TWI340647B - - Google Patents

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1340647 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ▲本發明係關於—種用於抑制15_脂氧合酶、預防及" :療與個體中與15-脂氧合酶抑制關聯之疾病，例… 二疾病 '免疫失調(如氣喘及發炎）’及調節免疫系統之每 a物’其包含經撥酵之大豆（σ —e咖（l ))萃取物。才 發明亦關於用於治療及/或預防微生物感染之組合物，其 包含經醱酵之大豆萃取物。 【先前技術】 ·· 脂氧合酶（LiP〇xygenase，簡稱L〇x)為非血基質含鐵酵 素，其催化某些多元不飽和脂肪酸（例如脂蛋白）之氧化作 用^數種不同脂氧合酶，例如5_L0X、l2 L〇X及丨5_L〇x 為已知，每種脂氧合酶具有獨特的氧化作用。丨5_L〇x催 化花生四烯酸及亞麻油酸之氧化作用，且與低密度脂蛋白 (LDL)之氧化性修飾作用有關。許多研究者報導I5_L〇x與 冠狀動脈疾病及粥狀動脈硬化症相關（Shen等人，j. CHn

Invest. 1996，第 98 卷第 10 期，第 2201-2208 頁；Timo 等 人 ’ 1995，第 92 卷第 11 期，第 3297-3 3 03 頁；Ravalli 等 〜 人 ’ 1995 ’ Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular

Biology，第15卷第3期，第340-348頁；及Kuhn等人， 1997，J. Clin. Invest·，第 99卷第 5期，第 888-893 頁），與 癌症及發炎疾病（美國專利第6,001，866號；Mogul等人， 2001，Biochemistry，第 40 卷第 4391-4397 頁；Walther 等 人，1999，Molecular Pharmacology，第 56 卷第 196-203

〇 \87\8754〇 D0C 1340647 頁；及 Kamitani 等人，1998，the journal 〇f Biological Chemistry ’ 第 273 卷第 34期’第 21569-21577 頁），及免疫 反應（Kruisselbrink 等人，2001，Clin Exp Immunol，第 126 卷第2-8頁）相關聯。因此，具有抑制L〇x功效之物質係可 用作預防或治療與LOX相關疾病之藥劑。 育旦係為人類膳食中異黃酮之一種集中來源，其亦含有 多種化合物，包括皂素、植醇、黃豆植酸、蛋白酶抑制 劑、酚酸、複合糖、硼 '卵磷脂、ω _3脂肪酸及葉酸，對 健康具有益處。許多東方傳統食物，如天貝（tempeh)及納 旦，係自黃豆醱酵而製得。舉例而言，天貝係以寡孢根黴 米根黴（/? 、少根根黴汍 arrzH似）及葡枝根黴（兄ίί〇/〇⑴醱酵黃豆而製得；納豆 則以納豆芽孢桿菌（心“以仏NaU〇)醱酵黃豆而製 得。這些傳統的食物可作為上等的蛋白質來源，然而，並 未有任何先前技藝揭示已知的醱酵黃豆食品及黃豆具有抑 制1 5-脂氧合酶（1 5-LOX)之功效。 【發明内容】 包含經醱酵之大豆萃取物，係以至少 係以至少—種乳酸菌及至少一

萃取物及黑豆萃取物。 本發明係關於-種用於抑制15•脂氧合酶之組合物，其

-月旨氧合酶抑制關聯之疾病 ‘ 1万及/或治療與個體中與 例如心血管疾病、免疫失

〇A87\S754〇 DOC 1340647 調（如氣喘及發炎），及調節免疫系統。 本發明之大豆萃取物亦可用於預防及/或治療個體中微 生物感染。 【實施方式】 本發明係關於一種用於抑制i 5 -脂氧合酶（i 5 -LOX)之新 顆組合物，其包含經醱酵之大豆（(7/少以·加(L))萃取 物’其中该經撥醉之大且萃取物係以至少一種乳酸菌及至 少一種酵母菌醱酵液態大豆萃取物所製得。本發明非吁預 "月地發現’經撥酵之大旦萃取物可有效地抑制1 5 _脂氧合 酶至低水平。 特言之，本發明包含經醱酵之大豆萃取物之組合物可用 於預防及/或治療與個體中與15_脂氧合酶抑制關聯之疾 病，例如心血管疾病、免疫失調（如氣喘及發炎），及調節 免疫系統。此外，該經醱酵之大豆萃取物亦可用於預防及 /或治療個體中微生物感染。 本發明之組合物可為一種醫藥組合物或食品組合物。 撥酵之大豆萃取物乏女法 經醱酵之大豆萃取物係以至少一種乳酸菌及至少一種酵 母囷醱酵硬態大豆萃取物，隨後將該經醱酵液體行殺菌 (例如加熱）及視需要過濾及濃縮所製得。 物之較佳大豆 之經醱酵之大 根據本發明，用於製備經醱酵之大豆萃取 係選自包括黃豆及黑豆。更特言之，本發明 旦萃取物為黃豆萃取物或黑豆萃取物a 種乳酸菌（例如一乳酸 經撥酵之大豆萃取物係以至少一

