TWI338046B - Human g protein-coupled receptor and modulators thereof for the treatment of inflammatory disorders - Google Patents

Description

1338046 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ‘ 本專利文件所揭示之發明係關於跨膜受體，更特定而 言，係關於G蛋白-偶聯受體（其之内生性配體已被鑑別 出），尤其是經修改而確立受體之持續活性之cxc趨化激 素受體亞型3 (CXCR3)Hb具體實施例中，使用 CXCR3的型直接鑑定用於治療疾病之候選化合物，例如受

體之促效劑(agonist)、反向促效劑、部分促效劑或拮抗 劑，此等疾病例如，但非限於，移植物排斥、皮膚炎症、 發炎性腸疾病；過敏性發炎、過敏性肺炎、發炎性脫髓鞘 神經病變、中拖神經發炎、類風濕性關節《、阻塞性細支 氣管炎症候群、牙周病及神經退化性疾病。依照本發明揭 示之方法鑑定出之候選化合物於靈長類(包括，但不限於 人類以及非人類靈長動物）以及其他哺乳動物（包括，作不 限於’狗、猫、老鼠、馬、羊、豬、及牛）中可能有用。 【先前技術】 A. G蛋白·偶聯爻體（G pr〇tein c〇upied ⑽） 雖然人體内存在多種受體，但是至目前為止最豐富且與 治療相關者以G蛋白·偶聯受體類為代表。據估計有3〇,〇〇〇-40,000基因存在人類基因中，其中估計將近有μ編碼 GPCRs。&等受體包括：受體之内生性配體已被鑑定出之 GPCRs，其被稱為「6知」冑體，以及受體之内生性配體 未被鑑定出之GPCRs，其被稱為「孤兒（—）」受體。 GPCRs代表藥劑製品開發之—個重要領域：從⑽種已 103483-960706.doc 1338046 知GPCRs中之約20種’開發出所有處方藥劑中之約6吖。 舉例來說’在1999年’百大品牌處方藥物中，下列藥物會 ,、GPCRs交互作用（藥物所治療之主要疾病以及/或失調示 於括弧中）：

Claritin® (過敏症）、百憂解pr〇zac⑧（憂鬱症）、 Vasotec® (高血壓）、赛樂特—⑽（憂營症）、左樂復 Zoloft® (憂鬱症）、普樂Zyprexa@ (精神異常）、可悦您 Cozaar® (问血壓）、舒馬曲坦Imitrej<^ (偏頭痛）、善胃 錠Zantac® (逆流）、西沙必利Pr〇pulsid⑧（逆流疾病）、維 思通Risperdal® (精神分裂病）、Servent@ (氣喘）、法莫 替丁 Pepcid® (逆流疾病）、蓋舒泰Gaster⑧（潰瘍）、定喘 樂Atrovent® (支氣管痙攣）、速悅Effex〇r(g)(憂鬱症）、 Depakote® (癲癇症）、多沙唑秦Cardura® (前列腺）、艾 來Allegra® (過敏症）、Lupron® (攝護線癌）、醋酸高捨 瑞林Zoladex® (攝護線癌）、普魯泊福Diprivan@ (麻 醉）、煩寶BuSpar® (憂慮）、泛得林Ventolin⑧（支氣管癌 攣）、定脈平Hytrin® (高血壓）、Wellbutrin® (憂繫症）、 Zytec® (鼻炎）、保栓通 Plavix® ( / 中風）、Toprol-XL® (高血壓）、天諾敏Tenormin® (喉頭炎）、舒而坦 Xalatan® (青光眼）、欣流Singulair® (氣喘）、得安穩 Diovan® (高血壓）、哈樂Harnal® (前列腺肥大症）（Med Ad News 1999 資料）。 一般來說，當内生性配體與該受體結合（通常稱為該受 體的「活化作用」），在該細胞内區域的構造上將會有所變 103483-960706.doc 1338046 化，其允許該細胞内區域與細胞内「G蛋白」連結。據報 告GPCRs與G蛋白「混雜結合」’換句話說，GpCRs可與不 只一個G蛋白交互作用，參閱Kenakin，T，43 Life Sciences 1095 (1988)。雖然有其他G蛋白’目前，Gq、Gs、Gi、Gz 以及G。為已經鑑定出的G蛋白。與g蛋白偶聯之經配體活 化之GPCR，啟動一連串傳信過程（稱為「信號轉導」 (signal transduction))。在正常狀況下，信號轉導最後結果 疋細胞活化作用或抑制作用。雖然不希望侷限於任何理 論，惟一般認為該IC-3迴路和該受體的羧基端與α蛋白交 互作用。 在生理的狀況下，GPCRs以兩不同構形：「非活性」狀 態以及「活性」狀態彼此平衡地存在於膜。在非活性狀態 之受體無法連結於細胞内信號轉導路徑，以致無法發動信 號轉導而無法產生生物反應^將該受體構形改變為活化狀 態允許連結至該信號轉導路徑（藉著該（}蛋白）以及產生 生物反應。 藉由配體或化合物，例如藥物，可使受體穩定在活性狀 態。近來發現，包括（但非限於）修改受體的胺基酸序列之 方法，在配體或藥物之外提供另一種促使受體呈活性狀態 構形且使之安定化的方法。這些方法藉由模擬配體與受體 結合的效果，有效地使活性狀態之受體安定化。藉由此種 非依存於配體之方法所達成之安定化稱為「持續受體活 化」（constitutive receptor activati〇n) 〇 B. CXC趨化激素受體亞型3 (「cxcRj」） 103483-960706.doc

第093107222號專利申請案 中文說明書替換頁(97年5月） 1995年選殖出CXC 修正補充 本 η 趨化激素受體亞、型3 原本將其稱作GPR9且錯誤地將其基因定位在人類染色體

8p 11.2-12 ( Marchese 等人，23,609-618 ( 1995))，但是之 後已正確地將其基因定位於Xql3 ( Loetscher等人，Eur J

Immuno 128 : 3696-3705 ( 1998 ))。在進一步分析 GPR9之 後’鑑定出該受體可與趨化性細胞激素的趨化激素家族之 一個或多個成員結合且將其重新命名為CXCR3。已鑑定出 CXCR3可結合於三個促效劑，7 -干擾素誘導性蛋白_1〇 (‘‘ IP-1 0 ’’ ）、干擾素誘導性T細胞α -化學吸引因子 (“ I-TAC ” ）以及由Τ -干擾素所誘導之單核因子 (“ Mig” ）（ Murphy, Ρ.Μ·，等人提出，Pharmacol Rev 西元 2000年 3月；52 ( 1 ) : 145-76)。 已測知CXCR3在循環血液中T-細胞、B-細胞、自然殺手 (NK )細胞以及嗜伊紅性細胞中表現。當τ細胞為活性 時，該CXCR3的表現量以及回應性會增加。此觀察顯示該 CXCR3參與發炎，和白血球運輸以及免疫監督。 【發明内容】 本發明揭示針對人類CXCR3受體之非内生性、持續活化 型（在本文中稱為N134S)之核酸分子以及蛋白質^已測知 該N134S受體為人類CXCR3的持續活化形式，其係由位於 位置134之天冬醯胺酸殘基點突變成絲胺酸殘基而成。 本發明係關於人類CXCR3受體之非内生性持續活化型以 及此等受體的各種用途。在一些具體實施例中，CXCR3具 有序列識別號：6的胺基酸序列。在一些具體實施例中， Ι 03483-970502.doc .ΙΟ 1338046 CXCR3由序列識別號：5的核苷酸序列編碼。 在另外態樣中’本發明係針對包含載體及具有序列識別 號：5之cDNA之質體。 在一些癌樣中’本發明係針對包括質體之宿主細胞，其 中該質體包含載體及具有序列識別號：5之cDNA。 在另外癌樣中’本發明係針對直接鑑定非内生性候選化 合物為内生性CXCR3之促效劑、反向促效劑、部分促效 劑或拮抗劑的方法。該方法包含下述步驟：（a)令非内生 性CXCR3進行持續受體活化以產生非内生性持續活化 CXCR3 ; (b)使非内生性候選化合物與該非内生性持續活 化CXCR3接觸；以及（e)藉由測量該經接觸之化合物所誘 導之細胞内信號與不存在該經接觸之化合物下之細胞内信 號之差異，以鑑定該非内生性候選化合物係屬促效劑、反 向促效劑、部分促效劑或拮抗劑。這些被鑑定出之候選化 合物可被用於治療與CXCR3受體相關之疾病及失調之醫 藥組合物’其中與CXCR3受體相關之疾病及失調包括， 但不限於，移植物排斥；發炎性皮膚疾病；發炎性腸疾 病；過敏性發炎、過敏性肺發炎、發炎性脫髓鞘性神經病 變、中樞神經發炎；類風濕性關節炎、阻塞性細支氣管炎 徵候群、牙周病以及神經性退化疾病。 在另外態樣中，本發明係針對CXCR3相關疾病之預防或 治療藥劑之製造’該CXCR3相關疾病例如為選自心臟、肺 臟、腎臟及皮膚移植物所組成族群中之移植物之排斥，其 中該移植物為同種異體移植物或異種移植物。 103483-960706.doc -11· 1338046 在另外態樣中，本發明係針對CXCR3相關疾病之預防或 〜療藥劑之製造’該CXCR3相關疾病例如為選自發炎性皮 膚疾病、發炎性腸疾病、過敏性發炎、過敏性肺發炎、發 炎性脫髓鞘神經病變、中樞神經發炎、類風濕性關節炎、 阻塞性細支氣管炎症候群、牙周病以及神經退化性疾病所 組成族群之發炎性疾病。 在另外態樣中，本發明係針對CXCR3相關疾病之預防或 治療藥劑之製造，該CXCR3相關疾病例如為選自牛皮癬、 扁平苔癖、慢性盤狀紅斑性狼瘡、過敏性貼膚試驗反應以 及皮膚的Jessner’s淋巴球增多性浸潤所組成族群中之發炎 性皮膚疾病。 在另外態樣中，本發明係針對CXCR3相關疾病之預防 或治療藥劑之製造，該CXCR3相關疾病例如為選自多發 性硬化症、局部性中風以及腦脊髓炎所組成族群中之中樞 神經系統發炎。 在另外態樣中，本發明係針對藉由上述方法所鑑定出之 化合物。 在在另外態樣中，本發明係針對包含括由本發明方法所 直接鑑疋出之化合物之組合物，包括醫藥組合物。 在一些態樣中，本發明係針對調節生理作用的方法，該 方法包括將内生性CXCR3予以持續受體活化，以產生非 内生性持續活化的CXCR3。藉此調節生理作用。在一些 具體實施例’該非内生十生CXCR3具有序列識別號：6的 胺基酸序列。 103483-960706.doc 12- IJJ8U46 在些具體實施例中，該生理作用係選自白血球運輸' 免疫皿督先天性與後天性免疫反應以及各種形式的病理 發炎所組成之族群。 '的届理 在另外態樣中’本發明係'針對調節生理作用的方法，該 方法包括：⑷令内生性CXCR3 it行持續受體活化，以產 生非内生性持續活化的CXCR3 ;以及⑻使該非内生性持 續活化的CXCR3與CXCR3的非内生性促效劑、反向促效 劑邛刀促效劑或拮抗劑接觸。藉此調節生理作用。在 :些具體實施例中，該非内生性CXCR3具有序列識別 號：6的胺基酸序列。在__些具體實施例中，該生理作用 選自白血球運輸、免疫監督、先天性與後天性免疫反應以 及各種形式的病理發炎所組成之族群。 在一些態樣中，本發明係針對直接鑑定出對於内生性、 持續活化G蛋白-偶聯細胞表面受體（GpCR)具有反向促效 劑活性或促效劑活性之非内生性候選化合物之方法，該方 法包括下述步驟：（a)使非内生性候選化合物與gpcr融合 蛋白接觸’該GPCR融合蛋白包括内生性持續活化的 CXCR3以及G蛋白；以及（b)藉由測量該經接觸之化合 物所誘導之細胞内信號與不存在該經接觸之化合物下之細 胞内信號之差異’以鑑定該非内生性候選化合物係屬該内 生性持續活化CXCR3之促效劑、反向促效劑、部分促效 劑或拮抗劑。 在另外態樣中，本發明係針對直接鑑定出對於内生性、 持續活化G蛋白偶聯細胞表面受體（GPCR)具有反向促效 103483-960706.doc •13· 1338046 劑活性或促效劑活性之非内生性候選化合物之方法，該方 法包括下述步驟：⑷使非内生性候選化合物與gpcr融合 蛋白接觸，該GPCR㉔合蛋白包括内生性、持續活化的 CXCR3以及G蛋白；以及（b)測定受體機能是否被調節， 其中受體機能上的改變指示該候選化合物為該内生性、持 續活化的CXCR3的促效劑、反向促效劑、部分促效劑或 拮抗劑。 在一些態樣中，本發明係針對調節靈長類（包括，但不 限於，人類以及非人類靈長類）以及其他動物（包括，但不 限於，狗、貓、鼠、大型鼠、馬、羊、豬以及牛）之生理 作用之方法。該方法包括下述步驟：（a)令内生性CXCR3 進行持續受體活化以產生非内生性持續活化CXCR3 ; (b) 使非内生性候選化合物與該非内生性持續活化CXCR3接 觸，以及（c)藉由測量該經接觸之化合物所誘導之細胞内信 號與不存在該經接觸之化合物下之細胞内信號之差異，以 鑑定該非内生性候選化合物係屬該非内生性持續活化 CXCR3之促效劑、反向促效劑、部分促效劑或拮抗劑； 以及（d)使該哺乳動物與該反向促效劑或促效劑接觸，藉以 調節該生理作用。 在其他態樣中，本發明係針對包括非内生性持續活化的 G蛋白-偶聯受體（GPCR)。在一些具體實施例中，該G蛋 白-偶聯受體具有序列識別號：6的胺基酸序列。在一些具 體實施例中，該G蛋白-偶聯受體由序列識別號：5的核苷 酸序列編碼。 I03483-960706.doc -14· 1338046 【實施方式】 討論受體之科學上文獻採用許多術語稱謂對於受體具有 各種功效之配體。為了明確性以及一致性，於此篇專利文 件中採用下述定義。當這些定義與其他針對這些術語的定 義有牴觸時，以下述定義為準： 促效劑（AGONISTS )意指與受體結合時可活化細胞内 反應，或者可提高GTP與膜之結合之物質（例如：配體、候 選化合物）。在一些具體實施例中，該促效劑係先前不知 當其與受體結合時可活化細胞内反應或提高GTP與膜之結 合之物質。 異位調節劑（ALLOSTERIC MODULATORS)意指會影 響受體的官能活化，但並不阻止内生性配體與受體結合之 物質（例如：配體 '候選化合物）。異位調節劑包括反向 促效劑、部分促效劑以及促效劑。 本文中所用之胺基酸縮寫列於表A:

丙胺酸（ALANINE) ALA A 精胺酸（ARGININE) ARG R 天冬醯胺酸 (ASPARAGINE) ASN N 天冬胺酸（ASPARTIC ACID) ASP D 半胱胺酸 (CYSTEINE) CYS C 麩胺酸（GLUTAMIC ACID ) GLU E 麩醯胺酸 GLN Q 103483-960706.doc 15

