KR101012672B1

KR101012672B1 - 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제와 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101012672B1
Application number: KR1020070121223A
Authority: KR
Inventors: 이충재; 이봉덕; 성창근
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2007-11-27
Filing date: 2007-11-27
Publication date: 2011-02-09
Also published as: KR20090054524A

Abstract

본 발명은 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제와 그의 제조방법에 관한 것으로서, 항생물질을 함유한 생약추출물의 지속적인 투여가 설사증의 발병과 폐사를 일으키는 살모넬라균을 방제하여 가금류의 생존률을 높이고 더불어 육계에 있어서는 내장 및 복부지방 비율의 감소를 유발하여 도체율의 증가를 일으키며, 산란계에 있어서는 산란율을 5 ~ 6% 상승시키고 난황의 지방산 조성에서는 불포화지방산을 상승 시키면서 콜레스테롤의 함량은 낮추는 효과를 일으킨다. 이를 통하여 가축은 물론 인간에게까지 보다 안전하고 경제적이며 가축의 생산성을 높일 수 있는 상기의 사료첨가제를 제공하고자 한다.

황련, 금은화, 상엽, 사료첨가제, 생약, 항생물질

Description

황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제와 그의 제조방법{The feed additive containing the mixed extractions of Coptidis Rhizoma, Lonicerae Flos and Mori Folium herbal mixture as an antibiotic and its manufacturing process}

본 발명은 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제와 그의 제조방법에 관한 것이다.

가축의 질병예방, 영양보충, 성장촉진을 통한 축산 농가 생산성 증진 목적으로 사용되는 사료첨가용 항생제는 매년 그 사용량과 사용 범위가 증가되고 있는 실정이다. 그러나 항생제의 무분별한 남용과 과다 사용으로 인한 내성균주의 증가, 새로운 병원균 출현, 축산식품 내 유해물질 잔류 등의 부작용으로 인해 EU를 비롯한 다수의 국가에서는 그 사용을 단계적으로 규제하고 있다. 동시에, 축산식품의 안전성에 대한 소비자 관심 증대 등의 요인으로 가축사료에 항생제를 첨가하는 행위 자체의 근거가 위협받고 있는 실정이다. 이에 따라 안전한 축산물 생산을 위해 합성 항생제의 사용감소가 예상되므로 새로운 항생제 대체 물질의 개발이 요구되고 있으나, 현재 동물약품 원료는 300여 종으로 그 중 80%를 해외수입에 의존하고 있는 실정으로 새로운 원료의 개발이 시급하다.

더불어 동물약품이 축산식품에 잔류함으로써 파생되는 인체에 대한 2차적 유해성, 즉 인체 사용 항생제와의 교차내성 발현 등이 이 심각한 사회문제로 부각되고 있다. 2001년부터 동물약품에서 큰 비중을 차지하고 있던 사료첨가제 중 비타민, 아미노산, 생균제, 효소제, 미량 광물질 등에 대한 사료업계의 직접취급 허용과 항생·항균제 사용규제로 인하여 시장 규모의 위축을 보이고 있다. 또한 정부의 우수제조품질관리기준(KVGMP) 지정 의무화와 제조물 책임법의 시행 등으로 인해 업계의 생산성 향상 및 수지 타산을 위한 대안책 마련이 시급한 실정이다. 이에, 가축과 인체에서 유발될 수 있는 다양한 유해 작용들을 미연에 방지하기 위해서는 합성 항생제 사용의 대안으로 천연물 소재의 기능성 사료첨가제의 개발이 요구된다. 그로 인하여 안전한 식육의 시장 공급으로 친환경 생명산업을 구축, 국민의 건강한 식생활을 보장할 수 있으며, 국산 축산물의 고품질화로 내수 시장에 대한 경쟁력 뿐 아니라 국제적 경쟁력도 확보할 수 있다. 또한, 국내 사료시장의 위축 및 내수 시장의 한계, 약품사용원료의 규제로 인한 제한된 국내 시장에서 고부가가치의 기능성 첨가물 제품 개발 및 상품화는, 내수시장의 안정화, 원료 수입에 대한 대체효과로 축산산업 전반의 발전에 기여할 수 있다.

종래에는 항생제 대체효과를 목적으로 하는 프로바이오틱스(probiotics, 생균제)가 사용되고는 있으나 그 효능이 미미한 실정이다. 또한, 장내 서식 유익균의 성장과 대사에 선택적으로 작용, 숙주에 유익한 영향을 주는 비소화성 식품성분을 총칭하는 물질인 프리바이오틱스(prebiotics)를 프로바이오틱스와 함께 사용함으로써 효능을 증폭시키고자 하는 시도가 있어 왔으나 아직은 발달 초기 단계이다.

