TWI299752B - Multipotent placental stem cell and methods thereof - Google Patents
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Description
1299752 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於一種取自產後胎盤的幹細胞,及其取得 與培養之方法。本發明特別關於含有胎盤幹細胞之組合物 及應用胎盤幹細胞的方法。 【先前技術】 幹細胞具有分化成體内各種細胞的潛力。理論上,幹 細胞可無限制地分裂增殖,以補充它種細胞數量。當幹細 胞分裂時,每個新細胞可維持幹細胞的狀態或成為具有一 更特化功能的他種細胞,例如肌肉細胞、紅血球細胞或腦 細胞。幹細胞通常分為全能型(totipotent)、潛能型 (pluripotent)與多能型(multipotent)。全能型幹細胞具有成 長為身體中所有不同種類細胞的能力,包括生殖細胞 (germ cell),例如受精卵便是一個全能型幹細胞。潛能型 幹細胞會成長為身體中除了發育胎兒所需之細胞種類以 外的任何細胞。多能型幹細胞則僅可在一指定器官或一指 定組織中成長為兩種或兩種以上不同的細胞種類。相對於 幹細胞’祖代細胞(progenitor cell ’或稱母細胞)則無法進 行細胞自新(self-renew),並僅能成長為少數幾種細胞。 胚胎幹細胞(embryonic stem ceU)與成人幹細胞 (adult stem cell)是幹細胞的主要來源。胚胎幹細胞來自於 由受精卵所發育而成的胚胎。為研究目的,可徵求捐贈者 以使卵子發 同意,在諸如體外受精臨床診所進行體外受於 5 1299752 育成胚胎,並自其中取得胚胎幹細胞以供研究之用。 可於受精後第4或第5天取得胚胎,此時,胚胎像一 細胞所構成的微小空心球,稱為囊胚(blastocyst)。囊 含三種結構,分別是:滋養葉細胞(trophoblast),其 層環繞著囊胚的細胞;囊胚腔(blastocoel),其為囊胚 的空腔;以及内細胞群(inner cell mass),其為一群集 囊胚之一端、約由3 0個細胞所組成的細胞群。 將這些内細胞群分離出來,並以體外培養方式 之,以取得胚胎幹細胞。内細胞群一般生長在一層餵 胞(feeder cell)上。這些餵養細胞通常是小鼠胚胎纖 細胞(mouse embryonic fibroblasts),作為内細胞群的 層與營養來源。所得到的胚胎幹細胞是潛能型幹細胞 成為身體中所有種類的細胞。 成人幹細胞或體幹細胞(somatic stem cell)是一 在器官或組織之已分化細胞中發現的未分化細胞。成 細胞可自我複製更新(細胞自新),並可分化成器官或 中特定的細胞種類。科學界相信每種組織中具有一特 域能使成人幹細胞保持長達數年不活動的狀態(即 裂),直到這些細胞因疾病或組織受傷等因素而被活 止。每種組織中存在的成人幹細胞數目極少,並已在 腦、骨髓、周邊血液、血管、骨骼肌、皮膚、臍帶、 組織、羊膜與肝臟等組織與器官中找到成人幹細胞£ 由於幹細胞可做為細胞或組織新生的來源,因此 胞在各種疾病、身體異常狀況以及殘障治療上扮演相 通常 個由 胚包 為一 内部 中在 培養 養細 維母 附著 ,可 種可 人幹 組織 定區 不分 化為 包括 脂肪 幹細 當重 6 1299752 要的角色。骨髓中用來形成血球的造血幹細胞 (hematopoietic stem cell,HS C s)是目前唯一 一種已被普遍 使用的幹細胞。造血幹細胞被用來治療白血病、淋巴瘤及 數種遺傳性血液疾病。然而,其他幹細胞同樣具有治療他 種疾病的潛力。許多報告曾暗示一些成人幹細胞具有分化 成數種細胞的能力。例如,造血幹細胞可能分化成腦細胞 (神經細胞、寡樹突膠質細胞(〇1丨§〇(1611(111〇0}^68)與星狀細 胞(astrocyte))( Hao et al·,H. Hematother. Stem Cell Res· 1 2:23 -32,2003; Zhao et al·,PNAS 1 00:2426-243 1,2003; Bonilla et al·,Eur· J. Neurosci· 1 5:5 75-5 82,2002)、骨路 肌細胞(Ferrari et al·,Science 279:1 528- 1 530, 1 998;
Gussoni et al ·,Nature 40 1 : 3 90-3 94, 1 99 9)、心肌細胞 (Jackson et al·,J. Clin· Invest. 1 07:1 395-1 402,2001)以及 肝細胞(Lagasse et al·,Nat. Med. 6:1229-1234,2000)。骨 髓基質細胞(Bone marrow stromal cells)可能分化為心肌 細胞與骨骼肌細胞(Galmiche et al·,Blood 82:66-76,1993; Wakitani et al·,Muscle Nerve 1 8:14 1 7- 1426,1 995) ’ 而腦 幹細胞則可能分化成血球細胞與骨骼肌細胞H α/., Science 283:5 34-547, 1 999 ; Galli et aL, Nat.
