201016848 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新穎副乾赂乳桿菌副乾路亞種{Lact〇bacUius subsp. SG96菌株，特別是指一種可以抑制大腸桿菌 (五▲η—祕)及沙門氏菌(&/_. 等病原菌之新穎副乾 酷乳桿菌副祕亞種微生物株，以及含有賴乾崎桿_乾路亞種之抑 菌組合物及該組合物之用途。 【先前技術】 近幾十年來’由於人口快速增加、物質生活水準大幅提昇，人們對肉 品的需求量大增，為了献市場需求，許多經濟動物的飼養逐漸具規模， 尤其是落後國家對於食物進口的能力較低，_大量高密度或大面積飼養 經濟動物’導致許多疾病在動物間快速散播。為了改善經濟動物生病問題， 或讓經濟動物快速生長，長期以來的作法是在飼料中添加抗生素，或對動 β物施打抗生素’結果導致大量耐藥菌株的產生。 _年代末期，抗生素的出現，使人類在治療細祕感染的領域上獲 知卫則勝利。争夕原本致命的傳染病不再可怕。然而近幾年，具抗藥性細 菌的出現，人輯傳雜赫的憂讀恐懼又再度升高，因為抗生素已經 不再是控翻情的萬靈丹，具抗雜細随播速度更是超出我們的想像。 、”田菌耐藥性帶來的不僅是療效的下降甚至無效，而且已經嚴重影響到人類 的健康。四十年前全世界每年死於感染性疾病的人數約為7〇〇帛，而到了 201016848 •現在，醫學脾轉了很大的進步，每年死於絲性疾賴人數卻上升到 2，_萬。當人們長期食用含有抗生素殘_、蛋、奶等畜禽食品時，這 些抗生素殘留會對人體產生有害作用，並在人體中蓄積’導致抗藥性菌株 不斷的發生。 肉品安全的問題最近十年來最受到消費者、農漁畜牧生產者及政府所 關注，消費者對肉品安全的持績高度關注’起因於過去幾年_外發生數 起令人驚恐的肉品安全事件，例如翻發生的狂牛症、東南亞與中國大陸 發生麵纽鱗事件。為了肉品食_安錄，世界各國對抗生 素殘留引起不良後果_也相t重視。為了賴具抗藥__題的發 生，·年中期’—魏洲國家開始在醫療上及農業上約束、管制抗生素 使用希冀以此方式來降低域，關株產生的速率。歐盟從I"5年開始， 陸續禁用某些抗生素用於飼料中，並且㈣良好的成效，例如，哥本哈根 的丹麥獸醫實驗室研究人員表示，當禁用安巴素(av〇parcin)的抗生素後，丹 麥嫩雞消化道中的腸球菌(細瞻OCCMi/_•⑽）對安巴素的抗藥性，從西 元"5年的η/。’至2〇00降為6%。德國與荷蘭在同時期的五年内禁用安 巴素後，亦顯示於動物及人體中的抗藥性菌株均減少了，所以，歐盟已於 2006年1月開始禁止添加抗生素於飼料中。 在飼料中添加抗生素的目的是促進生長，減少粗飼料，可以提高畜禽 的生長效率’但是由於畜禽的生長週細短，營養物質的韻必然減少， 使^•畜禽產品特有的風味和品質下降;更為嚴重的是藥物的殘留對人類的 健康，特別是對兒童在生長期的健康造成嚴重的危害。因此，於經濟動物 201016848 的铜料中禁用抗生素或逐漸減少抗生素使用種類、用量，係為世界之潮流。 但當抗讀逐步禁驗’也會衍生許多問題，為使畜牧業能正常生產，業 者現已能接受利用益生菌劑(Probio㈣作為抗生素代用品的觀念，進而採用 作為匈料添加劑(Feed additives)。 益生菌主要是《菌，因為乳_可輯持和恢復畜切化道的菌群 平衡，消除畜禽的應激狀態(stress)，提高畜禽的免疫抗雜力，降低發病率。 提倡使用乳酸__㈣侧和液__料，因為乳酸__料既 ©可以有效的保持飼料的營養成分，提高消化利用率，又可以在酿酵過程中 消除可致病的腸道病原菌和某些引起人畜共患病的微生物。乳酸菌已被公 認為是抗生素非常理想的替代品。 益生菌在畜禽體内的有益作用包括： 1. 維持和恢復畜禽消化道内以乳酸菌群為優勢__群平衡。消除畜禽 處於應激狀態(stress，如斷奶、更換飼料、高溫、寒冷、運輸、驚嚇、疾 病等）’而造成的消化道内環境失調。抑制有害菌的異常增殖及致病菌的 入侵和放，預防和治療腹濱、下,鱗消化道疾病，減少或消除體内毒 素的產生。對於微生物體系尚未建立的幼畜、雛禽，補充乳酸菌的作用 尤其顯著。 2. 產生非特異性免疫調㈣子，提高畜禽免疫抗病能力，降減病感染率 和死亡率。极替代抗生素和化轉物，齡無殘㈣_，提升人 類的食物品質。 3. 補充營養成分’促進畜禽生長^產生消化酶，增強消化吸收能力，顯著 201016848 提高養殖業的產量和效益。 4. 減少畜禽糞便中臭味物質，改善養殖場的環境❶ 5. 顯著提高奶、肉、蛋的產量，增加了養殖業的效益。 