또한, 종래의 국외 사료첨가제 관련 연구를 살펴보면, 생균제 첨가 및 아로마 요법 등에서 사용되는 생리활성 오일에 관한 연구가 일부 효능연구를 위해 생리활성물질의 성분조사를 시작한 단계이나 사료첨가제 제조에 적용하지 못하고 있는 현실이다. 더불어 일부 효능물질의 명확한 작용기전 규명이 미비하고, 개발된 물질의 안전성 검증실험 결과가 미흡할 뿐만 아니라 현장적용 실험을 통한 동물실험 자료의 부족이 문제점으로 제기되고 있다. 이에, 사료첨가용 항생제의 축산식품으로의 전이율 감소와 축산식품의 지속적인 공급을 확고히 하기 위해 소비자가 요구하는 안전 청정 축산식품 생산, 축산식품 생산성 저하요인 방지에 필요한 사료첨가용 항생제 대체물질의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명에서는 인체의 감염성 질환 치료에 사용되던 생약에서 항균, 항염증 활성물질들을 분리하고 이러한 생리활성을 나타내는 생약 추출물이 프리바이오틱스의 기능을 보유하는지를 밝혀서, 항생물질을 포함하는 상기의 생약추출물을 가축에게 공급되는 사료에 첨가하여, 보다 경제적인 비용으로 가축 뿐 아니라 인간에게도 안전한 가축 사료를 공급하고자 한다.

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여 안출된 것으로, 전통 동양의학에서 인체 감염성 질환의 치료에 효율적으로 사용되어 그 임상적 안전성이 확보된 다수의 생약으로부터 항균기능을 가지는 물질인 황련과 금은화 및 상엽을 선정하였고 상기 생약으로부터 항생물질을 추출함으로써, 상기의 추출물을 항생물질로 포함하는 사료첨가제를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제를 제공하는 목적이 있다.

또한, 본 발명은 황련, 금은화 및 상엽으로부터 추출된 추출물인 사료첨가제를 함유하여 항생효과를 갖는 사료를 제공하는 목적이 있다.

또 다른 본 발명의 목적은, 황련, 금은화 및 상엽으로부터 항생물질을 추출하여, 상기 추출물을 포함하는 사료첨가제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한, 본 발명은 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제에 관한 것이다.

상기의 금은화와 상엽은 그 추출물을 황련 추출물과 혼합하여 닭 등 가축에게 공급하였을 때는 그 항균효과가 효율적이었고, 재료의 비용도 황련을 단독으로 사용할 때보다 절감할 수 있어서 경제적이므로 상기와 같이 황련, 금은화 및 상엽의 3가지 생약을 선정하여, 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제를 제조하였다.

상기 혼합 추출물은 물 및 (C1 ~ C4)저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하는 것을 특징으로 한다. 이 때 상기 극성 유기용매는 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 아세톤 등이 사용 가능하며 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 전통 동양의학에서 항균활성 및 항염증효능을 보이는 것으로 알려져 온 황련과 금은화 및 상엽을 대상으로 메탄올 추출과 열수 추출을 통하여 추출물을 얻은 후 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)에 대해 항균활성시험을 수행하였다. 상기의 추출법에 있어서는, 열수 추출법 보다는 메탄올 추출법을 사용하여 추출물을 얻었을 때 항균 효과가 더 뛰어났으므로, 본 발명에 있어서 생약으로부터 항생물질을 포함하는 추출물을 얻을 때는 메탄올 추출법을 사용하기로 한다.

따라서 본 발명에서는 상기와 같이 선정된 황련, 금은화 및 상엽을 대상으로 메탄올 추출을 하여 하기와 같은 조건으로 혼합하였다. 생약 추출 혼합물은 금은화추출물 100 중량부에 대하여 상엽추출물은 80 내지 120 중량부, 황련추출물은 1 내지 15 중량부로 혼합되어 있다. 이에, 황련, 금은화 및 상엽으로부터 추출된 추출물인 상기 사료첨가제를 함유하여 항생효과를 갖는 사료를 제조하였다. 이 때 상기 사료는 사료 전체 중량 중 사료첨가제를 0.1 ~ 2.0 중량%로 포함하여 제조한다. 사료를 제조할 때 사료첨가제가 0.1 중량% 미만으로 포함된 경우에는 항생효과가 미미하며, 2.0 중량% 초과로 포함된 경우에는 사료의 향미가 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명의 황련과 금은화 및 상엽 생약 혼합 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 본 발명의 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제를 제조하는 방법은,

1) 황련, 금은화 및 상엽을 각각 분쇄하여 각 분쇄물을 제조하는 단계;

