TWI305230B - Nucleic acid construct and expression vector for enhancing the production of recombinant protein, and method for the massive production of recombinant protein - Google Patents

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1305230 玖、發明說明： t 明戶斤屬·^ ^:斗椅々貝j 發明領域 本發明是有關於用以增進重組型多肽/蛋白質 5 (recombinant polypeptide/protein)的生產的核酸建構物與表 現載體’以及用以大量生產重組型多肽/蛋白質的方法，其 中一包含有一編碼硫乳化還原蛋白（thi〇redoxin)的第一核 酸序列（nucleic acid sequence)以及一編碼血紅蛋白 (hemoglobin)的第二核酸序列被選殖至一重組型宿主細胞 10 (recombinant host cell)内，藉此而增強該重組型宿主細胞生 產一選定的基因產物的能力以及幫助該重組型宿主細胞纾 解由於該基因產物的過量生產所致的細胞内壓力 (intracellular stress) 〇 L jltr 15 發明背景 「重組型多肽/蛋白質（recombinant polypeptide/protein) 的生產」堪稱是生物技術領域中的一個非常重要的基因工 程技術，其基本原理在於將一會表現一所欲基因產物[例 如，工農業用酵素、治療性蛋白質(therapeutic proteins)、 2〇 干擾素（interferons)、間白素（interleukins)、激素 (hormones)、生長激素（growth hormones)、抗原性多肽 (antigenic polypeptides)、抗體（antibodies)]的目標基因 (target gene)選殖至一個適當的載體(vector)上，隨後將所形 成的重組型載體輸送至一勝任的宿主細胞(competent host 1305230 cell)中，由此所形成的重組型宿主細胞(recombinant host cell)可於一適當的培養基與培養條件下進行培養，並於適 當時機誘導該目標基因的表現，俾以達到大量生產所欲基 因產物的目的。 5 迄今在重組型多肽/蛋白質的生產上，大腸桿菌 coh·)是一最被廣泛運用且最為成功的宿主細 胞，而由此菌種所研發出的質體載體種類亦相當多，包括： 高複製數目的質體型態(如colE1)、中複製數目的質體型態 (如pl5A)、低複製數目的質體型態（如pSClOl)以及以溫度 10控制質體複製數目的質體型態(如R1)等等(S.C. Makrides d β/· (1996)，Mi’craWo/·尺ev.，60:512-538)。此等被研發建構出 的質體載體往往具有一可誘導的人工啟動子（inducible artificial promoter)，而一目標基因若被選殖位在該人工啟 動子的下游區域，便可達到調控該目標基因的表現的目的 15 (if a target gene is cloned downstream the artificial promoter, the object of controlling the expression of said target gene can be achieved) 0 一般最常被使用的人工啟動子包括kc、irp 、tac、trc、 和T7啟動子等’而被用來誘導這些啟動子 2〇的方式可為加入異丙基-β-D-硫代半乳糖η底喃苔（isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖(lactose)、阿拉伯糖 (arabinose)，或是溫度的變化等等（S.C· Makrides Μ αΖ. (1996)，MzcraMo/.尺ev.,60:512-538)。另一方面，一被選殖 的目標基因若含有本身的啟動子，它可被直接地選殖至一 1305230 載體内’而虽使用此種目標基因來建構重組型載體時，通 系無/員使用誘導的方式來誘導重組型多肽/蛋白質的生產。 疋以何種方式將目標基因選殖至質體載體上， 欲生產重組型多肽/蛋白質，就必須將含有被選殖的目標基 5因的重組型質體栽體輸送至宿主細胞内（transfer into host Cell) ’並以所形成的轉形宿主細胞(transformed host cell)作 為重組型多肽/蛋白質的生產工廠。但是，有許多因素可能 造成被植入於轉形宿主細胞中的質體載體不穩定而流失， 這些因素包含’例如：培養基的構成組份、宿主細胞的培 10養條件、質體以及宿主細胞本身的特性，以及被表現的多 肽/蛋白質產物具有毒性等。因此，基於質體載體的穩定性 問題’也可考慮藉由採用同源性基因重組（homologous recombination)以及嗤菌體（bacteri〇phage)和移動子 (transPoson)的方式來將目標基因插入至(insert into)細胞染 15 色體中（A. Haldimann d 从（2001)，J fiacimi/.，183: 6384-6393) ° 依據現今生物技術領域所存在的知識與技術，理論上 幾乎源自於各種不同生物來源的基因都可於大腸桿菌 的細胞内被表現，而有關的操作技術也已 2〇相當成熟。但疋，當付諸產業上的實施時，仍有一些問題 亟待解決。例如，當被誘導以大量生產重組型多肽/蛋白質 時，經轉形的細菌細胞往往會承受極大的生理代謝負擔 (metabolic burden)。而所謂的「細胞生理代謝負擔」是指 轉形宿主細胞因為生產一重組型多肽/蛋白質而致使細胞 1305230 的生長緩慢’進而觸發壓力反應（stress responses)(T. Schweder et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:330-337)。結果’細胞内會產生大量的熱休克蛋白質（heat shock proteins)’而引發被生產的重組型多肽/蛋白質遭受到 5 分解攻擊的命運（H. Bahl ei αΖ. (1987)，Ge狀 Dev·, 1:57-64)。熱休克蛋白質的產生亦有可能造成細胞生長遲緩 (C_G_ Kurland 以 α/. (1996)，Mo/· Mz’craWo/·, 21:1-4)，或是引 發rRNAs的破壞瓦解並造成核糖體的損失，進而導致細胞 死亡（H. Dong d αΛ (1995)，《/. Bacien'i?/·，177:1497-1504)。 10 值得注意的是’由轉形宿主細胞所大量生產出的重組型多 肽/蛋白質，無論是否與宿主細胞的代謝生長相關或是否具 有毒性，均可能於轉形宿主細胞内引發壓力反應，以致無 法達到大量生產重組型多肽/蛋白質的目標。 由於重組型多肽/蛋白質的高生產量攸關生技工業的 15 產業競爭力，如何克服上述問題以達到重組型多肽/蛋白質 的局生產量的目標’即成為生物技術產業上的一個極為重 要的研發課題。 另一方面，在各種不同的生物製程(bioprocesses)中， 對有氧地生長中的細胞培養物（aerobically growing cell 20 cultures)維持一適當的氧氣供應，是一重要的問題。 透明顫菌屬（細菌是一群可於缺氧的環境 (oxygen-poor environments)下生長的長絲狀需氧性細菌 (filamentous aerobic bacteria)。該屬的細菌在低氧條件 (hypoxic conditions)下的生長會導致一種可溶性金基質蛋 1305230 白質（sobulbe heme protein)(次單位MW 15,775)的合成有一 為數倍的誘發。該血基質蛋白質後來被證實是一種細菌性 血紅蛋白（bacterial hemoglobin)，它和真核生物的血紅蛋白 (eucaryotic hemoglobins)具有一顯著的光譜性（speactral) 5 (Webster et al. (1974), Journal of Biological Chemistry 249:4257-4260)、結構性（structural)(Wakabayashi d <2/. (1986)，Nature, 322:481-483)以及動力學上的（kinetic)(Orii et al. (1986), Journal of Biological Chemistry 261:2978-2986) 同源性(homology)(參照US 5,049,493)。 10 於C. Khosla等人的先前研究中，透明顫菌物種 (V/ireosd/Za sp.)的血紅蛋白（hemoglobin)基因被選殖至大 腸桿菌細胞内並被表現(C. Khosla and J.E. Bailey (1988)， Mo/_ Gen. Genei.，214:158-161)，而且在低氧條件(hypoxic condition)的發酵培養過程中，帶有透明顫菌jk紅蛋白 15 (Viirei^d/Ζα hemoglobin)基因的重組型大腸桿菌菌株的生 長性質較諸於野生型菌株有獲得明顯改善，例如，生長較 為快速、細胞總質量增加(C. Khosla and J.E. Bailey (1988)， Nature, 331:633-635) 0 於授予C. Khosla等人的USP 5,049,493中揭示有關於透 2〇 明顫菌血紅蛋白的核苷酸序列，包括一編碼該蛋白質的結 構基因，以及一基因啟動子/調控子可用於對DNA序列的轉 錄/轉譯(transcription/translation)進行藉由外部性控制的選 擇性調控（selective regulation by external control);以及含有 此等核苷酸序列的質體載體，它們可用於增進細胞的生長 1305230 特性以及提高細胞的各種蛋白質與代謝物的生產。該透明 顫菌企紅蛋白可以促進需氧性微生物在具有充足的或減低 的或低量的氧氣環境下的生長以及產物合成特性。 另有文獻報導，在低氧條件的發酵培養過程中，生產 5透明顫菌血紅蛋白的重組型大腸桿菌可以有效地增加細胞 本身蛋白質的生成量（C Khosla以0/. (1990), 伽/kWy，8:849-853)以及重組型α_殿粉酶(a-amylase) 的產量（M. Khosravi 以 α/· (199〇)，心細·< 24:19〇_194)。此 外，當以枯草桿菌似如㈣和中國倉鼠卵巢細胞 10 (Chinese hamster ovary ceu)作為宿主細胞，在低氧條件 下’含有透明顫菌血紅蛋白的重組型細胞同樣地可以生產 出較高量的重組型蛋白質(P.T. Kallio and J.E.Bailey (1996)， Biotechnol Prog., 12: 31-39 ； G.J. Pendse and J.E. Bailey (1994)，历oie/rno/· ⑼g.，44:1367-1370)。 15 有趣的是，相較於野生型菌株，生產透明顫菌血紅蛋 白的重組型大腸桿菌細胞内的NAD(P)H的生產速率降低 2.4倍’這個結果顯示，生產透明顫菌血紅蛋白的重組型細 胞内是處於氧化狀態（P.S. Tsai以α/_ (1995)，B/oiec/md fi/oeng.，49: 347-354)。 20 一般而言，在正常的細胞生理狀況下，大腸桿菌細胞 内是處於還原狀態，因此位於細胞質内的蛋白質不易形成 雙硫鍵(disulfide bond)。但是，目前已知有兩種細胞質内酵 素（intracellular enzymes)，如核糖核普酸還原酶 (ribonucleotide reductase)和氧化壓力反應轉錄因子 10 1305230 (oxidative response transcription factor, OxyR)，在它們參與 的反應周期中可以形成雙硫鍵，此種蛋白質過渡雙硫鍵的 形成有賴於細胞内的硫氧化還原蛋白（thioredoxin)和榖胱 甘肽-榖胱還原氧化素(glutathione/glutaredoxin)反應途徑機 5 制（A· Aberg ei a/· (1989)，所〇/. C/ie附.，264:12249-12252 ; M. Zheng d α/· (1998), Science，279:1718- 1721)。曾有文獻 報導，在大腸桿菌中大量生產硫氧化還原蛋白（thioredoxin) 可以促進細胞内的還原狀態，而有助於所生產真核生物細 胞的蛋白質的溶解性（E.R. LaVallie αΖ. (1993), 10 Bio/Technology, 11:187-193 ； T. Yasukawa et al. (1995), J Biol Chem., 270:25328-25331) ° US 2003/0167524 Al揭示一種用於生產與油體缔合的 重組型蛋白質（recombinant proteins in association with oil bodies)的改良方法，該重組型蛋白質可為：第一和/或第二 15 重組型多肽(first and/or second recombinant polypeptides)、 多元性蛋白質複合物(multimeric-protein-complexs)、異體多 元性蛋白質複合物(heteromultimeric-protein-complexs)、多 元性融合蛋白質(multimeric-fusion-proteins)、異體多元性融 合蛋白質（hetero-multimeric-fusion-protein)、免疫球蛋白多 20 肽鏈（immuiioglobulin-polypeptide-chains)、免疫球蛋白 (immunoglobins)、氧化還原融合多肽（redox-fusion-polypeptides)和/或硫氧化還原蛋白相關的蛋白質 (thioredoxin-related proteins)，其中該第一重組型多肽是一 硫氧化還原蛋白（thioredoxin)，而該第二重組型多肽是一硫 11 1305230 氧化還原蛋白-還原酶(thioredoXinredUCtase) 〇 但是，就申請人所知，要以當今生物技術領域所存在 的技術來達成高產量的重組型蛋白質的目標上，仍有困 難。因此，本技藝仍然存在有一需要來發展出新技術以改 5進重組型多肽/蛋白質的生產。 【發明内容】 發明概要 虽運用轉形宿主細胞來過量生產一所欲的重組型蛋白 質時，有可能在轉形宿主細胞内引發所謂的壓力反應或生 10理負擔，進而導致轉形宿主細胞無法大量生產該重組型蛋 白質。因此，申請人嘗試提供一種兼具有效和通用性的解 決方法，俾以達到大量生產重組型蛋白質的目的。 於是，在第一個方面，本發明提供一種用以提高一選 疋的基因產物於一重組型宿主細胞内的生產的方法，其包 15 含下列步驟： (a)將一編碼該選定的基因產物的基因序列、—包含有 一編碼硫氧化還原蛋白的第一核酸序列（nucleic acid sequence)以及一編碼血紅蛋白的第二核酸序 列植入至一宿主細胞内； 20 (b)將步驟(a)所形成的重組型宿主細胞培養於一合適 的培養基中，俾以容許該基因序列的表現；以及 (c)收穫被表現的基因產物。 在第一個方面，本發明提供一種可表現一選定的基因 產物的重組型宿主細胞(recombinant host cell)，其包含有一 12 1305230 編碼該選定的基因產物的基因序列，以及―編碼硫氧化還 原蛋白的第一核酸序列和一編碼血紅蛋白的第二核酸序 列。 在第三個方面’本發明提供可供上述方法的實施以及 5上述重組型宿主細胞的生成的核酸建構物（nucleic acid construct)，其包含有一編碼硫氧化還原蛋白的第一核酸序 列（nucleic acid sequence)以及一編碼血紅蛋白的第二核酸 序列。本發明亦提供攜帶有該核酸建構物的載體。 本發明的技術可以用來改善生產重組型蛋白質的轉形 10宿主細胞的性質，例如蛋白質的產量、抗蛋白質毒害的能 力、保護細胞内被生成的蛋白質不被分解以及維持細胞内 核糖體的完整性。 依據本發明，可以促進轉形宿主細胞在好氧條件 (aerobic conditions)下生產重組型蛋白質的效能，可以有效 15縮短發酵培養的時間，並且有利於轉形宿主細胞在高細胞 密度下的培養操作。 此外，本發明的實施不受限於使用特定的宿主細胞， 而可以運用到各類宿主細胞’包括細菌、酵母菌、真菌、 植物細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等，並可用來生成各 20種形式的蛋白質，包括位於細胞質（cytoplasm)或細胞間質 (periplasm)内的蛋白質、位於細胞膜(membrane)上或細胞外 (extracellular)的蛋白質，以及工業、農業、食品、環境、 水產業和畜牧業用的酵素，尤其是醫藥用蛋白質和胜肽， 諸如干擾素、人類和動物激素、免疫性抗原和抗體等。 13 1305230 本發明的上述以及其他目的、特徵與優點，在參照以 下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得 明顯，在圖式中： 囷式簡單說明 5 圖1是一顯示質體PUHE21-2的架構的圖，其中含有： pMBl ori’質體pMBl的複製源點；ρΑ1，Τ7Α1啟動子；Apr， 胺苄青黴素抗性基因；Seal，限制酶Seal切割位址；以及多 重選殖位址(multiple cloning sites, MCS)，其中所包含的核 糖體結合位址(ribosome binding site, RBS)與限制酶切割位