食品安全問題已經引起世界各國政府的高度重視。目前各國政府 極推廣綠色畜牧業，在政策、財力、物力上支援綠色產品的發展。建立綠 色養殖的示範基地，扶植綠色畜牧產品的品牌，讓綠色產品的經營者能夠 付到實惠’讓消費者能夠得到向品質、無公害的安全、綠色畜禽食品，造 φ 福於人類。 由此可見，上述習用對經濟動物施打抗生素之方法仍有諸多缺失，實 非一良善之設計者，而亟待加以改良。 本案發明人鑑於上述施用抗生素所衍生的各項缺點，乃亟思加以改良 創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件新穎副乾酪 乳桿菌副乾赂亞種c///⑽辦沉纖· subsp㈣沉纖·）SG96、含彼之抑 菌組合物及其用途。 • 【發明内容】 本發明之目的即在於提供-賴_祕乳桿目副祕雖SG%菌 株’該菌株與習知之副乾酪乳桿菌BCRC 91〇22〇(^〇w/卿謙_·)、 以及副乾路乳桿菌副乾酪亞種BCRC1彻！、BCRC161〇〇 (&論邊沒 ^_’SUbSp.p__·)之種係關係具有明顯差異鸲一新穎之副乾赂乳 桿菌副乾酪亞種微生物株。 本發月之*目的係在於提供_種含有新鋼乾赂乳桿㈣乾酿亞種 201016848 SG96之抑菌組合物，該組合物具有可抑制大腸桿菌(五邮及沙門 氏儀[Salmonella typhimurium)等病原蛰n的故朱。 -目_在於提供—種含有新綱乾錄㈣副乾赂亞種 SG96之抑g組合物的細，該_組合物可作為雜補、飲水之添加 物’以增進動物抵抗病原菌之能力；該抑菌組合物更可進一步作為人類食 品、飲品添加物或食品，以增進人體抵抗病原菌之能力。 可達成上述發明目的之新穎副乾赂乳桿菌副乾赂亞種如96、含彼之抑 ❹菌組合物及其用途，包括有：一新穎副乾路乳桿菌副乾路亞種犯96菌株， »亥菌株係筛選自豬隻腸道排泄物，經過革蘭氏染色分析、% 分析、 16S rDNA &序力析 '穩分析後確認為—_之副乾闕^桿㈣乾絡亞種 〇^z^//___‘subSw_m生物株，齡乳桿菌副乾路 亞種SG96 _已經寄存於新竹食紅#發展研究所生物資祕存及研究 中心，寄存編號為BCRC 9卿8，寄存日期為·8年8月2〇日。 將本發明所篩選到之副乾赂乳桿菌副乾路亞種犯96菌株，分別進行遽 ❿紙片瓊脂擴散法(disc-agar diffusion)分析以及與病原菌混合培養試驗分析， 、”。果顯不’本發明SG96菌株可以抑制大腸桿邮滅)及沙門氏菌 等病原菌之生長，甚至有殺菌效果。 將本發明之副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株配製成水溶液飯食未 離乳豬仔’結果顯示本發明SG96 可·促進未離乳㈣體重增加、改 善仔豬飼料之換肉率，並具有良好的抗下献果，且成效優於一般使用之 抗生素’證明本發明SG96菌株具有增進動物抵抗病原菌之能力。 201016848 含有本發明副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之抗菌組合物，除可配 製為水溶液做為動物飲用水之外’亦可搭配習用飼料添加物製成技術，以 製備成其他开>式’包括動物飼料添加物、動物用及人類用醫療組合物、食 品添加物、飲料添加物、食品、飲品、健康食品等，經由口服方式為動物 及人類所攝取。於一較佳實施例中，該抗菌組合物可製成乳酸錠劑、粉末 或顆粒狀’並可添加於動物飼料或食品中(如：1噸的飼料添加1公斤粉狀 或顆粒狀的副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株(l〇7CFU/g));或可單獨或 ❹與其他乳酸菌將乳品輯製成優路乳或優格等乳製品。 本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所 限制。 【實施方式】 實施例一副乾酪乳样菌副乾酪亞種SC%菌株之篩選與分離 收集豬隻腸道排泄物，置入MRS肉湯培養基(Difco™，REF288130)中， φ在37°c厭氧環境下培養24小時後，將該培養物塗佈在MRS瓊脂平板 (DifcoTM，REF28821〇)上，然後在37>c培養3天。培養後收集在瓊脂培養 基上出現的菌落’共獲得1000多株產酸菌’再以濾紙片瓊脂擴散法(disc agar diffusion)篩選出具有抑制大腸桿菌(_g· e〇/z·) (bcRCI 1634)及沙門氏菌(51. 