TWI333976B - High-performance bio-tube for purifying dna and method thereof - Google Patents

Description

1333976 五、發明說明（2)

血液檢體。然後，在步驟1 3，將酚/氣仿/異戊乙醇溶液與 血液檢體的混合物離’心，以將去氧核糖核酸從此混合物中 分離出來，其中得到一沈降物及一懸浮液，去氧核糖核酸 係保持於懸浮液中。接著，在步驟1 4，使用滴管（p i pe 11 e )取出此懸浮液並移至另一試管中。在步驟1 5，加入乙酸 鈉/ 1 0 0 %乙醇溶液於此試管中，以混合含有去氧核糖核酸 的懸浮液。在步驟1 6，將乙酸鈉/ 1 0 0 %乙醇溶液與含有去 氧核糖核酸的懸浮液的混合溶液離心，以得到一含有去氧 核糖核酸的沈降物及一懸浮液。在步驟1 7，移除此懸浮液 及收集此含有去氧核糖核酸的沈降物。可繼續以下步驟以 進一步從此沈降物中收集固體去氧核糖核酸。在步驟1 將一含有7 0 %乙醇的溶液混合此含有去氧核糖核酸的沈降 物，接著在步驟1 9，將此混合物離心，以得到一含有去氧 核糖核酸的沈降物及一懸浮液。重覆步驟1 7，移除此懸浮 液及收集含有去氧核糖核酸的沈降物。步驟1 7至步驟1 9可 重覆兩次或更多次，以得到純化的去氧核糖核酸。 第一圖所示的傳統的去氧核糖核酸純化方法係繁雜、

冗長費時，及需要技術純熟的技術人員操做，才能得到所 要純化量的去氧核糖核核酸。 第二圖係另一種傳統的去氧核糖核酸的純化方法，其 係利用去氧核糖核酸在一促溶劑（c h a 〇 t r 〇 p i c a g e n t)促進 下可與玻璃表面鍵結的特性。如第二圖所示，在步驟2 1，

第6頁 1333976 五、發明說明（3) 加入玻璃殊（glass beads)及碘化鈉（Nai、 中玻璃珠係供做一去 '氧核糖核酸鍵結固相於〜試營中， 促溶劑。在步驟2 2，將含有去氧核糖核竣及鐵化鈉供做其 蛋 白質及其它細胞成份的一血液檢體加二核糙核 〜 碘化鈉與血液檢體的混合物。然後，在 ' Β τ , ^ ^ 培養此混合物約五分鐘，以形成去氧核搪騍2 3，在室=成 —…核醆結鍵固 此試管中 又、 DNA-binding s〇iid phase)，即吸附去 珠。在步騍24，將此混合物離心，以必/核轉核 溫下 相（ to q-π邮心，以將吸，了艰峻的珀 的玻璃珠從此混合物中分離出來。在步驟2去氧核糙核= 除，並將吸附去氧核糠核酸的玻璃珠保 ，將懸浮^ ^

驟26，以含有70%乙醇的溶液洗滌吸附去氧管中。=^ 璃珠三次’接著以滴管移除懸浮液及將吸附^糖〃核酸的破· 的玻璃珠保持於試管中。然後，在步驟2 7，加===，= 氨基甲烧-乙二胺四乙酸緩衝溶液（TE buffer, l〇mM

Tr is, lmMEDTA，pH8. 0)於試管中，在45°C下培養約2至3 分鐘’以使去氧核糖核酸脫離玻璃珠❶在步驟2 8，將此試 管離心’以得到含有去氧核糖核酸的三羥甲基氨基甲烷_ 乙胺四乙酸緩衝溶液。最後，在步驟2 9，使用滴管將含有 去氧核糖核酸的三羥曱基氨基曱烷—乙胺四乙酸緩衝溶液 取出移至另一試管中。 第二圖所示的另一種傳統去氧核糖核酸純化方法’其 步驟仍然繁雜冗長及需要高度操做技術。再者，所使用的 輔助生化試劑例如玻璃珠價格昂貴，亦使得此一純化方法

第7頁 1333976 五、發明說明（4) 所需成本無法降低。 · 據此，亟待提供一種可從生化檢體中純化去氧核糖核 酸的裝置及方法，其可克服傳統純化方法的缺失。 三、【發明内容】 本發明之主要目的係提供一種高效能生醫試管及其去 氧核糖核酸純化方法，其可快速簡便地從一生化檢體中純 化出高產量的去氧核糖核酸。

本發明之另一目的係提供一種高效能生醫試管及其4 氧核糖核酸純化方法，其可明顯降低技術門檻及純化的時 間。 本發明之又一目的係提供一種生化微粒固著於其内壁 的高效能生醫試管，其係製備容易，可降低純化去氧核糖 核酸的成本。

根據以上所述之目的，本發明提供一種高效能生醫試 管及其去氧核糖核酸純化方法。本發明的高效能生醫試管 係具有一生化微粒薄層固著於其内壁，其粒徑大小不大籲 1 0 0微米及具有吸附去氧核糖核酸的能力。本發明方法係 將一生化檢體加入此試管，然後加入一溶胞緩衝溶液於試 管中形成生化檢體與溶胞緩衝溶液的混合物，以溶解生化