10 址（restriction enzyme cutting sites)被標示於MCS 框（MCS frame)内； 圖2是一顯示質體pA199A-2的架構的圖，其中含有： pMBl ori，質體pMBl的複製源點；pa1，T7A1@動子；以小 iac抑制蛋白質基因；，πτϊ5基因轉錄終止位址 15 (translation termination site) ; Apr，胺苄青黴素抗性基因； WrMl ’限制酶A^mI切割位址；以及多重選殖位址，其中所 包含的核糖體結合位址(RBS)與限制酶切割位址被標示於 MCS框内； 圖3是一顯示質體pGB2的架構的圖，其中含有：pS(：101 20 ori，質體PSC101的複製源點；SpcVStf，壯觀黴素/鏈黴素 抗性基因（spectinomycin/streptomycin resistance gene);以及 夕重選殖位址，其中所包含的限制酶切割位址被標示於 MCS框内； 圖4是一顯示質體pGB-VHb的架構的圖，其中含有： 14 1305230 pSClOl (Hi ’質體pSC101的複製源點；v劝’透明顫菌血紅 蛋白的結構基因（structural gene); PA丨，T7 A1啟動子；, /π抑制蛋白質基因；以及SpcVStrr，壯觀黴素/鏈黴素抗性 基因； 5 圖5是—顯示質體PJF118EH的架構的圖，其中含有： pBR322 〇d，質體pBR322的複製源點；4，加啟動子； ’ /此抑制蛋白質基因；rrnfiT1T2，基因轉錄終止 位址，iVrwI，限制酶jyrMi切割位址；Apr ,胺苄青黴素抗性 基因；以及多重選殖位址，其中所包含的限制酶切割位址 10 被標示於MCS框内； 圖6是一顯示質體pGB-Trx的架構的圖，其中含有： pSClOl ori，質體pSC101的複製源點；irxA，硫氧化還原蛋 白的結構基因；Ptac，啟動子；Zac/q，；ac抑制蛋白質基 因；以及Spc7Strr，壯觀黴素/鏈黴素抗性基因； 15 圖7是一顯示質體pJF-TrxFus的架構的圖，其中含有： pBR322 ori，質體PBR322的複製源點；Ptac，咖啟動子； irxA ’硫氧化還原蛋白結構基因（不含有終止密碼子）； /Mq，kc抑制蛋白質基因；iW*Ml，限制梅#rwI切割位址； mzfiTlT2，rrnfi基因轉錄終止位址；Apr，胺爷青徽素抗性 20基因’以及多重選殖位址’其中所包含的限制酶切割位址 被標示於MCS框内； 圖8是一顯示質體pGB-TVl的架構的圖，其中含有： pSClOl ori ’質體PSC101的複製源點；irM，硫氧化還原蛋 白的結構基因；叹办，透明顫菌血紅蛋白的結構基因；Ptac， 15 1305230 iac啟動子；/ac/q，/ac抑制蛋白質基因；以及Spcr/Strr，壯 觀徽素/鍵徵素抗性基因； 圖9是一顯示質體PGB-TV2的架構的圖，其中含有： pSClOl 〇ri，質體pSC101的複製源點；irjcA，硫氧化還原蛋 5白的結構基因；v<^，透明顫菌血紅蛋白的結構基因；puc， iflc啟動子；pA1，Τ7 A1啟動子；Zac/41，/π抑制蛋白質基因； 以及Spc7Strr，壯觀黴素/鏈黴素抗性基因； 圖10是一西方墨點分析圖（Western blot)，其顯示以透 明顫菌血紅蛋白的一次抗體來免疫檢測經n>TG誘導的大腸 10 桿菌重組型菌株BL21(DE3)/pGB-VHb的透明顫菌血紅蛋白 生產情形，其中徑1:蛋白質標準物(ProSieve® Color Protein Marker，Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導；徑3 : 以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示透明顫菌血紅蛋白的 位置； 圖11是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-Trx的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 20 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex

BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3 :以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白的位 16 1305230 置； 圖12是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21 (DE3)/pGB-TV 1的硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 5 白的融合蛋白質生產情形，其中徑1:蛋白質標準物 (ProSieve® Color Protein Marker，Cambrex BioScience);徑 2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑3 :以30 μΜ IPTG 誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以100 μΜ IPTG誘導的菌 株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白 10 質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 白的融合蛋白質的位置； 圖13是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-TV2的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 15 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex

BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3:以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4:以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白的位 20 置； 圖14是一西方墨點分析圖，其顯示以透明顫菌血紅蛋 白的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-TV2的透明顫菌血紅蛋白生產情形，其中 徑 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker， 17 1305230

Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質 樣本；徑3 :以30 gMIPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 : 以ΙΟΟμΜΙΡΤΘ誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示透明顫菌血 5 紅蛋白的位置； 圖15是一顯示質體pET-IFN的架構的圖，其中含有： ori，pBR322複製源點；fl 〇ri，fl複製源點；ifn〇c2，人類 干擾素0t2基因；T7 ’ T7啟動子；iVdel，限制酶iVt/el切割位 址；ΧΛοΙ，限制酶Χ/ιοΙ切割位址；/ac/，kc抑制蛋白質基因； 10 以及Apr，胺苄青黴素抗性基因； 圖16是一蛋白質電泳圖，其中徑1 :蛋白質標準物(MBI Fermentas);徑2 :未經誘導的對照菌株(R〇setta(DE3)/pET-IFN/pGB2);徑3 :經誘導後的對照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2);徑4 :經誘導後生產出透明顫菌血紅蛋白的菌 15 株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb);徑5 :經誘導後生產 出硫氧化還原蛋白的菌株（Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx);以及徑6 :經誘導後生產出硫氧化還原蛋白和透明顫 .菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株（RosettaCDESVpET-iFN/pGB-TVl) ; 20 圖17是一顯示質體pET-estll的架構的圖，其中含有： ori，pBR322複製源點；fl ori，fl複製源點；αίΑ，香茅醇 假單胞菌ciirawd/o/⑻的酉旨解酶基因；Τ7，Τ7 啟動子；，限制酶切割位址；Χ/ισΙ，限制酶 切割位址；Zac/，kc抑制蛋白質基因；以及Apr，胺苄青黴 18 1305230 素抗性基因； 圖18是一顯示質體pAl-AspA的架構的圖，其中含有： pMBl ori，pMBl複製源點；flipA，天冬胺酸分解酶基因； fiamM ’限制酶5歸//1切割位址；心/1，限制酶5^/ι切割位 5 址，πτζβΤ1Τ2，πτϊβ基因轉錄終止位址；pA1，Τ7 Α1啟動 子；kc/，kc抑制蛋白質基因；以及Apr，胺苄青黴素抗性 基因； 圖19是一蛋白質電泳圖，其顯示經過發酵培養7小時 (上方）與20小時(下方)後’被誘導生產天冬胺酸分解酶的重 10 組型菌株的蛋白質生產情形，其中徑1:蛋白質標準物(MBI Fermentas);徑2 :未生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原 蛋白的菌株(\^78632/口八1-八8卩八/卩032);徑3:生產透明顫菌 血紅蛋白的菌株(VJS632/pAl-AspA/pGB-VHb);徑4 :生產 硫氧化還原蛋白的菌株(VJS632/pAl-AspA/pGB-Trx);徑 15 5 :同時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (VJS632/pAl-AspA/pGB-TV2);徑6 :生產硫氧化還原蛋白 和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白的菌株 (VJS632/pAl-AspA/pGB-TVl);以及箭頭指示天冬胺酸分 解酶的位置；以及 20 圖20是一顯示質體pET20-Z的架構的圖，其中含有： ori，pBR322複製源點；fl ori，fl複製源點；，半乳糖 苷分解酶的基因；T7，T7啟動子；，限制晦Λ^/ei切割 位址；所以111 ’限制酶所以111切割位址；以及Apr，胺窄青 黴素抗性基因。 19 1305230 I：實施方式3 較佳實施例之詳細說明（發明的詳細說明） 關於要如何達到重組蛋白質高產量的目標，綜觀當今 生物技術領域所存在的問題，申請人認為可由兩個方面來 5 尋求解決方策：第一個方面是確保細胞的生長或有效提高 細胞的生長密度，而另一個方面是有效提高重組蛋白質的 產量。 雖然硫氧化還原蛋白基因和透明顫菌血紅蛋白基因已 有被使用於轉形生產重組型蛋白質的宿主細胞，迄今未見 10 有任何文獻資料明示或暗示，這兩個基因當被組合使用 時，會對於轉形宿主細胞產生何種效用。 而申請人經由研究而發現，若將硫氧化還原蛋白基因 和透明顫菌血紅蛋白基因一起輸送至宿主細胞内，可賦予 轉形宿主細胞下列效用：保護所生產的重組型蛋白質不被 15 分解，促進細胞生長而不受大量生產蛋白質所引發的生理 代謝負擔的負面影響，以及增進重組型蛋白質的產量。而 從所得實驗結果來看，這個策略確實可以有效解決上述所 提的在大量生產重組型蛋白質時所碰到的問題，而對於生 物技術產業將會有極為重要的貢獻。 20 於是，本發明提供一種用以提高一選定的基因產物於 一重組型宿主細胞内的生產的方法，其包含下列步驟： (a)將一編碼該選定的基因產物的基因序列、一包含 有一編碼硫氧化還原蛋白的第一核酸序列(nucleic acid sequence)以及一編碼血紅蛋白的第二核酸序 20 1305230 列植入至一宿主細胞内； (b) 將步驟(a)所形成的重組型宿主細胞培養於—合適 的培養基中，俾以容許該基因序列的表現；以及 (c) 收穫被表現的基因產物。 5 “核酸”或“核酸序列，，等術語意指呈單股或雙股形式的 去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且包含已知的天 然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化 學仿效物（aritificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核 酸’’此術語可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸，，和 1〇 “聚核苷酸”交換使用。 除非另有指明’一核酸序列除了於本文中所顯示的特 疋序列外’亦涵蓋其互補序列（complementary sequences)以 及守恒性類似物(conservative analogs)，例如具有簡併性密 碼子取代（degenerative codon substitutions)的同源性序列 15 (homologous sequences)。特別地，簡併性密碼子取代可以 經由’例如，在一核酸序列中的一或多個被選定的密碼子 的第3位置處替換以其他的核苷酸殘基而被產生。 用來操作核酸的技術，像是例如用來於序列中產生突 變(mutation)、次選瘦(subcloning)、標示(labelling)、探針檢 20 測(probing)、定序（sequencing)、雜交(hybridization)等等， 在科學和專利文獻中皆有詳細說明。參見，例如，Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ed., 21 1305230