Neurosci. 3:986-991,2000) ° 胚胎幹細胞與成人幹細胞在細胞再生治療的應用上 分別具有其優缺點。成人幹細胞的優點之一在於可培養患 者自身的細胞,放大其細胞數量後’再重新植回患者體 内。使用患者自身的成人幹細胞可避免患者發生免疫系統 7 1299752 排斥外來細胞的情形,因此可以不需使用免疫抑制藥物。 相反地,若將捐贈者所提供的胚胎幹細胞植入患者體内, 則可能造成患者出現移植排斥的現象。 相反地,胚胎幹細胞可分化成體内所有的細胞種類, 雖然上述内容中提到曾有證據暗示成人幹細胞可能分化 成其他的細胞種類,但通常成人幹細胞僅能分化成自身來 源組織的細胞種類。此外,胚胎幹細胞較成人幹細胞相對 較容易經培養而生長,而成人組織中的成人幹細胞數目稀 少,並難以藉由細胞培養方式來放大其細胞數量。基於上 述理由,因此對於需要大量細胞數目的幹細胞取代治療方 法來說,胚胎幹細胞較具優勢。 胚胎幹細胞通常取自人工受精計晝或捐贈配子 (gamete)中所多出的胚胎。然而,由於胚胎幹細胞與生命 息息相關,因此在其應用上極具爭議性。相對的,成人幹 細胞雖不引起道德上的爭議,但其細胞增殖與分化的能力 低於胚胎幹細胞。此外,通常需要進行侵入性手術方能取 得成人幹細胞。再者,胚胎幹細胞可能產生畸胎瘤(一種 共由三層胚層所構成的良性瘤),而成人幹細胞則無此問 題。 【發明内容】 本發明提供一種取自產後胎盤的幹細胞。本發明之方 向在於提供一種獲得胎盤幹細胞的方法,此方法包括:取 得一產後胎盤;製備胎盤細胞的一單離細胞懸浮液〇 8 1299752 single-cell suspension);培養該胎盤細胞;以及獲得一 盤幹細胞。所獲得的該胎盤幹細胞可能為多能型或潛能 幹細胞,並且該胎盤可以是人類胎盤。 本發明之另一方向在於提供一種培養胎盤幹細胞 方法,此方法包括:取得一產後胎盤;製備胎盤細胞之 單離細胞懸浮液;培養該胎盤細胞;獲取一胎盤幹細胞 以及培養該胎盤幹細胞。所獲得的該胎盤幹細胞可能為 能型或潛能型幹細胞,並且該胎盤可以是人類胎盤。 本發明之又一方向在於提供一種已分離的胎盤幹 胞(an isolated placental stem cell),此胎盤幹細胞具有 細胞標記等數種特定的特徵。 本發明之更有一方向在於提供一種已分離的多能 或潛能型胎盤幹細胞之同質細胞群,其具有包括細胞標 在内的數種特定的特徵。 因此,本發明亦有一方向為提供一種根據某些細胞 記特徵來取得一胎盤幹細胞的方法。 再者,本發明更有一方向是提供取自產後胎盤的冷 保存胎盤幹細胞。 本發明尚有其他方向是提供一種包含胎盤幹細胞 組合物,及一種包含胎盤幹細胞的藥學組合物。本發明 提供一種治療病患的方法,此方法包括對患者施予一有 劑量之胎盤幹細胞。 【實施方式】 胎 型 的 9 多 細 如 型 記 標 凍 之 亦 效 9 1299752 是幹 盤為 胎盤 於胎 由此 。 因 胞, 細份 幹部 的一 盤的 胎來 後出 產化 自演 來胎 種胚 1 由 供是 提且 明源 發起 本的 兒 胎 豐 了 供 提 子 因 長 生 與 胞 細 有 具 胞 細 幹 人 成 他 其 較 能 可此 胞。 細力 幹能 盤化 胎分 , 與 此殖 為增 〇 胞 源細 來的 的高 富 更 盤器侵 時行 *7暫進 外的需 是 官 棄不 丟亦 後議 產 爭 於德 並道 活成 存造 兒 會 胎不 持盤 維胎 來的 用 得 中取 宮後 子產 在以 個所 胞 細 得 取 來 術 手 性 入 些于 這別 述特 描為 作些 僅該 語 術 的 用 使 及 例 施 實 佳 較的 之目 述之 敘例 處施 此實 佳 較 明 發 本 定 限 來 用 br 而 揭 ^明 佳發 較本 他讀 其閱 之在 述者 敘藝 中技 文知 明 發 本 為 亦 例 蓋 涵 所 圍 可 後 容 易 本 習並 且明 發 實施之。 本發明係有關於取自產後胎盤的幹細胞。于文中所使 用之用詞「幹細胞(stem cell)」係指一種能不斷複製增殖 以形成器官或組織之特殊功能細胞的優勢細胞(master cell)。幹細胞可進行分裂而產生兩個子代幹細胞,或是產 生一個子代幹細胞與一個祖代細胞(或稱過渡細胞,transit cell),此祖代細胞隨後會增殖成組織中成熟發育完全之細 胞。文中所使用「幹細胞」之用詞包括多能型幹細胞與潛 能型幹細胞。 文中之用詞「潛能型細胞(p 1 u r i ρ 〇 t e n t c e 11)」係指一 種具有完整多分化能力的細胞,即指那些可成長為哺乳動 物身體中,除了用來發育胎兒所需的細胞以外之任何細胞 種類的細胞。潛能型細胞可進行細胞自新,並且細胞可在 10 1299752 組織中保持休眠或靜狀態。 此處之用詞「多能型細胞(multipotent cell)」係指一 種具有可在一指定器官或組織中成長為兩種或兩種以上 不同種類細胞之能力的細胞。