2) 상기 각 분쇄물에 60 ~ 80 중량%의 메탄올과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 추출 용매를 각각 가하여 각 추출물을 얻는 단계; 및

3) 상기 각 추출물을 각각 여과한 후 감압 농축하여 각 농축물을 얻는 단계;

를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 황련과 금은화 및 상엽을 분쇄하여 분쇄물을 제조하며, 상기의 건조중량은 제한되지 않는다. 상기 각 분쇄물에 물 및 (C1 ~ C4)저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매를 각각 가하고 대용량 추출기를 이용하여 18 ~ 24시간동안 50 ~ 500rpm으로 실행하여 추출한 후 거즈 및 여과지로 2 ~ 10차례 여과하고, 이를 감압농축기를 이용하여 감압농축을 한다. 상기 혼합 용매는 60 ~ 80 중량%의 (C1 ~ C4)저급 알콜과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 것으로 한다. 이 때 (C1 ~ C4)저급 알콜이 60 중량% 미만인 경우에는 추출되는 추출물의 양이 충분치 못하며, 80 중량% 초 과인 경우에는 추출물로부터 (C1 ~ C4)저급 알콜을 제거하는데 오랜 시간이 소요되는 문제점이 있다.

생약 추출물 분리를 위해 크로마토그래피를 사용하는데, 이는 고정상과 이동상의 극성에 따른 평형을 이용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피가 주로 많이 사용되며, 이외에도 겔 여과 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피, 분취 실리카겔 박층 크로마토그래피 등이 사용가능하고, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 상기와 같이 추출한 최종 추출물을 사료에 첨가 시, 최종 추출물인 금은화추출물 100에 대하여 상엽추출물은 80 내지 120 중량부, 황련추출물은 1 내지 15 중량부로 혼합하는 사료첨가제 제조방법을 사용한다. 상기의 농축물은 60 ~ 80 중량%의 메탄올과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 추출 용매 0.5 ~ 2L에 다시 각각 용해하는 단계를 포함한다. 최종적으로 상기 추출물은 메탄올을 증발시켜 분발형태로 제조하며, 상기와 같은 제조방법으로 제조된 최종 추출물인 사료첨가제는 가축용 사료와 혼합하여 생약추출물을 포함하는 사료를 제조할 수 있다. 상기 사료첨가제는 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형으로 제공할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명은 황련, 금은화 및 상엽의 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제와 그의 제조방법을 제공함으로써, 항생물질을 함유한 생약추출물의 지속적인 투여가 설사증의 발병과 폐사를 일으키는 살모넬라균을 방제 하여 가금류의 생존률을 높이고 더불어 육계에 있어서는 내장 및 복부지방의 비율의 감소를 유발하여 도체율의 증가를 일으키며, 산란계에 있어서는 산란율을 5 ~ 6% 상승시키고 난황의 지방산 조성에서는 불포화지방산을 상승 시키면서 콜레스테롤의 함량은 낮추는 효과를 일으킨다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

[제조예 1] 대상 생약의 메탄올 추출물 제조

황련, 금은화 및 상엽을 대상으로 이들의 메탄올 추출물을 제조하였다. 메탄올 추출물은 실험에 사용된 생약의 건조중량 각 1kg에 75% 메탄올 용액 2L를 각각 가하여 실온에서 24시간 동안 추출기(코바이오텍, 내부용량 500L, 최대추출용량 325L)를 이용하여 추출한 후 여과지로 3 ~ 5차례 여과하였고, 이를 감압농축기를 이용하여 감압농축한 후 10mL의 75% 메탄올 용액에 재용해 하였다.

[비교예 1] 대상 생약의 열수 추출물 제조

상기 제조예 1의 생약을 대상으로 열수 추출물을 제조하였다. 열수 추출물은 황련, 금은화 및 상엽의 각 건조중량 1kg에 1,000mL의 증류수를 가하여 100℃에서 3시간씩 2회 열수 추출하고 이를 회전식 감압농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 감압 농축한 다음, 10mL의 증류수에 재용해 하였다.