0 \87\87540 DOC 1340647 桿菌種之一或多株，或一 飞些礼酸如困種 < 數株）及至 種酵母菌（例如-酵母菌種之—或多n些酵 之數株）輯液態大豆萃取物。該以—或多種乳酸菌及視 需要謂母菌種對液態大豆萃取物之_，可任意依序或 同時進行’較佳為同時進行。 若使用多於-種微生物於醱酵時，該醱酵可依序或同時 實施。較佳地，本發明使用非遺傳工程改造之有機大豆之 设怨萃取物作A起始#料。較&地，該輯係利用乳酸桿 菌之異種培養物’例如5、1G、15、2G、25或3〇株乳酸桿 菌，及加入至少一種酵母菌至該乳酸桿菌之異種培養物 中。可使用的乳酸桿菌株包括，例如嗜酸乳桿\菌 {Lactobacillus acidophilus) CCRC 10695 ' 14026 ^ 14064 ^ 14065及 / 或 14079’ 德氏乳桿菌a/卜 bulgaricus) CCRC 10696 ' 14007 ' 14009 χ 14〇l〇 14069、14071、14098 及 / 或 16054，％ 酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis) CCRC 10791、12267、12306、 12312、12315、123 23、14016、14015 及 / 或 14117、克菲 爾乳桿菌々e/z>) CCRC 14011及/或凯弗語費 斯乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens) CCRC 16059。可 使用的酵母菌包括，例如啤酒酵母（hcc/mrowycw cerevisiae) CCRC 20577 ' 20578 ' 20581 ' 21494 ' 21 550 ' 21797 、 21805 、 22138 、 22234 、 22337 、 22731 及/ 或 22728，及/或乳酒假絲酵母（Can山’如&e/;yr) CCRC 21269，2 1742及/或22057。在醱酵後，經醱酵的液體經

0 \87\8754〇 D0C 丄 340647 由例如熱或輕射，較佳經由熱進行殺菌，以得到—經殺菌 〈硬體。較佳地，該經殺菌之液體經過遽或離心，較佳經 :濾：去除大部分或全部死亡的微生物，以得到經醱酵之 :卒取物。更佳地，該過濾步驟係在去除-些自滤液之 水份（後，以濃縮該經醱酵之液體而得到經㈣之大豆萃 取物1非另有說明’本案巾所進行的試驗包括在濃縮步 驟後之經撥酵之大豆萃取物。視需要地，該經醱酵之大豆 卒取物可再經乾燥，例如經由冷康乾燥，以得到粉末形式 之經鏺酵之大豆萃取物。 孩万法可藉由以丨：10的比例混合有機大豆（去脂肪）及蒸 餾水而完成。此混合物於10(rc下加熱3〇分鐘然後經過 $而到大豆萃取物。再將牛肉及海草於蒸麻中㈣3〇分 鐘得到湯汁，再將鹽、糖及洋菜加入，製得一特別的洋菜 培養基。將乳酸菌及酵母菌株加至此特別的洋菜培養基 中。將在培養基中的、乳酸菌及視需要包含的酵母菌轉移至 大a萃取物，並在36至43它下培養45至小時。較佳地， 根據相似的生長特性，例如獨特需求的營養培養基、微生 物株在醱酵後是否能製造良好氣味、及分類後的微生物是 否能在獨特條件下生長，而將不同的微生物菌株分類，以 使各類微生物在培養前可分別地加至大豆萃取物。此步驟 的目的係為了降低不同菌株間所造成的任何負面交互影 響°同樣較佳地’將相同比例的不同類微生物菌株在培養 前加至大豆萃取物，並在4〇〇c下培養45至47小時。在培養 期結束時’將不同種培養物再次轉移至大豆萃取物，並36