John。Wiley & Sons, Inc.，New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen ed.，Elsevier, N.Y· (1993)。 5 如本文中所用的，“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”等術語 可被相互交換使用，且意指一種由胺基酸殘基所構成的聚 合物，其中一或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸 (naturally occurring amino acids)或人造化學仿效物。 如本文中所用的，“細胞”、“宿主細胞”、“轉形宿主細 10 胞(transformed host cell)”與“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”等術語可被互換使用，而且不僅指特定的個體細 胞（individual cells)還包括繼代培養的子代（sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代細胞可’ 能在後續世代中因為突變作用或環境影響而發生特定的遺 15 傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能 與母細胞並不相一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用 的術語的範疇内。 可被使用於本發明方法的步驟(a)中的宿主細胞可以是 原核生物細胞(prokaryotic cells)或真核生物細胞(eukaryotic 2〇 cells) ’ 且為未轉形/轉染的細胞(non_transf〇rmed/transfected cells)，或是已被至少一種其它重組型核酸序列轉形/轉染的 細胞（transformed/transfected cells)。 適用於本發明的原核生物細胞包括，但不限於，源自 於下列的細胞：細菌’例如大腸桿菌迟、枯草桿菌 22 1305230 似如伯）、乳桿菌屬物種#·)、鏈黴 菌屬物種（《Sirepiomyc^印.）以及沙門氏傷寒桿菌 (Salmonella typhi) _，蓋綠藻（Cyanobacteria) ’，故線菌 (Acii’womiyceies)等等。 5 適用於本發明的真核細胞包含，例如，真菌細胞、原 生動物(protozoa)細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以 及人類細胞。合適的真菌細胞代表例是酵母細胞，例如麵 包酵母菌（iS^cc/iaromyces 或嗜甲醇酵母菌 。合適的植物細胞是衍生自裸子植物 10 (gynosperms)或被子植物（angiosperms)，以單子葉植物 (monocots)與雙子葉植物(dicots)為佳，特別是作物(crops)， 而且疋取自這些植物的根、莖、棄或分生組織(meristem) 等部位，並以原生質體(protoplasts)或癒舍組織(cauus)的形 式被培養。合適的昆蟲細胞代表例是果蠅S2細胞以及衍生 15 自秋行軍蟲(印Mopera 的Sf21細胞與Sf9細胞。 合適的動物細胞可以是培養的細胞或活體内細胞，且較佳 為脊椎動物細胞’更較佳為哺乳動物細胞，並且是衍生自 動物的腎臟、肝臟、肺臟、卵巢、乳房、皮膚、骨骼、血 液等器官或組織’其中的代表例例如CHO、COS、BHK、 20 HEK-293、Hela、NIH3T3、VERO、MDCK、MOLT-4、Jurkat、 K562、HepG2等等。 適用於進行DNA重組技術的宿主細胞的適當培養基以 及培養條件’在生物技術領域中已被詳知。例如，可將宿 主細胞培養在本技藝中所慣用的發酵生物反應器、搖動繞 23 1305230 瓶、試管、微滴盤與平淺培養皿中，且該培養可在適合於 重組型宿主細胞生長的溫度、pH值及氧含量下進行。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該步驟(a)的進行 可藉由將該基因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序列 5 植入至一可於該宿主細胞内表現的載體内，以及將由此所 形成的重組型載體輸送至該宿主細胞内。 在依據本發明的另一個較佳具體例中，該步驟(a)的進 行是藉由將該基因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序 列分別植入至一可於該宿主細胞内表現的載體内，以及將 10 由此所形成的重組型載體一起輸送至該宿主細胞内。 在依據本發明的另一個較佳具體例中，該步驟(a)是藉 由下列次步驟來進行： (i) 建構一可於該宿主細胞内表現並且包含有該第一 核酸序列以及該第二核酸序列的第一重組型載 15 體； (ii) 建構一可於該宿主細胞内表現並且包含有該基因 序列的第二重組型載體；以及 (iii) 將該第一重組型載體與第二重組型載體輸送至該 宿主細胞内。 20 在依據本發明的一個較佳具體例中，於該次步驟⑴中 所建構的該第一重組型載體進一步包含有一可誘導的啟動 子序列用以控制該第一核酸序列與該第二核酸序列的表 現。 在依據本發明的另一個較佳具體例中，於該次步驟⑴ 24 1305230 中所建構的該第一重組型載體進一步包含有一可誘導的第 一啟動子序列用以控制該第一核酸序列的表現，以及一可 誘導的第二啟動子序列用以控制該第二核酸序列的表現， 該第一啟動子序列與第二啟動子序列彼此不相同。 5 “啟動子序列”此術語是指一DNA序列，其通常是位在 一DNA聚合物内所存在的一個基因之前方，並且提供一用 於起始該基因的轉錄以生成xnRNA的位址(site for initiation of the transcription of said gene into mRNA)。適用於本發明 的實施的啟動子序列可以是衍生自病毒(viruses)、噬菌體 10 (bacteri〇Phages)、原核生物細胞或真核生物細胞，且可為 一組成性啟動子（constitutive promoter)或是一可誘導的啟 動子（inducible promoter)。 依據本發明，該編碼該選定的基因產物的基因序列、 該編碼硫氧化還原蛋白的第一核酸序列與該編碼血紅蛋白 15的第二核酸序列可分別地被可操作地連接至（operatively linked to)—啟動子，特別是一可誘導的啟動子。 “可操作地連接，，此術語是指一第一序列被放置於足夠 近於一第二序列，而使得該第一序列可以影響該第二序列 或該第二序列所控制的區域。例如，一啟動子序列可操作 20地連接-基因序列，且通常是在該基因序列的5，位置，而 使得該基因序列在該啟動子序列的控制下表現。此外，— »周即序列可以可操作地連接一個啟動子序列，俾此強化該 ^子序列促進轉錄的能力。在這情況下，該調節序列通 常是位在該啟動子序列的5,位置。 25 1305230 適用於本發明的該啟動子序列較佳地是衍生自下列任 一者：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類細 胞 '植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。例如， 可被使用於細菌細胞的啟動子包含，但不限於，如c啟動子、 5 T7啟動子、T7 A1啟動子、/ac啟動子、啟動子、加啟動 子、flraBAZ)啟動子以及動子等。.可被使用於植物 細胞的啟動子包含，例如，35S CaMV啟動子、肌動蛋白 (actin)啟動子、泛素(ubiquitin)啟動子等。適用於哺乳動物 細胞的調節要素包含CMV-HSV胸腺核普激酶啟動子、 10 SV40、RSV-啟動子、CMV增強子或SV40增強子。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該編碼硫氧化還 原蛋白的第核酸序列與該編碼血·紅蛋白的第二核酸序列 被植入於一第一載體内，而該編碼該選定的基因產物的基 因序列被植入至一第二載體内，且該第一載體與該第二載 15體各自具有一可誘導的啟動子序列來控制該第一核酸序列 與第二核酸序列以及該基因序列的表現。 在依據本發明的—個較佳具體例中，被植入於該第一 重組型載體内的該第一核酸序列與第二核酸序列的表現是 文同一個啟動子所控制，例如，如〔啟動子、丁7啟動子、 2〇 A1啟動子、/π啟動子、冲啟動子、的啟動子、㈣似〇啟 動子或啟動子，較佳是—加^_啟動子。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該第一核酸序列 與該第二核酸序列被連結成編碼一由硫氧化還原蛋白與血 紅蛋白所構成的融合蛋白質。 26 1305230 在另一個較佳具體例中，被植入於該第一重組型載體 内的該第一核酸序列與第二核酸序列的表現是各自為一選 自於下列所構成的群組中的不同啟動子所控制：iac啟動 子、T7啟動子、Τ7 A1啟動子、/ac啟動子、冲啟動子、的 5 啟動子、啟動子以及啟動子。在一更佳具體 例中，該第一重組型載體包含有一iflC啟動子用以控制該第 一核酸序列的表現以及一T7 A1啟動子用以控制第二核酸 序列的表現。 適用於本發明的載體包含一般遺傳工程技術中所使用 10 的載體’例如，嗤菌體(bacteriophages)、質體(plasmids)、 黏接質體（cosmids)、病毒（viruses)或反轉錄病毒 (retroviruses)。 適用於本發明的載體可以含有其他表現控制要素，例 如一轉錄起始位址(transcription starting site)、一轉錄終止 15 位址（transcription termination site)、一核糖體結合位址 (ribosome binding site)、一 RNA 剪接位址（RNA splicing site)、一個聚腺苷酸化位址(polyadenylation site)以及一個 轉譯終止位址(translation termination site)。適用於本發明的 載體還可包含另外的調控要素，例如轉錄/轉譯的加強子序 20 列（enhancer sequences)，以及至少一個供在適當的條件下篩 選該載體的標記基因（marker gene)或報導基因（reporter gene)。可用於本發明的標記基因包括，例如，用於真核細 胞培養物的二氫葉酸還原酶基因以及G418或新黴素 (neomycin)抗性基因，以及用於大腸桿菌與其他細菌培養物 27 1305230 的胺苄青黴素(ampicilin)、鏈黴素(streptomycine)、四環素 (tetracycline)或康那黴素(kanamycine)抗性基因。適用於本 發明的載體可再包含一編碼分泌信號(secreti〇n signai)的核 酸序列。這些序列是熟習此項技術者已知的。 5 如本文中所用的，“表現載體”此術語意指任一種重組 型表現系統’其可於活體外(b 或活體内“„ v/v0)，在 任一宿主細胞中構成地(C〇nStitutiVely)或誘導地(inducibly) 表現依據本發明的該第一核酸序列、該第二核酸序列與該 基因序列。該表現載體可為一線性或環形表現系統，且涵 10蓋保持游離基因形式或是被整合至宿主細胞的基因組内的 表現系統。該表現系統可具有或不具有自我複製的能力， 它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。 根據本發明，術語“轉染(transfection)”可與術語“轉形 (transformation)”交替地使用，並且泛指將一核酸分子被引 15進一選定的宿主細胞内的方式。依據本技藝中已知的技 術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載 體)可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞内，例如 磷酸鈣或氯化鈣媒介的轉染作用（transfecti〇n)、電穿孔法 (electroporation)、微注射法（micr〇injecti〇n)、粒子撞擊法 20 (particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用（iipos〇me_ mediated transfection)、利用細菌嗤菌體的轉染作用、利用 反轉錄病毒（retrovirus)或其他病毒[例如，牛痘病毒 (vaccinia virus)或昆蟲細胞的桿狀病毒(bacul〇virus)]的轉導 作用(transduction)、原生質體融合(pr〇t〇plast fusion)、農桿 28 1305230 菌媒介的轉形法(AgroZ?acier/wm-mediated transformation)或 其他方法。 依所使用的載體與宿主系統而定，本發明所產生的重 組型基因產物（蛋白質）可被維持在重組型宿主細胞内、被分 5 泌至培養基内、被分泌至兩個細胞膜間的空間内或被保留 在細胞膜的外表面上。由本發明方法所生成的重組型基因 產物（蛋白質）可使用多種標準蛋白質純化技術來純化，例 如，但不限於，親和力層析法、離子交換層析法、凝膠過 濾法、電泳法、逆相層析法、色層焦集法(chromatofocusing) 10 等等。較佳地，由本發明方法所生成的重組型基因產物(蛋 白質）是“呈實質純質的形式(in substantially pure form)”被 回收。如本文中所用的，“實質純質的（substantially pure)’’ 是指一被純化的蛋白質所具有的純度可使該蛋白質能有效 地作為一商業產品。 15 依據本發明，該第一核酸序列是衍生自下列任一種細 胞的硫氧化還原蛋白基因：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌 細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人 類細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該第一核酸序列 是衍生自大腸桿菌的硫氧化還原蛋白基因（irxA)。 20 依據本發明，該第二核酸序列是衍生自下列任一種細 胞的血紅蛋白或含有血基質的攜氧蛋白（heme-containing oxygen carrier protein)基因：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌 細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人 類細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該第二核酸序列 29 1305230 疋何生自透明顫菌屬物種⑽⑽此咖sp)的血紅蛋白基因 (V#)。 依據本發明的方法可被用來生產-同源性多肽或-異 源性多肽。在本發明的一個較佳具體例中，本發明方法所 5要生產的基因產物是選自於下列群組：一酵素，例如β半 乳糖苔分解峰、酉旨解酶以及天冬胺胺酸分解酶；一治療性 多肽，例如干擾素、間白素、動物或人類激素；一抗原決 定位或一抗體。較佳地，該基因產物是一源自下列之抗原 決定位·病原性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲 10 或腫瘤細胞。 本發明亦提供—種核酸建構物（nucleic acid construct)，其包含有一編碼硫氧化還原蛋白的第一核酸序 列以及一編碼血紅蛋白的第二核酸序列。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該核酸建構物可 15進一步包含有一可誘導的啟動子序列用以控制該第一核酸 序列與該第二核酸序列的表現》較佳地，該啟動子序列是 讨生自下列任一者.病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌 細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人 類細胞。依據本發明，該啟動子序列可以是選自於下列所 20 構成的群組：啟動子、T7啟動子、T7 A1啟動子、/此啟 動子、irp啟動子、ire啟動子、arafiAD啟動子以及;啟 動子，且較佳為me啟動子。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該第一核酸序列 與該第二核酸序列被連結成編碼一由硫氧化還原蛋白與血 30 1305230 紅蛋白所構成的融合蛋白質。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該核酸建構物進 V匕3有一可誘導的第一啟動子序列用以控制該第一核 酸序列的表現，以及一可誘導的第二啟動子序列用以控制 .亥第一核酸序列的表現’該第一啟動子序列與第二啟動子 序列彼此不相同。 車又佳地，該第—啟動子序列與該第二啟動子序列是各 自地何生自下列任—者：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、 真囷細胞、漆類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以 及人類、田肊依據本發明，該啟動子序列可以是各自地選 自於下列所構成的群組：加啟動子、了7啟動子、了7 ^啟 動子、冲啟動子、心啟動子★啟動子、㈣細啟動子 ，及/IPA啟動子。在依據本發明的—個較佳具體例中，該 第啟動子序列疋啟動子，而該第二啟動子序列是T7 15 A1啟動子。 本發明亦提供一種載體，其包含有一如上所述的核酸 建構物。依據本發明，該載體可進—步包含有下列至少一 者：-標記基因、一報導基因、一抗生素-抗性基因、一加 20 強子序列、—編碼—被選定的基因產物的基因、—個聚腺 誓酸化位置以及一調節序列。 本發明亦提供一種可表現-選定的基因產物的重組型 =主細胞(物福細hGst eell)，其包含有—編碼該選定的 物的基因序列，以及—編瑪硫氧化還原蛋白的第-核I序列和一編碼血紅蛋白的第二核酸序列。 31 1305230 在依據本發明的一個較佳具體例中，該基因序列、該 第一核酸序列和該第二核酸序列被攜帶於一可於該宿主細 胞内表現的載體上。在依據本發明的另一個較佳具體例 中’該基因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序列各自 被攜帶於-可於該宿主細胞内表現的載體上。在依據本發 明的另一個較佳具體例中，該第一核酸序列和該第二核酸 序列被攜帶於-可於該宿主細胞内表現的第一載體上，而 該基因序列被攜帶於〜可於該宿主細胞内表現的第二載體 上。 10 &據本發明’該第-載體可進-步包含有-可誘導的 啟動子序列用以控制該第一核酸序列與該第二核酸序列的 I現’而4啟動子序列可以是衍生自下列任_者：病毒、 細菌細胞、酵母菌細跑、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、 &蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。較佳地，該啟動子序 15列疋k自於下列所構成的群組：阶啟動子、T7啟動子、T7 Α1啟動子/ac啟動子、冲啟動子、的啟動子、㈣似微 動子以及啟料，且難W啟動子。 在依據本發明的一個較佳具體例中，被包含於該重組 型侣主、、田胞中的该第一核酸序列與該第二核酸序列被連結 2〇成編碼一由硫氧化還原蛋白與血紅蛋白所構成的融合蛋白 質。 在依據本發明的一個較佳具體例中，被包含於該重組 型宿主細胞中的該第第1體進-步包含有-可誘導的第 啟動子序歹j用以控制該第—核酸序列的表現，以及一可 32 1305230 誘導的第二啟動子序列用以控制該第二核酸序列的表現， 該第-啟動子序列與第二啟動子序列彼此不相同。 依據本發明’該第-啟動子序列與該第二啟動子序列 是各自地衍生自下列任—者：病毒、細菌細胞、酵母菌細 5胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細 胞以及人類細胞。較佳地，該第一啟動子序列與該第二啟 動子序列是各自地選自於下觸構成的群組：加啟動子、 T7啟動子、T7 A1啟動子' iac啟動子、冲啟動子、irc啟動 子、_腳啟動子以啟動子。在依據本發明的一 Η)個較佳具體例中，該第-啟動子序列是加啟動子，而該第 二啟動子序列是Τ7Α1啟動子。 依據本發明，被包含在該重組型宿主細胞内的該第一 載體進一步包含有一標記基因、一報導基因、一抗生素_抗 性基因、一加強子序列、一個聚腺苷酸化位置或一調節序 15 列。 在依據本發明的一個較佳具體例中，該第一核酸序列 與該第二核酸序列被併入於該宿主細胞的基因組DNAr。 依據本發明’該重組型宿主細胞會生產一選定的同源 性多肽或異源性多肽。在本發明的一個較佳具體例中，該 20重組型宿主細胞會生產一選自於下列群組中的基因產物： 一酵素，例如β-半乳糖苗分解酶、酯解酶以及天冬胺酸分 解酶；一治療性多肽(therapeutic polypeptide)，例如干擾素 (interferon)、間白素(interleukin)、動物或人類激素(animal or human hormone); —抗原決定位（antigenic derterminant)或 33 1305230 一抗體(antibody)。較佳地，該基因產物是〜源自下列之抗 原決定位：病原性病毒、細菌或其他微生物，寄生 蟲或腫瘤細胞。 依據本發明，該重組型宿主細胞選自於下列所構成的 5群組：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆 蟲細胞、動物細胞或人類細胞。在本發明的一個較佳具體 例中’該重組型宿主細胞是大腸桿菌細胞。 本發明將就下面實施驗例來作進一步說明，但應瞭解 的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本 10 發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗方法與材料： 本發明中所採用的實驗方法以及用於DNA選殖(DNA cloning)的相關技術，是參考本技藝中所詳知的教科書·· 15 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ’例如使用限制酶的DNA剪切反應（DNA cleavage reaction by restriction enzymes)、使用 T4 DNA黏接 酶（ligase)的 DNA黏接反應（DNA ligation with T4 DNA 20 ligase)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)、 瓊脂凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis)、硫酸十二酯 鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 、 西方墨 點分析 （Western blotting)和質體轉形法(plasmid transformation)等’而這些技 34 1305230 術都是熟悉此項技術人士可根據本身的專業素養來實施 者。例如，於下面實施例中所使用的質體轉形法是以經氯 化約（CaCl2)處理的勝任細胞（calcium chloride-treated competent cell)來進行。此外，細胞密度是使用分光光度計 5 (V530, Jasco)測量，測量波長定為550 nm，所得到的吸光值 紀錄為OD550。蛋白質濃度分析是使用蛋白質分析試劑 (Protein Assay Reagent, BioRad Co.)，並以影像分析儀 (GAS9000, UVltec)來分析定量經凝膠電泳的蛋白質。 細菌染色體(chromosome)、質體(plasmid)和DNA片段 10 的純化是分別使用Wizard®基因組DNA純化套組(Genomic DNA Purification Kit)(Promega Co.)、QIAprep® Spin Miniprep kit (Qiagen Co.)和 NucleoSpin® 核酸純化套組 (Nucleic Acid Purification Kit)(Clontech Co.)等商業化純化 套組來進行。 15 所有的限制酶(restriction enzymes)、T4 DNA黏接酶 (ligase)和 Pfu DNA 聚合酶（polymerase)是購自於 New