[실시예 1] 생약추출물의 항균력 측정

상기 제조예 1과 비교예 1에서 황련, 금은화 및 상엽으로부터 각각 추출한 메탄올 추출물과 열수 추출물의 항균력을 측정하기 위해서, 본 연구실에서 보관 중인 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)을 사용하여 항균력을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 항균력 측정은 페이퍼 디스크(paper disc) 확산법으로 확인하였다. 페이퍼 디스크 확산법을 실시하기 위해, LB 고체배지(10g/L 염화나트륨, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 트립톤, 7.5g/L 아가로스, 121℃, 15분간 멸균) 평판 위에 대장균과 살모넬라 엔테리티디스의 세균생육배지(뇌-심근 침출배지, Brain Heart Infusion Medium)를 각각 접종한 후, 멸균된 핀셋으로 페이퍼 디스크를 배지 위에 얹어 놓았다. 페이퍼 디스크에 상기의 생약추출물을 흡수시키기 위해 50μL를 로딩하여 24 ~ 48시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 그 결과 항균력을 나타내는 곳은 저지환(inhibition zone)이 생성되어, 이 저지환의 크기에 따라 항균력의 유무와 효과를 결정하였다.

하기 표 1에 나타난 바와 같이 대장균과 살모넬라 엔테리티디스에 대해 항균활성을 갖는 생약추출물을 탐색한 결과, 메탄올 추출물이 열수 추출물에 비하여 높은 항균력을 나타냄을 확인하였고 특히, 황련의 메탄올 추출물이 실험에 사용된 두 종류의 세균에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다.

표 1. 생약추출물의 항균력 측정 결과

-: 무저해, +: 저해 크기 1-3mm, ++: 저해 크기 4-5mm

[제조예 2] 선정된 생약의 생약추출물 제조

상기에서 항균활성이 높은 생약인 황련과 금은화 및 상엽을 선정하였고, 항균활성 추출물을 제조하기 위하여, 각 생약의 건조중량 각 100kg을 분쇄하여 표준 시이브로 100 메쉬 크기 입자를 선별하였다. 상기의 입자에 75% 메탄올 용액 200L를 가하여 실온에서 대용량 추출기를 이용하여 18시간 동안 125rpm으로 추출한 후 거즈 및 여과지로 3 ~ 5차례 여과하였다. 이를 감압농축기를 이용하여 감압농축 한 후 1L의 75% 메탄올 용액에 다시 용해하였고, 메탄올을 완전히 휘발시켜 분말형태의 최종 추출물을 얻는다.

[제조예 3] 생약추출물을 포함한 사료 제조

본 발명에 의하여 가금용 사료첨가제를 하기 표 2와 같은 조성으로 제조하였다. 상기 제조예 2의 제조 방법에 의해 제조된 각 추출물의 비율을 금은화 : 상엽 : 황련 = 48.5 : 48.5 : 3.0으로 배합하여 이후의 실험예에 사용하였다. 생약추출물을 포함한 사료 제조는 50kg의 미강과 혼합하여 사료를 제조하였다.

표 2. 가금용 사료첨가제를 포함하는 사료의 구성성분

[ 실험예 1] 생약추출물 첨가가 육계에 미치는 영향

본 실험예에서는 시험사료에 본 발명에 의해 제조된 생약추출물을 0% 함유한 육계 전기(0 ~ 21일령)와 후기(22 ~ 35일령) 사료를 대조구(Control)로 하고, 대조구와 동에너지-동단백질이 되도록 생약추출물 0.3%를 포함하는 사료를 T1으로 하며, 생약추출물 1.0%를 포함하는 사료를 T2로 하여 시험사료를 제조하여, 그 성분을 하기 표 3과 표 4에 나타내었다. 전기 사료는 물질대사 에너지 3100 kcal/kg, 조단백질 21.0%가 되도록 배합하였었으며, 후기사료는 물질대사 에너지 3100 kcal/kg, 조단백질 19.0%가 되도록 배합하였다.

표 3. 육계 전기 사료의 시험사료 제조(0 ~ 21일령)

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

²사료/kg당 함유량 : 비타민 A, 5,500IU; 비타민 D₃, 1,100IU; 비타민 E, 11IU; 비타민 B₁₂ 0.0066mg; 리보플라빈, 4.4mg; 니아신, 44mg; 판토텐산, 11mg(칼슘-판토네이트, 11.96mg); 콜린, 190.96mg (콜린 콜라이드 220mg); 메나디온, 1.1mg (메나디온 소듐 바이설레이트 복합체, 3.33mg); 엽산, 0.55mg; 피리독신, 2.2mg(피리독신 하이드로콜라이드, 2.67mg); 비오틴, 0.11mg; 티아민, 2.2mg(티아민 모노나이트레이트, 2.40mg); 에톡시퀸, 125mg.

³사료/kg당 함유량 ; 망간, 120; 아연, 100; 철, 60; 구리, 10; 요오드, 0.46; 칼슘, 최소: 150, 최대: 180.