妳/»>m^m)(BCRC129407)之乳酸菌，再從其中挑選出活性最佳之機能性 一乾路乳才干鼬副乾路亞種(1_〇5_7/«15押_0^/8油8卩.押^^7(2时/)8096，此 .菌種培養特徵如下：在MRS瓊脂平板上長成直徑為2-3 mm的灰色菌落， 最佳培養溫度在37°C。所述的副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96已經寄存於 201016848 新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為 910398，寄存日期為2008年8月20日。 實施例二副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG%菌株之革蘭氏染色 利用革蘭氏染色法檢測菌株的特徵。結果如圖一A所示，本發明的菌 株為革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria)，無芽胞厭氧菌(__sp〇ring anaerobes) ’及無運動性菌(non_mobility)，為乳桿菌的典型特徵。 副乾酷·乳桿菌副乾赂亞種SG96菌株之菌學特徵如下所示· Φ (a)形態學特徵： (1) 細胞形狀及大小：當細胞置於MRS肉湯培養基中，在37〇c厭氧 環境下培養24小時後，可於顯微鏡下觀察到呈現桿狀之桿菌(如 圖一 B所示）。 (2) 活動力：無運動性 (3) 鞭毛：無 φ (4)孢子形成：無孢子形成 (5)革蘭氏染色：陽性 0>)培養特徵： (1) 培養基：MRS肉湯培養基，pH = 6.25 (2) 培養條件：37°C厭氧環境 (c)生理學特徵： ⑴過氧化氫酶：陰性 (2)氧化酶：陰性 201016848 (3)API 5〇 CHL測試：請參閱實施例三所示。 實施例三副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之16S rDNA定序分析 1.DNA萃取 利用 FavorPrep™ Blood Genomic DNA Extraction Mimi Kit 純化 DNA，將該菌培養隔夜，取 200 nL 菌液加 20 pL proteinase K (proteinase K使用前加110 pL ddE^O振盈混合5min使濃度為11 mg/mL，冰存於_2〇 °C備用）’加200 jiL FABG buffer，振盪混合5秒，60 °C加熱15分鐘 Φ
後短暫離心。加200 μί 95%酒精，振盪混合10秒，短暫離心，加入FABG 管柱(FABG column)中，而且 FABG column 放入 Collection Tube 中， 10,000 rpm離心2分鐘。將離心後之FABG column取出，將下清液倒 出後以衛生紙吸乾後’將FABG column放回Collection Tube.中，加500 pL W1 buffer (第一次取用時須加入8mL 95%酒精），l〇,〇〇〇rpm離心2 分鐘’將離心後之FABG column取出’將下清液倒出後以衛生紙吸乾， 馨 將 FABG column 放回 Collection Tube 中。加入 750 |〇L WB (第一次取用 時須加入40mL95%酒精）’ 10,0〇〇rpm離心2分鐘，將下清液倒出後以 衛生紙吸乾’將 FABG column 放回 Collection Tube 中，l〇,〇〇〇rpm 離心 6分鐘。再將離心後之FABG column放入1.5ml離心管中，加入Elution Buffer 150 kL，靜置3分鐘’10,000rpm離心4分鐘，此即為純化2DNA， 置於-20°C備用。 2.16S rDNA PCR片段放大 取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之DNA，以及副乾赂乳桿 12 201016848 菌GMNL-32菌株之DNA(該菌株寄存編號為BCRC910220,該菌株已 獲得我國發明專利1284149，為具有治療過敏相關功能之副乾酪乳桿菌 菌株）’進行16S rDNA (ribosomal DNA)片段放大，所用引子(primers) 為根據5.CO/H6S rDNA基因第8-27位鹼基和1510-1492位鹼基序列設 計的原核生物 16S rDNA PCR 通用引子(William G. Weisburg，Susan M. Barns, Dale A. Pelletier, and David J. Lane. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. J. Bacteriol. 1991 January; 173(2): • 697_7〇3)，引子序列如下所示： 正向引子fDl : -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3/ (SEQ ID No: 1) 反向引子rPl : 5，-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3， (SEQ ID No: 2) 該16S rDNAPCR片段放大程序如下：（i) 95〇c下5分鐘；（2) 94°C下1 分鐘；（3) 60°C下30秒；（4) 72°C下1.5分鐘；（5) 72°C下10分鐘，步 Φ 驟(2)至⑷重複30個循環。 另外，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種BCRC14001 尸aracosei subsp· pamcosez·)以及副乾酪乳桿菌副乾酪亞種BCRC16100 subsp，/>aracosei)之 DNA 進行 16S rDNA 片段放 大’所用引子係根據副乾酪乳桿菌16SrRNAVl區域，以及乳桿菌16S rRNA 保守(conserved)序列而來(Ward，L. I H·，and Timmins，M. J. 1999. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and 13 201016848
Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 29: 90-92.)，引子序列如下所示： 正向引子： 57 -CACCGAGATTCAACATGG-3A (SEQ ID No: 3) 反向引子： -CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3/ (SEQ ID No: 4) 該16S rDNAPCR片段放大程序如下：（1) 95°C下5分鐘；（2) 94〇C下1 φ 分鐘；（3) 60°C下30秒；（4) 72°C下1.5分鐘；（5) 72°C下10分鐘，步 驟(2)至(4)重複30個循環。 3.16S rDNAPCR片段定序、比對 將副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之16S rDNA的PCR產物進 行瓊脂凝膠電泳，結果如圖二所示；由圖二得知，該PCR產物片段約 為1，500 bp (標準品片段之長度由上至下依序為3k，2k，1.5k, 1K，900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp)，並進行定序工作，副乾酪乳桿 ❿ 菌副乾酪亞種SG96菌株之16SrDNA的序列如SEQIDNo: 5所示；將 序列對照複合序列比對資料集（NCBI blastn ， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行序列比對，結果如圖三所示， 序列比對結果為98%精確度副乾酿乳桿菌parai⑽ei)。 實施例四副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之API 50 CHL分析 利用API 50 CHL試劑檢驗本發明乳酸菌菌株的碳水化合物代謝性 14 201016848 能，API 5〇 CHL試劑可用來鑑定菌株在屬或種上的差異，經委託新竹 食品工業發展研究所檢測，API 5〇 CHL分析結果如表一及附件—所 示，顯示本發明的菌株與副乾酪乳桿菌副乾酪亞種 paracr〇^_subSp_p_case/之碳水化合物代謝活性具有98%相似性，因 此以API 50 CHL分析進一步確認本發明之菌株歸類於副乾酪乳酸桿菌 表一 API 50 CHL分析結果 φ 參照：97ID〇36-L27 條片(strip) : API 50 CHL V5.1 为佈(profile) . + + +++----++- +++++++?-- ++-+-----+ _