England Biolabs。聚合酶連鎖反應中所用的引子(primers) 是由明欣生物科技公司（台北)所合成。用於測定透明顫菌血 紅蛋白（Wireosci’/Za hemoglobin)的一次抗體（primary 20 antibody)是委託亞諾法生技公司（台北）來製備，而用於測定 硫氧化還原蛋白的一次抗體、二次抗體（sec〇ndary antibody)[被使用於本文中的二次抗體是辣根過氧化酶綴 合的山羊抗-兔IgG (horseradish peroxidase- conjugated goat anti-rabbit IgG)]以及其餘的化學藥品皆是購自於Sigma 35 1305230

Chemical Co. 〇 實施例1.構築包含有透明顫菌血紅蛋白結構基因（叹幻和 硫氧化還原蛋白結構基因(kcA)的表現質體 實驗材料： 5 於DNA選殖過程中所使用的中介細胞（intermediate cells)是大腸桿菌co//) XLl-Blue (Stratagene Co·)，並在37°C 下培養於Luria-Bertani (LB)培養基内（Miller, J.H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY)，隨後將經轉形 10 的大腸桿菌培養於添加有抗生素的培養基内[抗生素的用 量為鏈黴素(streptomycin)是使用15 pg/mL，而胺苄青黴素 (ampicillin)是使用 50 pg/mL]。 透明顫菌屬物種（Wireoxd/Za sp_)(Murray strain no. 389) 是由 Dr. Webster (Department of Biology, Illinois Institute of 15 Technology，Chicago, USA)所贈與，並在30X：下培養於一含 有1.5%酵母萃取物（yeast extract)、1·5%蛋白腺(peptone)和 0.02%醋酸鈉（sodium acetate)的培養基内。 A.構築帶有透明顫菌血紅蛋白結構基因（叹幻的重組質體 pGB-VHb 2〇 質體pGB-VHb包含有一個T7 A1啟動子用以控制透明 顫菌血紅蛋白結構基因（vgZ>)的表現，其構築方式說明如下。 根據透明顫菌血紅蛋白結構基因的核苷酸序列（Khosla C，Bailey JE. (1988)，Mo/ Ο狀ί.，214:158-161)來合成 下面兩個引子： 36 1305230 前向引子 5 -aagggatccatgttagaccagcaaacc-3 (序列辨識編號：1) 反向引子 5’-atagl£M£ccaagttttggcaacagc-3’（序列辨識編號：2)

5 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶和*Sfl/I 的切割位址(如底線所標示者）。 以使用Wizard®基因組DNA純化套組所純化出的透明 顫菌染色體作為模版(template)，並以上述兩個引子來進行 PCR反應’藉此而擴增出一含有透明顫菌血紅蛋白的結構 10 基因v#的DNA片段(0.55 kb)。之後，以NucleoSpin®核酸 純化套組來純化所擴增出的DNA片段，以限制酶 進行切割，並將所形成的切割產物併入 (incorporate)至以 fiamHIASaZI切開的質體pUHE21-2 [如圖 1 所示，此質體是得自於Dr. Bujard, Heidelbrg University, 15 Germany，且具有胺苄青黴素抗性基因、ρΜΒ 1複製源點 (replication origin)、T7 A1啟動子、限制酶Seal切割位址以 及多重選殖位址（multiple cloning site)]内，而得到質體 pUHE-VHb。 接著使用限制酶五⑺7?1/所m/III而從質體pUHE-VHb切 20 出一帶有核糖體結合位置(ribosome binding site)和透明顫 菌血紅蛋白結構基因的DNA片段，並予以粘接至以 EcoM/Z/ini/III切開的質體pA199A-2 (如圖2所示，此質體具 有胺苄青黴素抗性基因、pMBl複製源點、/fle/抑制基因、 T7 A1啟動子和多重選殖位址）(Y.-P. Chao d以.（2003)， 25 所尸广〇贫· 19: 1076-1080)，而得到質體pAlA2-VHb。 37 1305230 最後’使用限制酶ΑνΜΙ///ίηύ?ΠΙ而從質體pAlA2-VHb切 出一含有心獅制基因、T7 A1啟動子以及透明顫菌血紅蛋 白結構基因〇及幻的DNA片段’並予以併入至以Smal/Z/bdlll 切開的質體pGB2 (如圖3所示，此質體具有鏈黴素抗性基 5因、PSC101複製源點和多重選殖位址)(G. Churchwarden/. (1984)，Gene，31:165-171)，而獲得質體pGB-VHb，其架構 如圖4所示。 質體pGB-VHb是委託源資國際生物科技公司（台北）來 進行定序分析，而被證實包含有質體pGB-VHb上所含有的 10 T7 A1啟動子的核苷酸序列以及透明顫菌血紅蛋白結構基 因〇妙)的核苷酸序列。 B.構築帶有硫氧化還原蛋白結構基因（办^a)的重組質體 pGB-Trx 質體pGB-Trx包含有me啟動子用以控制硫氧化還原蛋 15 白結構基因的表現，其構築方式說明如下。 根據硫氧化還原蛋白結構基因的核普酸序列(C. J. Lim ei 此（1985)，J5acim'oZ.，163:311-316)來合成下面兩個引 子： 前向引子 20 5，-ccgMi££aaccacacctatggtgtatgc-3’（序列辨識編號：3) 反向引子 5’-ggggM££gctgcaaggcgattaag-3’（序列辨識編號：4) 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶£coi?I和 的切割位址(如底線所標示者）。 38 1305230 以使用QIAprep® Spin Miniprep kit所純化出的質體 pTrx (Invitrogen Co.)作為模版，並以上述兩個引子來進行 PCR反應，藉此而擴增出一含有硫氧化還原蛋白結構基因 〇xA)的 DNA片段(0.58 kb)。 5 之後’以NucleoSpin®核酸純化套組來純化所擴增出的 DNA片段，以限制酶進行切割，並將所形成的 切割產物併入至以五切開的質體pJFl 18EH (如 圖5所示’其具有胺苄青黴素抗性基因、pBR322複製源點、 /^^抑制基因、iac啟動子和多重選殖位址)(j.p. Furste以以 10 (1986)，Ο邮，48:119-131)，而得到質體pJF-Trx。 最後，以限制酶而從質體pJF-Trx切出一含 有/flc/q抑制基因、啟動子和硫氧化還原蛋白結構基因 ⑽焱)的DNA片段，並予以併入至以s麵廳祕π切開的質 體pGB2内’而獲得質體pGB-Trx，如圖6所示。 15 質體PGB-Trx亦是委託源資國際生物科技公司（台北） 來進行定序分析，而被證實包含有質體pGB-Trx上所含有的 iac啟動子的核苷酸序列以及硫氧化還原蛋白結構基因 (irxA)的核苷酸序列。 C.構築帶有經融合的硫氧化還原蛋白結構基因(/rjeA)和透 20 明顫菌血紅蛋白結構基因（vg6)的重組質鱧pGB-TVl 質體pGB-TVl包含有iac啟動子用以控制經融合的硫氧 化還原蛋白結構基因（ίη:Α)和透明顫菌血紅蛋白結構基因 的表現，其構築方式說明如下。 使用限制酶SamHI/Hint/III而從上述a部分中所得到的 39 1305230 夤體pUHE-VHb切出一含有透明顫菌血紅蛋白結構基因 (v奸)的DNA片段’並予以併入至以如開的質 體pKF3 (Takara Shuzo Co.)内，而得到質體pKF-VHb。