표 4. 육계 후기 사료의 시험사료 제조(22 ~ 35일령)

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

²사료/kg당 함유량 : 비타민 A, 5,500IU; 비타민 D₃, 1,100IU; 비타민 E, 11IU; 비타민 B₁₂ 0.0066mg; 리보플라빈, 4.4mg; 니아신, 44mg; 판토텐산, 11mg(칼슘-판 토네이트, 11.96mg); 콜린, 190.96mg (콜린 콜라이드 220mg); 메나디온, 1.1mg (메나디온 소듐 바이설레이트 복합체, 3.33mg); 엽산, 0.55mg; 피리독신, 2.2mg(피리독신 하이드로콜라이드, 2.67mg); 비오틴, 0.11mg; 티아민, 2.2mg(티아민 모노나이트레이트, 2.40mg); 에톡시퀸, 125mg.

실험에 사용된 육계는 갓 부화한 육계(Cobb 500) 480수를 12개의 펜(3.0m× 1.0m)에 40수씩 완전 임의로 배치하였다. 깔짚은 톱밥을 사용하였고, 24시간 점등을 실시하였다. 0 ~ 21일령까지는 전기사료를 급이 하였으며, 22 ~ 35일령 동안은 후기사료를 첨가하였다. 사료와 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 체중은 8일령, 22일령, 36일령 각 1회씩 측정하였다. 사료섭취량은 전기 사료와 후기 사료 섭취량을 각각 측정하였다. 사료요구율은 총사료섭취량을 총증체량으로 나누어서 산출하였다. 생약추출물의 사료에의 첨가가 육계의 생산성에 미치는 효과를 하기 표 5에 나타내었다. 생약추출물을 육계 전기 및 후기사료에 0.3% 및 1.0% 첨가하였으나, 성장률, 사료섭취량 및 사료효율에 있어서 대조구와 비교하여 볼 때 유의한 차이가 발견되지 않았다. 그러나 생약추출물을 첨가한 시험구의 경우 생존율이 대조구와 비교하여 1 ~ 3%의 상승된 결과를 나타내었다.

표 5. 생약추출물의 사료에의 첨가가 육계 생장에 미치는 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

²평균 ± SD.

생약추출물을 사료에 첨가하여 첨가하는 경우, 비가식부인 내장과 복부지방의 비율 및 도체율에 미치는 영향을 하기 표 6에 나타내었다. 내장비율의 경우 생약추출물 첨가구가 대조구보다 낮게, 복부지방 비율에서는 첨가구가 대조구보다 유의적으로 낮은 수치를 나타내었으며, 도체율은 첨가구가 대조구보다 높게 나타났다. 이는 본 시험에 사용된 생약추출물을 사료에 첨가하여 육계에 첨가하는 경우 비가식 부위인 내장 및 복부지방의 비율이 감소를 유발하여 도체율의 증가가 얻어진 것으로 판단되므로 본 생약추출물의 첨가는 육계의 도체품질상승에 도움을 줄 수 있는 것으로 여겨진다.

표 6. 육계의 내장과 복부지방 및 도체율에 있어서 생약추출물의 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

^a-b Means with different superscripts within the same column are significantly different(P<0.05).

[실험예 2] 생약추출물 첨가가 산란계에 미치는 영향

본 실험예에서는 시험사료에 본 발명에 의해 제조된 생약추출물을 0% 함유한 육계 전기(0 ~ 21일령)와 후기(22 ~ 35일령) 사료를 대조구로 하고, 대조구와 동에너지(TMEn 2,780 kcal/kg)-동단백질(17.0%)이 되도록 생약추출물 0.3%를 포함하는 사료를 T1으로 하며, 생약추출물 1.0%를 포함하는 사료를 T2로 하여 시험사료를 제조하여, 그 성분을 하기 표 7에 나타내었다.

표 7. 산란계 사료에 생약추출물을 첨가한 시험사료 제조

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

² 사료/kg당 함유량 : 구리, 10mg; 철, 80mg; 망간, 80mg; 아연, 80mg; 요오드, 0.9mg; 셀레늄, 0.2mg; 코발트, 0.5mg.

³ 사료/kg당 함유량 : 비타민 A, 12,000IU; 비타민 D3, 3,000IU; 토코페롤 15mg; 비타민 K3, 2mg; 티아민, 2.0mg; 리보플라빈, 6.0mg; 피리독신, 2mg; 비타민 B12, 0.03mg; 엽산, 1.0mg; 비오틴, 0.15mg; 니아신, 45mg; D-칼슘 판토티네이트, 15mg; 항산화제, 0.5mg.

⁴옥수수 증류기로 말린 낟알.

⁵계산된 값.