(GLUTAMINE) 甘胺酸（GLYCINE) GLY G 組胺酸（HISTIDINE) HIS H 異白胺酸 (ISOLEUCINE) ILE I 白胺酸（LEUCINE) LEU L 離胺酸（LYSINE) LYS K 甲硫胺酸 (METHIONINE) MET M 苯丙胺酸 PHE F (PHENYLALANINE) 脯胺酸（PROLINE) PRO P 絲胺酸（SERINE) SER S 酥胺酸 THR T (THREONINE) 色胺酸 TRP W (TRYPTOPHAN) 酪胺酸（TYROSINE) TYR Y 缬胺酸（VALINE) VAL V 1338046 拮抗劑（ANTAGONIST)意指會在與促效劑相同之部位 競爭性地與受體結合，但不會活化受體的活化形式所引發 之細胞内反應，而藉此抑制促效劑所引發之細胞内反應之 物質（例如：配體、候選化合物）。拮抗劑 (ANTAGONIST)在缺少促效劑下，不會減少細胞内反應 的基礎值。在一些具體實施例中，拮抗劑 (ANTAGONIST)係先前不知當其與受體結合時可活化細 胞内反應或提高GTP與膜之結合之物質。 候選化合物（CANDIDATE COMPOUND)意指可以通過 103483*.960706.doc • 16· 1338046 篩檢之分子（例如，但不限於，化合物）。片語「候選化合 物」較佳不包括選自先前藉由間接鑑定法決定之受體的反 向促效劑、促效劑或拮抗劑所組成族群之公知化合物；更 佳不包括先前已測知對於至少一種哺乳動物具有治療效果 之經間接鑑定之化合物；以及最好不包括先前已測知對於 人類具有治療用途之經間接鑑定之化合物。 組合物（COMPOSITION )意指包括至少一種成分之物 質；“醫藥組合物”為該組合物的一例。 化合物效力（COMPOUND EFFICACY)意指化合物抑 制或刺激受體機能之能力之測量值，即活化/抑制信號轉 導路徑的能力，而非指受體結合親和力。偵測化合物效力 的方法範例揭示在本專利文件的實施例中》 密碼（CODON )意指三個核苷酸（或核苷酸同等物） 所組成之單位，該核苷酸通常包括與磷酸基偶聯之核苷 (腺苷（A)、鳥苷（G)、胞苷（C)、尿苷（U)以及胸苷 (T ))，該密碼被轉譯時編碼一胺基酸。 持續活化受體(CONSTITUTIVELY ACTIVATED RECEPTOR)意指已接受持續受體活化之受體。持續活化 受體可為内生性或非内生性。 持續受體活化（CONSTITUTIVE RECEPTOR ACTIVATION)意指藉由使受體與其配體或其配體之化學 同等物結合以外之方法使活性狀態之受體安定化。 接觸（CONTACT or CONTACTING)意指不論於體外系 統或體内系統使至少兩部分在一起。 103483-960706.doc •17· 1338046 減少（DECREASE )係指可測量的數量減低，其與“減 低（reduce 減小（diminish )，，、 “ 降低 (lower)、” “使減小（lessen) ” 同義。 直接鑑定（DIRECTLY IDENTIFYING or DIRECTLY IDENTIFIED )用於描述“候選化合物（candidate compound ) ”時，意指筛檢候選化合物對於一持續活化受 體（以經持續活化之孤兒受體為較佳，以經持續活化之G 蛋白-偶聯細胞表面孤兒受體為最佳）之作用，以及評估此 鲁 化合物的效力。該術語，無論如何都不應被解釋成或被認 為含於或包含術語間接鑑定（indirectly identifying or indirectly identified) 。 内生性（ENDOGENOUS)意指哺乳動物天然生產之物 質。舉例言之，内生性ENDOGENOUS )用於形容術語 受體時，意指受體由哺乳動物（例如，但不限於，人 類）或病毒所天然產生。相對照地，術語非内生性（N〇N_ φ ENDOGENOUS))在本文中意指非由哺乳動物（例如，但 不限於，人類）或病毒所天然產生者。舉例言之，在本文 中，内生性形式非為持續活化，但經處理後變成持續活化 之受體最宜被稱為“非内生性持續活化受體”。此二術語 皆可被用於描述“體内（in viv0 ) ’，以及“體外（in vitro )系統。舉例言之’在一篩檢方法中，該内生性或 非内生性受體皆可用於體外系統之描述。另一非限定性例 子中’在哺乳動物的基因組（gen〇me)經處理後包括非内生 性持續活化受體之情況，可藉由活體内系統的方法來篩檢 103483-960706.doc -18· 1338046 候選化合物。 表現載體（EXPRESSION VECTOR)意指包含編碼一種 或多種期望多肽之核酸序列之分子，該分子包括與調節單 元可操控地連結之起始及終止訊號，該調節單元包括啟動 子以及能指引表現之多腺苷酸化訊號。 G蛋白-偶聯受體融合蛋白及GPRC融合蛋白在本文所揭 示之發明内容中，各表示與至少一個G蛋白（以該G蛋白之 α次單位為最佳，該α次單位為與GTP結合之次單位）融合 之内生性、持續活化之GPCR或非内生性、持續活化 GPCR，其中該G蛋白較佳與内生性孤兒GPCR所天然偶聯 之G蛋白屬於相同類型。舉例言之（但非限制），在内生性 狀態，假設該G蛋白“Gsa”是與該GPCR偶聯的主要G蛋 白，則基於該特殊GPCR之GPCR融合蛋白，將為包括與Gs α融合之GPCR之非内生性蛋白質；在某些情況下，如下 述，非主要G蛋白可與該GPCR融合。該G蛋白可以被直接 地融合至組合性活化GPCR的C-終端，或二者之間可有間 隔基。 宿主細胞（HOST CELL)將意指能夠納入質體及/或載 體之細胞。在原核宿主細胞之情況，當宿主細胞複製時， 質體典型以自律（autonomous)分子之方式複製（通常，隨 後該質體被單離，以被引進真核宿主細胞中）；在真核宿 主細胞之情況，質體被整合入該宿主細胞的細胞DNA中， 以致於當該真核宿主細胞複製時，該質體亦隨之複製。在 一些具體實施例中，宿主細跑為真核細胞，以哺乳動物細 103483-960706.doc -19- 1338046 胞為較佳，以選自293細胞、23 9T細胞以及COS-7細胞為 最佳。 間接鑑定（INDIRECTLY IDENTIFYING or INDIRECTLY IDENTIFIED )意指藥物發現過程之傳統途 徑，其包含鑑定出對於内生性受體具特異性之内生性配 體；藉由測定候選化合物中何者會干擾配體-受體的交互 作用及/或與配體競爭和受體的結合而篩檢出對抗該受體 之候選化合物；評估該化合物影響至少一種與該活化受體 相關的第二傳信路徑之效力。 抑制（INHIBIT or INHIBITING )用於描述「反應」 時，意指於存在化合物下，與不存在該化合物時相較，反 應減少或被阻止。 反向促效劑（INVERSE AGONISTS)意指可與受體的内 生性形式及受體的持續活化形式之任一者結合，而抑制該 受體活化形式所發動的基本細胞内反應，致使其低於不存 在促效劑時所觀察到活性之正常基礎值，或者可減少GTP 與膜之結合之物質（例如配體、候選化合物）。當反向促效 劑存在時，與該反向促效劑不存在時的基本反應相比，較 佳抑制基本細胞内反應至少30% 、至少50% 、至少60% 、 至少70% 、至少75% 、至少80% 、至少85% 、至少90% 、 至少92% 、至少94% 、至少95% 、至少96% 、至少97% 、 至少98% ;最佳抑制至少99% 。 細胞内信號（INTRACELLULAR SIGNAL)意指由受體 轉導之可偵測信號。細胞内信號的例子為熟習本技術者所 103483-960706.doc -20- 1338046 熟知。細胞内信號可為内生性，例如内生性分子 (包括’但不限於第二傳信者）；或非内生性，例如非^ 性細胞内信號(包括，但不限於，經遺傳工程製 號，即卜半乳糖芽酶、GUS、榮光素酶。偵測細胞内; 唬的分析為熟習本技術者所已知’其包括GTp 口分析。

。着分析；™分析半乳糖㈣分析、勞光辛酶 分析，編分析；AP1分析；ΙΡ3分析以及腺苦酸環化酶 分析。在-些具體實施例中’術肖「細胞内作號 (INTRACELLULAR signal ),與「報信子信號 (reporter signal )」同義。 分離（ISOLATED)意指物質從其原本環境（例如，若 物質係自然地產生，則原本環境指自然環境）移出。舉例 來說，存在於活動物體之自然產生之聚核苷酸或多肽為 「未分離」，但該相同聚核苷酸或DNA或多肽與自然系統 中共存之物質之一部分或全部分開時則謂之「分 。= 」〇該

聚核苷酸可以為載體之一部分及/或該聚核苷酸或多狀可 以為組合物的一部分’當該載體或組合物非為其自然環产 的一部分時，上述「分離」仍然適用。 已知受體（KNOWN RECEPTOR)意指受體之特異性内 生性配體已被鑑定出的受體。 配體（LIGAND )意指對於自然產生的受體具有特異性 的分子。 · 在本文中，術語調節（MODULATE )」或修改 (MODIFY )意指一特定活性、功能或分子的數量、品質 103483-960706.doc • 21· 1338046 或效果增加或減少。 突變種（MUTANT)或突變（MUTATION)用於描述内 生性受體的核酸和/或胺基酸序列時，意指此等内生性序 列發生單種或複數種特定的變化，以致内生性非持續活化 受體的突變形式顯示受體經持續活化。關於特定序列之同 等物’若符合下述條件（a)及（b)，則人類受體的接續突 變形式被視為與人類受體的最初突變同等：（a)人類受體 接續犬·變形式的持續活化程度與受體的最初突變所呈現之 持續活化程度實質相同；（b)受體的接續突變形式與受體 的最初突變間之序列（胺基酸及/或核酸）類似性百分率為至 少80% 、至少85% 、至少90% 、至少92% 、至少94% 、至 少95% 、至少96% 、至少97% 、至少98% ，最佳至少99 % 。在一些具體實施例，由於本文所揭示之達成持續活化 之一些較佳基因盒（cassette)包括在GPCR的内生性形式以 及非内生形式間單一胺基酸及/或密碼的改變，因此序列 類似性百分率應至少98% 。 非孤兒受體（NON-ORPHAN RECEPTOR)意指對於鑑 定出之配體有特異性之天然產内生性分子，其中配體與該 受體之結合可活化細胞内傳信路徑。 孤兒受體（ORPHAN RECEPTOR )意指對受體有特異性 之配體尚未鑑定出或尚不知之内生性受體。 部分促效劑（PARTIAL AGONISTS)意指當與受體結合 時，會以低於促效劑之程度活化細胞内反應，或者以低於 促效劑之程度增強GTP與膜之結合之物質（例如配體、候 103483-960706.doc -22- 1338046 選化合物）。較佳地，該部分促效劑所引起之細胞内反應 為促效劑所產生之基本反應之至少95% 、至少80% 、至少 70% 、至少60% 、至少65% 、至少50% 、至少45% 、至少 40% 、至少38% 、至少35% 、至少34% 、至少33% 、至少 32% 、至少31% ，最佳至少30% 。 醫藥組合物（PHARMACEUTICAL COMPOSITION)意 指包括至少一活性成份之组合物，藉以該組合物可經受於 哺乳動物體内（例如，但不限於，人類）内對於特定成效 之研究。本技術領域具有一般技術之人士當瞭解以及體認 適於測定活性成分是否具有期望成效之技術視本技術人士 之需要而決定。 質體（PLASMID )意指載體與cDNA的組合。一般來 說，將質體導入宿主細胞，以複製該cDNA及/或將該 cDNA以蛋白質的形式表現。 受體機能（RECRPTOR FUNCTIONALITY)意指受體接 收刺激及調整細胞回應之正常運作，其包括，但不限於， 調節基因轉錄、調節離子的流入或流出、施行催化反應及 /或經由G蛋白調節活性。受體機能（RECRPTOR FUNCTIONALITY )可由熟習本技術人士測量細胞内信 號、離子的流出或流入、基因轉錄以及催化反應的效果 (但不限於此等）而輕易測知。 第二傳信者（SECOND MESSENGER)意指由於受體活 化，產生之細胞内反應。第二傳信者可以包括，例如，肌 醇三磷酯（IP3 )、雙醯甘油（DAG )、環狀AMP ( cAMP ) 103483-960706.doc ·23· 1338046 以及環狀GMP ( cGMP )。可以量測第二傳信者反應以決定 受體活化度。另外，可以量測第二傳信者反應，以直接鑑 义候選化合物（包括’例如，反向促效劑、部分促效劑、 促效劑以及拮抗劑）。 信號：雜信比（SIGNAL TO NOISE RATIO )將意指回 應活化、擴增或刺激所產生之信號，其中該信號大於背景 雜信（即未活化、未擴增或未刺激時之基礎位準）。在一 些較佳具體實施例，該信號高於背景雜信或基礎位準至少 10% ’較佳地至少20% 、更佳地至少30% 、更佳地至少4〇 % 、更佳地至少50% 、更佳地至少60% 、更佳地至少7〇 % 、更佳地至少80% 、更佳地至少90% ，最佳地至少1〇〇 % ，在背景訊號或基本水準之上。 間ftw基（S PACER )意指位在基因（例如，本文論及之 GPCR)的最後密碼子或最後胺基酸之後，且位在本文論及 之G蛋白的起始密碼子或起始區域之前之多個被轉譯的胺 基酸，其中該多個被轉譯的胺基酸位於G蛋白的起始區域 之讀框。被轉譯胺基酸之數目可根據精於本技術人士的需 要而設定’通常為一個胺基酸、較佳地兩個胺基酸、更佳 地三個胺基酸、更佳地四個胺基酸、更佳地五個胺基酸、 更佳地六個胺基酸、更佳地七個胺基酸、更佳地八個胺基 酸、更佳地九個胺基酸、更佳地十個胺基酸、更佳地十一 個胺基酸，最佳十二個胺基酸。 刺激（STIMULATE or STIMULATING)用於描述「反 應（response)」時，意指當化合物存在時，與該化合物不 103483-960706.doc -24· 1338046 存在時相較，反應增加。 令内生性GPCR進行持續受體活化（SUBJECTING AN ENDOGENOUS GPCR TO CONSTITUTIVE RECEPTOR ACTIVATION )係指經由該步驟將GPCR持續活化。 受試者（SUBJECT )意指靈長類（包括，但不限於，人 類以及非人類靈長類）；以及其他哺乳動物（包括，但不限 於，狗、貓、老鼠、鼠類、馬、羊、豬以及牛）。 實質上相似（SUBSTANTIALLY SIMILAR)意指結果為 對照組結果的40%之内、較佳地在35%之内、更佳地在30 %之内、更佳地在25%之内、更佳地在20%之内、更佳地 在15%之内、更佳地在10%之内、更佳地在5%之内、更 佳地在2%之内，最佳地在對照組之結果的1%之内。舉例 來說，就該受體機能而言，若用本文所教示之方法或精於 本技術人士已知之相似方法測得之經轉導之信號在對照組 所產生信號之40%以内，則謂受試受體顯示與對照受體實 質上相似之結果。 載體（VECTOR )用於描述cDNA時，意指能夠納入至 少一種cDNA，同時能夠被納入宿主細胞之環形DNA » 隨後段落的次序係就說明效度之觀點而配置，非意欲， 亦不應視作，為下述申請專利範圍設限。 總論 A. CXCR3受體的背景資料 趨化激素構成一群小型細胞激素，其在發炎的狀態下造 成且調節白血球聚集（Baggiolini，Μ等人提出，“介白素- 103483-960706.doc -25· 1338046 8及其相關趨化細胞激素—CXC以及CC趨化激素” ，Adv. Immunol. 55 : 97-179 ( 1994) ; Springer, Τ·Α提出“在内皮 上淋巴球再循環以及白血球移行之傳輸信號” Anmi. Rev.