接著使用限制酶而從質體pKF-VHb切出一 5含有透明顫菌血紅蛋白結構基因（v^>)的DNA片段，並予以 併入至以切開的質體pBiuescript n_SK (StratageneCo.)内，而得到質體pBlue_vHb。 之後，使用限制酶而從質體pBlue-VHb切出一 含有完整的透明顫菌血紅蛋白結構基因幻的DNA片段， 10並予以併入至以Smal/Rsil切開的質體pjF_TrxFus (如圖7所 示’其具有胺苄青黴素抗性基因、pBR322複製源點、 抑制基因、me啟動子、限制酶;^^丨切割位址以及多重選殖 位址，並且在加c啟動子下游處植入有一個不含有終止密碼 子的硫氧化還原蛋白結構基因）(Y._P. Chao以(2000)， 15 却〆始.历如，54: 348-353)，而得到質體 pJF-Trx/VHb。 最後，使用限制酶Α^·μΙ/历Will而從質體pjF-Trx/VHb 切出一個含有kc/41抑制基因、加c啟動子以及經融合的硫氧 化還原蛋白結構基因（ί^Α)和透明顫菌血紅蛋白結構基因 20 (叹幻的dna片段，並予以併入至以切開的質體 pGB2，而獲得質體pGB_Tvl，如圖8所示。 質體pGB-TVl亦是委託源資國際生物科技公司（台北） 來進行定序分析，而被證實包含有質體15(3小丁乂1上所含有 的me啟動子的核苷酸序列以及經融合的硫氧化還原蛋白結 40 1305230 構基因OjcA)與透明顫菌血紅蛋白結構基因的核苷酸 序列。 D.構築帶有硫氧化還原蛋白結構基因(ίη:Α)和透明顫菌血 紅蛋白結構基因（ν#)的重組質體pGB· TV2 5 質體pGB-TV2包含有T7 A1啟動子以及啟動子分別 用以控制透明顫菌血紅蛋白結構基因（V0)與硫氧化還原蛋 白的基因（irjcA)的表現，其構築方式說明如下。 以限制酶&αΙ/Ηίηί/ΙΙΙ而從上述A部分中所得到的質體 pUHE-VHb切出一個含有T7 A1啟動子和完整的透明顫菌 10 血紅蛋白結構基因（vgb)的DNA片段，同時以限制酶 "rwIAB麵Μ而從上述B部分中所得到的質體PJF-Trx切出一 個含有制基因、加c啟動子以及完整的硫氧化還原蛋 白結構基因（ίη：Α)的DNA片段，然後將這兩個DNA片段併入 至以切開的質體pGB2内，而獲得質體 15 pGB-TV2(圖 9)。 質體PGB-TV2亦是委託源資國際生物科技公司（台北) 來進行定序分析’而被證實包含有如圖9所示的載體架構， 其中透明顫菌也紅蛋白結構基因（叹的是位在T7 A1啟動子 的下游’而硫氧化還原蛋白結構基因（ίη：Α)是位在iac啟動子 20 的下游。 實施例2·以大腸桿菌來生產硫氧化還原蛋白、透明顫菌血 紅蛋白以及硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 白的融合蛋白質 依照上面“一般實驗方法”中所述的質體轉形法，將實 41 1305230 施例1中所得到的重組質體pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TVl 和pGB-TV2分別轉形至大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen Co_)中，而得到重組型菌株BL21(DE3)/pGB_VHb、 BL2l(DE3)/pGB-Trx、BL2l(DE3)/pGB-TVl 和 BL21(DE3)/ 5 pGB-TV2。 由固態培養皿點選出各個重組型菌株的菌落，並予以 接種至5 mL含有15 pg/mL鏈黴素的LB培養基内，於37°C下 培養過夜。之後，將經過夜培養的細胞接種至一含有2〇11^ LB培養基(含15 |ug/mL鏈黴素）的250 mL燒瓶中，在細胞起 10始密度達到0.05 (〇〇55〇)後，將新接種的菌液培養於一為37 C和250 rpm的恒溫震盈培養箱内。待細胞密度達到約0.3 (OD55〇)時’將不同濃度的IPTG加入培養液中以誘導重組 型菌株來生產重組型蛋白質產物。 在加入誘導劑4小時後，以離心方式收集細胞，並以高 15 壓均質機(French Press, Thermo Spectronic，NY)將收集到的 細胞打破’然後以冷凍離心機分離細胞並回收上清液。接 著以Protein Assay Reagent (BioRad Co.)來測量所收集的上 清液内的蛋白質濃度，並以西方墨點分析來免疫檢測重組 型蛋白質的生產量。 20 西方墨點分析係依照上面“ 一般實驗方法，，中所述來進 行。將所收集的樣品（含有20 pg蛋白質）依次裝填至15%聚 丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)上進行電泳。電泳完畢 後’使用電流轉潰器（Electrophoretic Transfer Cell, BioRad)， 以怪心電流300 mA將膠片上被分離的蛋白質轉印至硝基纖 42 1305230 維素膜(nitrocellulose membrane)歷時3小時。轉印後的硝基 纖維素膜以一次抗體於室溫中進行雜交歷時3小時，然後使 用含有1%明膠(gelatin)的清洗緩衝液來重複清洗硝基纖維 素膜2次。之後，於室溫中將硝基纖維素膜浸泡在含有二二欠 5 抗體的溶液中搖晃浸泡歷時1小時，再以含有1%明膠的清 洗緩衝液來重複清洗2次，然後將硝基纖維素膜浸泡在—含 有9 mg氯萘盼(4-chloro-1 -naphthol)的呈色液中直至有色帶 出現。取出硝基纖維素膜並以去離子水清洗以終止反應。 圖10是一西方墨點分析圖，其顯示以透明顫菌血紅蛋 10 白一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的大腸桿菌重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-VHb的透明顫菌血紅蛋白生產情形，其中 徑 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker,

Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質 樣本；徑3 :以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 : 15 以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；箭頭指示透明顫菌血紅蛋 白的位置。 圖11是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 20 BL21(DE3)/pGB-Trx的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3:以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4:以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 43 1305230 的菌株的蛋白質樣本；箭頭指示硫氧化還原蛋白的位置。 圖12是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21 (DE3)/pGB-TV 1的硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 5白的融合蛋白質生產情形，其中徑1:蛋白質標準物 (ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑 2:未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑3:以3〇 μΜ iptg 誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以loo μΜ IPTG誘導的菌 株的蛋白質樣本；徑5 :以5〇〇 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白 質樣本’前頭4曰示硫乳化還原蛋白和透明顏菌血紅蛋白的 融合蛋白質的位置。 圖13是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-TV2的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 15 1·蛋白質標準物(ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex

BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3:以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4:以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；箭頭指示硫氧化還原蛋白的位置。 20 圖14是一西方墨點分析圖，其顯示以透明顫菌血紅蛋 白的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-TV2的透明顫菌血紅蛋白生產情形，其中 徑 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質 44 1305230 樣本；徑3:以30μΜΙΡΤΘ誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 : 以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以5〇f μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；箭頭指示透明顫菌血紅蛋 白的位置。 5 從圖10·14可見，未經IPTG誘導的重組型®株無法偵測 到重組型蛋白質的生成，而在加入IPTG誘導後，重組型菌 株即可被誘導而生產出重組型蛋白質，且蛋白質生產量會 隨著誘導劑劑量的增加而增高》這些結果顯示，依據本發 明而被轉形的大腸桿菌重組型菌株具有生產硫氧化還原蛋 10白、透明顫菌血紅蛋白或硫氧化還原蛋白與透明顫菌血紅 蛋白的融合蛋白質的能力，並且重組型蛋白質的生產量可 以藉由使用不同IPTG濃度來予以控制。 實施例3.以經轉形的大腸桿菌來生產異源性蛋白質一人 類干擾素(X2 15 質體pET-IFN含有T7啟動子用以控制人類干擾素α2結 構基因的表現，其構築方式說明如下。 根據人類干擾素〇c2結構基因的核苷酸序列(E. AustrUy ei α〖·（1998)，Cancer Gene 77ier.，5··247·256)來合成下面兩個 引子： 20 前向引子 5’-tgctctcatatgttg atctgcctcaaac-3’（序列辨識編號：5) 反向引子 5’-cgtg£i£S^ttattattccttacttcttaaac-3’（序列辨識編號：6) 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶和的 45 1305230 切割位址(如底線所標示者）。 以使用QIAprep® Spin Miniprep也所純化出的質體 pIFN2A [得自於國家衛生研究院的徐祖安教授，它含有被 植入在質體pET22b(+)(Novagen Co.)内的人類干擾素α2基 5因]作為模版’並以上述兩個引子來進行PCR反應，藉此而 擴增出一含有人類干擾素α2基因（iNFa2)的DNA片段。 之後’以NucleoSpin®核酸純化套組來純化所擴增出的 DNA片段，以限制酶Λ^βΙ/Χ/ιοΙ進行切割，並將所形成的切 割產物併入(incorporate into)至質體pET22b (Novagen Co.) 10 内，而得到質體pET-IFN，其架構如圖15所示。 依照上面“一般實驗方法”中所述的質體轉形法，將質 體 pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx和 pGB-TVl 分別連同質體 pET-IFN予以轉形至大腸桿菌菌株Rosetta(DE3；KNav£igen Co.)内，而得到重組型菌株Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2、 15 Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb 、 Rosetta(DE3)/pET- IFN/pGB-Trx和Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TVl。重組型菌 株的培養方法是依照實施例2中所述程序來進行，但在培養 基中同時添加鏈黴素和胺芊青黴素，使用劑量依照上面“一 般實驗方法”中所述。 20 當新接種的菌液的細胞密度達到大約0.3 (〇D55Q)時，將 500 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產 重組型蛋白質產物。當細胞生長接近早期的停滞生長時期 (加入誘導劑6小時後）時’以離心方式收集細胞並以蛋白質 電泳分析法來測量重組蛋白質的生產量。 46 1305230 蛋白質電泳分析法（即硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠 電泳)係依照上面“一般實驗方法”中所述來進行。將收集到 的細胞以沸水煮3分鐘，以冷凍離心機分離細胞並回收上清 液，接著以Protein Assay Reagent (BioRad Co.)來量測所收 5 集的上清液的蛋白質濃度。將所收集的的上清液的樣品(含 有20 gg蛋白質）依次裝填至15%的聚丙稀醯胺凝膠 (polyacrylamide gel)上進行電泳’隨後以影像分析儀 (GAS9000, UVItec)來分析定量電泳膠的蛋白質。實驗結果 如表1所示。 10 表1·經誘導生產人類干擾素(X2的重組型菌株的生長狀況 菌株 Rosetta(DE3) 質體 IPTG誘導 (μΜ) 最終細胞密度 (od550) pET-IFN/pGB2 0 4.00 500 1.54 (1)* pET-IFN/pGB-VHb 500 1.36(0.88) pET-IFN/pGB-Trx 500 2.63(1.7) pET-IFN/pGB-TVl 500 2.65(1.7) *:括弧中的數字代表是各重組型菌株相對於對照菌株的 細胞密度的比值。相對細胞密度的計算方式是將表中經 誘導後各重組型菌株所達到的細胞密度除以經誘導後 對照菌株(R〇setta(DE3)/pET-IFN/pGB2)的細胞密度。 15 在發酵終止時，未被誘導生產人類干擾素α2的菌株 (Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)的細胞密度可達到 4.0 (OD550)，但是當力口入IPTG來誘導生成人類干擾素α2時，對 照菌株一亦即不生產透明顏菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白 的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)-的生長立即受到抑 20制’這種細胞生長抑制現象也發生在生產透明顫菌血紅蛋 白的菌株(R〇setta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb)中，最終這兩者 47 1305230 的細胞密度分別只達到1 ·54 (OD55〇)和1.36 (OD550)。 但是，與被誘導生成人類干擾素〇c2的對照菌株(R0Setta (DE3)/pET-IFN/pGB2)相比較，經誘導後生產硫氧化還原蛋 白的菌株(R〇setta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)以及生產硫氧化 5 還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白的菌株 (Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TVl)的生長可以增加70%，最 後的細胞密度均可達到大約2.65 (OD550)。 此外，圖16的蛋白質電泳分析顯示，與未生產透明顫 菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的對照菌株 10 (Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)相較，生產透明顫菌血紅蛋 白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb)所生成的人類 干擾素oc2產量減少53%，而生產硫氧化還原蛋白的菌株 (Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)所生成的人類干擾素α2產 量也減少35%。反觀生產硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅 15 蛋白的融合蛋白質的菌株（Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1)，其所生成的人類干擾素α2產量與對照菌株相當。與 對照菌株相較，由生產硫氧化還原蛋白的菌株(Rosetta (DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)所生成的人類干擾素α2減少，這個 結果說明了可能因為此菌株生成較為少量的人類干擾素 2〇 α2，所以此菌株的細胞生長狀況較佳。 總結’相對於未經誘導生成人類干擾素α2的對照菌株 (R〇Setta(DE3)/pET-IFN/pGB2)而言，經誘導的對照菌株之 生長會受到嚴重抑制。然而與經誘導的對照菌株相較，生 產硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白基因融合蛋白質的 48 1305230 菌株（Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TVl)可以生成等量的人 類干擾素α2，而細胞密度卻增加70%以上。這意謂著’帶 有硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合基因的載體 可以賦予被轉形的宿主細胞纾解過量生成重組型蛋白質產 5 物（例如人類干擾素）時所產生的毒害效應。 實施例4.以經轉形的大腸桿菌來生產異源性蛋白質一香 茅醇假單胞菌（Pseudomonas ciironenolis)的鹿 解酶(esterase) 在我們先前的研究中曾製備出質體pET-estll (圖17)， 10 其含有T7啟動子用以控制香茅醇假單胞菌 ciirane/Zo/iX)的酯解酶基因的表現(Y.P. Chao flZ. (2003)，