然而,多能型細胞具有成為 潛能型細胞的能力。例如,最初認為造血幹細胞是一種多 能蜇細胞,即是一種只能發育成數種血球細胞,但無法發 育成腦細胞的一種幹細胞。然而,如前述内容曾提過,近 來有證據顯示造血幹細胞可能是潛能型細胞,因為其可能 分化成包括腦細胞等其他種類的細胞。 此處之用詞「袓代細胞(progenitor cell)」,係指一種 專門用來分化成一特定細胞種類或形成一特定組織種類 的細胞。 此處之用詞「產後胎盤(post-pa rtum placenta)」,係指 產後自子宮内排出且不包含臍帶的胎盤。因此,本發明之 取得胎盤幹細胞的方法不同於習知技術之使用臍帶或臍 帶血的方法(Migliaccio et al·,Blood 96:2717-2722,2000; Rubinstein et al.? New England J Medicine 3 3 9:1 565- 1 577, 1 998; Hariri et al., U.S· Patent Publication No·: 2 0 0 3 0 1 8 0 2 6 9)。可自任何哺乳物種中取得該產後胎盤,包 括齧齒類、人類、非人類靈長動物、馬類、犬科動物、貓 科動物、牛亞科動物、豬科動物、羊屬動物、兔類動物及 其他動物種類。在一較佳實施例中,使用之胎盤係由人類 身上取得。 胎盤幹細胞可根據其細胞標記來特徵化。目前已知有 11 1299752
多種不同的細胞標記,該些已知的細胞標記可參考資料 如:Stem Cells : Scientific Progress and Future Research Directions. Department of Health and Human Services. June 2001· http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。可利 用如免疫化學法(immunochemistry)或流式細胞儀(flow cytometry)等習知方法來偵測細胞標記。流式細胞儀可對 發光細胞或粒子進行快速光線散射與螢光的測量。當細胞 或粒子各自通過一光束時會產生訊號。分別測量每個細胞 或粒子的信號,且其之輸出結果可代表細胞個別累積的流 式分析特徵(cytometric characteristics)。藉由在用來辨識 細胞標記的抗體上標定螢光染料,使其可被流式細胞儀偵 測到。上述方法請參考下列資料:Bonner et al·,Rev· Sci. Instrum 43:404-409,1 972 ; Herzenberg et al.5 Immunol. Today 2 1:3 8 3 -3 90, 2000 ; Julius et al·, PNAS 69:1934-1938,1 9 7 2; Ormerod (ed·),Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press, 1 997; Jaroszeski et al. (eds·),Flow Cytometry Protocols in Methods in Molecular Biology No. 9 1,Humana Press,1 997; Practical Flow Cytometry, 3rd ed.? Wiley-Liss? 1 995。 在本發明一較佳實施例中,一種人類胎盤幹細胞可表 現出至少一種下列細胞標記:CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD105/SH-2/内皮因子(endoglin)、CD166、 SH-3、SH-4、間絲蛋白(vimentin)、HLA-ABC、SSEA-4、 TRA-1-60與TRA-1-81。在又一較佳實施例中,人類胎盤 12 1299752 幹細胞至少對下列一種細胞標記之測驗為陰性:c D 1 4、 CD34、CD45、AC 或 CD133/2、細胞角質蛋白 7 (cytokeratin 7)、溫偉伯氏因子(von Willebrand factor)、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白 A(glycophorin A)、胎盤驗性填酸酶 (placental alkaline phosphatase)與 β-人類絨毛膜性腺激素 (β -human chorionic gonadotropin) 〇 在本發明另一較佳實施例中,胎盤幹細胞至少對下列 一種細胞標記之測驗為陽性:CD9、CD1 3、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD105/SH-2/内皮因子(endoglin)、CD166、 SH-3、SH-4、間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1 - 8 1,並且至少對下列一種細胞標記之測驗為陰 性:CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、細胞角質蛋白 7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白A、胎 盤鹼性磷酸酶與β _人類絨毛膜性腺激素。 