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株，分別進行濾 紙片壤脂擴散法(disc-agar diffusion)分析以及與病原菌混合培養試驗分析， 結果顯示，本發明SG96菌株可以抑制大腸桿邮⑽·)及沙門氏菌 等病原菌之生長，甚至有殺菌效果。 將本發明之副祕乳㈣副祕亞種SG96 _配製成水溶液館食未 離乳豬仔，結果顯示本發明SG%菌株可明顯促進未離乳仔諸趙重增加、改 善仔緒飼料之換鱗’並具有良好的抗下痢效果，且成效優於—般使用之 抗生素，證明本㈣SG96 _具有增進動物抵抗病原菌之能力。 1343949 合有本發明副乾酪乳桿菌副乾酪亞種8(3%菌株之抗菌組合物，除可配 ’製為水溶液做為動物仙水之外，亦可搭配習賴料添加物製成技術，以 。製備成其他形式’包括動物飼料添加物、動物用及人顚詩組合物、食 添加物、飲料添加物、食品、飲品、健康食品等，經由口服方式為動物 及人類所攝取。於-健實關巾，該抗陳合物可製成乳雜劑、粉末 或顆粒狀’並可添加於動物飼料或食品中(如：丨顿飼料添加丨公斤粉狀 或顆粒狀的副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG%菌株(1〇7CFU/g》；或可單獨或 鲁與其他乳gm將乳品醋酵製成優路乳或優格等乳製品。 本發明係以下面的實施例予以示範闌明，但本發明不受下述實施例所 限制。 【實施方式】 實施例一副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之篩選與分離 收集豬隻腸道排泄物，置AMRS肉湯培養基(碰〇下'卿28813〇)中， #在3?>C厭氧環境下培養24小時後，將該培養物塗佈在MRS礎脂平板 (Difco , REF28821G)_L ,然後在37T培養3天。培養後，收集在瓊脂培養 基上出現㈣落’共獲得_多株產_，再赠紙㈣脂絲法(disc— diffusion)篩選出具有抑制大腸桿菌(五⑺"）（BCRC丨丨及沙門氏菌 )(BCRC1294G7)之乳_，再從其巾麟出減最佳之機能性 ® M$i^Sk^(Lactobacillusparacasei subsp. paracasei) SG96»ith 菌種培養特徵如下：在MRS _平板上長成直徑為2 3顧的灰色菌落， 最佳培養溫度在37°C。所述_祕乳桿菌副乾路亞種SG%已經寄存於 1343949