Micrafeio/·，154:521-526)。 依照上面“一般實驗方法”中所述的質體轉形法，將質 體 pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TVl 和 pGB-TV2 分 15 別連同質體pET-estll轉形至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中， 而得到重組型菌株 BL21(DE3)/pET-estII/pGB2、 BL21(DE3)/pET-estII/pGB-VHb 、 BL21(DE3)/pET-estll/pGB-Trx 、 BL21 (DE3 )/pET-estII/pGB -TV 1 和 BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2。 20 重組型菌株的培養是照實施例3中所述方式來進行，當 新接種的菌液的細胞密度達到大約〇.3 (OD55^)時，將3〇〇 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產重 組型蛋白質產物。當加入誘導劑6小時後（亦即發酵時間9小 時），以離心方式收集細胞並檢測所生產出的酯解酶的活 49 1305230 性。 香茅醇假單胞菌c/iraWs)的S旨解酶 活性的測定是根據我們較早的論文内所報導的方法來進行 (Y_P. Chao 扣从（2〇〇3)，心& MkraMoZ.，154:521-526)。主要 5 地’以兩壓均質機(French Press)將收集到的細胞打破，繼 而以冷凍離心機分離細胞並回收上清液。接著以protein Assay Reagent (BioRad Co.)來量測所收集的上清液的蛋白 質濃度。在400 μ：ί的反應溶液中加入6 pL的細胞上清液和 10 mM的對石肖紛醋酸鹽(para-nitrophenol acetate)，而反應溶 10 液包含1〇〇 mM磷酸鈉鹽缓衝液φΗ 7.4)、0.1%的阿拉伯膠 (arabic gum)和0.4% Triton X-100。在室溫下進行反應，隨 著時間紀錄反應產物在波長410 nm下的吸光值，並據此來 計算酵素的比活性(U/mg)，其中酵素活性單位(u)被定義為 每分鐘每μιηοίε的產物產生。所得實驗結果被顯示於表2。 15 表2.經誘導生產假單胞菌酯解酶的重組型菌株的生長狀況以及 _酵素生產量___ 菌株BL21(DE3) IPTG誘導最終細胞密度~~Ϊ素比活性-i_5_(μΜ) (〇D550) ru/歸、 pET-estII/pGB2 0 300 5.2 1.7 (1)* pET-estll/pGB-VHb 300 1.7(1) pET-estll/pGB -Trx 300 4.2 (2.5) pET-estll/pGB-TVl 300 3.7 (2.2) pET-estII/pGB-TV2 300 3.5 (2.1、 15.5 (1)* 11.5 (0.7) 6.0 (0.4) 15.0 (1) ,15.5 (1) :括弧中的數字代表是各重組型菌株相對於對照菌株的細胞密 度和所生產的酵素比活性的比值。相對細胞密度和相對酵素比 活性的計算方式，是將表中經誘導後各重組型菌株所達到的細 胞密度和酵素比活性分別除以經誘導後對照菌株 (BL21 (DE3)/pET-estII/pGB2)的細胞密度和酵素比活性'了 50 20 1305230 由此實驗可以觀察到在發酵終止時，未被誘導生產酯 解酶的對照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)的細胞密度可 達到5.2 (〇D55())，但是當被誘導生產酯解酶後，對照菌株― 亦即不生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 5 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)-的生長立即受到抑制，這種 細胞生長抑制現象也發生在生產透明顫菌血紅蛋白的菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-VHb)中，最終這兩者的細胞密 度只達到1.7 (OD55〇)。 但是’與被誘導生產酯解酶的對照菌株(BL21(DE3)/ 10 pET-estII/pGB2)相比較，經誘導後生產硫氧化還原蛋白的 菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-Trx)以及同時生產透明顫 菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (BL21 (DE3)/PET-eStII/PGB-TV2)或是生產硫氧化還原蛋白 和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株 15 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TVl)的生長卻可增加 110-150%，最後細胞密度分別可達到4.2 (〇d55Q)、3.5 (〇D55Q) 和3_7 (OD550) 0 由表2中所示的酵素生產量的結果可知，加入ipTG誘導 後’不生產透明顏菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 2〇 (31^21(〇丑3);^11-681;11/0〇62)可以得到賴解酶比活性達15.5 U/mg，而生產透明顫菌血紅蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET_ estll/pGB-VHb)所得到的酯解酶比活性為115 u/mg，而同 時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (BL21(DE3)/PET-eStII/PGB-TV2)或是生產硫氧化還原蛋白 51 1305230 和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TVl)所得到的酯解酶比活性則 分別可達到15.5 U/mg和15 U/mg，而與經誘導的對照菌株 (BL21 (DE3)/pET-estII/pGB2)所得到的酯解酶產量相當。 5 與對照菌株相較，生產硫氧化還原蛋白的菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-Trx)所得到的酯解酶卻減少 60% (酵素比活性只達到6 U/mg)，這個結果說明了因為此 菌株生成較為少量的酯解酶，所以此菌株的細胞生長狀況 較佳。 10 總結，相對於未被誘導生產酯解酶的對照菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)，經誘導的對照菌株的生長會 受到嚴重抑制。然而，與經誘導的對照菌株相較，同時生 產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2)或是生產硫氧化還原蛋白 15 和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株 (BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TVl)均可以生成等量的酯解 酶，而細胞密度卻增加110%以上。這意謂著，無論同時生 產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白或是生產硫氧化還 原蛋白和透明顫菌血紅蛋白基因融合蛋白質，可以賦予經 20 轉形的宿主細胞具有纾解過量生成重組型蛋白質產物[例 如香茅醇假單胞菌仏)的S旨解酶]時 所產生的毒害效應。 實施例5·以經轉形的大腸桿菌來生產同源性蛋白質一天 冬胺酸分解酶(aspartase) 52 1305230 質體pAl-AspA包含有T7A1啟動子用以控制大腸桿菌 天冬胺酸分解酶基因的表現，其構築方式說明如下。 根據天冬胺酸分解酶基因的核苷酸序列（S.A. Woods以 (1986)，S/oc/iem Λ，237:547-557)來合成下面兩個引子： 5 前向引子 5’-cacag^i£^acaacattcgtatcgaag-3’（序列辨識編號：7) 反向引子 5’-acgagi£^£ttcgctttcatcagtatag-3，（序列辨識編號：8) 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶仙m//I和*WI 10 的切割位址（如底線所標示者）。 以使用Wizard®基因組DNA純化套組所純化出的野生 型大腸桿菌菌株VJS632 (得自於Dr. Stewart, University of California，Davis, CA, USA)的染色體作為模版，並以上述 兩個引子來進行PCR反應，藉此而擴增出一含有天冬胺酸 15 分解酶基因（ί^ρΑ)的DNA片段。 之後’以NucleoSpin®核酸純化套組來純化所擴增出的 DNA片段，以限制酶fiamHIASa/I進行切割，並將所形成的 切割產物併入至質體pA199A-2中，而得到質體pAl-AspA， 其架構如圖18所示。 20 依照上面“一般實驗方法”中所述的質體轉形法，將質 體pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TVl和pGB-TV2分別 連同質體pAl-AspA予以轉形至大腸桿菌菌株VJS632中，而 得到重組型菌株\^3632/卩八1-八8卩八/口〇62、\^3632/卩八1-

AspA/pGB-VHb、VJS632/pAl-AspA/pGB-Trx、VJS632/pAl- 53 1305230

AspA/pGB-TVl和VJS632/pAl-AspA/pGB-TV2。 重組型菌株的培養是依照實施例3中所述方式來進 行’但使用的培養基含有下列組份：Na2HP04 (6g/L)、 KH2P〇4 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4Cl (lg/L)、MgS04.7H20 5 (1 mM)、CaCl2 (0.1 mM)、葡萄糖(0.4%)和鏈黴素（i〇 pg/mL) 以及胺苄青黴素（15 μ g / mL)。當新接種的菌液的細胞密度達 到大約0.3 (OD550)時，將1〇〇〇 μΜ IPTG加入至培養液中， 俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培 養時間來收取菌液樣品以測量細胞密度。在培養時間為7和 10 20小時的時間點，以離心方式收集細胞並測量重組型蛋白 質產物的生產量和酵素活性。

蛋白質電泳分析的方法是參照實施例3中所述方式來 進行，並將所收集的的上清液的樣品（含有2〇叫蛋白質）依 次裝填至10%的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。大腸桿菌天 15冬胺酸分解酶活性的測定是根據我們較早的論文（γ. _ R

Chao et al. (2000)，27:19-25)内所 報導的方法來進行。主.要地，在丨mL的反應溶液中加入〇. 〇 5 mg蛋白質，反應溶液的組成包含1〇〇 mM天冬胺酸、ι〇〇 mMTris緩衝液(PH 8.4)和5 mM MgS04。當在室溫下反應1〇 20分鐘後，以高性能液相層析(HPLC)來分析產物，分析條件 為：移動相溶液為〇.〇5 N硫酸，流速為0.5 mL/min，偵測波 長為210 nm。酵素的比活性單位為u/mg，而酵素活性單位 (U)被定義為每分鐘每μιη〇1ε的產物產生。所得實驗結果被 不於表3。 25 表3·經誘導生產天冬胺酸分解酶的重組型菌株於不同發酵時間 54 1305230

點的酵素生產I

21.1 19.9 20.9 pAl-AspA/pGB-Trx pAl-AspA/pGB-TVl pAl-AspA/pGB-TV2 6.1 (0.29) 12.5 (0.63) 21.1 (1)

比值。相對酵 20小時所 比活性。

參見圖19的上方，在發酵培養7小時後， 所有被誘導生 產天冬胺酸分解酶的重組型菌株可以生成相當量的天冬胺 酸分解酶’且酵素比活性達敎觸u/mg左右(參見表3)。 參見圖19的下方’在發酵培養2〇小時後，不生產透明顏菌 10血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株（VJS632/PA1-AspA/pGB2)所生成的天冬胺酸分解酶酵素活性只有3 7 U/mg，而降低了 81%;生產透明顫菌血紅蛋白的菌株 (VJS632/pAl-AspA/pGB-VHb)所生成的天冬胺酸分解酶酵 素活性只有6.1 U/mg，而降低了 71% ;以及生產硫氧化還原 15 蛋白的菌株（VJS632/pAl-AspA/pGB-Trx)所生成的天冬胺 酸分解酶酵素活性只達12.5 U/mg，而降低了 37%。由圖19 所示的蛋白質電泳結果也可觀察到上述菌株所生成的天冬 胺酸分解酶的量明顯減少。 反觀同時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的 20菌株(VJS632/pA 1 -AspA/pGB-TV2)或是生產硫氧化還原蛋 白和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株 55 1305230 (VJS632/pAl-AspA/pGB-TVl)，它們所生成的天冬胺酸分 解酶的量並未受到影響（參見圖19下方），而且酵素比活性均 維持在大約20U/mg (表3)。 總結，生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白或是 5 生產硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質可 以賦予經轉形的宿主細胞具有保護並安定化重組型蛋白質 產物(例如天冬胺酸分解酶）的效用，而可確保重組型蛋白質 產物不會受到細胞内蛋白質分解酶的不利分解作用。 實施例6.以經轉形的大腸桿菌來生產同源性蛋白質_β_ 10 半乳糖苷分解酶(β-galactosidase) 質體ΡΕΤ20-Ζ包含有Τ7啟動子用以控制β-半乳糖苷分 解酶基因的表現，其構築方式說明如下。 根據半乳糖苷分解酶基因的核苷酸序列(A. Kalnins d (1983)，又2; 593-597)來合成下面兩個引子： 15前向引子 5’-tatg£§Mg_aggatccattcactggccgtc-3’（序列辨識編號：π) 反向引子 5’-cggaagcttttatttttgacaccagacc-3’（序列辨舖.编號:18) 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶和ΧΤιοΙ的 20 切割位址(如底線所標示者）。 以使用Wizard®基因組DNA純化套組所純化出的大腸 桿菌菌株BL21(DE3)的染色體作為模版，並以上述兩個引子 來進行PCR反應’藉此而擴增出一含有β-半乳糖苔分解酶基 因（/acZ)的DNA片段。 56 1305230 之後，以NucleoSpin®核酸純化套組來純化所擴增出的 DNA片段’以限制酶進行切割’並將所形成的切 割產物併入至質體pET22b中，而得到質體pET20-Z，其架 構如圖20所示。 5 依照上面“一般實驗方法”中所述的質體轉形法，將質 體 pGB2、pGB-VHb、pGB，Trx、pGB-TVl 和 pGB-TV2 分別 連同質體PET20-Z予以轉形至大腸桿菌菌株bL21(DE3) 中，而得到重組型菌株BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2、 BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-VHb > BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-10 Trx、BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TVl 和 BL21(DE3)/pET20- Z/pGB-TV2。 重組型菌株的培養是依照實施例5中所述方式來進 行，當新接種的菌液的細胞密度達到大約〇.3 (〇D550)時，將 300 μΜ IPTG加入至培養液中’俾以誘導重組型菌株來生產 15重組型蛋白質產物，並隨著培養時間收取菌液樣品以測量 細胞密度’並在培養時間達11小時後，以離心方式收集細 胞並測量所生產的β -半乳糖苷分解酶的活性。 大腸桿菌β-半乳糖苔分解酶活性的測定是根據Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring 20 Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory 中所述的方法。 主要地，將培養中的細胞隨取樣時間取出α1 mL的菌 液放入至 0.9 mL Z 緩衝溶液[16.1 g/L Na2HP04 · 7H20、5.5 g/L NaH2P04 · H20、0.75 g/L KCn、0.246 g/L MgS04 · 7H20、2.7 mL β-威基乙醇(β-mercaptoethanoi)]中，並使最 57 1305230 後體積維持為1 mL。之後，加入10 μί甲苯，以旋轉器震 盪打破細胞，並以冷凍離心機來分離細胞並回收上清液。 於所收集的上清液中加入含有鄰-硝基苯基-β-D-硫代 半乳糖苷(o-nitrophenyl-P_D-thiogalactoside)(4 mg/mL)的反 5 應溶液0_2 mL。在室溫下反應歷時5分鐘後，予以加入0.5 mL NaKO3 (1 M)以終止反應，並於420 nm的波長下進行谓 測。β-半乳糖苷分解酶的比活性單位被定義為Miller單 位。所得實驗結果被示於表4。 10 表4.經誘導生產β-半乳糖苷分解酶的重組型菌株的生長狀況以 及酵素生產量 菌株 BL21(DE3) 質體 IPTG誘導 (μΜ) 最終細胞密度 (OD550) 酵素比活性 (Miller 單位） pET20-Z/pGB2 0 3.2 — 300 〇·7 (1)* 56300 ⑴* pET20-Z/pGB-VHb 300 0.9 (1.3) 51700 (0.9) pET20-Z/pGB-Trx 300 2.3 (3.3) 40400 (0.7) pET20-Z/pGB-TVl 300 2.5 (3.6) 83200 (1.5) pET20-Z/pGB-TV2 氺· Ay U. ^ 300 1.7 (2.4、 97000 (1.7) .括弧中的數字代表是各重組型菌株相對於對昭菌棟的細胳疮 度和所獲得的酵素比活性的比值。相對細胞密^和相對酵素比 活性的計算方式是將表中經誘導後各重組型菌株所泪| $ $細 15 胞密度和酵素比活性除以經誘導後對照菌株（BL21(DE3)/ pET20-Z/pGB2)的細胞密度和酵素比活性。 在發酵終止時’未被誘導生產β-半乳糖苷分解酶的對 照菌株一亦即不生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白 的菌株(BL21(DE3)/PET20-Z/PGB2)〜的細胞密度可達到 3.2 (OD55。），但是當加入IPTG以誘導生成半乳糖苔分解 20酶時’對照菌株和生產透明顫菌血紅蛋白的菌株 (BI^KDESVpETZO-Z/pGB-VHb)的生長立即受到嚴重的抑 58 1305230 制，直到培養時間終止，最終細胞密度只達到0.7-0.9 (OD550)。而與經誘導的對照菌相較，生產硫氧化還原蛋白 的菌株（BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)以及生產硫氧化還 原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株 5 (BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TVl)於發酵最終的細胞密度可 達到2.3-2.5 (OD550)，細胞密度增加230〜260% ;而同時生 產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV2)的細胞密度也可達到 1.7 (OD550)，細胞密度增加140% 〇 10 另一方面’由表4所示的酵素比活性的結果可知，經誘 導過後，對照菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)可以生成約 56,000 Miller單位的β-半乳糖誓分解酶，而生產透明顫菌血 紅蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-VHb)也可生成大 約51,000 Miller單位的β-半乳糖苷分解酶。然而，同時生產 15透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株（BL21 (DE3)/pET2〇-Z/pGB-TV2)可以生產大約 97,000 Miller單位 的β-半乳糖苷分解酶，而生產硫氧化還原蛋白和透明顫菌 血紅蛋白的融合蛋白的菌株（BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV1)可以生產大約83,000 Miller單位的β-半乳糖苷分解 20酶’與經誘導的對照菌株（BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)相 較，增加了大約50-70%的β-半乳糖苷分解酶產量。 反觀生產硫氧化還原蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)，其只能生成4〇,〇〇〇 Miller單位的β-半乳糖苷分 解酶，與經誘導的對照菌株(BL2i(DE3)/pET20-Z/pGB2)相 59 1305230 比較，β-半乳糖苷分解酶產量減少了大約30%。這個結果說 明了生產硫氧化還原蛋白的菌株（BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)因為重組型蛋白質的產量減少，故而此菌株的 細胞生長狀況較佳。 5 總結，無論同時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原 蛋白或是生產硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融合 蛋白質，可以賦予經轉形的宿主菌株具有增高β半乳糖苷 为解酶產里且生長良好的效用。根據H_ Dong et al. (1995)，乂 177:1497-1504的報導，過量生成半乳糖普分解酶 10會導致大腸桿菌的核糖體瓦解而使得細胞生長受到嚴重抑 制。由此推斷，可同時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還 原蛋白或是生產硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋白的融 合蛋白的轉形菌株將可能具有減緩細胞核糖體因為過量生 產蛋白質以致瓦解的效用。 ;本^兒明書中被引述之所有文獻資料與專利案以其整 體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細 說明（包含界定在⑴將佔上風。 雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地 背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變 20化□此w欲的是，本發明僅受如隨文檢附 圍所示者的限制。 60 1305230 【圖式簡單說明3 圖1是一顯示質體pUHE21-2的架構的圖，其中含有： pMBl od，質體pMBl的複製源點；ΡΑ1，Τ7Α1啟動子；Apr， 胺卞青黴素抗性基因；Seal ’限制峰Seal切割位址；以及多 5 重選殖位址(multiple cloning sites，MCS)，其中所包含的核 糖體結合位址(ribosome binding site，RBS)與限制峰切割位