Physiol，57 : 827-872 ( 1995 );以及Schall, T.J等人與 K.B.

Bacon提出，“趨化激素、白血球運輸以及炎症” 〇pin

Immunol.6 : 865-873 ( 1994 ))。趨化激素能選擇性地誘導 血液之形成要素（除了紅血球）之趨化性，此等血液之形 成要素包括白血球（例如嗜中性白血球）、單核球、巨嗟細 胞、嗜伊紅性細胞、嗜驗性細胞、肥大細胞、以及淋巴球 (例如T細胞以及B細胞）。趨化激素除了刺激趨化性之外， 可以選擇性地誘導其他變化，包括改變細胞形狀、細胞内 游離鈣離子（Ca2+ )的濃度暫時性上升、微粒外釋作用 (granule exocytosis)、整合素調升、生物活性脂質（例 如.白二稀素）以及呼吸爆發（respiratory burst)，此等與 白血球活化有關。因此，趨化激素係發炎反應之早期發動 劑’其引起發炎媒介物之釋放，而使得白血_球等趨化及外 滲至感染以及發炎的部位。 趨化激素經由屬於7個跨膜G蛋白-偶聯受體組成的超家 族（Murphy，P.M提出“白血球趨化性受體的分子生物 學” Annu. Rev. Immunol.，12 ： 593-633 ( 1994) ； Gerard C. and N.P, Gerard ‘‘白血球的7個前發炎性跨膜片段受 體” )Curr. Opin. Immunol., 6 ： 140-145 ( 1994 ))中之受 體而發揮作用。 此等受體中之兩個受體，即介白素-8 ( IL-8 )受體IL- 103483-960706.doc -26- 1338046 8R1 (第I型介白素受體；Holmes，W.E.等人提出，“人類 介白素-8受體的結構以及功能表現”8(^1^6，253:1278- 1280 ( 1991 ))與 IL-8R2 (第 I型介白素-8 受體；Murphy, P.M.與H.L· Tiffany提出，“編碼功能性人類介白素_8受體之 互補性DNA的選殖” Science，253 : 1280-1283 ( 1991 ))深 受嗜中性白血球限制且能識別Glu_Leu_Arg ( ELR )模體 (motif)之ΝΗπ終端’其為誘導嗜中性白血球趨化性之 CXC趨化激素所必須的結合表位（epit〇pe) ( ciark-Lewis, I. 等人’ “利用化學合成類似物測定介白素_8的結構-活性關 係。NHr終端殘基的重要角色以及與嗜中性白血球趨化 性、細胞外吐作用以及受體結合活性無關之證據” j, Biol.

Chem·’ 266 : 23128-12134 ( 1991 ); Hebert, C.A.等人·， ‘‘掃介白素-8之描式致突變鑑定出受體結合所必需之一群 殘基 ” J· Biol. Chem·，266 : 18989-18994 ( 1991 );以及

Clark-Lewis，I·等人，“血小板因子4當其N終端以Glu· Leu-Arg修飾時，可結合至介白素8受體且活化嗜中性白血 球 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 ： 3574-3577 (1993 )) »已提出五個不同的CC趨化激素受體，其被稱 作 CC-CKRl，-2，-3，-4 與-5 ( CC-CKR、CC趨化激素受體；

Neote’ Κ·等人’ “ CC趨化激素受體的分子選殖、機能 表現與傳信特徵” Cell, 72 : 415-425 ( 1993 ) ; Gao，J.-L. 等人’人類巨嗟細胞炎性蛋白質1. alpha/RANTES受體 之結構及機能表現，，）J. Exp. Med” 177: 1421-1427 (1993 ) ’ Char〇5 i.f.等人“二單核球趨化性蛋白質1受體 103483-960706.doc • 27· 1338046 之分子選殖及機能表現顯示羧基終端尾部之另一種拼接’， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 ： 2752-2756 ( 1994 )； Myers, S.J 等人提出，Biol. Chem.,270 ： 5786-5792 (1995 ) ; Combadiere，C等人提出“人類嗜伊紅性細胞cc 趨化激素受體的選殖與機能表現” j. Biol. Chem.，270 (27 ) : 16491-16494 ( 1995 );與 Correction，j. Bi〇1. Chem.，270 : 3023 5 ( 1995 ) ; Ponath，P.D.等人提出“在伊 紅性細胞上選擇性表現之人類趨化因子（e〇taxjn )受體的 分子選殖及特徵鑑定” J. Exp. MED.，183 : 2437-2448 (1996 );以及Daugherty，B.L.等人提出“人類嗜伊紅性細 胞趨化因子受體的選殖、表現以及特徵鑑定，’ j. Εχρ.

Med” 183 : 2349-2354 ( 1996 ); Power, C.Α·等人 1995, “來自人類嗜鹼性細胞株之新穎CC趨化激素受體cDNA的 分子選殖與機能表現” j. Bi〇l. Chem.，270: 19495-19500 (1995 ) ; Hoogewerf，AJ 等人提出，“鼠 cc CKR-4 之分 子選瘦以及趨化激素與鼠及人類CC CKR-4的高親和性結 合 Blochem. Biophys. Res. Commun ·, 218 : 337-343 ( 1996 ); Samson, M等人提出“新穎人類CC-趨化激素受 體基因的分子選殖以及機能表現” Bi〇chemistry，35 : 33 62-3367 ( 1996 ))。CC趨化激素受體存在於數種類塑的 白血球（包括單核球、顆粒球與淋巴球），且可識別cc趨化 激素’但無法識別CXC趨化激素》 藉由定點突變法（但非限於此法）可以獲得CXCR3的續活 化非内生彳生型。可用於直接鑑定候選化合物的持續活化受 103483-960706.doc -28- 1338046 體最佳藉由，例如，在跨膜三（TM3)區域中之特定位置使· 受體大變而達成。该突變可以產生經持續活化之非内生性 受體，此可由父體之機能活性增加（例如，第二傳信者之 活化度上升）而證實。 如下文更洋細的說明及揭示所示，利用突變方法修飾 CXCR3之内生性序列導致此受體的持續活化型之生成。此 CXCR3的非内生性持續活化型尤其可被用於篩檢候選化合 物’以直接地鏗定出能調節過程及活性（包括’但不限 於，白血球運輸、免疫監督、先天性及後天性免疫反應以 及各種形式的病理發炎）之化合物。此等病理過程尤其可 經由令内生性CXCR3進行持續受體活化，產生非内生性持 續活化CXCR3 ;以及使該非内生性持續活化cxcR3與受體 之非内生性促效劑、反向促效劑、部分促效劑或拮抗劑接 觸而進一步調節；或在其他具體實施例中，藉由使内生性 CXCR3進行持續受體活化，產生非内生性持續活化之 CXCR3，藉以調節該病理過程。 B. 受體的篩檢 依據對於本文所揭示之GPCR的非内生性持續活化型之 作用篩檢候選化合物，可以直接鑑定出作用於細胞表面受 體之候選化合物，而不需要使用該受體的内生性配體。此 專利文件揭示創建CXCR3的非内生性持續活化型之突變方 法。利用該揭示之技術’熟習本技術人士當能創建用於本 文所揭示之用途以及其他用途之CXCR3之持續活化型。 c· 疾病/失調的鑑定及/或選擇 103483-960706.doc •29- 1338046 如下文更詳細的說明及揭示所示，最佳地，該非内生性 持續活化GPCR之呈小分子化學化合物形式之反向促效 劑、部分促效劑以及促效劑，可以藉由本發明的方法鑑 定。此等化合物在治療特定受體相關性疾病或失調之藥物 之開發計畫中，係作為前導調節劑的理想候選者。在不使 用受體的内生性配體下，直接鑑定此等作用sgpcr之化 合物之能力，使得醫藥組合物得以開發。 較佳地，在不清楚疾病或失調是否與受體相關之情況； 該GPCR的DNA序列被用於製作下列者之探針：（a)對組 織-mRNA之點潰分析，及/或（b)在組織樣本中受體表現的 RT-PCR鑑定。較佳地，可利用在組織來源或患病組織中 受體的存在，或者受體在患病組織中之濃度相較於在正常 組織之濃度呈現升高，鑑定出疾病與該疾病之治療給藥法 之相關性。藉著此技術可同樣良好地將受體定位。依據受 體所定位之特定組織的已知功能，可以推斷該受體在機能 上的可能角色。 D.候選化合物的篩檢 1.GPCR的通用篩檢分析技術 當G蛋白受體變成持續活化時，其與G蛋白（例如、 Gs、Gi、Gz、G。）結合以及刺激GTp與G蛋白之結合該〇 蛋白之作用如同GTPase，其在正常情況下慢慢地將GTp水 解成GDP，且變得失去活性。然而，持續活化受體持續使 GDP變成GTP。可以使用GTP的非水解性類似物，〔35S〕 GTP γ S，來監測GTP與表現持續活化受體之膜之結合增 103483-960706.doc -30· 1338046第〇931〇7222號專利申請案9? 中文說明書替換頁(97年5月） 加。據報導該〔35s〕gta ,… 2 月 正充h 修補ί - 1 監測存在或缺乏配 體下G蛋白與膜之偶聯。在熟習本技術者已知之監測例子 中，該監測之一例於1995年由Traynor與Nahorski報導。此 分析系統較佳運用於候選化合物的初步篩檢，因為該系統 一般適用所有G蛋白-偶聯受體，不論該特定Q蛋白是否與 受體之細胞内結構域（domain)交互作用。 2.特異性GPCR篩檢分析技術 一旦候選化合物用該「通用」G蛋白偶聯-受體分析（即 挑選為促效劑、部分促效劑、或反向促效劑的化合物）鑑 定出後，較佳進行進一步篩檢，以確認該化合物在該受體 部位有交互作用。舉例言之，該「通用」分析法所鑑定出 之化合物可能不會與該受體結合，而可能只是自該細胞内 結構域使G蛋白「脫去偶聯（unc〇uple)」。 a. Gs ' G2^Gi

Gs刺激酵素腺苦酸環化酶。另一方面，Gj (以及Gz與 〇。）抑制該酵素。腺苷酸環化酶促使Ατρ轉換成cAMp ; 因此/、Gs蛋白偶聯的持績活化GPCRs和cAMP的細胞内 ;農度增加有關。另一方面，與& (或Gz、G〇)S白偶聯的 持續活化GPCRs和cAMP的細胞内濃度降低有關。一般， 大觸傳遞的間接機制”第八章，From Neuron Τη Rram (广 Ed. ) Nich〇ls，J.G 等人著作，Sinauer ASS〇CiateS’ Inc.出版（1992 )。因此，該谓測cAMP之分析 可以用於測义候選化合物是否為該受體的反向促效劑（亦 即°亥化合物會降低cAMP的濃度）。可以利用本技術已知 103483-970502.doc •31 · 1338046 之許多量測cAMP的方法，最佳的方法係仰賴使用抗_ cAMP抗體之酵素免疫分析法（elisa)。另一型可以使用的 分析為第二傳信者受體系統分析。基因上之啟動子驅動由 特定基因所編碼之蛋白質的表現。環形AMP，藉由促進 cAMP-反應性〇财_結合蛋白質或轉錄因子（cr剛與稱 為cAMP反應性單元之特定部位上之啟動子結合而驅動該 基因的表現。可以建構報信子系統（rep〇rter system)，其在 報信子（例如，半乳糖苷酶或螢光素酶）基因之前方具有 含多個cAMP反應性單元之啟動子。因此，持續活化Gs連 結丈體造成cAMP的蓄積，cAMP接著活化報信子基因以及 使該報信蛋白質表現。接著可用標準生化分析（Chen等 人_ 1995 )偵測该報信蛋白質，例如召_半乳糖苷酶或螢光 素酶。 b. G0與 Gq G。與Gq與酵素4脂酶c之活化有關，該酵素磷脂酶c最 φ 終會水解磷脂質PII>2，釋出兩個細胞内傳信者：二醯基甘 油（DAG)以及肌醇-1，4,5-三磷酸酯（1?3)。IPs的蓄積增加 與Gq-以及G。-締合受體之活化有關。一般來說，參見“突 觸傳遞的間接機制”第八箄，From Neuron Rv (/γΛ