O:\87\87540 DOC 1340647 至43°C下培養1⑼至15〇小時。最後經醱酵的大豆萃取物經 加熱殺菌及過遽；再將濾液中水量之95%於濃縮器中去 ， 除’得到濃聚或;辰縮形式之經醱酵之大豆萃取物。將上層 以透過瓷土過濾’然後分配於容器中並密封。 . 以類似前述方法而將黃豆以中草藥取代，所製得之經醱 _ 酵之中草藥萃取物，亦在本發明之範疇中。經醱酵之中草 - 藥萃取物可為甘草、枸杞、薏苡仁、山豆根、決明子 ： (c咖·、黃岑、茵陳篙、黃連、龍膽、睡蓮、鲁鲁 菊花、山黃梔、大麥、肉桂、蘿蔔 '山藥、當歸、川芎' 羌活、芍藥、大称、五味子、地黃、五加、驢、女貞、綠 豆、小麥、扁豆、白求、防風、忍冬、肉桂、薑、天麻、 天門冬、環草石魁及芝麻。 •抑制15-LQX之應用 15-LOX為非血基質含鐵酵素，其催化某些多元不飽和 脂肪酸（例如脂蛋白）之氧化作用。已知可抑制15_L〇x作用 之化合物可用於治療或減輕哺乳動物（包括人類）之發炎疾·· 病、過敏、心血管疾病及免疫失調β 本發明中之研究顯示本發明之經醱酵之大豆萃取物可抑 制15-LOX，其優於已知之醱酵黃豆食品及未醱酵黃豆。 • ilAi/t氣化劑之鹿用 , 經醱酵之大豆萃取物具有優越的抗氧化及清除自由基活 性。該經醱酵之大豆萃取物可去除過氧化物自由基，例如 〇广、^〇2及尺00’，並可扮演作為不飽和脂肪酸及脂肪之