0 GLY ERY DARA LARA + RIB DXYL lxyl ADO MDX + + + + — 一 一 一 + + GAL GLU FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR MDM + MDG + NAG + AMY + ARB + ESC + SAL + CEL MAL LAC - + + 一 + — — — _ _ MEL SAC TRE INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN + 一 + — — — 一 一 _ _ TUR LYX TAG DFUC LFUC DARL LARL GNT 2KG 5KG 重大門類 %ID T 對比測試 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 2 98.5 0.78 葡萄糖酸(GNT) 83% 次一門類 %ID T 對比測試 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 1 1.4 0.55 乳糖(LAC) 99% 龍膽二糖(GEN) 80% 葡萄糖酸(GNT) 93% 實施例五副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96譜系分析 15 201016848 將 NCBI Nucleotide 資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中所公饰 之45株副乾路乳桿菌、副乾絡乳酸桿菌副乾路 Sl 後(Lactobacillus paracasei subsp. pamcosei)及乾路乳桿菌 (Lactobacillus casei)之序列，與BCRC資料庫中所公佈之兩株 BCRC14001、BCRC16100之序列，以及中華民國專利和美國專利核准 各一株 GMNL-32 (BCRC910220)與 CSK01 之序列，利用 embl Ebi ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/cliistalw)進行譜系分析比較，譜系分 參 析結果如圖四所示，SG96僅與其中五株菌種屬同一族群，但又可與該 五株分歧出另一支獨立的品系’此代表SG96在分類系統上具有獨特 性’因此確實證明SG96為一新穎副乾酪乳酸桿菌副乾赂亞種 subsp. paracoseO微生物株 〇 實施例六副乾酪乳样菌副乾酪亞種SG96菌株對大腸桿菌與沙門氏菌的 抑制作用 泰 1 ·滤紙片瓊脂擴散法(disc-agar diffusion)
W 將大腸桿菌(寄存編號BCRC 11634)及沙門氏菌（寄存編號bcrc 12947)分別取一白金耳的菌量接種於TSA培養基(S〇ybeaii-CaSein 〇igest Agar Medium, Difco™，REF236950)斜面，經過 35-37。(：培養 Π-24 小 時，使菌株逹到生長平穩期，並使用分光光度計進行濁度測定，調整適 當菌體濁度(約600nm之濁度80%，80% T)。分別吸取此二種病原菌菌 液0.5ml至溫度約為48。(：之平板固體培養基中，再倒入培養皿中，放 置1小時待凝固後’取直徑8mm無菌渡紙錠沾取副乾酷·乳桿菌副乾赂 201016848 亞種SG96菌株之菌液，輕放無菌遽紙錠於上述培養皿上，於 下培養17-24小時觀察結果’測量抑制圈直徑，同時用抗生素鍵徽素 (streptomycin) 15g/mL 做正對照組―kive ⑺血叫 〇 、、-。果士圖五_/、所示’本發明副乾赂乳桿菌副乾酿亞種s⑽菌 株對大腸桿菌(BCRC 11634)的抑制圈直徑為118mm(如圖五所示），而 抗生素streptomycin的抑制圈直徑為11〇 _，顯示副乾赂乳桿菌副乾 酪亞種SG96菌株有較強的抑制作用。而本發明菌株對沙門氏菌(腹 ❹ 12947)的抑麵直徑心.5 mm (如圖六所示），而抗生素鄉〇mydn 的抑制圈直徑為11.2 mm，顯示副乾路乳桿菌副乾赂亞種黯6菌株有 較強的抑制作用。 2·副乾赂乳桿菌副乾路亞種SG96菌株與病原菌混合培養試驗 在此實驗中選用大腸桿菌(5匚1^ 11634)及沙門氏菌(8€11(：^947) 作為病原i。