Ed.) Nichols，J.G# 人著作，Sinauer Associates, Inc.出版 (1992 )。偵測IP;蓄積之分析可用於測定候選化合物是否 為Gq-以及G。-締合受體的，例如，反向促效劑（即該化合 物會降低IPs的濃度）。Gq-締合受體亦可以用Ap丨報信子分 析檢測’其中Gq-依存性磷脂酶C引起含API單元的基因的 -32- 103483-960706.doc 1338046 活化；因此，活化Gq-締合受體將顯示此基因的表現增 加，故而其之反向促效劑將顯示此表現下降，同時促效劑 將顯示此表現增加。市面上可以獲得用於該偵測的分析套 組。 3. 基於配體的確認分析 利用上述技術（或同等技術）直接鑑定出的候選化合物 最佳利用基於配體的確認分析（例如於本說明書實施例7之 試驗計劃所述者）加以證明。此處的重點為候選化合物被 直接鑑定；之後使用内生性配體進行的確認僅是用來證實 該直接鐘定出之候選化合物以該受體作為目標。 4. GPCR融合蛋白 非内生性持續活化GPCR用於候選化合物的篩檢以直接 鑑定反向促效劑、促效劑以及部分促效劑的用途，提供一 有趣的篩檢挑戰，亦即根據定義，該受體甚至在内生性配 體未與其結合下仍具有活性。因此，為了區別，例如，該 非内生性受體於候選化合物存在時以及該非内生性受體於 候選化合物缺乏時之差異，以了解此化合物是否為該受體 之反向促效劑、促效劑、部分促效劑、或對於該受體沒有 任何影響，較佳使用能增強此區分能力之方法。—較好的 方法為使用G P C R融合蛋白。 一般來說，一旦用上述分析技術（以及其他技術）測出 非内生性GPCR已被組成性活化，即可能測定與内生性 GPCR偶聯的主要G蛋白。G蛋白與GPCR的偶聯提供一可 以評價之傳信路徑。最好使用哺乳動物表現系統來執行篩 103483-960706.doc -33· 檢因為預期此系統中具有内生性G蛋白質。因此在此 系統中，兮 j g rin j_ 1 。 Λ 生性持續活化GPCR顯然持續地發出訊 戒。就這一 典 ”而έ ’較佳增強該信號，以致例如於存在該 又體的反向促效劑時，尤其是在篩檢之情況，當受體與反 向促效劑接觸時’可以更輕易地區別出。 PCR— 口蛋白意圖增強G蛋白與非内生性GPCR的偶聯 效果。就使用非内生性持續活化GPCR進行筛檢而言，以 使用GPCR融合蛋白為較佳，因為此方法可增強篩檢技術 所最佳利用之信號。該法促使信號：雜信比增加頗為重 要，對於本文所揭示之候選化合物的篩檢而言以信號： 雜信比增加為較佳。 在此領域中這些具有原本技能的範圍_，一構成物的該 建構有益於一可用於表現GPCR融合蛋白的構築體的構築 係在本技術領域具有普通技術人士的能力範圍内。商業上 可取得的表現載體及系統提供可符合研究者特殊需求的各 種管道。對於GPCR融合蛋白構築體而言，重要基準即是 内生性GPCR序列以及G蛋白序列兩者皆在讀框中（in_ frame )(較佳地，内生性GPCR的序列在該G蛋白序列的上 游）’以及GPCR的“停止”密碼子被刪除或取代，以致 GPCR表現時，G蛋白亦被表現^ GPCR可以直接地與G蛋 白連結’或在該兩者之間存在間隔殘基（較佳地，不超過 !2’惟此數目可由此領域中具有普通技術之人士輕易決 定）。以使用間隔基為較佳（基於便利性））；一些未被利用 到之限制部位（restrction site，即限制酶内切部位），於表 103483-960706.doc -34· 1338046 現時變成間隔基。最佳地，在該GPCR融合蛋白構築體.建 立之前先鑑定出與非内生性GPCR偶聯之G蛋白。因為僅有 少許G蛋白被鑑定出，因此以包括可供插入内生性gpcr序 列之G蛋白序列之構築體（即通用G蛋白構築體）為較 佳；此在大量篩檢具有不同序列的各種相異内生性GPCRs 上具有效率。 E.目標Gi-偶聯GPCR與信號增強子Gs-偶聯GPCR (基 於cAMP之分析）之共轉染 已知Gi-偶聯受體抑制腺苷酸環化酶，因此降低cAMP產 量’其可用於評估cAMP產量激發。量測cAMP的生產減少 以作為活化時主要與G i偶聯之受體之持續活化之指標之有 效技術，係藉由使信號增強子（例如，活化時主要與與Gs (例如，TSHR-A623I，揭示於下）偶聯之非内生性持續 活化受體）與連結有Gi之GPCR共轉染而達成《顯而易知 Gs-偶聯受體的持續活化可依據cAMP的產量增加而測定。 Gi-偶聯受體的持續活化導致cAMP生產降低。因此，該共 轉染的方法意圖善用這些“相反的，，影響。舉例來說，非 内生性持續活化Gs偶聯受體（「訊號增強子」）與内生性Gi 偶聯受體（「目標受體」）的共轉染提供cAMP信號基礎 值（即是，雖然該Gi-偶聯受體降低cAMP量，但該“降 低係在持續活化Gs-偶聯信號增強子所確立之camP實質 增加下之相對值）。之後’將信號增強子與目標受體之持 續活化型共轉染’由於Gi目標的機能活性（即降低cAmp 的能力）增強，因此可以預期cAMP將更進一步降低（相 103483-960706.doc •35· 1338046 對於該基礎值）。 可以利用基於c.的分析達成候選化合物的筛檢，惟 有下述二附帶條件：第—，相對於Gi_偶聯目標受體，需 有“相反”作，亦#，Gi_偶聯目標受體的反向促效劑 將增加測得之CAMP訊號，而Gi_偶聯目標受體的促效劑將 降低該信號；第二，顯而易夫。，利用此方法直接鑑定之候 選化合物應另行評估，以確保這些候選化合物非以信號增 強受體作為目#(此可以在對該被共轉染之受體進行候選 化合物之篩檢之前或之後進行）。 F·醫藥化學（Medicinal Chemistry) 一般來說，但非一成不變，候選化合物的直接鑑定較佳 與藉由組合化學技術所產生之化合物一起進行，藉以可以 製備成千上萬的化合物以供進行此分析。一般來說，此篩 檢的結果將集中於具有獨特核心結構的化合物；其後這 些化合物較佳於較佳的核心結構周圍施行額外的化學修 飾’以進一步增強醫藥性質。此技術為此領域人士所已 知，因此於此專利文件將不再詳細說明。 G.醫藥組合物（Pharmaceutical compositions ) 爲了進一步開發而選擇之候選化合物可藉由使用此技術 領域人士已知的技術調配成醫藥組合物。合適的醫藥上可 接受之載劑為此技術領域人士可以取得；例如，參見

Remington 的藥劑科學（pharmaceutical Sciences )，第 16 版’ 1980年’由Mack Publishing公司出版（Oslo等人出 版）。 103483-960706.doc -36- 1338046 Η.其他效用（Other Utility) 雖然，本文所揭示之已知CXCR3之非内生性型之較佳用 途係用於直接鑑定候選化合物係屬反向促效劑、促效劑、 部分促效劑或拮抗劑（較佳作為藥劑），已知CXCR3的此 型亦可用於研究。舉例來說，納入CXCRs之試管内及活體 内系統可用於進一步說明以及釐清這些受體在正常的與患 病人體内所扮演的角色，同時釐清該持續活化應用於傳信 串聯（signaling cascade)的角色。本技術領域人士，尤其在 閱讀本專利文件後，將顯而易知此等被揭示受體的其他用 途0 實例 列舉下列實例以供說明’但此等實例非爲本發明設限。 雖然本文揭示特定的核酸及胺基酸序列，但相信本技術領 域具有普通技術的人士能對此等序列進行小幅的修飾，同 時達成與下列所報告者相同或實質相似的結果。 實例1内生性GPCR : CXCR3之製備 如下述製造人類CXCR3的cDNA，且將其選殖入pCMV表 現載體：利用一純株（由Brian O’Dowd提供）作為模板以 及使用pfu聚合酶（Stratagene )進行pcr，其中使用製造 商提供之緩衝系統，並添加10% DMS0，引子（各ο υ μΜ) 以及4種核苷酸（各〇.5mM)。PCR條件為：94。〇 1分鐘；56 °C 1分鐘以及72°C2.5分鐘之循環25次。該5，1>(：11引子含有 EcoRI部位且具有下述序列： 103483-960706.doc -37- 1338046 ACGAATTCAGCCATGGTCCTTGAGGTGAGTGACCACCAA GTGCTAAAT-3’ （序列識別號：3) 以及3’引子含有BamHI部位且具有下述序列： 5，-GAGGATCCTGGAATGCGGGGAAGTCAG-3’ （序列 識別號：4 ) 該1.2kb PCR片段用EcoRI消化，將其選殖入pCMV表現 載體的EcoRI-Smal部位。其後測定及確認人類CXCR3的核 酸（序列識別號：1 )及胺基酸（序列識別號：2 )序列。 實例2 GPCR : CXCR3的非内生性型之製備 相信精於本技術領域之人士有能力挑選使核酸序列突變 的技術。該非内生性持續活化之人類CXCR3受體的製備藉 由創建N1 34S突變（關於核酸序列，參見序列識別號：5 ; 關於胺基酸序列，參見序列識別號：6 )而達成。使用轉 形器Site-Directed™致突變套組（Clontech)並根據製造者 的指南引起突變。所使用之二致突變引子具下述序列： 5,-CCCTCTTCAACATCAgCTTCTACGCAGGAGC-3, (序列識別號：7 ) 5，-GCTCCTGCGTAGAAGcTGATGTTGAAGAGGG-3’ (序列識別號：8 ) 將生成之1,2 kb PCR斷片用EcoRI消化及將此等斷片選 殖入pCMV表現載體的blunt-EcoRI部位。之後測定及確認 人類CXCR3的核酸（序列識別號：5 )及胺基酸（序列識 別號：6)序列。 CXCR3的内生性型及非内生性型兩者皆以雙標籤：5’- 103483-960706.doc -38 · 1338046 HA及3 ’-V5標識。 然後評估人類C X Γ R 3 + 貝的非内生型之組成活性。參見下 述之實例4。 實例3受體之表現 本技術領域中有各種細胞可供表現蛋白f，然而就本專 利文件的目的而言，以非洲爪蟾卵母細胞及哺乳動物細胞 為較佳。 1.暫時性轉染 利用心準δ式驗計劃評估CXCR3的内生性型以及非内生性 型在經暫時轉染之黑色素細胞中的機能表現。目前用於研 九的細胞類型為純株1 〇 ( c 10 n e 1 〇，〇 1 〇 )。這些細胞衍生 自人類石2_腎上腺素性表現型黑色素細胞株。特別挑選這 些細胞係由於其具有較似板形的外觀，且就色素移動的觀 點而言，其具有比母板樣細胞大的動態範圍。終究，分析 法之開發以及最適化取決於細胞類型，必須針對所用之每 個GPCR目標及細胞株進行評估。簡言之，利用肤蛋白酶 (0.7Χ )從燒瓶（T-185cm2燒瓶）採收細胞，同時藉由電 穿孔法轉染此等細胞。將細胞預接種於燒瓶中培養約3-4 小時，以除去死細胞及碎片。完成後，接著將燒瓶用胰蛋 白酶處理且接種至96孔經聚D-離胺基酸包覆之培養盤以供 分析。所有分析於轉染後48小時進行且評估持續Gs/Gq或 Gi偶聯。以使用各種濃度的單獨鮭魚精子（SS )或鯡魚精 子（HS )進行電穿孔而得到之模擬轉染細胞作為對照組。 此黑色素細胞之模擬轉染圖描繪出在黑色素細胞中，於缺 103483-960706.doc -39· 1338046 1 乏被表現之XCRC3受體下分散與聚集之動態範圍。第一圖 顯不經模擬轉染（HS)或經20pg的内生性及非内生性CXCR3 DNA轉染之黑色素細胞在轉染後〇小時及60小時後以CFM 所取得之照片。該細胞在照相前暴露在光線下將近一小 時。二組細胞在形態上有相似處。在缺乏ιρ_丨〇下，經模 擬轉染之細胞以及經内生性CXCR3 (野生型）轉染的細 胞’如預期，保留正常的分散色素表型，而當用非内生性 CXCR3 ( CART )轉染時此等細胞大體上聚集在一起。比 較於存在IP-1 〇下含有野生型的細胞以及含有Cart的細 胞’發現含有CART的細胞較多以聚集其色素來回應。 2.安定的細胞株 將約12x1 06個293細胞接種在15公分的組織培養盤。將 此4細胞在含10%牛胎血清及1%丙酿I酸納、1_麵酿胺酸 及抗生素之DME高濃度葡萄糖培養基中培養。接種29 3細 胞後24小時（或達80%會合）’用12 的DNA轉染該細 胞。將12 的DNA與60 μΐ的親脂胺（lipofectamine)以及2 毫升不含血清的DME高濃度葡萄糖培養基混合。該培養基 從該培養盤中抽出’以不含血清的培養基沖洗細胞1次。 將該DNA、親脂胺（lip〇fectamine)及培養基混合物，連同 10毫升不含血清的培養基，加入該培養盤中，之後在37。匚 之下培養4到5小時，抽出該培養以及加入25毫升含血清的 培養基。轉染後24小時，再次抽出培養基以及加入含血清 的新鮮培養基。轉染後48小時，抽出該培養基以及加入含 血清及最終濃度為500 gg/mL的慶大黴素（Geneticin，G418 103483-960706.doc -40- 1338046 藥品）的培養基。該等經轉染的細胞接受篩檢，以選出含 G418抗性基因之陽性轉染細胞。當篩檢選時，每4到5天更 換培養基。在篩選期間，培養細胞以產生安定的會合株或 分株以供選擇安定的純株。 實例4用於測定非内生性CXCR3之持續活性之分析 評估人類CXCR3之非内生性之持續活性有各種途徑。以 下所述為範例；相信此技術領域中具有普通技術之人士具 有決定這些技術中何者對其需求最能提供效益的能力。 1·膜結合分析：〔35S〕〇τργ8分析 當G蛋白·偶聯受體處於活化狀態（不是由配體結合造 成，就是由持續活化造成）時，該受體與〇蛋白偶聯，刺激 咖的釋出且隨後刺激GTp結合至該〇蛋白。該g蛋白的 心次單元與受體的複合體作用如同⑽咖，可慢慢地將 ϋ水解成GDP，此時該受體通常失活。持續活化受體則 =續=將GDP交換成GTp。可以使用⑽的非水解性類似

社人s〕οτργs ’ &證明gtp與表現持續活化受體之膜 ::二增加。利用〔35s〕gtpys結合來量測持續活化之優 近膜表面a)其可通用於所μ蛋白.偶聯受體（b)其接 此…丨’使之較不可能順帶影響該細胞内串聯之分子。 “關二Γ蛋白-偶聯受體刺激〔35s〕gtp爾至表現 體之膜之能力，，此分析可以被使用在直接 受知持續活化之G蛋白-偶聯孤兒 於所有G蛋白匕。物。此分析具通用性，可應用於開發作用 所有G蛋白-偶聯受體之藥物。 103483-960706.doc 1338046 將該〔35S〕GTPYS 在含 20mM HEPES、1 mM 至 20 mM 氣 化鎂（爲了使結果最佳化，可以調整此量，惟以2〇處為 較佳）、0.3 nM至口 nM〔、〕GTPr s (爲了使結果最 佳化，可以調整此量，惟以i.2 nM為較佳）、12 5叫至7 5 gg的膜蛋白（例如表現該Gs融合蛋白之293細胞；此量可 以凋整以使結果達最佳化）以及丨〇 GDp (此量可以調 整以使結果達最佳化）之結合用緩衝液（pH 74)中培養丨小 時。接著添加小麥胚芽凝集素珠粒（25 μ1 ; Amersham ) 且將該混合物在室溫下再培養3 〇分鐘，之後在室溫下將該 試管以1500xg之轉速離心5分鐘，接著以閃爍計數器計 數。 2_基於細胞的CAMP偵測分析 在下述分析中’使用96-孔腺苷酸環化酶活性化閃爍計 數盤（NEN : # SMP004A )。首先，將50 μΐ的分析用標 準液加至該培養盤中，一式兩份，於每孔加入在50 pmol 到0 pmol範圍的CAMP。用水重配成標準CAMP液（NEN : # SMP004A)，同時用 1XPBS ( Irvine Scientific# 9240)進 行系列稀釋。接著，在所有孔中加入50 // 1該刺激用緩衝 液（NEN : # SMP004A )。最終濃度在ΙμΜ到ImM之範 圍。在該分析中使用腺苷5，-三磷酸（ATP)(Research Biochemicals International: #A-141))及腺苷 5'-二磷酸 (ADP) ( Sigma ： # A2754 )在此分析中。接著，將該293 細胞用12pg(對於每一 150 mm組織培養盤）之個別cDNA (CMV或CXCR3 )轉染，以及於轉染後24小時採收。抽出 103483-960706.doc -42- 1338046 該培養基及以lxPBS清洗此等細胞1次。然後將5毫升的ιχ PBS，連同3毫升細胞溶離用緩衝液（8丨吕111&:#〇-1544 )’加入此等細胞。將該分離的細胞轉移到離心管中 並在室溫下離心5分鐘。接著將該上清液移除並此等該細 胞粒再次懸浮於適當量的1 xPBS中’使其最終濃度為每毫 升2x1 〇6個細胞。 在室溫下，將該盤在振盪器上培養15分鐘。製備包括追 蹤劑cAMP之债測用緩衝液。在11毫升的偵測用緩衝液 (NEN : # SMP004A )中，加入 50 μΐ (等於 1 pCi )的 〔125I〕cAMP ( NEN : # SMP004A )。培養後，在各孔中 加入50 ul包括追蹤劑cAMP之偵測用緩衝液。接著將該盤 放置在振盪器上，於室溫培養2小時。最後，將盤之各孔 中之溶液抽出，且用Wallac MicroBeta盤閱讀機 (FlashPlate)計數。 3·α 篩檢（Alpha Screen) 將得自上述實例3 ( 2 )之培養基抽出且以PBS ( 5_ 10ml/)清洗IX。接著將10-20 ml的PBS加入每一燒瓶且靜 置2-5分鐘。將該細胞以移液管移到離心管以1500rpm之轉 速旋轉5分鐘。抽出PBS且再次懸浮在刺激用緩衝液中 (1XHBSS、0.5mM IBMX、5mM Hepes 及 011% BSA)。用 2°/〇 DMSO稀釋Hepes緩衝液，以每孔1〇"1以及每孔15000 個細胞之方式加入細胞並培養30分鐘。在每孔中加入5 μΐ cAMP接受體珠粒溶液（perkin Elmer產品編號： 6760600R)並使其最終濃度成為15 μ§/ιηι。將此等孔加蓋 103483-960706.doc -43- 1338046 並將其置於室溫培養2小時。加入5 μΐ的分析反應混合物。 該分析反應混合物藉由混合供給體珠粒（Perkin Elmer產 品編號：6760600R)(最終濃度20 pg/ml)、生物素化cAMP 混合物（Perkin Elmer產品編號：6760600R)(最終濃度10 nM)及溶裂用緩衝液（5rnM Hepes及0.18% Igapel)而製 備。接著將此等孔加蓋且在室溫下培養2小時。培養後， 將孔在a Quest上讀數及量測吸光值。藉由cAMP濃度並使 用從 GraphPad Prism視窗 3_00版（GraphPad Software，San