사양실험에 사용된 공시계는 로만 브라운 계통의 28주령 산란계 108수로서, 충남대학교 환경조절축사에서 6주간 사육하였다. 실험설계는 3처리 6반복, 반복 당 6수씩 완전 임의 배치하였으며, 일일 17시간 점등하며 관리하였다. 사료섭취량은 7일 단위로 총 첨가량에서 잔량을 제외하여 측정하였고, 산란율은 실험기간 동안 매일 오후 1시에 수집한 산란개수를 사육수수로 나누어 백분율로 표시하여 산란율을 Hen-day 산란율로 매일 측정하였다. 생약추출물의 첨가에 의한 산란계의 난생산성에 미치는 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 그 결과, 생약추출물을 첨가한 산란계에 있어서 산란율의 5 ~ 6% 상승을, 난중 및 총난중이 다소 상승하는 결과를 얻었으나, 사료섭취량과 난생산 및 사료효율에 있어서는 생약처리에 따른 유의적 차이가 발견되지 않았다.

표 8. 생약추출물의 첨가에 의한 산란계 ¹ 의 난생산성의 영향

¹ 로만브라운 산란계를 대상으로 함

²대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

³ 암탉의 주간 산란율

⁴ 사료섭취량 / 난중

⁵ 평균 ± SD.

지방산 및 콜레스테롤 분석은 Folch 등(1957)의 방법에 준하여 지방을 추출하고, 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography)로 분석하였다. 생약추출물의 첨가가 난황의 지방산 조성 및 콜레스테롤 함량에 미치는 영향은 하기 표 9에 나타내었다. 불포화 지방산 중에서 필수지방산인 리놀렌산(linolenic acid)(18:2)는 생약추출물 첨가구에서 1.05 ~ 1.6% 상승하였고, 리놀렌산(18:3)의 함량도 생약추출물 첨 가구에서 높은 증가를 나타냄으로써 최종적으로 생약추출물 첨가구는 대조구와 비교하여 난황의 지방산 중 약 1.5 ~ 2% 정도 불포화 지방산 함량이 높아진 결과를 나타내었다. 또한, 생약추출물 첨가구의 경우 난황의 콜레스테롤 함량이 대조구와 비교하여 1.5% 전후 낮아짐을 관찰할 수 있었는데 이것은 포화지방산 중에서 혈중 콜레스테롤 농도를 상승시키는 것으로 알려져 있는 팔미트산(Palmitic acid)(16:0) 함량의 감소와 함께 혈중 콜레스테롤 농도를 하강시키는 기능을 소유한 것으로 알려진 리놀렌산(18:3) 함량의 대록적인 증가에 기인하는 것으로 보인다.

표 9. 생약추출물의 첨가가 난황의 지방산 조성 및 콜레스테롤 함량에 미치는 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

^* 포화지방산

^** 불포화지방산

[실험예 3] 생약추출물 첨가가 장내 미생물 균총에 미치는 영향

본 실험예에서는 사료에 생약추출물을 혼합하여 첨가하는 경우 육계 및 산란계의 장내 미생물 균총 변화에 미치는 영향을 검증하고자 하였다. 실험에 사용된 육계 및 산란계는 평균체중에 가까운 36일령의 육계(Cobb 500) 및 로만 브라운 계통의 34주령 산란계를 3수씩 선발하여 경정맥 방혈을 실시한 직후 탈모기에서 우모를 제거한 다음 맹장부위를 적출하였다. 이를 생리식염수로 수차례 세척하여 단계별로 희석한 다음, 살모넬라 속(Salmonella sp.), 대장균 및 총 박테리아 및 혐기성 세균의 측정을 위하여 각각 SS 배지(Salmonella Shigella agar, 펩톤 10.0g/L, 유당 10.0g/L, 황소 담즙 8.5g/L, 나트륨 구연산염 10.0g/L, 나트륨 thiosulfate 8.5g/L, 염화 철 (III) 구연산염 1.0g/L, 브릴리언트 녹색 0.0003g/L, 중립 빨강 0.025g/L, 우뭇가사리 12.0g/L), 맥콘키 배지(MacConkey agar, 카세인의 펩톤 17.0g/L, 고기의 펩톤 3.0g/L, 염화 나트륨 5.0g/L, 유당 10.0g/L, 담즙 소금 혼합물 1.5g/L, 중립 빨강 0.03g/L, 크리스탈 제비꽃 0.001g/L, 우뭇가사리 13.5g/L, 4-메틸룸벨리페릴-b-D-글루쿠로니드(methylumbelliferyl-b-D-glucuronide) 0.1g/L), 영양 배지(Nutrient agar, 육수 추출물 3.0g 펩톤 5.0g, pH 6.8) 및 세균생육배지(Brain Heart Infusion medium agar(Difco사, 제품번호:4203290) 26g, 증류수 500ml)를 사용하여 분석하였다.