第8頁 1333976 五、發明說明（5) 檢體中的細胞而釋放出去氧核糖核酸，靜置此混合物於試 管中一段足夠時間，‘以使釋放出來的去氧核糖核酸吸附至 此些生化微粒。接著，移除剩餘的混合物，及加入一流洗 液於此試管中，以將吸附至此些生化微粒的去氧核糖核酸 沖洗出來，及收集含有去氧核糖核酸的此一流洗液。

藉本發明高效能生醫試管，可獲得一容易、快速的去 氧核糖核酸純化方法，其不需要非常高的純化技術門檻及 不會增加額外的樣品處理步驟。再者*本發明南效能生醫 試管純化的去氧核糖核酸可直接使用於複製（c 1 on i ng)、 定序（sequence)或其它技術。 _ 本發明之目的及諸多優點藉由以下具體實施例之詳細 說明，並參照所附圖式，將趨於明瞭。 四、【實施方式】

去氧核糖核酸與固相表面的作用方式有兩種。第一， 去氧核糖核酸經由其本身的羥基與固相表面成份產生氫鍵 鍵結。第二，去氧核糖核酸本身的帶負電磷酸鹽與固相表 面的帶正電元素產生電性吸引作用。固相表面的親水性及 親正電性必須足以從細胞成份的懸浮液中或從核酸及其· 成份的懸浮液中鍵結去氧核糖核酸，以及能讓去氧核糖核 酸從鍵結的固相材質上流洗出來。因此，具有適當的親水 性及親正電性可用於純化去氧核糖核酸的固相材質成為一

第9頁 1333976 五、發明說明（6) 種需求。 · 本發明提供一種高效能生醫試管，其内壁具有固著（ i m m 〇 b i 1 i z e d )的一生化微粒薄層，係可從一生化檢體中純 化出去氧核糖核酸。固著於本發明高效能生醫試管内壁的 生化微粒，藉由其形成材質或修飾其表面，其具有足夠的 親水性及親正電性，可從細胞成份中鍵結去氧核糖核酸， 及允許去氧核糖核酸從固著的生化微粒中流洗出來。

第三圖係本發明高效能生醫試管的一例示透視圖，其 主要包括一試管3 1及一固著於試管3 1底部内壁的生| 微粒薄層3 2 。一封蓋3 3係用以密封試管3 1 。此生化

微粒薄層3 2可以喷灑技術直接塗敷（coat i ng)於試管 3 1的底部内壁。生化微粒3 2的粒徑大小不大於1 0 0 微米（// m)，其具有一經修飾表面，係具有親水性及親正 電性，可鍵結去氧核糖核酸。生化微粒3 2的經修飾表面 的親水性可藉由存在可吸引水分子的官能基而獲得，適當 的官能基包括-OH、-NH、-F及-H或具有雙鍵結氧原子的官 能基，例如幾基（carbonyl)、續驢基（sulfonyl)或填酸 基（p h 〇 s p h ο n y 1 )。生化微粒3 2的經修飾表面的親正電性 可藉由存在有帶正電原子而獲得，適當的帶正電原子包眷 石夕、棚或I呂。本發明中，親水性可藉由加入適當的親水性 官能基修飾生化微粒3 2的表面來達成，而親正電性可藉 由加入矽或其它適當的帶正電原子修飾生化微粒3 2的表

第10頁 1333976 五、發明說明（7) 面來達成。此外，本發明的生化微粒3 2可由含矽材質 (silicon-containihg material)形成，例如棚、石夕酸鹽 '石夕酸紹、磷石夕酸鹽（phosphosilicate)、幾基二氧化 石夕(silica carbonyl)、績酿基二氧化石夕(silica su 1 fοny 1 )及璃酸基二氧化石夕（silica phosphonyl)。親水 性可藉由加入適當的親水官能基於含矽材質來達成，及親 正電性可藉由加入適當的帶正電原子於含矽材質來達成。

第四圖係使用本發明高效能生醫試管的去氧核糖核酸 純化方法的步驟流程圖。然而，以下所舉的方法僅係用以 舉例說明使用本發明高效能生醫試管的去氧核糖核酸純| 方法，並非用以限定本發明。在步驟4 1 ’首先製備一底部 内壁固著有生化微粒3 2的試管3 1 。在步驟4 2，加入生

化檢體於試管3 1中，生化檢體可以是人類血液、血清、 黏液、尿液等，或經培養的細胞、經培養的細菌等。然後 ，在步驟4 3，加入一溶胞緩衝溶液（1 y s i s b u f f e r )於試管 3 1中，以形成生化檢體與溶胞緩衝溶液的一混合物’以 溶解生化檢體中的細胞’使去氧核糖核酸釋放出來。溶胞 緩衝溶液的組成份係依欲純化的生化檢體而定。例如，適 用於溶解人類血液檢體細胞的一溶胞緩衝溶液組成包括2 0 mM三羥甲基氨基曱烷鹽酸（Tris_HC1， ΡΗ7.5) 、150[ηΛ 化鈉（NaCl) 、ImM乙二胺四乙酸二納（Na2EDTA) 、lm MEGTA、1% 2.5mM焦磷酸鈉鹽（sodium pyrophosphate) 、lmM0 -甘油磷酸鹽-glycer〇Phosphate)、lmM鄰叙酸