本發明亦可提供一種胎盤幹細胞之均質細胞群。文中 之用詞「均質細胞群(homogeneous population)」係指表現 出實質相同之表現型的一群細胞,例如利用細胞標記來判 斷細胞是否為相同表現型。一群均質細胞群中至少包含約 70 %的相同細胞,或至少包含約80 %、90 %、92 %、96 0/〇 或99 %之實質相同的細胞。 故本發明提供一種藉著分離出具有某些細胞特徵之胎 盤細胞以取得胎盤幹細胞的方法。可由上述產後胎盤取得 之胎盤細胞的該單離細胞懸浮中,或由自胎盤中分離ji加 以培養的胎盤細胞中,分離出具有上述這些細胞特徵的胎 13 1299752 盤細胞。並藉著如上述之流式細胞儀並根據細胞特徵來分 離細胞。在本發明之一較佳實施例中,藉著分離具有至少 下列一種特徵之胎盤細胞來取得胎盤幹細胞,該些特徵為·· 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、CD9〇/Thy-l、 CD105/SH-2/内皮因子(endoglin)、CD166、SH-3、SH-4、 間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1.81 之測試呈陽性反應; 對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、細 胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣 蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β -人類絨毛膜性腺激素之測試 呈陰性反應;或是 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、CD90/Thy-1、 CD105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、SH-4、間絲蛋白、 HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81 呈陽性反應, 並且對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、 細胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、HLAG、血型 醣蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β -人類絨毛膜性腺激素呈陰 性反應。 本發明亦提供一種取得胎盤幹細胞的方法。此方法至 少包括步驟:取得一產後胎盤、製備胎盤細胞之一單離細 胞懸浮液、培養該胎盤細胞、以及取得一胎盤幹細胞。產 後胎盤之取得方法可以在徵求同意後自剖腹產手術或正 常分娩過程中取得。並可使用如剪刀等器具將胎盤以機械 性的方式切成小片。再利用如胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳 14 1299752 蛋白酶(chymotrypsin)、溶鹵 if (lyS0Zyme)、殿粉酶(amyiase) 或K蛋白分解酶 (protease K)等酵素來分解胎盤以製備 出一單離細胞懸浮液。並以含有如DMEM (Gibco)與1〇 % 小牛血清(指定批次之Hy cl one產品)之標準培養基的培養 液來培養上述過程中所得到的胎盤細胞,並可在培養液中 添加適量的葡萄糖及/或抗生素。在培養液中持續培養的 胎盤細胞中取得胎盤幹細胞。 可根據分化成不同細胞種類之能力來彳貞測培養過程 中出現的胎盤幹細胞。例如,可測試培養中的細胞其分化 成脂肪細胞(adipocyte)及/或造骨細胞(oste〇blast)的能 力。脂肪細胞是一種負責合成與儲存脂肪的結締組織細胞 (connective tissue cell) »造骨細胞則是負責骨骼生成的主 要細胞’並被認為是源自於骨架組織(s k e 1 e t a 1 t i s s u e s)中 的骨質祖代細胞(osteoprogenitor cell)。 