址（restriction enzyme cutting sites)被標示於 MCS 框（MCS frame)内； 圖2是一顯示質體pA199A-2的架構的圖，其中含有： 10 pMB 1 od，質體PMB1的複製源點；PA丨，17 A1啟動子；/flc/， kc抑制蛋白質基因；rrwfiTlT2，ητιβ基因轉錄終止位址 (translation termination site) ; Apr，胺苄青黴素抗性基因； iVrwI，限制酶iVrwI切割位址；以及多重選殖位址，其中所 包含的核糖體結合位址(RBS)與限制酶·切割位址被標示於 15 MCS框内； 圖3是一顯示質體pGB2的架構的圖，其中含有：psem ori ’質體pSClOl的複製源點；Spc7Strr，壯觀黴素/鏈黴素 抗性基因（spectinomycin/streptomycin resistance gene);以及 多重選殖位址，其中所包含的限制崎切割位址被標示於 20 MCS框内； 圖4是一顯示質體pGB-VHb的架構的圖，其中含有： pSClOl ori ’質體pSClOl的複製源點；v沖，透明顫菌血紅 蛋白的結構基因（structural gene); PA1，T7 A1 啟動子；/flC/， /π抑制蛋白質基因；以及Spc7Strr，壯觀黴素/鏈黴素抗性 61 1305230 基因； 圖5是一顯示質體pjF118EH的架構的圖，其中含有： pBR322 ori ’質體pBR322的複製源點；Ptae，加啟動子； Me/41 ’ /ac抑制蛋白質基因；rm5TlT2，mzB基因轉錄終止 5 位址；价Ml，限制酶WnJ切割位址；Apr ,胺苄青黴素抗性 基因，以及多重選殖位址，其中所包含的限制酶切割位址 被標示於MCS框内； 圖6是一顯示質體pGB-Trx的架構的圖，其中含有： pSClOlod’質體PSC101的複製源點，硫氧化還原蛋 10白的結構基因；Ptac，ifle啟動子；kef，Me抑制蛋白質基 因；以及Spc7Strr，壯觀黴素/鏈黴素抗性基因； 圖7是一顯示質體pJF-TrxFus的架構的圖，其中含有： PBR322 ori，質體pBR322的複製源點；I，加啟動子； irxA，硫氧化還原蛋白結構基因（不含有終止密碼子）； 15 Mc/q ’ Zac抑制蛋白質基因；，限制酶iVnJ切割位址； —1Τ2 ’咖咖轉錄終止位址；Apr，胺"黴素抗性 基因；以及多重選殖位址，其中所包含的限制酶切割位址 被標示於MCS框内； 圖8是一顯示質體PGB-TV1的架構的圖，其中含有： 20 pSC1〇1〇ri，質體PSC101的複製源點；卜以，硫氧化還原蛋 白的結構基因透明顫菌血紅蛋白的結構基因；ρ^， iac啟動子；zac/q，^^抑制蛋白質基因；以及spcr/strr，壯 觀黴素/鏈黴素抗性基因； 圖9是一顯示質體PGB-TV2的架構的圖，其中含有： 62 1305230 pSClOl 〇ri，質體pSClOl的複製源點；，硫氧化還原蛋 白的結構基因；以办’透明顫菌血紅蛋白的結構基因；匕扣， iac啟動子’ pA1 , Τ7 A1啟動子；；ac/q，抑制蛋白質基因； 以及Spcr/Strr，壯觀黴素/鏈黴素抗性基因； 5 圖疋—西方墨點分析圖（Western blot)，其顯示以透 明顫菌血紅蛋白的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的大腸 桿菌重組型菌株BL21(DE3)/pGB-VHb的透明顫菌血紅蛋白 生產清形’其中徑1.蛋白質標準物(pr〇Sieve⑧c〇i〇r pr〇tein

Marker, Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導；徑3 : 10以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以1〇〇 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以5〇〇 μΜ iptg誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示透明顫菌血紅蛋白的 位置； 圖11是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 15 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-Trx的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 1 .蛋白質標準物(ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3:以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4:以1〇〇 μΜ 20 IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白的位 置； 圖12是一西方墨點分析圖’其顯示以硫氧化還原蛋白 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 63 1305230 BL21 (DE3)/pGB-ΤV1的硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 白的融合蛋白質生產情形，其中徑1 :蛋白質標準物 (ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑 2:未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑3:以3〇μΜΙΡΤβ 5 誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 :以100 μΜ IPTG誘導的菌 株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白 質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白和透明顫菌血紅蛋 白的融合蛋白質的位置； 圖13是一西方墨點分析圖，其顯示以硫氧化還原蛋白 10 的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 BL21(DE3)/pGB-TV2的硫氧化還原蛋白生產情形，其中徑 1 :蛋白質標準物(ProSieve® Color Protein Marker, Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑 3 :以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4:以100 μΜ 15 IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ IPTG誘導 的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示硫氧化還原蛋白的位 置； 圖14是一西方墨點分析圖，其顯示以透明顫菌血紅蛋 白的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株 20 BL21(DE3)/pGB-TV2的透明顫菌血紅蛋白生產情形，其中 徑 1 :蛋白質標準物（ProSieve® Color Protein Marker,

Cambrex BioScience);徑2 :未經IPTG誘導的菌株的蛋白質 樣本；徑3 :以30 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑4 : 以100 μΜ IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；徑5 :以500 μΜ 64 1305230 IPTG誘導的菌株的蛋白質樣本；以及箭頭指示透明顫菌血 紅蛋白的位置； 圖15是一顯示質體pET-IFN的架構的圖，其中含有： ori，pBR322複製源點；fl ori，fl複製源點；IFN〇c2，人類 5干擾素α2基因；T7 ’ T7啟動子；//del，限制酶ΑΓί/eI切割位 址，_Χ7ιοΙ，限制酶Χ/ιοΙ切割位址；/似/ ’ /沉抑制蛋白質基因； 以及A〆，胺苄青黴素抗性基因；

圖16是一蛋白質電泳圖，其中徑1 :蛋白質標準物(MBI

Fermentas);徑2 :未經誘導的對照菌株(Rosetta(DE3)/pET-10 IFN/pGB2);徑3 :經誘導後的對照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2);徑4 :經誘導後生產出透明顫菌血紅蛋白的菌 株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb);徑5 :經誘導後生產 出硫氧化還原蛋白的菌株（RosettaCDESVpET-IFN/pGB-Trx) ; 以及徑 6 : 經誘導後生產 出硫氧化還原蛋白和透明顫 15 菌血紅蛋白的融合蛋白質的菌株（RosettaCDESVpET-iFN/pGB-TVl) ; 圖17是一顯示質體pET-estll的架構的圖，其中含有： ori，pBR322複製源點；fl ori，fl複製源點；如A，香茅醇 假單胞菌（PwwiiomonaA· ciiranenohX)的酯解酶基因；T7，T7 2〇 啟動子；，限制酶fiamM切割位址；，限制 切割位址；kcJ，/沉抑制蛋白質基因；以及Apr，胺苄青黴 素抗性基因； 圖18是一顯示質體pAl-AspA的架構的圖，其中含有： pMBl ori，pMBl複製源點；似PA，天冬胺酸分解酶基因； 65 1305230 s舰m，限制崎切割位址；制丨，限制酶制〗切割位 址；rniBTlT2，rmB基因轉錄終止位址；Pai，T7 A1啟動 子，’ /ac抑制蛋白質基因；以及A〆，胺苄青黴素抗性 基因； 5 圖19是一蛋白質電泳圖，其顯示經過發酵培養7小時 (上方)與20小時(下方)後，被誘導生產天冬胺酸分解酶的重 組型菌株的蛋白質生產情形，其中徑1 :蛋白質標準物(MBI Fermentas);徑2 :未生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原 蛋白的菌株(VJS632/pAl-AspA/pGB2);徑3 :生產透明顫菌 10 血紅蛋白的菌株(\^3632/卩八1-入8卩八/卩0丑-\^13);徑4:生產 硫氧化還原蛋白的菌株(VJS632/pAl-AspA/pGB-Trx);徑 5:同時生產透明顫菌血紅蛋白和硫氧化還原蛋白的菌株 (VJS632/pAl-AspA/pGB-TV2);徑6 :生產硫氧化還原蛋白 和透明顫菌血紅蛋白的融合蛋白的菌株 !5 (VJS632/pAl-AspA/pGB-TVl);以及箭頭指示天冬胺酸分 解酶的位置；以及 圖20是一顯示質體pET20-Z的架構的圖，其中含有： ori ’ pBR322複製源點，fl 〇ri ’ fl複製源點；，半乳糖 苷分解酶的基因；T7’ T7啟動子；iW/el，限制酶切割 20 位址；所以111 ’限制酶Hini/III切割位址；以及Apr，胺辛青 黴素抗性基因。 【圖式之主要元件代表符號表】 (無） 66 _____ U V/J J V/ α j %1.货、日修(更}正替換頁丨 _________________ί 序列表 <110>逢甲大學 行政院農業委員會台中區農業改良場 <120>用以增進重組型蛋白質的生產的核酸建構物與表現載體，以 5 及用以大量生產重組型蛋白質的方法 <130> CP-20389 <160> 8 <170> Patent In version 3.2 <210〉 1 10 <211〉 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>用於透明顫菌血紅蛋白基因的人工前向引子 15 <400〉 1 27 27 aagggatcca tgttagacca gcaaacc <210〉 2 <211〉 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>用於透明顫菌血紅蛋白基因的人工反向引子 <400> 2 atagtcgacc caagt11tgg caacagc 20 1305230 1 ^ 1 ^ .於—-—- <210> ； _______j· '*" * ^ \----------— 3 / <211〉 29 <212> DNA <213> 5 <220〉 人工序列 <223> <400〉 用於大腸桿菌硫氧化還原蛋白基因的人工前向引子 3 ccgaattcaa ccacacctat ggtgtatgc 29 <210> 10 <211> 4 25 <212〉 DNA <213> <220〉 人工序列 <223> 15 <400〉 用於大腸桿菌硫氧化還原蛋白基因的人工反向引子 4 ggggatccgc tgcaaggcga ttaag 25 <210〉 <211> 5 28 <212〉 DNA 20 <213〉 <220> 人工序列 <223> <400〉 用於人類干擾素a lpha2基因的人工前向引子 5 tgctctcata tgttgatctg cctcaaac 28 2 1305230 .......---------------------------- '.… <210〉 <211〉 *--------------------------- 6 33 <212〉 DNA <213〉 5 <220〉 人工序列 <223> <400> 用於人類干擾素alpha2基因的人工反向引子 6 cgtgctcgag t tat tat tcc t tact tct ta aac 33 <210> 7 10 <211〉 28 <212> DNA <213〉 <220> 人工序列 <223> 15 <400> 用於天冬胺酸分解酶基因的人工前向引子 7 cacaggatcc acaacatteg tategaag 28 <210> <211> 8 29 <212> DNA 20 <213> <220〉 人工序列 <223> 用於天冬胺酸分解酶基因的人工反向引子 <400〉 8 aegagtegae ttegetttea tcagtatag 29 3