Diego California USA公司提供）下載之線性迴歸函數，將 該吸光值轉換成pmol cAmp/孔。 4.用於分析Gi-偶聯目標GPCRs之基於細胞之CAMP分析 TSHR為一種Gs偶聯GPCR，其活化時會造成cAMP蓄 積。TSHR藉由使胺基酸殘基623突變（即，使丙胺酸殘基 改變成異白胺酸殘基）而被持續活化。預期Gi偶聯受體會 抑制腺苷酸環化酶，因此，降低cAMp產量，此使得cAMp

的》平估變得有刚景。量測cAMp的生產減少以作為Gi偶聯 丈體之持續活化之指標之有效技術，係藉由使作為信號增 強子之非内生性、持續活化TSHR (TSHRA623I)(或内生 性、持續活性Gs偶聯受體）與連結有Gi2GpCR共轉染以建 立cAMP之基礎丨農度而達成。—旦建立〜偶聯受體的非内 生性型後，將該目標GPCR的非内生性型與信號增強子共 轉染，所得之物質被用於進行篩檢。當使用cAMp分： 時’我們利用此方法來有效地產生信號；此方法較佳用於 直接鑑定作用於Gi.偶聯受體的㈣化合物。應注意就Gi 103483-960706.doc -44· 1338046 偶聯GPCR而言，當使用此方法時，目標GPCR的反向促效 劑將會增加cAMP信號，而促效劑將會降低該cAMP信號。 第一天，接種2 X 104個293細胞。第二天，準備兩個反 應試管（對於每一試管而言比例係遵循每盤之比例）：試 管A藉由將轉染入哺乳動物細胞之各受體之DNA 2 μ g，總 共4 pg的DNA (例如pCMV載體；具有經突變之THSR之 pCMV 載體（TSHR-A623I ) ; TSHR-A623I及 GPCR 等）混 入 1.2 毫 升不 含 血清之 DMEM ( Irvine Scientific,Irvine,CA )中而製備；試管B藉由將120 μΐ親脂 胺（lipofectamine) 混入1.2毫升不含血清之DMEN中而製 備。藉由倒置使試管A及試管B進行混合（數次），之後在 室溫下培養30-45分鐘。將該混合物稱為“轉染混合 物”。將接種之293細胞以1 X PBS清洗，之後加入10毫升 不含血清之DMEM。之後將2.4毫升的轉染混合物加入該細 胞，並在37°C /5%二氧化碳中培養4小時。藉由抽吸將該 轉染混合物移出，之後加入25毫升的DMEM/10%牛胎血 清。將細胞在37°C /5%二氧化碳中培養。在經過24小時的 培養後，採收該細胞並用於分析。

Flash Plate™腺皆酸環化酶套組 （New England Nuclear ; Cat.No.SMP004A )被設計用於基於細胞的分 析。不過，可視熟習本技術人士之需要，將該套組加以修 飾以與粗製漿膜合用。Flash Plate之孔包括閃爍塗層，該 閃爍塗層亦含有識別cAMP之特異性抗體。在孔中所產生 之cAMP藉由與放射性cAMP追蹤劑競爭和該cAMP抗體之 103483-960706.doc -45- 1338046 結合而直接測定。下文簡述在表現該受體之全細胞t量測 cAMP濃度變化的試驗計劃。 在暫時f生轉染後24小時採收經轉染之細胞。將培養基小 心地抽出且吾棄。將1〇毫升的pBS溫和地加人每碟細胞中 並小心地抽取。將丨毫升的σ細胞溶離用緩衝溶液及3毫升 的PBS加人各盤中。用移液管吸取盤中之細胞，並將該細 胞懸浮液收集在一50毫升的錐形離心管中。接著在室溫下 以1 OOOrpm離心該細胞5分鐘。該細胞粒小心地再次懸浮在 適當體積的PBS中（每盤約3毫升）。制金球計記數此等 細胞以及加入另外的PBS以得到適當數目的細胞（最終體 積為5 0 μ 1 /孔）。

根據該製造廠的指示製備及維持cAMP標準液及偵測用 緩衝液（包括1/zCi的追蹤劑〔i25IcAMp (5〇 ^)〕加至U 毫升的偵測緩衝液中）。用於篩檢的分析緩衝液必須新鮮 配製且含有50 μΐ的刺激用緩衝液，3 μ1的受試化合物（最 後分析濃度：12//Μ)及50 μΐ細胞，分析緩衝液可以冷藏 直到使用時為止。該分析可以藉由將5〇 μ1的cAMp標準液 加至適當孔中，接著將50 μΐ的PBSA加至孔Η-ll及H-12而 發動。將50 μΐ的刺激緩衝液加入所有孔中。利用一針具， 使用能夠調配3 // 1的化合物溶液將經選擇之化合物加入適 當的孔中，其中測試化合物的最終分析濃度：12yM及總 分析體積：100 μΐ。將此等細胞加入孔中且在室溫下培養 60分鐘。然後加入1〇〇 μΐ含追蹤劑“^卩的偵測混合物至孔 中。將盤再培養I2小時後，繼而在Wallac MicroBeta 103483-960706.doc ·46· 1338046 scintillation計數器上計數。cAMP/孔之值可以從含於各分 析盤的標準cAMP曲線外插得到。 5.基於報信子的分析（Reporter-Based Assays ) a. CRE-LUC報信子分析（Gs-締合受體） 將293及293T細胞以每孔2x104個細胞的密度接種在 96孔盤上，第二天根據製造商的指示用親脂胺試劑 (BRL)進行轉染。如下述製備用於各6-孔轉染之DNA/ 脂質混合物： 將在100 μΐ DMEM中之260 ng質體DNA與在100 μΐ DMEM中之12 μΐ脂質（260 ng的質體DNA由200ng的8 xCRE-Luc報信子質體，50 ng包含内生性受體或非内生性 受體之pCMV或單獨的pCMV以及10ng的GPRS表現質 體（在pcDNA3中之GPRS (Invitorgen))溫和地混合。8 xCRE-Luc報信子質體如下述製備：藉由將大鼠體泌素啟 動子（-71/+51)選殖於p/Sgal基本載體（Clontech)的 BglV-Hindlll部位而獲得載體SRIF-卢 -gal。藉由PCR從 腺病毒模板 AdpCF126CCRE8 (詳見，7 Human Gene Therapyl 883 ( 1996 ))獲得8份cAMP的反應單元且將其 選殖入SRIF-；8-gal載體之Kpn-BglV部位，生成8xCRE-yS -gal報信子載體。藉由將該8xCRE-冷-gal報告信子載 體中的/3 -半乳糖苷基因，在Hindlll-BamHI部位用得自 pGL3基本載體（Promega)中的蝥光素酶基因取代，而生 成8xCRE-Luc報信子質體。。30分鐘之後將其在室溫下 培養，該DNA/脂質混合物以400 μΐ的DMEM稀釋，將 103483-960706.doc -47- 1338046 1 00 μΐ經稀釋之混合物加入每一孔中。在細胞培養器中培 養4小時後，將含有10% FCS之10 μΙϋΜΕΜ加入每孔 中。第二天，將經轉染之細胞改以含有10% FCS之 DMEM (200 μΐ/孔）培養。8小時之後，用PBS沖洗一次， 然後將孔中之培養基改為不含酚紅之DMEM (100 Ρ1/孔）° 第二天利用LucLite™報信子基因分析套組（Packard )，依 照製造者指示量測螢光酶活性，及以1450MicroBeta™閃爍 與冷光計數器（Wallac)讀數。 a. API 報信子分析（API reporter assay ) 一偵測Gq刺激之方法係取決於Gq-依存性填脂酵素C 之已知性質，即引起啟動子中含有API單元之基因之活 化。可使用 Pathdetect™AP-lc cis-反應系統（Stratagene, Catalogue# 219073 )並依照如同上述CREB報信子分析之 試驗計劃（protocol)進行分析，不過磷酸鈣沈澱的成分為 410 ng的pAPl-Luc，80 ng的pCMV-受體表現質艎以及 20ng 的 CMV-SEAP。 b. SRF-Luc報信子分析（Gq-締合受體） 一偵測Gq刺激之方法係取決於Gq-依存性磷脂酵素C 之已知性質，即引起啟動子中含有血清反應因子之基因之 活化。可以使用 Pathdetect ™ SRF-Luc 反應系統 (Stratagene )來分析在例如COS7細胞中之Gq-偶聯活 性。使用哺乳動物轉形套組（Mammalian Transfection™Kit) (Stratagene, Catalogue # 200285 )，依照其製造商的指 示，將細胞用上述系統之質體及所示編碼内生性或非内生 103483-960706.doc •48- 1338046 性GPCR之表現質體轉染。簡言之，依照其製造商的指 不，將410ng的SRF-LuC與80ng的pCMV-報信子表現質 體以及20ng的CMV-SEAP (分泌型鹼性磷酸酶表現質 體’篁測經轉染細胞之培養基中之鹼性磷酸酶活性，以控 制樣本間轉染效率的差異）組合成磷酸鈣沉澱。將該沈澱 的一半均等地分佈在96孔盤中的3孔，並將該細胞保持 在不含血清的培養基中24小時。最後5小時，將該細胞 與1 μΜ血管緊縮素一起培養。接著將細胞溶裂，然後利 用 Luclite™ Kit (Packard，Cat # 6016911 )及 “Trilux 1450 Microbeta”液體閃爍及冷光計數器（wanac)依照 其製造商的指示分析螢光素酶活性。所得數據可以利用 GraphPad Rrism™2.〇a ( GraphPad software Inc )分析。 C. 細胞内IP3蓄積分析（Gq-締合受體） 第一天，將包含受體（内生性及/或非内生性）之細胞 接種在24孔盤上，通常每孔1χ1〇5個細胞，惟該數目可 視情況予以最佳化。第二天，藉由下述方法轉染細胞：首 先將在50 μΐ/孔不含血清之DMEM中之〇 25 ggDNA與在 50 A 1/孔不含血清之DMEM中之2 μΐ親脂胺（lipofectamine) 混合。將該溶液緩緩地混合且在室溫下培養丨5_3〇分鐘。 將細胞以0.5ml的PBS清洗，將400以1不含血清的培養 基與轉染用培養基混合以及加入此等細胞中。將該細胞在 37°C /5%二氧化碳中培養3-4小時，之後將該轉染用培養 基移除，且以一般生長培養基（1毫升/孔）替換。第三天， 以3H-肌醇標記此等細胞。簡言之，移除該培養基，並以 103483-960706.doc •49- 1338046 ο.5毫升的PBS清洗細胞。之後於每孔加入〇·5毫升不含 肌醇及不含血清的培養基（GIBCO BRL)與0·25 pCi3H-肌醇，之後將該細胞在37°C/5%二氧化碳中培養16-18小 時。第四天，以0.5毫升的PBS清洗該細胞，並加入 0.45毫升的分析用培養基（其為含1〇〇 帕吉林 (pargyline)及l〇mM氣化鋰之不含肌醇/不含血清培養基） 或0.4毫升的分析用培養基（含5〇〇 w的αχ酮舍林 (Ketanserin * Ket )達1 0 μΜ的最終濃度）。此等細胞接 著在37°C下培養30分鐘。然後將此等細胞以〇.5毫升的 PBS清洗’同時於每孔加入20 μ1的新鮮停止液及冷卻停 止液（1Μ的氫氧化鉀；i8mM的蝴酸納；3.8 mM EDTA)。將該溶液保持在冰塊上5-10分鐘，或直到此等 細胞溶裂’接著以200 μΐ的新鮮/冷卻中和溶液（75% HC1)中和此等細胞。將該溶裂物移入h5毫升微量離心 管（eppendorf tubes)且於每管中加入i毫升1:2的氣仿及 甲醇溶液。將該溶液旋轉15秒並將該上層相加至Biorad AG1-X8™陰離子交換樹脂（通過ι〇〇·2〇〇號篩）管柱中。 首先將該樹脂用水以1 : 1.25 w/v之比例清洗且將〇.9毫 升的上層相裝入該管柱中。將該管柱以1〇毫升的5mM肌 醇與10毫升5 mM的朋酸鈉/60 mM的甲酸鈉清洗。將 肌醇三磷酸酯洗提入含1〇毫升閃爍劑與2毫升的〇.1M甲 酸及1M的甲酸銨之混合物之小瓶。該管柱藉由使用1〇 毫升0.1M的甲酸與3M的甲酸銨清洗，且以純水清洗兩 次並儲存在4。(：的水中而再生。參見第三圖。 103483-960706.doc -50· 1338046 在第三圖中’分析CXCR3，其中利用293細胞，於存 在r干擾素誘導性蛋白質-10 ( IP-10)及單核因子誘導性 r干擾素（‘ Mig” ）下，測量肌醇磷酸（IP3 )的蓄積 量’並比較：CXCR3的非内生性型（Nms );與Gq (del ) /Gi構築體共轉染之cXCR3的非内生性型 (N134S);以及作為對照組之Gq (del) /Gi構築體。 6，將加HA標籤之CXCR3定量之ELISA法 根據上述實例3 ( 1)製備黑色素細胞，且藉由胰蛋白 酶處理將其從培養燒瓶移至96孔盤中。亦即從該培養燒 瓶中移出培養基並以無菌的PBs清洗一次及抽出。將5毫 升的胰蛋白酶-EDTA加入該燒瓶。一旦此等細胞從該盤脫 離’將其移至一無菌收集管中，該管中加有1〇毫升含 FBS的培養基。以3000xg離心此等細胞5分鐘並抽出培 養基，之後將此等細胞再次懸浮在一小體積的培養基中並 計數。將體積調整至使每毫升含5x104到5x1 05個細胞之 後，將此等細胞接種在96孔測試盤中。該測試盤的第1 及2行不接種細胞。將讓此等細胞保存黏附於孔20小 時。

在該細胞黏附於孔之後，移除培養基，之後使用多通道 吸量管以清洗緩衝液（200 μΐ/孔）清洗所有孔。之後將該清 洗緩衝液傾倒出，然後僅在含有細胞的孔中，加入固定液 (100 μΐ/孔），並在室溫下培養15分鐘。在培養之後，移除 該液體，以清洗缓衝液（200 μΐ/孔）清洗盤之所有孔兩次， 然後移除該液體。使用多通道移液器（Anti-HA 103483-960706.doc 51 1338046