將病原賴副乾桿H副絲亞種8(396雜混合培養 (以TSA培養基於37°C進行培養），並於培養期間取樣，取樣樣品經系 # 列稀釋適當倍數後分別取100队進行塗盤於s及TSA培養孤上， MRS培養皿置於35-37°C厭氧環境下培養，靜置培養24-48小時，TSA 培養皿置於35-37。(：好氧環境下培養，靜置培養24小時，待菌落生成 後分別計數副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之菌數(MRS培養^與 病原菌菌數(TSA培養皿）。 如圖七所示’取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇8菌數 (CFU/ml)分別與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合 17 201016848 培養，結果為大腸桿菌在8小時内菌數由108減少至101，沙門氏菌在6 小時内菌數由108減少至101，可見抑制效果強，甚至有殺菌效果。 如圖八所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇7菌數分別 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，大腸桿菌 在22小時内菌數由108減少至〇，沙門氏菌在16小時内菌數由1〇8減 少至0。 如圖九所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇6菌數分別 ❹ 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，大腸桿菌 在24小時内菌數由1〇8減少至102，沙門氏菌在18小時内菌數由1〇8 減少至0。 . 如圖十所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇5菌數分別 與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，32小時 後大腸桿菌菌數由1〇8減少至〇，而沙門氏菌在24小時内菌數由1〇8減 少至0。 鲁 如圖十一所示，取副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇4菌數分 別與大腸桿菌(BCRC 11634)及沙門氏菌(BCRC 12947)混合培養，38小 時後大腸桿菌菌數由1〇8減少至〇,而沙門氏菌在24小時内菌數由Μ 減少至0。 實施例七動物試驗 Μ乾赂乳桿菌副乾路亞種so%菌株對初生未離乳仔豬體重之影響 路農戶挑選由同-母_期生產之初生未離乳仔豬，將其分成兩組 201016848 進行餵飼’-組為每日僅辭含mG7cFU/mL _乾崎桿菌副乾酿 亞種SG96 g株水溶液，另—組為對照組，健飼抗生錄tc， ox卿，飯飼時間為21天，紀錄每週仔豬之體重變化，並以 T-test進行統計分析。結果如圖十二，餵飼副乾路乳桿菌副乾赂亞種 SG% g株兩週後’其體重增加率比银飼對照組顯著㈣〇5)，其體重平 均每週增加0.7-0.8公斤；餵例副乾赂乳桿菌副乾路亞種聊6菌株三 週後’仔豬總增加體重亦比對照組多，顯示假飼副乾絡乳桿菌副乾赂亞 • 種SG96菌株可明顯促進未離乳仔豬體重增加，及改善仔豬飼料之換肉 率。 2·副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株減少初生未離乳仔豬下痢之效果 由於初生未離乳仔豬常見下痢，該下痢狀況通常因母豬哺乳或環境 因素所造成，仔豬常因下痢情況嚴重而早天，若能早期改善下痢，將有 裨於仔豬正常生長。 酪農戶挑選由同一母豬同期生產之未離乳豬仔，將其分成兩組進行 ❹ 德飼，一組為每日僅施予含1*1〇7 CFU/mL的SG96乳酸菌水溶液，另 一組為對照組’餵飼抗生素(OTC ’ oxytetracycline)，飯飼時間為21天， 紀錄每週仔豬下痢狀況，予以評分’下痢分數評分係根據Underdahl等 人所發表的文獻標準而訂(Underdahl服，Torres_Medina A, Dosten AR. 1982. Effect of Streptococcus faecium C-68 in control of Escherichia coli-induced diarrhea in gnotobiotic pigs. Am. J. Vet. Res. 1982. 