Claims (1)

1305230 年#，.分修('更)正本 第093118569號專利申言^衆說明書1：&頁--修在!日期：97年9月16曰 拾、申請專利範圍： 1. 一種用以提高一選定的基因產物於一重組型宿主細胞 内的生產的方法，其包含下列步驟： (a) 將一編碼該選定的基因產物的基因序列、一編碼硫 5 氧化還原蛋白的第一核酸序列以及一編碼透明顫 菌血紅蛋白的第二核酸序列植入至一宿主細胞内； (b) 將步驟⑻所形成的重組型宿主細胞培養於一合適 的培養基中，俾以容許該基因序列的表現；以及 ⑻收穫被表現的基因產物。 10 2.如申請專利範圍第1項的方法，其中步驟(a)的進行是 藉由將該基因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序列 一起植入至一個可於該宿主細胞内表現的載體内，以及 將由此所形成的重組型載體輸送至該宿主細胞内。 3. 如申請專利範圍第1項的方法，其中步驟(a)的進行是 15 藉由將該基因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序列 分別地植入至一個可於該宿主細胞内表現的載體内，以 及將由此所形成的重組型載體一起輸送至該宿主細胞 内。 4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中步驟(a)的進行是 20 藉由： ⑴建構一可於該宿主細胞内表現並且包含有該第一 核酸序列以及該第二核酸序列的第一重組型載體； (ii)建構一可於該宿主細胞内表現並且包含有該基因 序列的第二重組型載體；以及 1 第麵8569號專利申請案說明書修正頁 修正日期π年⑽日 —S第重組型載體與第二重組型载體輸送至該 宿主細胞内。 5. 如申明專利⑽第4項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第-重組型載體進一步包含有一可誘導的啟動 子序列用以控制該第一核酸序列與該第二核酸序列的 表現。 6. 如申明專利麵圍帛5項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第4纟㈣載體所包♦的啟動子序列是衍生自 J任者.病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、 澡類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細 胞。 如申喷專利範圍帛6項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第一重組型載體所包含的啟動子序列是選自於 下列所構成的群組：加c啟動子、Τ7啟動子、Τ7Α1啟 動子、Zac啟動子、ίφ啟動子、ire啟動子、amfiAZ)啟 動子以及办啟動子。 8·如申凊專利範圍第7項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第一重組型載體所包含的啟動子序列是如(：啟動 子。 9.如申請專利範圍第4項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第一重組型載體中，該第一核酸序列與該第二核 酸序列被連結成編碼一由硫氧化還原蛋白與透明顫菌 血紅蛋白所構成的融合蛋白質。 1〇·如申請專利範圍第4項的方法，其中於次步驟⑴中所建 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年9月16曰 構的該第一重組型載體進一步包含有一可誘導的第一 啟動子序列用以控制該第一核酸序列的表現，以及一可 誘導的第二啟動子序列用以控制該第二核酸序列的表 現，該第一啟動子序列與第二啟動子序列彼此不相同。 5 11.如申請專利範圍第10項的方法，其中於次步驟⑴中所 建構的該第一重組型載體中，該第一啟動子序列與該第 二啟動子序列是各自地衍生自下列任一者：病毒、細菌 細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、 昆蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。 10 12.如申請專利範圍第11項的方法，其中於次步驟⑴中所 建構的該第一重組型載體中，該第一啟動子序列與該第 二啟動子序列是各自地選自於下列所構成的群組：me 啟動子、T7啟動子、T7 A1啟動子、/izc啟動子、irp 啟動子、ire啟動子、啟動子以及啟動子。 15 13.如申請專利範圍第12項的方法，其中於次步驟⑴中所 建構的該第一重組型載體中，該第一啟動子序列是toe 啟動子，而該第二啟動子序列是T7A1啟動子。 14. 如申請專利範圍第4項的方法，其中於次步驟⑴中所建 構的該第一重組型載體進一步包含有下列至少一者：一 20 標記基因、一報導基因、一抗生素-抗性基因、一加強 子序列、一個聚腺苷酸化位置以及一調節序列。 15. 如申請專利範圍第1項的方法，其中於步驟(a)中所用 的該第一核酸序列是衍生自下列任一種細胞的硫氧化 還原蛋白基因：細菌細胞、酵.母菌細胞、真菌細胞、藻 3 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 類細胞、植物細胞、昆蟲 '正曰期’ 97年9月16曰 16.如申請專利範圍第15項 頬細皰。 的該第-核酸序列是衍生自其中於步驟⑷中所用 白基因㈣）。 大腸桿菌的硫氧化還原蛋 5 17.如申請專利範圍第！ 认蛛十一 幻万去，其中於步驟+ 核酸序列是衍生自透明顫菌屬： (―叫)的血紅蛋白基因_。 物種 18.如申請專利範圍第i項 物是一同源性纽或1源性多肽其中該敎的基因產 10 19.如申請專利範圍第18 、 物是一酵素、-治療性多1方=其中魏定的基因產 20.如申請專利範圍第19項的抗原決疋位或—抗體。 _自於下列所構成的群組:：該因產 解酶、醋解鸣以及天冬胺酸分十《 礼糖誓分 15 21.如申請專利範圍第i ""刀解酶。 中的宿主細胞是選自柃下方法’其中被使用於步驟(a) 酵母菌細胞、真菌細跑列所構成的群組：細菌細胞、 胞以及人類細胞。匕昆蟲細胞、植物細胞、動物細 22. 如申請專利範圍第21 中的宿主細胞是大腸槔’其中被使用於步驟⑻ 23. —種核酸建構物，其包〃。 -核酸序列以及1有一編碼硫氧化還原蛋白的第 序列。 碘明顫菌 血紅蛋白的第二核酸 24. 如申請專利範圍第23 ，的核酸建構物，其進一步包含 20 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年9月16曰 有一可誘導的啟動子序列用以控制該第一核酸序列與 該第二核酸序列的表現。 25. 如申請專利範圍第24項的核酸建構物，其中該啟動子 序列是衍生自下列任一者：病毒、細菌細胞、酵母菌細 5 胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物 細胞以及人類細胞。 26. 如申請專利範圍第25項的核酸建構物，其中該啟動子 序列是選自於下列所構成的群組：iac啟動子、T7啟動 子、T7 A1啟動子、kc啟動子、irp啟動子、ire啟動 10 子、ara5AZ)啟動子以及yi/VPi啟動子。 27. 如申請專利範圍第26項的核酸建構物，其中該啟動子 序列是ifle啟動子。 28. 如申請專利範圍第24項的核酸建構物，其中該第一核 酸序列與該第二核酸序列被連結成編碼一由硫氧化還 15 原蛋白與透明顫菌血紅蛋白所構成的融合蛋白質。 29. 如申請專利範圍第23項的核酸建構物，其進一步包含 有一可誘導的第一啟動子序列用以控制該第一核酸序 列的表現，以及一可誘導的第二啟動子序列用以控制該 第二核酸序列的表現，該第一啟動子序列與第二啟動子 20 序列彼此不相同。 30. 如申請專利範圍第29項的核酸建構物，其中該第一啟 動子序列與該第二啟動子序列是各自地衍生自下列任 一者：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類 細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。 1305230 第麵8569號專利申請案說明書修正頁 修正曰期：97年9月16 g 31. 如申請專利範圍第3〇項的核酸建構物，其中該第〜啟 動子序列與該第二啟動子序列是各自地選自於下列所 構成的群組：加啟動子、T7啟動子、T7A1啟動子、 冲啟動子、〜啟動子、irc啟動子、㈣獅啟動子以 5 及匕啟動子。 32, 如申請專利範圍第31項的核酸建構物，其中該第—啟 動子序列是咖啟動子，而該第二啟動子序列是T7A1 啟動子。 玖如申請專利範圍第23項的核酸建構物，其中該第_核 酸序列是衍生自下列任一種細胞的硫氧化還原蛋白基 因：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、： 物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。 如申π專利範圍第33項的核酸建構物，其中該第—枝 酸序列是衍生自大腸桿菌的硫氧化還原蛋白基因 15 〇Μ)。 35. 如申請專利範圍第23項的核酸建構物，其中該第二枝 酸序列疋彳厅生自透明顫菌屬物種Sp.)的血 紅蛋白基因（vgfc)。 36. —種載體’其包含有一如申請專利範圍第23至朽項中 20 任一項的核酸建構物。 37. 如申請專利範圍第36項的載體，其進一步包含有下列 至少一者：一標記基因、一報導基因、一抗生素抗性 基因、一加強子序列、一編碼一被選定的基因產物的基 因、一個聚腺苷酸化位置以及一調節序列。 6 修正日期：97年9月16日 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 38. —種可表現一選定的基因產物的重組型宿主細胞，其包 含有一編碼該選定的基因產物的基因序列，以及一編碼 硫氧化還原蛋白的第一核酸序列和一編碼透明顫菌血 紅蛋白的第二核酸序列。 5 39.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該基 因序列、該第一核酸序列和該第二核酸序列被攜帶於一 可於該宿主細胞内表現的載體上。 40·如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該基 因序列、該第·一核酸序列和該第二核酸序列各自被攜帶 10 於一可於該宿主細胞内表現的載體上。 41.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該第 一核酸序列和該第二核酸序列被攜帶於一可於該宿主 細胞内表現的第一載體上，而該基因序列被攜帶於一可 於該宿主細胞内表現的第二載體上。 15 42.如申請專利範圍第41項的重組型宿主細胞，其中該第 —載體進一步包含有一可誘導的啟動子序列用以控制 該第一核酸序列與該第二核酸序列的表現。 43. 如申請專利範圍第42項的重組型宿主細胞，其中該啟 動子序列是衍生自下列任一者：病毒、細菌細胞、酵母 2〇 菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、 動物細胞以及人類細胞。 、tre 44. 如申請專利範圍第43項的重組型宿主細胞，其中該啟 動子序列是選自於下列所構成的群組：iac啟動子、T7 啟動子、T7 A1啟動子、he啟動子、irp啟動子 7 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 修正曰期：97年9月16曰 啟動子、aroSAD啟動子以及又户^心啟動子。 45. 如申請專利範圍第44項的重組型宿主細胞，其中該啟 動子序列是iac啟動子。 46. 如申請專利範圍第41項的重組型宿主細胞，其中該第 5 —核酸序列與該第二核酸序列被連結成編碼一由硫氧 化還原蛋白與透明顫菌血紅蛋白所構成的融合蛋白質。 47. 如申請專利範圍第41項的重組型宿主細胞，其中該第 —載體進一步包含有一可誘導的第一啟動子序列用以 控制該第一核酸序列的表現’以及一可誘導的第二啟動 1〇 子序列用以控制該第二核酸序列的表現，該第一啟動子 序列與第二啟動子序列彼此不相同。 如申叫專利範圍第47項的重組型宿主細胞，其中該第 —啟動子序列與該第二啟動子序列是各自地衍生自下 1 列任一者：病毒、細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、 15 藻類細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細 胞。 49. ^申請專利範圍第48項的重組型宿主細胞，其中該; 啟動子序列與該第二啟動子序列是各自地選自於_ 20 :所構成的群組:_啟動子、T7啟動子、麗啟， k啟動子、冲啟動子、的啟動子、㈣細啟售 子以及^户/?户L啟動子。 5〇·專利範圍第49項的重組型宿主細胞，其中該！ 啟子動序子列是加啟動子，而該第二啟動子序心 8 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年9月16曰 51.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該第 一核酸序列是衍生自下列任一種細胞的硫氧化還原蛋 白基因：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、 植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞以及人類細胞。 5 52.如申請專利範圍第51項的重組型宿主細胞，其中該第 一核酸序列是衍生自大腸桿菌的硫氧化還原蛋白基因 (irxA) 0 53. 如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該第 二核酸序列是衍生自透明顫菌屬物種（sp.) 10 的血紅蛋白基因（vgi>)。 54. 如申請專利範圍第41項的重組型宿主細胞，其中該第 一載體進一步包含有一標記基因、一報導基因、一抗生 素-抗性基因、一加強子序列、一個聚腺苷酸化位置或 一調節序列。 15 55.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該第 一核酸序列與該第二核酸序列被併入於該宿主細胞的 基因組DNA内。 56.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其中該選 定的基因產物是一同源性多肽或一異源性多肽。 20 57.如申請專利範圍第56項的重組型宿主細胞，其中該選 定的基因產物是一酵素、一治療性多肽、一抗原決定位 或一抗體。 58.如申請專利範圍第57項的重組型宿主細胞，其中該選 定的基因產物是選自於下列所構成的群組：干擾素、β- 1305230 第093118569號專利申請案說明書修正頁 修正日期：97年9月16曰 半乳糖苔分解酶、酯解酶以及天冬胺酸分解酶。 59.如申請專利範圍第38項的重組型宿主細胞，其是選自 於下列所構成的群組：細菌細胞、酵母菌細胞、真菌細 胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞或人類細胞。 5 60.如申請專利範圍第59項的重組型宿主細胞，其為大腸 桿菌細胞。 10