新竹食品紐展研究所生物魏保存及研究k，寄存編號為BCRC ,910398，寄存曰期為2008年8月20曰。 實施例二副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之革蘭氏染色 利用革蘭氏染色法檢測菌株的特徵。結果如圖一 A所示，本發明的菌 •株為革蘭氏陽性菌（Gram-positive bacteria)，無芽胞厭氧菌（non_sporing anaerobes) ’及無運動性菌(non-mobility)，為乳桿菌的典型特徵。 ^ 副乾路乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之菌學特徵如下所示： (a) 形態學特徵： (1) 細胞形狀及大小：當細胞置於MRS肉湯培養基中，在37〇C厭氧 環境下培養24小時後，可於顯微鏡下觀察到呈現桿狀之桿菌(如 圖一B所示）。 (2) 活動力：無運動性 (3) 鞭毛：無 φ (4)孢子形成：無孢子形成 (5)革蘭氏染色：陽性 (b) 培養特徵： ⑴培養基：MRS肉湯培養基，pH = 6.25 (2)培養條件：37°C厭氧環境 (c) 生理學特徵： ⑴過氣化氫酶：陰性 (2)氧化酶：陰性 1343949 (3)API 50 CHL測試：請參閱實施例三所示。 實施例三副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之16S rDNA定序分析 1.DNA萃取 利用 FavorPrep™ Blood Genomic DNA Extraction Mimi Kit 純化 DNA ’ 將該菌培養隔夜，取 200 pL 菌液加 20 pL proteinase K (proteinase K使用前加110 pLddH20振盈混合5min使濃度為11 mg/mL，冰存於-20 °C備用），加200 μι FABG buffer，振盪混合5秒，60 T加熱15分鐘 後短暫離心。加200 μί 95%酒精，振盪混合1〇秒，短暫離心，加入fABG 管柱(FABG column)中，而且 FABG column 放入 Collection Tube 中， 10,000 rpm離心2分鐘。將離心後之FABG column取出，將下清液倒 出後以衛生紙吸乾後，將FABG column放回Collection Tube中，加500 μΐ^ W1 buffer (第一次取用時須加入8mL 95%酒精），l〇,〇〇〇rpm離心2 分鐘’將離心後之FABG column取出，將下清液倒出後以衛生紙吸乾， 將 FABG column 放回 Collection Tube 中。加入 750 pLWB (第一次取用 時須加入40mL 95%酒精）’ 10,000rpm離心2分鐘，將下清液倒出後以 衛生紙吸乾，將FABG column放回Col丨ection Tube中，l〇,〇〇〇rpm離心 6分鐘。再將離心後之FABG column放入1.5ml離心管中，加入Elution Buffer 150 pL’靜置3分鐘，10,000rpm離心4分鐘，此即為純化之DNA， 置於-20°C備用。 2.16SrDNAPCR片段放大 取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG%菌株之DNA，以及副乾酪乳桿 [S1 12 1343949 菌GMNL-32菌株之DNA(該菌株寄存編號為BCRC910220,該菌株已 獲得我國發明專利1284149 ’為具有治療過敏相關功能之副乾酪乳桿菌 菌株）’進行16S rDNA (ribosomal DNA)片段放大，所用引子(primers) 為根據16S rDNA基因第8-27位鹼基和1510-1492位鹼基序列設 計的原核生物16S rDNA PCR通用引子(William G. Weisburg， Susan Μ. Bams, Dale A. Pelletier, and David J. Lane. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. J. Bacteriol. 1991 January; 173(2): 697,703)，引子序列如下所示： 正向引子fDl : 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID No: 1) 反向引子rPl : 5' -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’ (SEQ ID No: 2) 該16S rDNAPCR片段放大程序如下：（i) 95°c下5分鐘；（2) 94°C下1 分鐘·’（3) 60°C下30秒；（4) 72°C下1.5分鐘；（5) 72T下10分鐘，步 驟(2)至(4)重複30個循環。 另外’取田乾酷乳桿卤副乾赂亞種BCRC14001 (Lacioftac说ws paraawe/ subsp，以及副乾酪乳桿菌副乾酪亞種BCRC16100 subsp.paraawez·)之 DNA 進行 16S rDNA 片段放 大，所用引子係根據副乾酪乳桿菌16SrRNAVl區域，以及乳桿菌16S rRNA 保守(conserved)序列而來(Ward, L. J. H.，and Timmins, M. J. 1999. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and [S] 13 1343949

Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Lett. Appl.

Microbiol. 29:90-92.)，引子序列如下所示： 正向引子： (SEQ ID No: 3) (SEQ ID No: 4) -CACCGAGATTCAACATGGJ 反向引子： -CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3, 5玄16S rDNAPCR片段放大程序如下：（i) 95c>c下5分鐘；（2) 94〇c下1