생약추출물의 첨가는 하기 표 10에서 나타낸 바와 같이 육계와 산란계에 있어서 공히 살모넬라 속, 대장균 및 총 박테리아의 균수를 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 이는 본 실험예에 사용된 생약추출물가 장관을 통과하는 과정에 서 다양한 종류의 병원성 세균에 대한 저해활성(antagonistic activity)을 소유함을 증명하는 동시에 전체적인 미생물의 개체수도 감소시켰다.

표 10. 육계와 산란계의 장내 미생물 균총에 있어서 생약추출물의 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

[실험예 4] 생약추출물 첨가가 배설물의 가스 발생에 미치는 영향

본 실험예에서는 생약추출물의 첨가가 배설물에서 발생하는 유해가스의 발생에 미치는 영향을 규명하기 위하여 육계 중기(3주령) 및 후기(5주령)에서 채취한 분의 암모니아 및 황화수소 가스를 측정하였다. 유해가스 발생량의 측정은 육계 중기와 육계 후기에 각각 조사하였으며, 조사항목인 암모니아 및 황화수소가스의 발생량을 측정하기 위하여 동일한 시간 내에 배설된 분을 각 100g씩 정량하여 밀폐용기에 넣고 실온에서 24시간 방치 후에 Gastec(GV-100S, Japan)을 이용하여 측정하였다.

상기와 같이 측정한 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 전반적으로 암모니아가스의 발생량이 황화수소 발생량보다 현저히 낮게 나타났으며, 육계후기로 갈수록 무처리구에서 보다 생약추출물 첨가구에서 유해가스의 발생량이 감소하였다. 이는 상기 표 11에 나타낸 바와 같이 장내 미생물 개체수의 감소가 생약추출물의 첨가에 의하여 요소를 분비하는 암모니아 생산 원인균의 번식과 연계되어 유해가스의 발생량이 감소하였다.

표 11. 육계 배설물의 유해가스 발생에 있어서 생약추출물의 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

^a-b Means with different superscripts within the same column are significantly different(P<0.05)..

[실험예 5] 생약추출물 첨가에 따른 살모넬라 엔테리티디스의 장관정착 억제효과

1) 생약추출물 첨가에 따른 설사 발병률과 맹장 내 살모넬라 엔테리티디스의 개체수 영향

본 실험예에서는 사료에 생약추출물을 혼합하여 첨가하는 경우 육계에서 살모넬라 감염이 억제가능한지 여부에 대하여 조사하고자 인공적으로 살모넬라 엔테리티디스 균주를 감염시킨 후 장기의 살모넬라균의 분포와 설사 발병율을 검사하여 이의 장관정착억제효과를 검토하였다. 공시계로는 2주령의 육계(Cobb 500)를 사용하였으며, 실험설계는 3처리 3반복, 반복당 6수씩 완전 임의 배치하였고, 사료는 시판 육계 전기 사료(서부사료)에 생약추출물을 0.3%와 1%씩 각각 첨가하고 대조구는 시판 육계 전기 사료만을 사용하였다. 살모넬라균의 인공감염을 위하여 트립틱 소이 배지(Tryptic soy broth, 제품번호 BD-9061-73호)에 액체배양한 살모넬라 엔테리티디스 ATCC 13076(1ㅧ 107 cfu/ml)를 0.1ml씩 매일 1회, 총 3회 경구투여 하였다. 설사 발병율은 접종 후 2주간 1주 간격으로 조사하였고, 맹장 내의 살모넬라 엔테리티디스 균 분포를 동시에 측정하였다. 혈중 항체가는 살모넬라 엔테리티디스 접종 후 2주간 1주 간격으로 혈청을 분리하고, 이를 살모넬라 엔테리티디스 ATCC 13076을 표준균주로 하여 제작한 항원을 사용한 마이크로플레이트 응집 테스트(Microplate Agglutination Test, MAT)를 실시하여 측정하였다.

상기의 실험을 수행한 결과, 살모넬라 엔테리티디스의 인위적 감염에 따른 설사 발병율의 결과는 하기 표 12와 같다. 대조구는 감염 7일째 6수중 5수(2수 폐사), 생약추출물 첨가구는 감염 7일째 6수중 2수(T1) 또는 3수(T2, 1수 폐사)가 설사증세를 나타내었으나, 2주후에는 대조구만이 6수중 1수가 설사증세를 나타내었다.

표 12. 육계의 설사 발병에 있어서 생약추출물의 영향

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

^a 6마리의 육계로 시험함.