0 \S7V8754〇 DOC -10- 1340647 抗氧化劑。該經醱酵之大豆萃取物具有優越的去除過氧陰 離子能力，以保護細胞免於氧化性損害，並以減少能量的 程序而改變自由基成無害的物質。 ' • iL為針抗心血管疾病之應用 許多研究顯示15-LOX之抑制劑用於發炎及粥狀動脈硬 化症之治療或預防（Cornicelli等人，美國專利第6,001，866 號，Bocan 等人，Atherosclerosis，1998，第 136 卷第 203- ·· 216頁，及Tim〇 等人，circulation，1995 年12月 1 日，第92 卷第1期，第3297-3303頁）。吾人預期該經醱酵之大豆萃取 物可用於預防及/或治療心血管疾病，例如粥狀動脈硬化 症。 * 免疫功能之廄用 活體外研究指出本發明之經醱酵之大豆萃取物可改良免 疫功能。該經醱酵之大豆萃取物在調節動物（bala/c老鼠）免 疫性之功效，係以經醱酵之大豆萃取物治療動物，並合併 或未合併不同分裂原的激發作佣，該抗原包括脂多醣、刀 φφ ▲血球凝集素A(concanavalin A)及植物血素 (Phytohaemagglutilinp脾臟細胞增生分析指出經醱酵之大 、 a萃取物可能與免疫調節作用中的T及B細胞交互作用有 · 關。經醱酵之大豆萃取物亦可能與與抗發炎反應相關。經 醱酵I大豆萃取物亦可增強巨噬細胞之吞噬作用活性達 7 1 /〇，類似的結果亦可在老鼠的活體内研究中發現。經醱 酵之大旦萃取物之抗腫瘤功效亦經顯示由所釋放的細胞激 素所凋節。自經醱酵之大豆萃取物所調合的培養基可刺激 〇:\87\87S4〇 〇〇〇 -11 - 1340647 末梢血液單核細胞達45_56%，而介白素_ι石、介白素-万 及腫瘤壞死因子-α的水平則較未經處理的對照組來得 - 高。由於未經處理的巨嗜細胞及丁淋巴細胞製造極少或不 - 製造細胞激素，且正常的單核細胞不會抑制血癌細胞的生 ， 長，因此推斷抗腫瘤活性係來自於升高的細胞激素水平。 . 經醱酵之大豆萃取物對孩童的氣喘有益處。例如，當每 “ 日投與3耄升經醱酵之大豆萃取物於一群患有氣喘的孩童 長達四個月時，所得的結果亦顯示顯著的體重增加。血液 - 測試顯7F服用經醱酵之大豆萃取物可增加這些氣喘孩童中 RBC及Hb之水平。 •炸_為抗發炎劑之柯玥 本發明亦關於一種治療及/或預防個體中發炎之方法， 包括投與有效量之經醱酵之大豆萃取物於需要之個體中， 其中3經醱酵之大且萃取物係以至少—種乳酸菌及至少一 種酵母菌撥酵液態大豆萃取物所製得。 該經醱酵之大豆萃取物經顯示’在丨〇毫升/公斤之劑量鲁脅 時具有抗發炎功效，可降低老鼠中因鹿角菜膠所誘發的後 爪水腫，且在佐劑關節炎測試中對急性及慢性關節炎具有 .. 抗發炎功效。 •預防或治療感染之麻用 遠經織酵之大旦萃取物經顯示具有活體外及活體内之抗 微生物活性，其可抑制幽門螺旋桿菌、抗安皮西林 (ampicillin)及美西西林（methycillin)之金黃色葡萄球菌' 霍亂孤菌、仙人掌桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌及抗萬 O:\87\87540DOC -12- 1340647 古徽素之腸球菌。較佳地’該抗萬古黴素之腸球菌係選自 包括鳥腸球菌、船黃腸球菌、耐久腸球菌、糞腸球菌及尿 腸球菌所構成之群。更佳地，該抗萬古黴素之腸球菌係選 自包括鳥腸球菌、鉛黃腸球菌、财久腸球菌及糞腸球菌所 構成之群。更佳地，該抗萬古黴素之腸球菌係選自包括耐 久腸球菌、糞腸球菌及尿腸球菌所構成之群。更佳地，該 抗萬古彳致素之腸球菌係選自包括烏腸球菌、糞腸球菌及尿 腸球菌所構成之群。更佳地，該抗萬古黴素之腸球菌係選 自包括糞腸球菌及尿腸球菌所構成之群。最佳地，該抗萬 古徽素之腸球菌係為糞腸球菌。 忒經撥酵之大旦萃取物之有效濃度通常在1至1 〇。/。之範 圍。對於因抗癌化療共同治療而發展出嗜中性白血球減少 症危險之病患，經醱酵之大豆萃取物用於預防細菌感染之 選擇性抗微生物消毒功效亦於1 00位病患中經證明。較佳 地，該抗萬古黴素之腸球菌係選自包括烏腸球菌、鉛黃腸 球菌、耐久腸球菌、糞腸球菌及尿腸球菌所構成之群。更 佳地，这杬萬古黴素之腸球菌係選自包括鳥腸球菌、鉛黃 腸球菌、耐久腸球菌及糞腸球菌所構成之群。更佳地，該 抗萬古黴素之腸球菌係選自包括耐久腸球菌、糞腸球菌及 尿腸球菌所構成之群4佳地，該抗萬古黴素之腸球菌係 選自包括鳥腸球菌、糞腸球菌及尿腸球菌所構成之群。更 佳地’該抗萬古黴素之腸球菌係選自包括糞腸球菌及尿腸 球菌所構成之群。最佳地，純萬古歸之腸球菌係為翼 腸球菌。