分鐘；（3) 60〇C下30秒；（4) 72°C下1.5分鐘；（5) 72〇C下10分鐘，步 驟(2)至(4)重複30個循環。 3.16S rDNA PCR片段定序、比對 將副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之16S rDNA的PCR產物進 行瓊脂凝膠電泳，結果如圖二所示；由圖二得知，該pCR產物片段約 為1,500 bp (標準品片段之長度由上至下依序為3k，2k，丨5k, 1K，9〇〇, 800’ 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp) ’並進行定序工作，副乾酪乳桿 菌副乾酪亞種SG96菌株之16S rDNA的序列如SEQIDNo: 5所示；將 序列對照複合序列比對資料集（NCm blastn ， http://www.ncbi_nlm.nih.gov/BLAST)進行序列比對，結果如圖三所示， 序列比對結果為98%精確度副乾酪乳桿菌(1邮〇6^./^/?£^_.；)。 實施例四副乾路乳桿菌副乾路亞種SG96菌株之API 50 CHL分析 利用API 50 CHL試劑檢驗本發明乳酸菌菌株的碳水化合物代謝性 U] 1343949 能’ API 50 CHL試劑可用來鑑^菌株在屬或種上的差異，經委託新竹 . 食品工業發展研究所檢測，API 50 CHL分析結果如表一及附件一所 , 示，顯示本發明的菌株與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種⑽ subsp./^raccwe/ 1)之碳水化合物代謝活性具有98〇/〇相似性，因 此以API 50 CHL分析進一步確認本發明之菌株歸類於副乾酪乳酸桿菌 副乾路亞種subsp.)。 表一 API 50 CHL分析結果 φ 參照：97ID036-L27 條片（strip) : API50CHLV5.1 分佈(profile) .-----+----+ +++----++- +++++++·>__ ++

— — 一 — + - — 一 — 0 GLY ERY DARA LARA RIB DXYL LXYL ADO MDX + + + + - - — — + 十 GAL GLU FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR — + + + + + + + ? — MDM MDG NAG AMY ARB ESC SAL CEL MAL LAC - + + - + — — — — 一 MEL SAC TRE INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN + — + - — - — — 一 — TUR LYX TAG DFUC LFUC DARL LARL GNT 2KG 5KG 重大門類 %ID T 對比測試 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 2 98.5 0.78 葡萄糖酸(GNT) 83% 次一門類 %ID T 對比測試 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 1 1.4 0.55 乳糖(LAC) 99% 龍膽二糖(GEN) 80% 葡萄糖酸(GNT) 93%

實施例五副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96譜系分析 1343949 將 NCBI Nucleotide 資料庫(http://www.ncbi.nlm,nih.g〇v/)中所公佈 之45株副乾酷乳桿菌(LaciohczY/ws/wracosez*)、副乾路乳酸桿菌副#路 & 後（Lactobacillus pamcosez· subsp. paracosez·)及乾路乳桿菌 (Lactobacillus casei)之序列，與BCRC資料庫中所公佈之兩株 BCRCM0(H、BCRC16100之序列，以及t華民國專利和美國專利核准 各一株 GMNL-32 (BCRC910220)與 CSK01 之序列，利用 embl_EBi ClustalW2 (http://www.ebi_ac_uk/clustalw)進行譜系分析比較，譜系分 析結果如圖四所示，SG96僅與其中五株菌種屬同一族群，但又可與該 五株分歧出另一支獨立的品系’此代表SG96在分類系統上具有獨特 性，因此確實證明SG96為一新穎副乾酪乳酸桿菌副乾路亞種 (Lactobaci丨lusparacasei subsp.paracasei)微 ί 物株。 實施例六副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株對大腸桿菌與沙門氏菌的 抑制作用 1.渡紙片壤脂擴散法(disc-agar diffusion) 將大腸桿菌(寄存編號BCRC 11634)及沙門氏菌（寄存編號BCRC 12947)分別取一白金耳的菌量接種於TSA培養基(Soybean-Casein Digest Agar Medium, Difco™，REF236950)斜面，經過 35-370C 培養 17-24 小 時’使菌株逹到生長平穩期，並使用分光光度計進行濁度測定，調整適 當菌體濁度(約600nm之濁度80%，80% T)。分別吸取此二種病原菌菌 液0.5ml至溫度約為48°C之平板固體培養基中，再倒入培養皿中，放 置1小時待凝固後，取直徑8mm無菌濾紙錠沾取副乾酪乳桿菌副乾酪 [S] 16 亞種SC%菌株之菌液’輕放無菌濾、紙鍵於上述培養孤上於仰〇c 下培養17 24 !時觀察結果’測量抑細直徑，同咖抗生素鍵徽素 (streptomycin) 15g/mL 做正對照組(p〇sitive c〇mr〇1)。 結果如圖五、圖六所示，本發明副乾路乳桿菌副乾路亞種犯96菌 株對大腸桿菌(BCRC 11634)的抑制圈直徑為u 8咖（如圖五所示），而 抗生素s_o零in的抑制圏直徑為„ 〇咖，顯示副乾路乳桿菌副乾 酪亞種SG96 有較強的抑制作用。而本發明菌株對沙門氏菌(bcrc 12947)的抑制圈直控為12 5 _ (如圖六所示），而抗生素卿崎咖 的抑制圈直徑為11.2 mm，顯示副乾路乳桿菌副乾酿亞種SG%菌株有 較強的抑制作用。 2.副乾赂乳桿菌副乾路亞種SG%菌株與病原菌混合培養試驗