Antibody)，將一次抗體加入該盤之所有孔（1〇〇 _孔），且 讓其在室溫下培養2小時。接著移除㈣體且以2⑼μ1的 清洗緩衝液清洗三次在所有孔中加人⑽μ丨的㈣抗體 (羊抗兔*/3_半乳糖苷酶），且將其在室溫下培養玉小 時。之後將該液體移除以200 μ丨的清洗緩衝液清洗3次。 在所有孔中加入100 μ1/孔的受質（cpRG受質），且在室 溫下培養1至1.5小時。然、後讀取該盤之測定值以及使用 Softmax方法“HA.Quant」，，定量該受體表現。參見第二 圖。在第二圖中’趨化激素受體在黑色素細胞中表現以 及在ELISA分析中比較CXCR3 ( “CXCR3wt” ）的内生 性型與CXCR3( “N134S” ）的非内生性型以及對照載體 (链魚精子’’）。此資料證實CXCR3的非内生性型的組 成活性與該内生性型約有3倍的差異。

實例5融合蛋白的製備1. GPCR: Gs融合構築體該持續 活化GPCR-G蛋白融合構築體的設計可以如下述達成：將 該大鼠（rat)G蛋白Gs α (長型；Itoh，H.等人，83 PANS 3776 ( 1986 ))的5’及3,的終端加工成含有一 mndni (5’-AAGCTT-3’）序列。在確認序列正確（包括側翼 HindI11序列）之後，該整個序列藉由利用載體pcDNA3.1 (-)(Invitrogen，型錄編號 V795-20)的 Hindlll 限制部 酶内切部位進行分段選殖，而移入該載體pcDNA3.1 (-) 中。在分段選殖入pcDNA3· 1 (-)之後，測定該Gs α序列 的正確定向。繼而確認該經修改的pcDNA3.l ( ·)在 Hindlll序列包括該大鼠Gs ^基因；該載體現可以取得， 103483-960706.doc -52- 1338046

作為“通用的’’ Gsa蛋白質載體。該pcDNA3」（)載體 在該Hindlll部位的上游含有各種已知的限制部位，因 此，可提供在該Gs蛋白質的上游插入内生性持續活化 GPCR的編碼序列的能力。此相同的方法可以用來產生其 他“通用的’’ G蛋白質載體，當然，亦可使用其他商業上 可取传的載體或本技術領域人士已知的專有載體—重要的 基準是GPCR序列必須在G蛋白質的上游且與該G蛋白 質在同一讀框。接著進行PCR，爲了確保各個受體序列融 合在如上所揭示的Gs α通用受體内，以下述試驗計劃進 行PCR s式驗計劃：將1 〇〇ng的cDNA加入分別的試管（其 含有引子（核酸及反義核酸）各2 μΐ ’ 3 μΐ的1〇 mM dNTPs ’ 10 pL 的 1〇 χ Taq Plus™精確緩衝液，1 的

TaqPlus™精確聚合酶（startagene: # 600211 )以及 80 的水。反應溫度及循環時間如下述且第二步驟到第四步驟 重複 35 次：94°C 1 分鐘；94°C30 秒；62°C20 秒；72°C 1 分鐘40秒以及72°C5分鐘。接著將PCR產物通過1%壤 脂糖膠並純化。接著將經純化的產物以xbal及EcoRV消 化，以及將所欲的插子純化及黏接入Gs通用載體的個別 限制部位。轉形後將該陽性純株分離，同時藉由限制酵素 消化測定；依照以下提出的試驗計劃利用293細胞逹成表 現。繼而將GPCR-Gs融合蛋白的每一個陽性純株定序， 以證實正確性。2. Gq (刪除6個胺基酸）/ Gi構築體 (Gq ( 6 amino acid deletion) /Gi Construct) 一 Gq ( del ) /Gi構築體的設計依照下述達成：將N-終 l03483-960706.doc -53· 端六個胺基酸（胺基酸2到7號，具有小鼠（mouse)G a q 次單元的TLESIM序列（序列識別號：9))刪除，以及將 C-終端5個胺基酸（具有序列EYNLV (序列識別號：10)) 以Gai蛋白質的對應胺基酸（具有序列DCGLF(列識別 號：11 ))取代。CXCR3經由Gi偶聯。該Gq ( del) /Gi 的構築體依照下述製作：如下述設計引子。該融合蛋白藉 由使用下述引子： 5’-gatcaagcttcCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3’ (序列識別號：12)以及 5’- gatcggatccTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGC AGGATGGTG-3,（序列識別號：13) 以及以質體63313 (包含具有一紅血球凝集素標籤之小 鼠Gaq-野生型）當作模板進行PCR而得到。在較下帽區 (caps)中的核苷酸包括供Hindlll/BamHI用的選殖部位及 間隔基。使用 TaqPlus Precision DNA 聚合酶 (Stratagene )以下述循環進行擴增並重複第二步驟到第 四步驟 35 次：95°C 2 分鐘；95°C 20 秒；56°C 20 秒；72°C 2分鐘以及72°C7分鐘。將該PCR產物選殖入一 pCRII-TOPO 載體（Invitrogen)並利用 ABI Big Dye Terminator Kit ( P.E.B iso system s )定序β將從含有該融合構築體之序 列之ΤΟΡΟ純株而來的插入物藉由二步驟選殖法，移入表 現載體pcDNA3.1 (+)的Hindlll/BamHI部位。關於該核 酸序列，參見序列識別號：14 ;以及關於Gq ( del ) /Gi 103483-960706.doc .54· 1338046 構築體的推定胺基酸序列’參見序列識別號：15。 實例6 所揭示的人類GPCRs之組織分佈 1_反錄一聚合鏈鎖反應（RT-PCR) 應用反錄-聚合鏈鎖反應來確認人類CXCR3的表現及測 定其組織分佈。所使用的寡核苷酸為CXCR3-特異性，及 以該人體多重組織cDNA組（MTC，Clontech)當作模板。 根據製造商的指示’使用Tag DNA聚合酶（Stratagene) 在40yL的反應液中進行擴增。將20//L的反應液加載在 1.5%的瓊脂糖凝膠中’以分析該rT_pc：R的產物。 與位於這些組織或區域之受體相關的疾病或失調包括， 但不限於，心臟失調及疾病（例如栓塞、心肌梗塞；動脈 硬化’·心肌病變）腎臟疾病及失調（例如腎衰竭；腎小管 酸化症，腎性糖尿；腎性尿崩症；胱胺酸展症；多囊腎 病）；嗜伊紅性球增多症；白企球增多症；白血球減少 症；卵巢癌；性功能障礙；多囊性卵巢症候群；胰臟炎； 胰臟癌；大腸激躁症候群；直腸癌；克隆氏病；潰瘍性結 腸炎；憩室炎；慢性阻塞性肺病（c〇pD);纖維化囊腫； 肺炎：肺動脈高血壓；肺結核及肺癌；帕金森氏症；運動 障礙及失調；帛習力及注意力障礙；飲食障礙（例如厭食 症貪食症等），肥胖；癌症；胸腺瘤；重症肌無力；循 環“先疾㈤；攝護腺癌；攝護腺炎；腎疾病/失調（例如 腎衰竭’腎小f酸化症；腎性糖尿；腎性尿崩症，·胱胺酸 尿症，多囊腎病）；知覺·動作過程及喚醒失調；強迫症； 103483-960706.doc •55- 1338046 筆丸癌，異常勃起；前列腺炎；痛氣；内分泌失調；性功 能障礙；過敏症；抑鬱症；精神病；偏頭痛；逆流；精神 刀跛症，/貝瘍，支氣管痙攣；癲癇症；前列腺肥大丨焦慮 症，鼻炎；心絞痛及青光眼。因此，本發明的方法亦有用 於這些及/或其他疾病與失調的診斷及治療上。 2. Affymetrix 基因晶片技術（Affymetrix GeneChip®

Technology ) 將付自公開資料庫的序列託付Affmetrix設計及製造包 籲 括寡核酸的微陣列，以使用基因晶片®技術（GeneChip®

Technology)來監測G蛋白_偶聯受體（GPCRs)的表現程 度。將RNA樣本擴增，標記，於微陣列雜交，以及根據 製造商的指示分析數據。 實例7 试驗§·|*劃.反向促效劑及促效劑的直接鑑定 1. α碑檢 將得自上述實例3(1)之培養基抽出並以PBS ( 5-10毫升 ® /燒瓶）清洗一次。將10-20毫升的PBS加入每一燒瓶同 時靜置2-5分鐘。將該細胞以吸量管移到錐形離心管並以 1500rpm旋轉五分鐘。柚出PBS同時再次懸浮於刺激用緩 衝液（stimulation buffer)中（1 xHBSS，0.5mM IBMX， 5mM Hepes 及 0.11% BSA)。將化合物 A (5 μΐ/孔）用 Hepes 緩衝液稀釋，然後以10 μΐ/孔、15,000細胞/孔之方式加入 孔中，並且培養30分鐘。將5 μΐ/孔的CAMP受體珠粒 (Perkin Elmer產品編號6760600R)加入該孔中並使最 103483-960706.doc -56- 1338046 終濃度成為15 μΐ/毫升，然後蓋上蓋子，並在室溫下培養 2小時。之後加入5 a 1的分析反應混合物。該分析反應混 合物藉由混合供給體珠粒（perkin Elmer產品編號： 6760600R)(最終濃度20 pg/ml)、生物素化CAMP混合物 (Perkin Elmer 產品編號：6760600R)(最終濃度 1〇 nM) 及溶裂用緩衝液（5mM Hepes及0.18% Igapel)而製備。 接著將此等孔加蓋且在室溫下培養2小時。培養後，將孔 在a Quest上讀數及量測吸光值。藉由cAMP濃度並使用 從 GraphPad Prism 視窗 3.00 版（GraphPad Software，San

Diego California USA公司提供）下載之線性迴歸函數，將 該吸光值轉換成pm»ol cAmp/孔。 2.〔 35S〕GTPYS 分析 可以利用人類CXCR3的内生性型及非内生性型二者直 接鑑定候選化合物是否為例如反向促效劍。在一些具體實 施例中，如上所述的GPCR融合蛋白亦可以與非内生性持 續活化的CXCR3 —起使利用。當使用此一蛋白質時，分 析内差異似乎實質上穩定，藉以獲得有效的信號：雜信 比。此使得候選化合物可被更明快地鑑定。因此，在一些 具體實施例中，較喜歡使用CXCR3融合蛋白進行直接鑑 定’當使用時，遵循下列分析試驗計劃。 a.細胞膜的製備 在一些具體實施例中，用於直接鑑定候選化合物係屬反 向促效劑或促效劑之包含持續活化GPCR/融合蛋白之膜如 下述方式製備： 103483-960706.doc -57- 1338046 ι·材料 ‘‘膜刮除用緩衝液”包含20mM的HEPES及lOmM的 EDTA . pH 7.4 ； “膜清洗用緩衝液”包含20mM的 HEPES及〇·ΐ mM的EDTA，pH 7.4 ; “結合用緩衝液” 包含20mM的HEPES、lOOmM的氣化鈉及10mM的氣化 鎮，pH 7_4。 2.步驟 在整個步驟期間將所有的材料保存在冰上。首先，從細

胞的會合單層中抽出培養基’之後以10毫升的冷PBS清 洗，接著將其抽出。其後，加入5毫升的膜刮除用緩衝液 以刮除細胞；接著將細胞的萃取物移入50毫升離心試管 (在4°C下以20,000 rpm離心17分鐘）中。其後，抽出 上清液且將丸粒懸浮於3〇毫升的膜清洗緩衝液，之後在 4°C以20,000rpm離心速度離心17分鐘。接著抽出上清液 及將該丸粒再次懸浮於結合用緩衝液中。利用

Ρ〇1_η™均質機將其均質化（進行15_2〇秒直到所有物質 呈懸浮狀態）。本文中將其稱為“膜蛋白質，，。 b· Bradford蛋白質分析均質化之後，利用蛋白 質分析測㈣膜蛋白質濃度以供稍後㈣；㈣Bradford 蛋白質分析中’稀釋蛋白質至1.5毫克/毫升，等分試樣並 冷康（-80C);當冷;東的時候，使用試驗計劃如下. 之曰’在室溫下’融解冷㈣膜蛋白f，之 使用Polytron均質樁以奶,〇 ，〇〇〇rpm速度均質化約5·ι〇 私·製備多個製劑時，該均質機在將不同製劑均質 103483-960706.doc •58- 1338046 化之間應徹底地清潔。 L材料黏合緩衝液（如上所述）；Bradford染料試 劑；，依照製造商的指示使用Bradford蛋白質標準液 (Biorad，型錄編號 500-0006 )。 2.步驟 複製二試管，一包含該膜，一作為“空白，’對照組。 每一個均包含800 μΐ結合用緩衝液。其後，將1 4的

Bradford蛋白質標準液加入每一試管’且僅將1〇 μ1的膜 蛋白質加入單一個試管（非空白試管）中。其後，將2〇〇 μΐ的Bradford染料試劑加入每一試管，接著渦轉每一試 管。五分鐘之後，再次渦轉該試管且將其中材料轉移至玻 璃比色管（cuvettes)。接著利用CECIL3〇41分光光度計， 在波長595讀取該玻璃比色管。 c.直接鑑定分析 1 ·材料 GDP緩衝液包括37.5毫升的結合用緩衝液以及2毫克 的GDP (Sigma，型錄編號G_7127)，之後以結合用緩衝液 進打一系列稀釋，得到0.2 μΜ的GDp (在每一孔中GDp 的最終濃度為0，1 μΜ的GDP);每一孔包含候選化合物、 1〇〇 μΐ的GDP緩衝液（最終濃度，〇」的GDp)，5〇 μΐ含於結合用緩衝液中之臈蛋白質、及5〇 μ丨含於結合用 緩衝液的〔4〕GTPYS(0.6 _)(每10毫升結合用緩衝 液具有2.5 μΐ的〔35S〕〇ΤΡγ|δ)，最終體積為2〇〇 y。 2.步驟 103483-960706.doc •59- 1338046 最好利用96-孔盤格式r LL姑 裕式（此等可以在_8(TC下冷凍）篩檢 候選化合物。將膜蛋白暂< + n 龙曰貰（或具有不含GPCR融合蛋白基 因的表現載體的膜’作為對照⑹進行短時間均質化至呈 懸浮狀態。接著利用如前述的BradfGrd蛋白f分析測定蛋 白質的/農度。將膜蛋白冑（及對照組）以結合用緩衝液中 稀釋至0.25毫克/毫升（最終分析濃度，12 5盹/孔）。其