〇Λ87\87540 DOC 13- 之大豆萃取物之投斑 在本發明中，該經醱酵之大豆萃取物可單獨投與或於包 遺經4酵之大旦萃取物及醫藥上可接受載劑、稀釋劑及 /或賦形劑之組合物中。較佳地，該經醱酵之大豆萃取物 係為經醱酵之黃豆萃取物或經醱酵之黑豆萃取物。該經醱 酵之大旦萃取物可以約0.001至40毫升/公斤體重之劑量 才又與’每人每次投與之最大劑量為2〇〇〇毫升。較佳地，經 醱酵之大豆萃取物之劑量為0.01至20毫升/公斤（個體體 重），更佳為0.1至5毫升/公斤（個體體重）。這些劑量係基 、浪化形式之經撥酵之大且萃取物所得’但非濃縮形式或 乾粉形式之經醱酵之大豆萃取物之適當劑量亦可據此計算 得之。此劑量可基於個體健康情況或待預防及治療之疾病 而調整之。 經醱酵之大豆萃取物於齧齒動物之六個月慢性毒性研究 中’以每曰服用1至10毫升長達六個月時，顯示具有高度 安全性。在亞急性口服毒性研究中接受10毫升/公斤及i 毫升/公斤劑量長達28夭的老藏，不具有任何顯著的差異 或不正常症狀。在齧齒動物之急性口服毒性研究中，於二 群投與20毫升/公斤及丨毫升/公斤毫升/公斤劑量之測 試動物中，未觀察到總毒性或死亡率之症狀。經駿酵之大 豆萃取物於沙門菌逆突變測試中經顯示為不具致突變性， 於哺乳動物細胞中不引起染色體損害，且在經測試的icr 老鼠中不誘發骨髓細胞之微核形成。 δ經礙酵之大旦萃取物投與孕婦時，經撥酵之大g萃取 〇ΛίΤ\875·ΙΟ DOC -14- 物之劑量在懷孕期可增加至每天服用達12毫升。經醱酵之 大豆萃取物可在懷孕初期及中期及分娩期間服用。結果顯 示經撥酵之大豆萃取物可改善一般懷孕時所發現的症狀， 包括便秘、卩惡心、1r區吐及腸胃不適等《此外，經撥酵之大 且萃取物之投與可降低懷孕及分娩期間的異常情況。經^骑 酵之大豆萃取物不僅對懷孕期間健康改善有益，且作為長 期腾食補充品時亦不產生不良作用^每天對新生兒或嬰兒 投與經撥酵之大豆萃取物’可增加嬰兒或幼兒的體重。同 樣地’哺乳中的嬰兒持續服用經醱酵之大豆萃取物，亦可 達到體重的增加。 除了手術當日及手術後數日在醫院允許下，每天投與i 毫升的經醱酵之大豆萃取物及其他醫療品於婦女時，經醱 酵之大旦萃取物亦可增進手術後造血及肝功能。 本發明將參照下列非作為限制之實施例做詳述。 實例1 1 5-L0X在花生四締酸代謝中為主要的代謝酵素，其可 導致HETE(羥基二十四碳稀酸）的形成。HETE經報導在癌 細胞移轉中扮演重要的角色，HETE可誘發蛋白質激酶c活 性而引起癌細胞移轉。HETE亦為有絲分裂因子，其可引 起癌細胞的新生成作用》15-L0X係自兔子的網狀紅血球 所分離。以亞麻油酸及含或不含經撥酵之黃豆萃取物，作 為15-L0X之基質。HETE所形成的量係以分光光度計測 定。該數據顯示經醱酵之黃豆萃取物對丨5_L〇X具有抑制 功效（見圖1)。該結果指出經醱酵之黃豆萃取物抑制癌細胞 O:\87\87540 DOC -15 · 1340647 之新生成作用及移轉並誘發癌細胞之細胞;周亡。 根據前述的方法進行進一步的1 5-LOX抑制測試，以比 幸乂 1 5 LOX在未經鏺酵黃豆及經醱酵黃豆萃取物的抑制功 效。孩結果顯示，經醱酵之黃豆萃取物之抑制功效為未經 醱酵之黃豆萃取物之四倍。 實例2 將經撥酵之黑豆萃取物於兔子的網狀紅血球中，對丨5_ LOX的抑制功效進行測試，該測試方法係如