在此實驗中選用大腸桿菌(BCRC丨]634)及沙門氏菌(BCRC 12947) 作為病原菌。將病原菌與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG%菌株混合培養 (以TSA培養基於37°C進行培養），並於培養期間取樣，取樣樣品經系 列稀釋適當倍數後分別取1〇〇 μι進行塗盤於MRS及TSA培養皿上， MRS培養皿置於35_37^厭氧環境下培養，靜置培養24·48小時，TSA 培養皿置於35-37。(：好氡環境下培養，靜置培養24小時，待菌落生成 後分別計數副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之菌數培養皿)與 病原菌菌數(TSA培養姐）。 如圖七所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株108菌數 (CFU/ml)分別與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合 培養’結果為大腸桿菌在8小時内菌數由ίο8減少至ΙΟ1，沙門氏菌在6 小時内菌數由1〇8減少至101，可見抑制效果強，甚至有殺菌效果。 如圖八所示’取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇7菌數分別 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，大腸桿菌 在22小時内菌數由1〇8減少至〇，沙門氏菌在16小時内菌數由1〇8減 少至0。 如圖九所示’取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株106菌數分別 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，大腸桿菌 在24小時内菌數由1〇8減少至1〇2，沙門氏菌在18小時内菌數由1〇8 減少至0。 如圖十所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株105菌數分別 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，32小時 後大腸桿菌菌數由108減少至0，而沙門氏菌在24小時内菌數由1〇8減 少至0。 如圖十一所示’取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇4菌數分 別與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，38小 時後大腸桿菌菌數由1〇8減少至〇,而沙門氏菌在24小時内菌數由1〇8 減少至0。 實施例七動物試驗 L副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株對初生未離乳仔豬體重之影響 酪農戶挑選由同一母豬同期生產之初生未離乳仔豬，將其分成兩組 1343949 進行傲飼’ -組為每日僅施予含卜阶阳尬的副乾路乳桿菌副乾赂 亞種SG96菌株水溶液’另—組為對照組，姉抗生素_， 〇Xytetracycline) ’槪飼時間為21天，紀錄每週仔豬之體重變化，並以 T-test進行統計分析。結果如辭二，_副乾路乳桿_乾路亞種 SG96菌株兩週後’其體重增加率比傲飼對照組顯著㈣)帅其體重平 均每週增加0.7-0.8公斤；餵飼副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG%菌株三 週後，仔豬總增加體重亦比對照組多，顯示餵飼副乾酪乳桿菌副乾酪亞 種SG96菌株可明顯促進未離乳仔豬體重增加，及改善仔豬飼料之換肉 率〇 2.副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株減少初生未離乳仔豬下荆之效果 由於初生未離乳仔緒常見下痛j ’該下病狀況通常因母豬哺乳或環境 因素所造成’仔猪常因下痢情況嚴重而早天，若能早期改善下痛^，將有 裨於仔豬正常生長。 酪農戶挑選由同一母豬同期生產之未離乳豬仔，將其分成兩組進行 银飼，一組為每曰僅施予含1*107 CFU/mL的SG96乳酸菌水溶液，另 一組為對照組，傲飼抗生素(OTC，oxytetracyc】ine)，傲飼時間為21天， 紀錄每週仔豬下痢狀況，予以評分，下痢分數評分係根據Underdahl等 人所發表的文獻標準而訂(Underdahl NR，Torres-Medina A，Dosten AR. 1982. Effect of Streptococcus faecium C-68 in control 〇f Escherichia coli-induced diarrhea in gnotobiotic pigs. Am. J. Vet. Res \g%2. 12: 2227-2232)，評分說明： [S] 19 1W949 〇分=正常； 1分=軟便、肛門周圍乾燥； 2分=肛門周圍潮濕； 3分=水痢； 4分=標準1士食料佳、體线輕和消瘦 並以T-teSt進行統計分析。