第11頁 1333976 五、發明說明（9) 生醫試管可使去氧核糖核酸純化步驟簡化，容易操作及縮 短純化時間。換言之’，藉本發明的高效能生醫試管並不需 要高度的純化技術，而可快速簡便地純化出高純度的去氧 核糖核酸，以供基因試驗或基因分析。 以上所述僅為本創作之具體實施例而已，並非用以限 定本創作之申請專利範圍；凡其它未脫離本創作所揭示之 精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請 專利範圍内。

第13頁 1333976

第14頁

Claims (1)

1333976 案號 92116684

六、申請專利範圍 1. 一種生化檢體之去氧核糖核’酸純化方法，其包括： 提供一試管； . 、 將生化微粒固著於該試管，該生化微粒的粒徑大小不大於 1〇〇微米及具有吸附去氧核糖核酸的能力，其中，該生化、 微粒係由硼、矽酸鹽、矽酸鋁、磷矽酸鹽、羰基二氧化 矽，、磺醯基二氧化矽或磷酸基二氧化矽所組成，並且該生 化微粒具有一經修飾表面，係具有親水性及正電性，可與 去氧核糖核酸產生鍵結作用.，而該生化微粒之該經修飾表 面之正電性係藉由加入矽原子及其它帶正電原子來達成； 將一生化檢體加入該試管； ’ 加入一溶胞緩衝溶液於該試管中形成該生化檢體與該 溶胞緩衝溶液的混合物，以溶解該生化檢體中的細胞而釋 放出去氧核糖核酸，靜置該混合物於該試管中一段足夠時 間’以使釋放出來的去氧核糖核酸吸附至該等生化微教； 移除剩餘的該混合物；及 ’ 加入一流洗液於該試管中，以將吸附至該等生化微粒 的去氧核糖核酸沖洗出來，及收集含有去氧核糖核酸的誃 流洗液。 X 2. 如申請專利範圍第1項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法’其t上述之生化微粒係塗敷於該試管中。 3. 如申請專利範圍第1項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法，其中上述之生化微粒之該經修飾表面之親水

第15頁 1333976 --—案號92116684 〆月曰 條π：__ 六、申請專利範圍 * -- 性係藉由加入親水性官艉基來達成》 4. 如申請專利範圍第1項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法’其中上述之溶胞緩衝溶液組成係依該生化^ 體而定。 5. 如申請專利範圍第1項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法’其中上述之生化檢體係為人類血液。 6. 如申請專利範圍第5項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法’其中上述之生化檢體與該溶胞緩衝溶液的該 混合物靜置時間約1 〇分鐘。 7. 如申請專利範圍第6項所述之生化檢體之去氧核糖核 酸純化方法，其中上述吸附至該等生化微粒之去氧核糖核 酸的該流洗液係為水。 8. —種高效能生醫試管，其包括： 一試.管；及 一固著於該試管内壁的生化微粒薄層，該生化微粒之 粒徑大小不大於1〇〇微米及具有吸附去氧核糖核酸的能 力’其中’該生化微粒具有一經修飾表面，係具有親水性 及正電性’可與去氧核糖核酸產生鍵結作用，而該生化微 粒之該經修飾表面之正電性係藉由加入矽原子及其它帶正

第16頁 1333976 修正 .如申請專利範圍第8項所述之高效能生醫試 上述之生化微粒係由含矽材質形成。 其中 10.如申請專利範圍第9項所述之高效能生醫試管， 中上述之生化微粒係由硼、矽酸鹽、矽酸鋁、磷矽 、 羰基二氧化矽、磺醯基二氧化矽或磷酸基二氧化、 成。 r組

11. 一種高效能生醫試管的製作方法，其包括： 提供一試管； 提供一生化微粒，該生化微粒的粒徑大小不大於丨〇 〇微 米’且具有吸附去氧核糖核酸的能力，其中，該生化微粒 具有一經修飾表面，係具有親水性及正電性，可與去氧核 糖核酸產生鍵結作用，而該生化微粒之該經修飾表面之正 電性係藉由加入矽原子及其它帶正電原子來達成；以及 將該生化微粒直接固著於該試管。 12.如申請專利範圍第11項所述之高效能生醫試管的製 作方法’其中該生化微粒係塗敷於該試管中β 13.如申請專利範圍第11項所述之高效能生醫試管的 製作方法，其中該生化微粒係由含矽材質形成。

第17頁 1333976 . _案號92116684_名月日 絛正_ 六、申請專利範圍 14.如申請專利範圍第13項所述之高效能生醫試管的製 作方法，其中該生化微粒係由硼、矽酸鹽、矽酸鋁、磷矽 酸鹽、羰基二氧化矽、磺醯基二氧化矽或磷酸基二氧化矽 所組成。

第18頁