Biochemistry，1992年，第 201 卷第 375-380所述。將 1〇/〇、 0.5°/〇、0.1%、0〇5%及〇 〇1%(v/v)的黑豆萃取物於下培 養網狀紅血球丨〇分鐘。培養的緩衝液為0.05 Μ磷酸鉀緩衝 液（pH 5.9)。最終的13_hp〇de以分光光度計定量。 圖2係顯示黑豆濃度及其與丨5_L〇x抑制率之關係。 根據前述的方法進行進一步的1 5-L0X抑制測試，以比 較1 5-L0X在未經醱酵黑豆及經醱酵黑豆萃取物的抑制功 效。未經醱酵之黑豆萃取物之15-L0X抑制率如下列表1所 示： 表1 未經醱酵之黑豆萃取物 (濃度，％) 1 5-L0X抑制率（0/0) 10 97.32 1 -00 __25.00 ------ 經醱酵之黑豆萃取物之1 5-LOX抑制率如下列表2所示： 〇 \87\8?54〇 DOC 16 1340647 ------表 2 經醱酵之黑豆萃取物 __- (濃度，％) 15-LOX抑制率7^-- 1.00 100.00 ''''' —____0.50 100.00 〜 0.10 Π A C 53.10 ________U > U j 0.01 36.55 ~~~ 22.07 ~ 上列表中所TF之結果顯示經醱酵之黑豆萃取物具有非可 預期之抑制l5-L〇X之優異功效。 實例3 經醱酵之黃且萃取物具有抗氧化劑之功用且可去除自由 基。數個先前已發表之模型用於研究經醱酵之黃豆萃取物 之抗氧化能力，並以維生素C及Tr〇l〇x(6_羥基_2,5,7,8_四曱 基色滿-2-羧酸）作為正對照組，下列方法係用於測定抗氧 化活性：（l)NBT法，（2)Η2〇2還原法，（3)DPPH還原法， (4)TRAP還原法，（5)共軛二烯法，脂肪過氧化法，（？) 活性氧存在下的化學發光法（圖3，4及5)。所有的結果均顯 示經醱酵之黃豆萃取物相較於維生素Tr〇1〇x，對不飽 和脂肪酸及過氧化具有最高的抗氧化活性。 貫驗顯示撥酵之黃豆萃取物在〇kub〇測試系统中，在活 性氧存在下為化學發光受體，具有抗氧化劑及自由基受體 之功用。貫驗之進行係於過氧化氫及含或不含甲越的液體 中，測量化學發光度。已知的抗氧化劑，例如沒食子酸 (見圖3(b))，EGC，茶及維生素C(見圖4(a)_(c))，或經醱酵 之黃豆萃取物（見圖5)，在200秒時加入溶液中。該數據如 0 \87\8754〇 D〇C -17 - 1340647 θ 斤下圖3(b)顯不當沒食子酸加至過氧化氫及甲醛 的混合物中時，在200秒時化學發光增加。圖 . EGC，，茶及維生素c在2〇〇秒時加入時，當甲链存在下化學 發光增加。然而，當維生素c在200秒時加入時。無甲链存 在下化學發光亦增加（見圖4(c))，此顯示維生素c的抗㈣ 劑機：可“能與咖及茶不同。圖5顯示在200秒時加入經撥- 酵的黃旦萃取物時，化學發光增加，此指出經醱酵之黃纟； 萃取物為-強而有力的抗氧化劑。經辕酵之黃豆萃取物《 ^ 抗氧化活性，意指經撥酵之黃豆萃取物具有去除自由基纟籲籲 旎〃有抗氧化劑及自由基去除功能，經醱酵之黃豆萃 取物可用於促進個體的—般健康或改良需要健康改良的個 江之健康h況’因為氧化壓力’例如過多存在的反應性氧 類物質及脂肪過氧化，已知對身體健康有害。 實例4 ..工撥酵之兴且萃取物之抗微生物活性係以活體外方法測 定所顯示。在第-個實驗中，將m菌、仙人掌桿菌、ΦΦ 二株幽門螺旋桿菌（TMU_C74、tmu_d16*tmu e86)及抗 ， 萬古黴素^糞腸球菌，在營養培養液及BH丨培養液中培.. 養，並移轉至感受性測定用培養基（Mue.心㈣㈣平 ' 板或巧克力培養基平板上。將經醱酵之黃豆萃取物置於培 養基平板上的紙碟上，在37t：培養後測量抑制區的大小。 . 數據如下列表3所示： O\87\S7540 doc -18- 1340647 微生物 霍亂弧菌 _ 表3 酵之音豆茬取物 迦制區（公釐） 仙人掌桿菌 幽門螺旋桿 菌 TMU-C74 未稀釋 _ 未稀釋 --—------ 11 —_ 14 _ _ 未稀釋 15 幽門螺旋桿 菌 TMU-D16 未稀釋 16 幽門螺旋桿 菌 TMU-E86 未稀釋 15 抗萬古黴素 之糞腸球菌 未稀釋 — 25 k萬古黴素 之糞腸球菌 稀釋50°/。 