後，將 100 μΐ 的 GDP 緩衝液加入 WaUac ScintistripTM (WallaC)的每一孔中。接著使用5 μΐ針具（pin-t00l)將 5 μΐ的候選化合物移入此等孔中（換句話說，5 μ與總分 析體積200 μ丨之比丨·· 4〇，以致於該候選化物的最終篩檢 濃度為10 μΜ)。再者，為了避免污染，在每一轉移步驟 之後，該針具應在三個分別包含水（1χ)、乙醇（1χ)及 水（χ2 )的器皿中清洗，在每一次清洗之後，應該將多餘 的液體從工具上甩落，並用紙及擦拭紙（kimwipe)擦乾。其 後’於每孔加入50 μΐ的膜蛋白質（亦使用一對照組孔， 其包括不含GPCR融合蛋白的膜）且在室溫下預先培養5_ 10分鐘。其後’在每孔中加入在結合用緩衝溶液中之5 〇 μΐ〔 35S〕GTP r S (0.6 ηΜ)，並在室溫下，於搖盪器中培 養6 0分鐘（此外’在此實例中，將金屬箔片覆蓋在盤 上）。之後藉著4000rpm的速度，於22。(：下旋轉該盤15 分鐘，停止此分析。繼而，以8通道岐管抽取各盤且以盤 蓋密封。利用 “Prot. # 37”裝置（依照製造商的指示）， 在Wallac 1450上讀取各盤數據。 d.環化AMP分析另一直接鑑定候選化合物之分析方法 103483-960706.doc -60- 1338046 係使用基於環化酶之分析。除了直接鑑定之外，此分析方 法亦可以被用作確認上述〔35S〕GTPyS法之結果之方 法。較佳使用經修改的Flash Plate™腺苷酸環化酶套組 (New England Nuclear;型錄編號 SMP004A)並依照下 述試驗計劃直接锻定候選化合物係屬持續活化GPCRs的 反向促效劑或促效劑。採集轉染後約3天的轉染細胞。藉 由將在包含20mM HEPES，ρΗ7·4及10 mM氣化鎂之緩衝 液中之懸浮細胞均質化而製備膜。利用Brinkman Polytron ™在冰上執行均質化約1 〇秒鐘。將得到的均質化物在4〇c 下，以49,000Xg離心1 5分鐘。繼而將得到的丸粒再次懸 浮於包含 20mM HEPES ’ ρΗ7·4，以及 〇.1 mM EDTA 的緩 衝液中，並將其均質化10秒鐘，之後在41下，以 49,000 X g離心15分鐘。接著將得到的九粒儲存在_8(rc 直至使用。在直接鑑定篩檢之日，將膜丸粒在室溫下慢慢 地融解，然後再懸浮於包含20mM HEPES，pH7.4，及1〇 mM氣化鎂的緩衝液中，並使最终濃度成為〇6〇毫克/毫 升（將該再次懸浮的膜放置在冰塊上直至使用為止）。製 備c AMP標準液及偵測用緩衝液（包含於丨丨毫升的偵測 用緩衝液中之2 μ(：ί追蹤劑〔125I CAMP〔 1〇〇 μΐ〕〕）且根 據製造商的指示保存。製備新鮮的分析用緩衝液以供篩 檢，該分析用緩衝液含20mM HEPES，ρΗ7·4，1〇 mM氣 化鎮、20 mM的酿肌酸（Sigma)、0.1單位/m 1肌酸鱗^酸 激酶（Sigma)、50 /z M GTP (Sigma)及 0.2 mM ATP (Sigma);接著將該分析用緩衝液儲存在冰上直至使用為 103483-960706.doc -61 · 1338046 止。將依照上述鑑定出的候選化合物（假如經冷;東，將其 在室溫下融解），連同40^的媒蛋白質⑼⑽孔）及50 W的分析用緩衝液，加至較佳96孔盤中（3 μΐ/孔；最終 析用濃度.12 μΜ )。接著在室温下培養此混合物3 〇分 鐘，並伴隨輕微搖動。培養後，於每孔加人刚μΐ的倘測 用緩衝液’之後培養2·24小時。接著在鬚扣⑹㈣⑽ 作盤讀取機上利用“Port.#3l ”計數各盤（依照該製造商 的指示）。 實例8黑色素細胞技術黑色素細胞為在較低等的脊椎動 物中發現之皮膚細胞。其包括被稱為黑色素體之有色細胞 器官（pigmented organelles)。黑色素細胞於G蛋白偶聯受 體（GPCR)活化時，此等黑色素體會沿著微管網重新分配。 此色素移動的結果顯然會使細胞變淡或變深。在黑色素細 胞申，Gi-偶聯受體活化所造成之分子内cAMp濃度降 低，將導致黑色素體移動至細胞中央，使得顏色大幅地變 淺。右隨後Gs-偶聯受體活化使得camp濃度上升，則該 黑色素體將重新分配且該細胞再次變黑。偶聯受體活 化所造成之二酿基甘油濃度上升’亦可以誘導此重新分 散β此外’該技術亦適合用於研究某些受體酪胺酸激酶。 该黑色素細胞的反應在受體活化的短時間之内發生，结果 導致單純的、強烈的顏色變化。該反應可以輕易地利用一 般的吸光微盤分析儀或精密攝影系統偵測。不像其他皮膚 細胞’黑色素細胞從神經脊衍生且似乎表現所有傳信蛋白 質的補體。尤其，此等細胞表現極廣範圍的G蛋白，因此 103483-960706.doc •62- 1338046 能夠功能性地表現幾乎全部GPCRs。黑色素細胞不僅如上 所述’可以用於鑑定作用在GPCRs的化合物上；黑色素 細胞亦可被用來測定此等受體的活性。1 ·活性試驗 活性試驗係將黑色素細胞的色素分佈之定量程度作為 DNA轉染量的函數^該測試得以將需求的dna量最佳 化，以及估計篩檢的預期訊號大小。活性測試係在轉染後 48小時後進行。將細胞從培養器中移除，且暴露在房間 燈光下1小時。之後，以不含金漿的分析用緩衝液（〇 15)替換該細胞的生長培養基，並讓此等細胞再進行丨小 時的平衡。以10 nM退黑激素處理該細胞90分鐘，以弓丨 發充分的色素聚集，之後以100n]VI的α -MSH處理60分 鐘，以產生充分的色素分散。在此過程中每一個部分將 此等細胞照相，以及用微盤讀取機讀取吸光度。該實驗之 目標在於收集有關分析用緩衝液中黑色素細胞之休止或平 衡狀態信號的數據以及檢測該細胞的動態範圍（充分的色 素1集至充分的色素分散）。此等細胞的休止狀態及其動 態範圍皆受到持續活化GPCR之表現的影響。為了將該非 内生性持續活化CXCR3 ( “N134S” ）的分散（Gi)作 號活性最佳化，在該電穿孔過程中使用各種（2〇 pg、5q pg、75 pg、100叩及200 μ§)濃度之DNA。如先前所 述’活性測試包括經CXCR3轉染之黑色素細胞的數目及 視覺評估。從DNA的變化數量以外插法推測最終信號， L-15/MSH比值顯示該持續信號量，與模擬hS轉染細胞 相比’在20 gg的DNA濃度時較大。參考第四圖。第四 103483-960706.doc -63- 圖顯示該經模擬轉染之細胞（HS)呈現黑色素細胞的正常 動態範圍。就表現CXCR3的非内生性持續活化型 (N134S )的細胞而言，L-15/MSH吸光度讀值顯著 地下降，因為此等細胞之大部分聚集在—起。此信號證實 該N134S型具持續活性。 了以利用黑色素細胞來鑑定化合物，包括針對Gpcrs 之天然配體。此方法可以藉由使用色素細胞株作為受試細 胞而進行，其中該色素細胞株能夠回應特定刺激而分散或 聚集其色素且可表現編碼GCPR的外生性純株。兩種刺激 劑可以引起色素聚集及分散。舉例來說，在GpcR的活化 引起色素分散之情況，爲了誘導色素聚集，可使用刺激 劑♦退黑激素將色素分布的最初狀態設定為色素聚集。相 反地’在GPCR的活化引發色素聚集之情況，爲了誘導 色素分散，可使用刺激劑：黑色素細胞刺激激素（MSH)將 色素分布的最初狀態設定為色素分散。然後，將該受試細 胞與化合物接觸，以測定在該細胞中色素的分布是否變化 而與該色素分布的最初狀態有所不同。因候選化合物（包 括但不限於配體）偶聯於GPCR，造成色素細胞分散時，培 養皿上將呈現暗色，同時色素細胞的聚集變淡。 材料及方法係根據美國專利第5,462,856號及美國專利 第6,051，386號所揭示之内容。茲引述這些專利文獻的全 文於此作為參考。 2. CXCR3與配體的機能活性為了測試CXCR3在黑色素 細胞中的活化及機能信號’進行下列實驗。如前所述將黑 103483-960706.doc •64- 色素細胞用50或75 pg的内生性或非内生性CXCR3質體 DNA進行電穿孔。預接種完成後，將黑色素細胞用胰蛋 白酶處理，且以單一密度接種在塗覆有聚-D-離胺酸之盤 (96孔）中。轉染後約48小時，將此等細胞從CFM中 移除且放置在〇·7χ L-15以供分析。初步實驗暗示： CXCR3受體引起黑色素細胞的聚集；為了觀察對於聚集 細胞之促效劑活性，進行聚集試驗計劃圖譜分析 (aggregation protocol assay)以進一步分析結果。首先，在 處理前將該細胞放置在10nM的MSH(0.7X L-15)中將近 60分鐘。使用持續活化的Gi-偶聯受體按照例行方式進 行，以取得聚集與由持續活化受體所刺激之聚集之間的最 佳動態範圍。特定而言，以MSH預培育後接著用ip_1〇 及Mig處理者顯示在CXCR3之促效劑：IP-ίο及Mig存 在下黑色素明顯聚集。將結果示於第五圖A到第五圖c。 第五圖A到第五圖C顯示在黑色素細胞中，經轉染的鱗 魚精子（第五圖A )、CXCR3wt (第五圖B )及N134S (第五圖C)可劑量依存性地驅使預分散細胞中黑色素的 聚集。IP-10及Mig對於CXCR3wt的EC50分別為 0·15ηΜ 及 〇.29nM。IP-io 及 Mig 對於 N134S 的 EC50 分 別為〇_83 nM及〇.45nM。因此，如細胞之聚集狀態所證 明，CXCR3之已知配體IP-io及Mig可以活化所表現之 Gi偶聯受體。全部此專利文件引證的參考資料，包括共 同申請及相關專利申請將其全文引用於此做為參考。所揭 示發明的修飾及延伸，在熟習該技藝者的理解範圍内，亦 103483-960706.doc -65- 1338046 包含上述的揭示内容以及下列的申請專利範圍中。雖然在 本技述領域中可以獲取各種表現載體，但就内生性及非内 生性人類CXCR3之使用而言，以使用載體為Pcmv為最 佳。依據布達佩斯條約對於國際承認用於專利程序之微生 物之寄存規定，將此載體於1998年10月π日寄存於美 國典型培養物保藏中心（ATCC) ( 10801 University Blvd., Manassas，VA 2〇11〇_22〇9 USA) » 該 DNA 經由 ATCC 測 試為存活（viable)» ATCC分派之寄存編號為pCMV : ATCC# 20335 1。 【圖式簡單說明】 第一圖顯示於存在或不存在ΙΡ·1〇( 一種CXCR3之促效劑） 下’經模擬轉染（HS)或經20pg的内生性及非内生性cxCR3 dna轉染之黑色素細胞在轉染後〇小時及6〇小時後以cFM 所取得之照片。該細胞在照相前暴露在光線下將近一小 時。二組細胞在形態上有相似處^在缺乏Ip_1()下經模 擬轉染之細胞以及經内生性CXCR3 (野生型）轉染的細 胞，如預期，保留正常的分散色素表型，而當用非内生性 CXCR3 ( “ CART”）轉染時此等細胞大體聚集在一起。 此較存在ϊ 0下含有野生型的細胞以及含有c A rt的細 胞，可發現含有CART的細胞較多以聚集其色素來回應。 第二圖係圖示趨化激素受體在^素細胞中之表現，以及 在ELISA分析中比較CXCR3( “CXCR3wt”）的内生性型 與CXCR3 ( N134S )的非内生性型以及對照載體 (缝魚精子”）之'结果。此資料證實CXCR3的非内生性 103483-960706.doc -66 - 1338046 型的組成活性與該内生性型約有3倍的差異。第三圖係圖 示對CXCR3之第二傳k者分析之結果，其中利用293細 胞’於存在r干擾素誘導性蛋白質-10 (ip_ 1〇)及單核因 子誘導性γ干擾素（“ Mig” ）二者下，測量肌醇磷酸 (% )的蓄積量，並比較：CXCR3的非内生性型 (N134S );與Gq ( del) /Gi構築體共轉染之CXCR3的非内 生性型（N1 34S)，以及作為對照組之Gq ( del ) /Gi構築體。 第四圖係描繪在以内生性及非内生性CXCR3質體DNA之20 Mg ONA轉染之黑色素細胞上所進行之試驗中之l- 15/MSH 吸光度 >> 就表現CXCR3的非内生性持續活化型 (“N134S” ）的細胞而言’L-15/MSH吸光度讀值顯著地 下降，因為此等細胞之大部分聚集在一起。第五A-C圖係 圖示内生性CXCR3 ( ‘‘ CXCR3wt” ）（第五B圖）以及非 内生性CXCR3 ( “N134S” ）第五C圖）藉由病毒τ -干擾 素誘導性蛋白-10 ( ΙΡ-10)以及趨化激素誘導性7 -干擾素 (“ Mig” ）之活化，並與以作為對照組之用鯡魚精子活 化者（第五A圖）加以比較。黑色素細胞以25微克的 CXCR3wt 或 N134S轉染。IP-10 及 Mig對於 CXCR3wt 的 EC50 分別為 0.1 5nM及 0.29nM。IP-10及 Mig對於 N134S 的 EC50分 別為 0.83 nM及 0·45ηΜ » 103483-960706.doc •67- 1338046

序列表 <11 〇>美商艾尼納製藥公司 <120>人類G蛋白-偶聯受體及用於治療炎症之該受體之調節劑 <140>第093107222號專利申請案 <141>中華民國94年3月18日 <150> 60/455,911 <151> 2003-03-18 <160> 15 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213〉人類 <400> 1 atggtccttg aggtgagtga ccaccaagtg ctaaatgacg ccgaggttgc cgccctcctg gagaacttca gctcttccta tgactatgga gaaaacgaga gtgactcgtg ctgtacctcc ccgccctgcc cacaggactt cagcctgaac ttcgaccggg ccttcctgcc agccctctac agcctcctct ttctgctggg gctgctgggc aacggcgcgg tggcagccgt gctgctgagc cggcggacag ccctgagcag caccgacacc ttcctgctcc acctagctgt agcagacacg ctgctggtgc tgacactgcc gctctgggca gtggacgctg ccgtccagtg ggtctttggc tctggcctct gcaaagtggc aggtgccctc ttcaacatca acttctacgc aggagccctc ctgctggcct gcatcagctt tgaccgctac ctgaacatag ttcatgccac ccagctctac cgccgggggc ccccggcccg cgtgaccctc acctgcctgg ctgtctgggg gctctgcctg cttttcgccc tcccagactt catcttcctg tcggcccacc acgacgagcg cctcaacgcc acccactgcc aatacaactt cccacaggtg ggccgcacgg ctctgcgggt gctgcagctg £tggctggct ttctgctgcc cctgctggtc atggcctact gctatgccca catcctggcc gtgctgctgg tttccagggg ccagcggcgc ctgcgggcca tgcggctggt ggtggtggtc gtggtggcct ttgccctctg ctggaccccc tatcacctgg tggtgctggt ggacatcctc atggacctgg gcgctttggc ccgcaactgt ggccgagaaa gcagggtaga cgtggccaag tcggtcacct caggcctggg ctacatgcac tgctgcctca acccgctgct ctatgccttt 103483-960706.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1338046 gtaggggtca agttccggga gcggatgtgg atgctgctct tgcgcctggg ctgccccaac cagagagggc tccagaggca gccatcgtct tcccgccggg attcatcctg gtctgagacc tcagaggcct cctactcggg cttgtga <210> 2 <211> 368 <212> PRT <213>人類 <400> 2

Met Val Leu Glu Val Ser Asp His Gin Val Leu Asn Asp Ala Glu Val 15 10 15

1080 1107

Ala Ala Leu Leu Glu Asn Phe Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Gly Glu Asn 20 25 30