또한, 상기에서 각 시험구의 맹장에 존재하는 살모넬라 엔테리티디스의 개체수의 결과는 하기 표 13에 나타내었다. 접종 1주차에서는 대조구에서는 접종 1일째와 비교하여 약간의 균수 감소가 관찰되었으나 생약추출물 첨가구에서는 상당한 균수의 감소현상이 나타났다. 생약추출물 1% 첨가구인 T2의 경우 맹장 내의 살모넬라 엔테리티디스 개체수가 89% 이상, 생약추출물 0.3% 첨가구인 T1의 경우에도 77% 이상 살모넬라 엔테리티디스의 개체수가 대폭 감소하였다.

표 13. 육계 맹장 내의 살모넬라 엔테리티디스 개체수

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

^a 평균 ± SD 3 ~ 6마디 육계를 대상으로 시험함.

2) 살모넬라 엔테리티디스의 접종시 생약추출물 첨가에 따른 육계 장기 조직의 변화유무

본 실험예에서는 살모넬라 엔테리티디스의 인위적인 감염에 따른 육계 장기조직의 변화유무를 관찰하기 위하여 접종 2주 후의 육계를 도계하여 맹장을 적출하고 PBS버퍼(10X Phosphate Buffer saline, 제2인산나트륨 10.9g/L, 제1인산나트륨 3.2g/L, 염화나트륨 90g/L, pH 7.2)로 수차례 세척한 후 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)으로 관찰하였다. 육계 장기의 관찰 결과는 하기 도 1에 나타냈었다. 대조구의 경우 장 점막 상피 표면에 염증반응이 관찰된 반면, 생약추출물 0.3% 첨가구인 T1과 생약추출물 1% 첨가구인 T2의 경우에는 장 상피조직이 비교적 건강한 것으로 나타났다.

3) 살모넬라 엔테리티디스의 접종시 생약추출물 첨가에 따른 혈청항체가분석

본 실험예에서는 살모넬라 엔테리티디스를 인위적으로 감염시킨 후 1일, 1주일 및 2주일 경과시점에서 경추 탈골법으로 도계한 직후 심장에서 채혈하고 실온에서 혈액을 응고시킨 후 원심 분리하여 얻어진 혈청을 -80℃의 초저온 냉장고에 보관하여 혈청항체가분석에 사용하였다. 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다. 본 실험조건에서는 대조군에 비하여 생약추출물을 첨가한 첨가구의 혈청 내 항체역가가 전반적으로 낮게 나타났다.

표 14. 살모넬라 엔테리티디스의 인위적 감염시 육계 혈청항체가분석

¹대조구 : 0% 생약추출물

T1 : 0.3% 생약추출물

T2 : 1.0% 생약추출물

도 1은 살모넬라 엔테리티디스의 인위적 감염에 따른 육계 장기 조직의 변화유무에 대한 결과로써

도 1a는 대조구에 대한 주사전자현미경적 관찰 결과이고,

도 1b는 생약추출물 0.3% 첨가구인 T1에 대한 주사전자현미경적 관찰 결과이고,

도 1c는 생약추출물 1% 첨가구인 T1에 대한 주사전자현미경적 관찰 결과이다.

Claims

금은화추출물 100 중량부에 대하여 상엽추출물 80 내지 120 중량부 및 황련추출물 1 내지 15 중량부로 혼합된 혼합 추출물을 포함하는 항생효과를 갖는 사료첨가제.
제 1항에 있어서,

상기 혼합 추출물은 물 및 (C1 ~ C4)저급알콜 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 2항에 있어서,

상기 혼합 용매는 60 ~ 80 중량%의 (C1 ~ C4)저급 알콜과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 추출 용매를 이용하여 추출하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
삭제
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 황련, 금은화 및 상엽으로부터 추출된 추출물인 사료첨가제를 함유하여 항생효과를 갖는 사료.
제 5항에 있어서,

상기 사료 전체 중량 중 사료첨가제가 0.1 ~ 2.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 사료.
1) 황련, 금은화 및 상엽을 각각 분쇄하여 각 분쇄물을 제조하는 단계;

2) 상기 각 분쇄물에 60 ~ 80 중량%의 메탄올과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 추출 용매를 각각 가하여 각 추출물을 얻는 단계;

3) 상기 각 추출물을 각각 여과한 후 감압 농축하여 각 농축물을 얻는 단계;

4) 상기 각 농축물을 60 ~ 80 중량%의 메탄올과 20 ~ 40 중량%의 물을 혼합한 추출 용매에 다시 각각 용해하여 각 최종 추출물을 수득하는 단계; 및

5) 상기 각 최종 추출물로 금은화추출물 100 중량부에 대하여 상엽추출물 80 내지 120 중량부 및 황련추출물 1 내지 15 중량부로 혼합하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제 제조방법.
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