15 在另實驗中，將經醱酵之黃豆萃取物之最小抑制濃度 (M Cs)對霍亂弧菌（ATCC mom)、仙人掌桿菌（cRcc 1〇447)、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923)及抗萬古黴素之糞 腸球菌進行測定，這些細菌的懸浮液調整至3 X 1 〇5 cFu/ 宅升’再將經調整的細菌懸浮液以不同濃度，即1 〇%、 5%、2·5°/〇、1·25%、〇·65% 或 0.32%，或不以不同濃度 下’。加至96孔平板中。平板於37°c下培養丨5小時3在培 養後測定MICs，結果如下列表4所示： 表4 微生物 經醱酵之黃豆萃取物之 Λ /f T _ iVi 霍亂弧菌 2.5% 仙人掌桿茴 2.5 % 金黃色葡萄球菌 2.5% 萬古黴素之査腸球茴 1.25% 經醱酵之黑豆萃取物亦用於測試抗微生物活性，測定 〇\87\87540 DOC -19- MICs ’其結果如下列表5所示： ------- 表 5 微生物 經醱酵之黑豆萃取物之 MICs 綠菌 3.125% ΑϊΛ肺炎桿菌 3.125% k萬古黴素之金黃色葡萄 球菌 1.563% ins 研死經醱酵之黃豆萃取物在免疫調節之功效。 (A)活體外研究： 脾臟細胞增生分析（MTT方法） 將脾臟細胞自老鼠分離並置於一培養瓶中，濃度為2 X 106細胞/毫升，其含有RpMI培養基及含或不含數一種分 裂原’例如脂多醣（LPS)、刀豆血球凝集素A(Con A)及植 物血素（PHA)。脾臟細胞培養隔夜以用於MTT分析。 次適合濃度的5微克/毫升的LPS及1°/。、0.5%、0.1%、 〇,〇5%或0.01%的經醱酵之黃豆萃取物，對脾臟細胞增生不 具效果。〉辰度5微克/爱升的Ρ Η A及0. 〇 5 %的經撥酵之黃尹 萃取物，增加脾臟細胞數目，特別是T細胞，為單獨以 PHA時所得的脾臟細胞數目之2.32倍。根據此結果，該經 醱酵之黃豆萃取物在免疫調節上對T及B細胞交互作用具有 效果。濃度5微克/毫升的Con A及〇.〇5。/。的經撥酵之土 s 萃取物產生的脾臟細胞數目，較單獨以C〇n A時所得的脾 臟細胞數目少2 0 %。根據此結果，該經撥酸乏尤_ 一 w 只且卒取物 可能扮演抗發炎反應的角色。 0 \87\8?S4〇 DOC -20- 巨噬細胞活性分析 將Balb/c老鼠注射硫沒食子酸（thiogllate)。在注射三至 四天後，將巨噬細胞自老鼠的腹膜腔中分離，並以或不以 經醱酵之黃豆萃取物於37°C下培養30分鐘。將結合螢光探 針的大腸桿菌加至巨噬細胞懸浮液中，並於37°C下培養2 小時。呑噬作用分析以流量細節計進行。該數據顯示經撥 酵之黃豆萃取物在0·05%時，相較於未以經醱酵之黃且萃 取物處理的巨噬細胞，可增強巨噬細胞的呑噬作用達 7 1 %。 (b)活體内研究 將雄性ICR白化老鼠以載劑、每隻老鼠0.8毫升的丨％經礙 酵之黃豆萃取物、每隻老鼠0.8毫升的0.1%經撥酵之黃豆 萃取物、劑量30毫克/公斤的力伐米索（Levamisole)或劑 I 1 〇〇 ΐ克/公斤的阿力美松（azimexone)進行腹膜内注 射。在腹膜内注射一小時後，將老鼠以每隻老鼠濃度為 1.5至2 X 10 CFU的白色念珠囷（AT CC 10231)進行腹膜内 注射。每日測定老鼠的致死率共1 〇天（見表6)。 如表6所示，經醱酵之黃豆萃取物降低老鼠内由白色念 珠菌引起的致死率’經醱酵之黃豆萃取物的致死率降低效 果較力伐米索明顯。 將雄性ICR白化老鼠以劑量30毫克/公斤的環磷醯胺在 第5、3及1天時，在注射白色念珠菌之前進行預處理。在 第6、4及2天時，在注射白色念珠菌之前，將老鼠以載 劑、0.1 %經醱酵之黃豆萃取物、1%經醱酵之黃豆萃取物