12: 2227-2232)，評分說明： 19 201016848 〇分=正常； 1分二軟便、肛門周圍乾燥； 2分=肛門周圍潮濕； 3分=水痢； 4分==標準1-3+食慾不佳、體重減輕和消瘦 並以T-test進行統計分析。結果如圖十三，傲飼副乾酪乳桿菌副乾酪 亞種SG96菌株可達到減少下病之效果，其功效於帛二週時與對照組效 β 果相似。經餵飼三週後，餵飼副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG90菌株減少 下病效果比韻組(細抗生素⑹佳’且有縣差異㈣G5)，表示副 乾赂乳桿關乾輕種SG96 _具有良好的抗下痢效果，且成效優於 -般絡農戶使用之抗生素，能讓仔豬無抗生素殘留之問題。 本發明所提供之新網祕乳桿關祕亞種SG%、含彼之抑菌組合 物及其崎’與其他猶相互比較時，更具打狀伽： & 1.本發明之副乾路乳桿_乾赂亞種SG96赌經過革蘭氏染色分 析、AH SO CHL分析、16S rDNA定序分析、譜系分析後，確認與習知之 副乾路乳桿菌BCRC91G22G、以及副乾魏_聰赂亞種队此臟、 BCRC丨副〇之種侧係具有麵差異，為—_之聰靴桿關乾路亞 種0 2.將本發明之副乾絡乳桿菌副乾路亞種嶋菌株，分別進行遽紙片 _擴散法分析以及與病原菌混合培養試驗分析，結果顯示，本發明s⑽ 菌株不但可以抑制大腸桿菌及沙病顧之生長，且其抑菌作用較 20 201016848 抗生素streptomycin之抑菌作用強，甚至有殺菌效果。 3.將本發明之副乾路乳桿菌副乾路亞種SG%菌株配製成水溶液餵食 未離乳豬仔，結果顯不本發明SG%菌株可明顯促進未離乳仔豬體重增加、 改善仔豬飼料之換肉率’並具有良好的抗下舰果，且紐優於一般使用 之抗生素’證明本發明SG96菌株具有增進動物抵抗病原菌之能力。 ±列詳細制係針對本發明之-可行實獅彳之具觀明，惟該實施例 並非用以_本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實 ⑩施紐更’例如.含有S彳乾魏桿關祕亞種SG96雜之抑i組合物的 應用’以及製作含有δ彳乾魏桿H副乾赂亞種SG96麟之抑雜合物的形 式等變化之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。 综上所述’本案不但在菌種上確屬創新，並能較習用抗生素增進上述 多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提 出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。 【圖式簡單說明】 ® A _發_乾魏桿g副絲亞種SG96 ®株之革蘭氏染色結 果；圖一 B為本發明副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株之型態圖； 圖二為該副乾酷乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株16S rDNA片段以PCR 放大後之瓊脂凝膠電泳圓； 圖三為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種菌株SG96、BCRC 910220、 BCRC140(M、BCRC16100 之 i6S rDNA 序列比對圖； 圖四為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種菌株SG96、BCRC 910220、 21 201016848 職α娜、職丨侧及細彳絲乳輸獅碰株之種系譜系 分析圖； 圖五為以觀#瓊脂職法分細倾乳料副祕亞種⑽G菌株 對於大腸桿菌的抑制作用； 圖六細觀片輕纖法分析副祕乳桿㈣祕亞種犯96菌株 對於沙門氏菌的抑制作用； 圖七為副魏乳桿_祕_ SG%轉i q8隨翻賴混合培養 Ο試驗之結果； ▲圖八制乾_L㈣副祕亞種SG96 _ _數與病混合培養 試驗之結果； 圖九細隱乳桿_祕亞種SG96 g株，數麵賴混合培養 试驗之結果； 菌數與病原菌混合培養 圖十為副乾酪乳桿菌副乾酪亞種SG96菌株1〇5 試驗之結果；
圖十-為副乾路乳桿菌副乾路亞種SG96菌株1〇4菌數與病原菌混合培 養試驗之結果； 圖十二為副乾路乳桿菌副乾路亞種SG%菌株對未離乳仔緒體重變化 之影響；以及 圖十三為副乾赂乳桿菌副乾赂亞種SG%菌株對未離乳仔豬下奸影 22 201016848 【主要元件符號說明】