結果如圖十三，银飼副乾路乳桿菌副乾赂 亞種SG%齡可達職少下叙效果，其姐於第二猶與對照組效 果相似。經銀飼一週後’銀飼副乾路乳桿菌副乾路亞種犯％菌株減少 下病效果比對照峨飼抗生素峨，且錢著差異㈣均，表示副 乾路乳桿㈣祕亞種SG96 g株具有&好的抗下触果，且成效優於 I絡農戶使用之k生素’能讓仔豬無抗生素殘留之問題。 本發明所提供之觸副祕乳桿關祕亞種SG%、含彼之抑菌組合 物及’'用途，與其他習用技術相互比較時，更具有下列之優點： 1.本發明之副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株經過革蘭氏染色分 析、ah 50 CHL分析、16S rDNA定序分析 '譜系分析後，確認與習知之 田丨乾路乳㈣BCRC91G22G、以及I彳乾崎桿躺祕亞種BCRa4〇〇1、 BCRC16100之種、關係具有明顯差異，為一新穎之副乾路乳桿菌副乾酷亞 種。 將本發明之田I丨乾赂乳桿菌副乾赂亞種SG96菌株，分別進行波紙片 瓊脂擴散法分析以及與病原菌混合培養試驗分析，結果顯示’本發明sg% 菌株不1_了以抑制大腸桿菌及沙卩]氏菌等病原菌之生長，且其抑菌作用較 C S3 20 kHst_>myein之抑㈣㈣，甚至有殺菌效果。 3,將本發明之副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株配製成水溶液餵食 未離礼猪仔’結果顯示本發明SG96齡可賴促進未離乳仔豬體重增加、 改善仔豬飼料之換肉率’並具有良好的抗下痢效果，且成效優於_般使用 U/l生素’ _本發明SG%菌株具有增進動物抵抗病原菌之能力。 上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例 並非用以限縣發明之專纖圍，凡未_本發明技藝精神所為之等效實 施或變更’例如：含有副乾路乳桿菌副乾赂亞種SG96菌株之抑菌組合物的 應用’以及製作含有副乾路乳桿菌副乾路亞種SG%菌株之抑菌組合物的形 式等變化之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。 知上所述’本案不但在菌種上確屬創新，並能較習用抗生素增進上述 多項功效’應已充分符合新祕及進步性之紋發明專利要件，絲法提 出申清’懇請貴局核准本件發明專财請案，靖發明，至感德便。 【圖式簡單說明】 圖一 A為本發明副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之革蘭氏染色結 果，圖一 B為本發明副乾酪乳桿菌副乾酪亞種S(}96菌株之型態圖； 圖一為該副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株16S rDNA片段以pCR 放大後之瓊脂凝膠電泳圖： 圖二為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種菌株SG96、BCRC 910220、 BCRC140(H、BCRC16100 之 16SrDNA 序列比對圖； 圖四為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種菌株SG96、BCRC 9丨〇22〇、 [S] 21 1343949 BCRC140(H、BCRC16100及其他副乾路乳桿菌副乾路亞種菌株之種系譜系 分析圖； 圖五為以滤紙片壤脂擴散法分析副乾路乳桿菌副乾絡亞種SG96菌株 對於大腸桿菌的抑制作用； 圖、為以紙脂擴散法分析副乾路乳桿菌副乾路亞種SG96菌株 對於沙門氏菌的抑制作用； ▲圖七料絲乳桿_祕亞種SG% _ 1G«隨與病職混合培養 5式嶮之結果； 圖八為副祕乳桿關祕亞種SG96 _ If 與病職混合培養 、之結果； ▲圖九為副乾魏桿菌副祕亞種SG96 _丨，數與病賴混合培養 試驗之結果； ▲圖十為副乾路乳桿菌副乾絡亞種SG96菌株1〇5菌數與病原菌混合培養 喊铪之結果； 圖十一為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株104菌數與病原菌混合培 養贫嶮之結果； 圖十二為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株對未離乳仔豬體重變化 之影響；以及 圖十二為副乾赂乳;t干菌副乾絡亞種SG96菌株對未離乳仔豬下痢之影 響. I S] 22 1343949 【主要元件符號說明】 1343949 序列表 〈11〇>生展生物科技股份有限公司（Syngen biotech CO·, LTD.) <120>新|員副乾絡乳桿菌副乾酷'亞種（/^以〇/73<；/77£；5/?3/'3〇35^51]05口./?3/^<；3(^/)5696、含 彼之抑菌組合物及其用途 <160〉 5 <210> 1 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉

<223〉正向引子 <400〉 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210〉 2 <211> 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉反向引子

<400〉 2 acggttacct tgttacgact t 21 <210〉 3 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉正向引子 <400> 3 caccgagatt caacatgg <210〉 4 1343949 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉反向引子 <400> 4 cccactgctg cctcccgtag gagt 24

<210> 5 <211〉 1007 <212> DNA 〈213>副乾絡乳桿菌副乾路亞種5096菌株（/^£^沾3〇/77以坪/况3從/51^5口./73/^3從_/5696

strain) <400〉 5 ggggcgcgtg ctatacatgc aagtcgaacg agttctcgtt gatgatcggt gcttgcaccg 60 agattcaaca tggaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag 120 tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcatag atccaagaac cgcatggttc 180 ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta ttagctagtt 240 ggtgaggtaa tggctcacca aggcgatgat acgtagccga actgagaggt tgatcggcca 300 cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360 atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg ggtcgtaaaa 420 ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac ggtatccaac 480 cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta 540 tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc 600 tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg 660

gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720 gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 780 accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgg ttgggagggt ttccgccctt 840 cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggga gtacgaccgc aaggttgaac 900 tcaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttattc gaagcaacgc 960 gagagcttac cagtcttgac atcttttgat cactgagaga tcagttt 1007 2

Claims (1)

1343949 • 100年04月19丨ϋ修正替換頁 十、申請專利範圍： 1.種新穎wl丨乾酷乳桿菌副乾齡亞種subsp. SG96菌株，其係寄存於新竹食品工 資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC910398。 2·種包含如申請專利範圍第1項所述之副乾齡乳桿菌副乾酷亞種 SG96菌株之組合物。 籲 3·如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該組合物係用於抑制 大陽桿菌(Escherichia co〖i)之主長。 4. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該組合物個於抑制 門氏囷(ScUmotielia typfiinuiriiwi)之也長。 5. 如申請專利範’ 2項所述之組合物，其中該組合物制於抑制 下痢。 φ 6.如申請專利範圍第2項所述之組合物，針該組合物係為動物飲 水添加物 '動物飼料添加物、動物用及人類用醫触合物、食品 添加物、飲料添加物、食品、飲品、徤康食品等形式。 1