Glu Ser Asp Ser Cys Cys Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gin Asp Phe Ser 35 40 45

Leu Asn Phe Asp Arg Ala Phe Leu Pro Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Phe 50 55 60 乙eu Leu Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Ser 65 70 75 80

Arg Arg Thr Ala Leu Ser Ser Thr Asp Thr Phe Leu Leu His Leu Ala 85 90 95

Val Ala Asp Thr Leu Leu Val Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ala Val Asp 100 105 110

Ala Ala Val Gin Trp Val Phe Gly Ser Gly Leu Cys Lys Val Ala Gly 115 120 125

Ala Leu Phe Asn lie Asn Phe Tyr Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Cys 130 135 140 lie Ser Phe Asp Arg Tyr Leu Asn lie Val His Ala Thr Gin Leu Tyr 145 150 155 160 103483-960706.doc 1338046

Arg Arg Gly Pro Pro Ala Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Val Trp 165 170 175

Gly Leu Cys Leu Leu Phe Ala Leu Pro Asp Phe lie Phe Leu Ser Ala 180 185 190

His His Asp Glu Arg Leu Asn Ala Thr His Cys Gin Tyr Asn Phe Pro 195 200 205

Gin Val Gly Arg Thr Ala Leu Arg Val Leu Gin Leu Val Ala Gly Phe 210 215 220

Leu Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Tyr Cys Tyr Ala His lie Leu Ala 225 230 235 240

Val Leu Leu Val Ser Arg Gly Gin Arg Arg Leu Arg Ala Met Arg Leu 245 250 255

Val Val Val Val Val Val Ala Phe Ala Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His 260 265 270

Leu Val Val Leu Val Asp lie Leu Met Asp Leu Gly Ala Leu Ala Arg 275 280 285

Asn Cys Gly Arg Glu Ser Arg Val Asp Val Ala Lys Ser Val Thr Ser 290 295 300

Gly Leu Gly Tyr Met His Cys Cys Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ala Phe 305 310 315 320

Val Gly Val Lys Phe Arg Glu Arg Met Trp Met Leu Leu Leu Arg Leu 325 330 335

Gly Cys Pro Asn Gin Arg Gly Leu Gin Arg Gin Pro Ser Ser Ser Arg 340 345 350

Arg Asp Ser Ser Trp Ser Glu Thr Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Gly Leu 355 360 365 103483-960706.doc 1338046 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子序列 <400> 3 acgaattcag ccatggtcct tgaggtgagt gaccaccaag tgctaaat 48 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 φ <220> <223>引子序列 <400> 4 gaggatcctg gaatgcgggg aagtcag 27 <210> 5 <211> 1107 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>新穎序列 <400> 5

atggtccttg aggtgagtga ccaccaagtg ctaaatgacg ccgaggttgc cgccctcctg 60 gagaacttca gctcttccta tgactatgga gaaaacgaga gtgactcgtg ctgtacctcc 120 ccgccctgcc cacaggactt cagcctgaac ttcgaccggg ccttcctgcc agccctctac 180 agcctcctct ttctgctggg gctgctgggc aacggcgcgg tggcagccgt gctgctgagc 240 cggcggacag ccctgagcag caccgacacc ttcctgctcc acctagctgt agcagacacg 300 ctgctggtgc tgacactgcc gctctgggca gtggacgctg ccgtccagtg ggtctttggc 360 tctggcctct gcaaagtggc aggtgccctc ttcaacatca gcttctacgc aggagccctc 420 ctgctggcct gcatcagctt tgaccgctac ctgaacatag ttcatgccac ccagctctac 480 cgccgggggc ccccggcccg cgtgaccctc acctgcctgg ctgtctgggg gctctgcctg 540 cttttcgccc tcccagactt catcttcctg tcggcccacc acgacgagcg cctcaacgcc 600 -4- 103483-960706.doc 660 660

1338046 acccactgcc aatacaactt cccacaggtg ggccgcacgg ctctgcgggt gctgcagctg gtggctggct ttctgctgcc cctgctggtc atggcctact gctatgccca catcctggcc gtgctgctgg tttccagggg ccagcggcgc ctgcgggcca tgcggctggt ggtggtggtc gtggtggcct ttgccctctg ctggaccccc taicacctgg tggtgctggt ggacaicctc atggacctgg gcgctttggc ccgcaactgt ggccgagaaa gcagggtaga cgtggccaag tcggtcacct caggcctggg ctacatgcac tgctgcctca acccgctgct ctatgccttt gtaggggtca agttccggga gcggatgtgg atgctgctct tgcgcctggg ctgccccaac cagagagggc tccagaggca gccatcgtct tcccgccggg attcatcctg gtctgagacc tcagaggcct cctactcggg cttgtga <210> 6 <211> 368 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>新穎序列 <400> 6

Met Val Leu Glu Val Ser Asp His Gin Val Leu Asn Asp Ala Glu Val 15 10 15

Ala Ala Leu Leu Glu Asn Phe Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Gly Glu Asn 720 780 840 900 960 1020 1080 1107

Glu Ser Asp Ser Cys Cys Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gin Asp Phe Ser 35 40 45

Leu Asn Phe Asp Arg Ala Phe Leu Pro Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Phe 50 55 60

Leu Leu Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Ser 65 70 75 80

Arg Arg Thr Ala Leu Ser Ser Thr Asp Thr Phe Leu Leu His Leu Ala 85 90 95 103483-960706.doc 1338046

Val Ala Asp Thr Leu Leu Val Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ala Val Asp loo 105 no

Ala Ala Val Gin Trp Val Phe Gly Ser Gly Leu Cys Lys Val Ala Gly 115 120 125

Ala Leu Phe Asn lie Ser Phe Tyr Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Cys 130 135 140 lie Ser Phe Asp Arg Tyr Leu Asn lie Val His Ala Thr Gin Leu Tyr 145 150 155 160

Arg Arg Gly Pro Pro Ala Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Val Trp 165 170 175

Gly Leu Cys Leu Leu Phe Ala Leu Pro Asp Phe lie Phe Leu Ser Ala 180 185 190

His His Asp Glu Arg Leu Asn Ala Thr His Cys Gin Tyr Asn Phe Pro 195 200 205

Gin Val Gly Arg Thr Ala Leu Arg Val Leu Gin Leu Val Ala Gly Phe 210 215 220

Leu Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Tyr Cys Tyr Ala His lie Leu Ala 225 230 235 240

Val Leu Leu Val Ser Arg Gly Gin Arg Arg Leu Arg Ala Met Arg Leu 245 250 255

Val Val Val Val Val Val Ala Phe Ala Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His 260 265 270

Leu Val Val Leu Val Asp lie Leu Met Asp Leu Gly Ala Leu Ala Arg 275 280 285

Asn Cys Gly Arg Glu Ser Arg Val Asp Val Ala Lys Ser Val Thr Ser 290 295 300 103483-960706.doc 1338046

Gly Leu Gly Tyr Met His Cys Cys Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ala Phe 305 310 315 320

Val Gly Val Lys Phe Arg Glu Arg Met Trp Met Leu Leu Leu Arg Leu 325 330 335

Gly Cys Pro Asn Gin Arg Gly Leu Gin Arg Gin Pro Ser Ser Ser Arg 340 345 350

Arg Asp Ser Ser Trp Ser Glu Thr Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Gly Leu 355 360 365 <210> 7 <211> 31

•<212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子序列 <400> 7 ccctcttcaa catcagcttc tacgcaggag c <210> 8 <211〉 31 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子序列 φ <400> 8 gctcctgcgt agaagctgat gttgaagagg g <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>新穎序列 <400> 9

Thr Leu Glu Ser lie Met 1 5 103483-960706.doc 1338046

<210> 10 <211> 5 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223> 新穎序列 <400> 10 Glu Tyr Asn Leu Val 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223> 新穎序列 <400> 11 Asp Cys Gly Leu Phe 1 5 <210〉 12 <211〉 36 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子序列 <400〉 12 gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag 36 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉 引子序列 <400> 13 gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg 53 103483-960706.doc

1338046 <210> 14 <211> 1062 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>新穎序列 <400> 14 atggcgtgct gcctgagcga g£aggccaag gaagcccgga ggatcaacga cgagatcgag cggcagctgc gcagggacaa gcgcgacgcc cgccgggagc tcaagctgct gctgctgggg acaggggaga gtggcaagtc gaccttcatc aagcagatga ggatcatcca cgggtcgggc tactctgacg aagacaagcg cggcttcacc aagctggtgt atcagaacat cttcacggcc atgcaggcca tgatcagagc gatggacaca ctcaagatcc catacaagta tgaacacaat aaggctcatg cacaattggt tcgagaggtt gatgtggaga aggtgtctgc ttttgacgtc cccgactacg cggcaataaa gagcttgtgg aatgatcctg gaatccagga gtgctacgac agacgacggg aatatcagtt atctgactct accaaatact atctgaatga cttggaccgt gtagccgacc cttcctatct gcctacacaa caagacgtgc ttagagttcg agtccccact acagggatca tcgaataccc ctttgactta caaagtgtca ttttcagaat ggtcgatgta ggg£gccaaa ggtcagagag aagaaaatgg atccactgct ttgaaaatgt cacctccatc atgtttctag tagcgcttag cgaatatgat caagttcttg tggagtcaga caatgagaac cgcatggagg agagcaaagc actctttaga acaattatca cctacccctg gttccagaac tcctctgtga ttctgttctt aaacaagaaa gatcttctag aggagaaaat catgtattcc cacctagtcg actacttccc agaatatgat ggaccccaga gagatgccca ggcagctcga gaattcatcc tgaaaatgtt cgtggacctg aaccccgaca gtgacaaaat catctactcc cacttcacgt gcgccacaga taccgagaac atccgcttcg tctttgcagc cgtcaaggac accatcctgc agctgaacct gaaggactgc ggcctgttct aa <210> 15 <211> 353 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>新穎序列 103483-960706.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1062 9- 1338046 <400> 15

Mst Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Ala Arg Arg He Asn 15 10 15

Asp Glu lie Glu Arg Gin Leu Arg Arg Asp Lys Arg Asp Ala Arg Arg 20 25 30

Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr 35 40 45

Phe lie Lys Gin Met Arg lie lie His Gly Ser Gly Tyr Ser Asp Glu 50 55 60

Asp Lys Arg Gly Phe Thr Lys Leu Val Tyr Gin Asn lie Phe Thr Ala 65 70 75 80

Met Gin Ala Met lie Arg Ala Met Asp Thr Leu Lys lie Pro Tyr Lys 85 90 95

Tyr Glu His Asn Lys Ala His Ala Gin Leu Val Arg Glu Val Asp Val 100 105 110

Glu Lys Val Ser Ala Phe Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala lie Lys Ser 115 120 125

Leu Trp Asn Asp Pro Gly lie Gin Glu Cys Tyr Asp Arg Arg Arg Glu 130 135 140

Tyr Gin Leu Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Asp Arg 145 150 155 160

Val Ala Asp Pro Ser Tyr Leu Pro Thr Gin Gin Asp Val Leu Arg Val 165 170 175

Arg Val Pro Thr Thr Gly lie lie Glu Tyr Pro Phe Asp Leu Gin Ser 180 185 190

Val lie Phe Arg Met Val Asp Val Gly Gly Gin Arg Ser Glu Arg Arg 195 200 205 10- 103483-960706.doc 1338046

Lys Trp lie His Cys Phe Glu Asn Val Thr Ser lie Met Phe Leu Val 210 215 220

Ala Leu Ser Glu Tyr Asp Gin Val Leu Val Glu Ser Asp Asn Glu Asn 225 230 235 240

Arg Met Glu Glu Ser Lys Ala Leu Phe Arg Thr lie lie Thr Tyr Pro 245 250 255

Trp Phe Gin Asn Ser Ser Val lie Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp Leu 260 265 270

Leu Glu Glu Lys lie Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285

Tyr Asp Gly Pro Gin Arg Asp Ala Gin Ala Ala Arg Glu Phe lie Leu 290 295 300

Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys lie lie Tyr Ser 305 310 315 320

His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn lie Arg Phe Val Phe Ala 325 330 335

Ala Val Lys Asp Thr lie Leu Gin Leu Asn Leu Lys Asp Cys Gly Leu 340 345 350

Phe -11 - 103483-960706.doc

Claims (1)

1338046第093107222號專利申請案 令文申請專利範圍替換本(99年1〇月) 十、申請專利範圍：

公左本 種G蛋白-偶聯受體 # Bdz Μ. λΛ 1^- 飞又體其胺基酸序列具有與序列識別 ^ · 6至少。嶋之同—性，其係持續活化，且其在對應於 歹1識別號_ 6位置丨34的胺基酸為不同於天冬醯胺酸的 胺基酸殘基。 2·如°月求項1之G蛋白-偶跑為骑 ^ . y又體，，、中該不同於天冬醯胺 &的細基酸是絲胺酸。 3.如請求項1之〇蛋白為 包含序列心缺 y”又體、、中該。蛋白-偶聯受體 識別唬.6所示之胺基酸序列。 受體。D蛋白其包含〇蛋白及如請求項丨之。蛋白-偶聯 ，杓苷黾，其係編碼如請求項1至3 白-偶聯受體或如請求項4之融合蛋白。 員之〇蛋 載體其包含如請求項5之聚核#酸。 =項6之载體’其中該载體為表現載 苷酸與啟動子連結。 且及祆核 IS組宿主細胞，其包含如請求項7之載體。 現如請求項⑴中任—項之砰 呑月求項4之融合蛋白的方法，其包含： 體或如 胞如請求項7之表現栽體轉染進人合適的宿主細 (b )將該宿 聯受體或融& '細胞在允許該表現載體表如蛋白-偶 10.如請求項6: 條件下培養。 方法，其進—步包含自該細胞分離細胞 4. 5. 6. 8.9. 103483-991027.doc Γ338046 膜，其中該細胞膜包含該G蛋白-偶聯受體或該融合蛋 白0 11. 一種篩選候選化合物以找到可抑制或刺激如請求項1之G 蛋白-偶聯受體的化合物之方法，其包含： (a )使該候選化合物與如請求項】之G蛋白偶聯受體 接觸；以及 (b)測定該候選化合物是否可抑制或刺激該受體。 Φ I2.如靖求項11之方法，其中該不同於天冬醯胺酸的胺基酸 是絲胺酸。 13. 4吻求項丨丨之方法，其中該G蛋白偶聯受體包含序列識 別號：6所示之胺基酸序列。 14. 如咕求項n之方法，其卞該G蛋白-偶聯受體與〇蛋白共 同形成融合蛋白。 H h ^’其中該方法包含鑑定該受體之調節 劑’其係選自下列組成之群：該受體之反向促效劑 '促 擊效劑、邹分促效劑或拮抗劑。 16.如3月求項15之方法，其中該方法包含鑑定該受體之反向 促效劑。 17. 步包含將該反向促 劑調配為醫藥組合 如請求項15之方法，其中該方法進— 效劑、促效劑、部分促效劑或拮抗 物。 1 8.如請求項丨6之方法，其 T 方法包含將該反向促效劑調 配為醫藥組合物。 項之方法，其中 該G蛋白-偶聯受 19.如請求項】】至丨8中任一 103483-991027.doc 1 1338046 體係位於宿主細胞或其細胞膜中。 20.如請求項19之方法，其中該宿主細胞為靖乳動物宿主細 胞。 I如請求項19之方法’其中該宿主細胞為黑色素宿主細 胞0 、’ 22. 如Μ求項1 6之方法，其中該方法俜帛& 以神係用於師選候選化合物 以找到適合用於治療發炎病症或移植排物 物。 用之化合

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