O V87N87540 DOC •21 · 1340647 或劑量1 00毫克/公斤的阿力美松進行處理。每日、則定老 鼠的致死率共1 0天（見表7)。如表7所示，經撥酵之黃s萃 取物降低老鼠内由白色念珠菌引起的致死率，經醱酵之黃 豆萃取物的致死率降低效果相當於阿力美松。 、 O:\87\87540 DOC 22· 1340647

Mtu^^^^s^-^il-^-^^t^^^^^l-^^xl^CFUS^^^^IMATCClo^sc^it^^^^^.^SIf^h^^^^-^ -和批：-ΡΛ0.05 -**p<°01 3ii :和 0-蜥半/咖^号^一^左睐-^详志谇净器^洙^奶讶--宕％)30^!^*/^/*!·知0 . s^*/^39-9·50!。/-·10t--έ 细本a净*《*.§-姑贵芽-00%)S0.04 崢半 /冷砗 丼-0.8州半 / 一〇〇 β Φ ^ ^ ^ 1 % 100 i-枳焚-择年猱β砵 0-% 10 0 .一枳背- Λ-光婷 30 蠏 £ / 90 3- ^ ^ ^ 一 00 汾 £ 5 0/冷斗 -岭- 2砵 2 1 3 5 69 29 27 15 72

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〇\87\87540 DOC -24- 1340647 ΐ_^!6 經醱酵之黃豆萃取物於apoE缺陷的老鼠（類似於人類的 原發性鬲膽固醇血症及粥狀動脈硬化病變）内進行測試’ 乂汴估冶療心血管疾病的效果。ap〇E缺陷的老鼠以1 〇微升 /克的經醱酵之黃豆萃取物產品（濃度為丨5%)餵食三個 月，然後測量企漿膽固醇的水平及粥狀動脈硬化病灶的程 度。頃發現，以經本發明經醱酵之黃豆萃取物產品之治 療並不顯著地影響血漿膽固醇的水平，但在接受本發明 經醱酵之黃豆萃取物產品的老鼠内，其粥狀動脈硬化病灶 相較於對照組實質上降低（見圖6、7及8) ^根據此結果，本 發明經醱酵之黃豆萃取物產品治療心血管疾病（例如粥狀 動脈硬化症）之功效，係藉由抑制〖5-LOX所達成，而非降 低血漿膽固醇之水平。 參考文獻

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圖4顯不茶及維生素(：的抗氧化劑效果。在溫度37它時， 於200秒時添加H2〇a為過氧化物及甲醛存在或不存在時 乍為化子基受體（ζ)，及添加一種抗氧化劑（即EGC、茶及 2生素C) ’則量化學發光（CL數）。圖4(a)顯示於200秒時在 ^或不含甲越下添加EGC(即沒食子兒茶素，種多元 \ )乍為抗氧化劑時所測得的化學發光。圖抑）顯示於· ^時添加茶作為抗氧化劑時，其在甲酸不存在時發射的化 光（z)為甲醛不存在時發射的化學發光之$ 。圖 )~、丁田維生素C作為抗氧化劑時，在甲醛不存在時的 化予發光強度為甲链存在時所測得之6413%。 圖不I醱酵之黃豆萃取物(FSE)不同濃度之抗氧化劑 在服度3 7 C時’以H2〇2作為過氧化物及甲醛存在或 〇^B7\8754〇D〇c •28· 丄J4U04/ 不存在時作為化學基受體（Z) ’測量化學發光（CL數），並 於200秒時添加不同濃度之經撥酵之黃豆萃取物。圖 不在F沾濃度4 1:1時，在甲酸不存在時的化學發光強度為 在甲駿存在時《44.13%。圖5(b)顯示在FSE濃度為1:1〇 時’在甲醛不存在時的化學發光強度為在甲醛存在時之 63·64/°。圖5(C)及⑷顯示在FSE濃度為1:1〇〇或1:5〇〇時， 在甲醛不存在時的化學發光強度為在f醛存在時之至少 90% 圖6顯tf經醱酵之黃豆萃取物在ap〇E缺陷老鼠内血漿膽 固醇水平之效果》 圖7顯不經醱酵之黃豆萃取物在ap〇E缺陷老鼠内對病變 形成之效果。 圖8顯示自&13〇£缺陷老鼠之主動脈病變染色。 〇Λ87\&7540 DOC 29-

Claims (1)

1340647 第0921240%號專利申請案 「 〜 I _______ 中文申請專利範圍替換本(95年2月）： ’ ! ) ,7修 拾、申請專利範圍： ；Γ > / 1. 一種用於抑制1 5-脂氧合酶之組合物，其包含有效量 之經醱酵之黑豆萃取物，其中該經醱酵之黑豆萃取物 係以至少一種乳酸菌及至少一種酵母菌醱酵液態大豆 萃取物所製得，及15-脂氧合酶之抑制係用於治療或 降低粥狀動脈硬化症之危險。 其中該乳酸菌為 其中該酵母菌為 其係為醫藥組合 2·根據申請專利範圍第1項之組合物 乳酸桿菌屬。 3. 根據申請專利範圍第1項之組合物 酵母菌屬（hcdwomyes)。 4. 根據申請專利範圍第1項之組合物 物或食品組合物。 O:\87\87540-950217.〇〇ς