可將該細胞培養在含有1 0 %兔子血清(髓基質骨質原 生細胞中一種已知的脂肪生成作用(adipogenesis)誘導因 子)來誘導進行脂肪細胞分化(Diascro et al.,J. Bone Miner. Res· 13:96-106,1988)。並利用如免疫組織染色法 (immunohistochemistry)與反轉錄聚合酶鏈瑣反應 (RT-PCR)等方法來測定脂肪細胞轉錄因子ppaRy2及/或 CEBPa的表現量,以偵測脂肪細胞分化情形(ppaRy2全名 為 peroxisome proliferator activated receptor gamma 及 CEBPa全名為 CCAAT/enhancer binding protein alpha) 〇 或 是將細胞置於脂肪細胞誘導分化培養液中培養後,加入 15 1299752
Oil Red Ο進行染色來顯示細胞中脂質的累積量,以偵測 脂肪細胞的分化情形(Conget and Minguell,J· Cellular Physiology 1 8 1 :67-73,1 999)。亦可使用其他誘導與偵測 脂肪細胞分化的方法(請參考 Pittenger et al·,Science 284:1 43- 1 47,1 999; Tchoukalova et al.,Obesity Research 8:664-672, 2000) 〇 可將細胞培養在含有如甲異丁基黃嘌呤 (methylisobutylxanthine)、腎上腺皮質酮(dexamethasone) 與胰島素(insulin)等成分之培養液中便可誘導細胞進行 硬骨細胞分化(Student et al., J. Biol. Chem. 255:4745-4750, 1 980)。並藉著測試包括骨橋蛋白 (osteopontin,OP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OC)、骨黏連蛋 白(osteonectin,ON)與骨涎蛋白(bone sialoprotein)等造 骨標記的表現來偵測硬骨細胞分化過程。亦可利用 von Kossa染色法與/或用來偵測骨骼中鈣沈積活性之茜素紅染 色法(alizarin red stain)來偵測骨生成作用 (osteogenesis)(Jaiswal et al.? J Cell Biochem. 64:295-3 1 2, 1 997 與 Wan et al·,Chin. J. Traumatol. 5:3 74-3 79,2002) o 當然,亦可利用習知方法來誘導本發明之胎盤幹細胞 分化成其他種類之細胞。 本發明還提供一種培養胎盤幹細胞的方法,此方法至 少包含:取得一產後胎盤、製備胎盤細胞之一單離細胞懸 浮液、培養該胎盤細胞、取得一胎盤幹細胞、以及培養該 胎盤幹細胞。並且培養胎盤幹細胞之培養液可與培養胎盤 16 1299752 細胞之一單離細胞懸浮液之培養液相同。 本發明更提供一種含有本發明胎盤幹細胞的組合 物。本發明亦提供一種含有本發明胎盤幹細胞的藥學組合 物。本發明之胎盤幹細胞或其配方可藉由包括非經腸胃道 之注射(如皮下或肌肉内注射)或靜脈滴注等任何傳統方 法對患者用藥。上述治療方式可為單次用藥,或是在一週 期内進行數次用藥。此藥學組合物可包含一或一種以上藥 學可接受的載劑(carrier)。這些載劑必須為「藥學可接受 的」,而與胎盤幹細胞至少某種程度上的相容,且對該藥 劑之用藥者不具傷害性。載劑通常是經過高温殺菌且不含 致熱源(p y r 〇 g e η)的水或是生理食鹽水。 可冷凍保存本發明之胎盤幹細胞,其係將細胞冷凍保 存於溶液中,如保存於最終濃度不超過 1 0 %的二曱基亞 颯(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中。亦可將細胞冷束保 存於含有二甲基亞礙及/或葡萄聚醣(dextran)的溶液中。 其他冷凍保存細胞的方法亦為習知技藝者所熟知。 本發明提供一種治療患者的方法,此方法包括對一患 者使用一有效治療劑量之本發明胎盤幹細胞。使處之「有 效治療劑量(therapeutically effective amount)」係指能有 效降低疾病症狀的胎盤幹細胞劑量,或是能有效維持或增 加一患者體内從該胎盤幹細胞所衍生出之細胞數目的劑 量。 此處之患者係定義為任何需要接受一胎盤幹細胞之 治療的人類或非人類動物,或是任何在接受過該治療後能 17 物、牛亞科動物 動物種類。 1299752 獲得益處的對象’這些對象包括人類或非人類動物。欲 又療的非人類動物包括所有_養舆野生的哺乳動物。 本發明之一較佳實始办丨士 n位 汽施例中,欲使用之胎盤幹細胞的取得 源係與接受治療之备& 從± . '^勤物的物種相同。哺乳動物種類包括 齒類、人類、非人類雷旦毹輪 、頭靈長動物、馬類、犬科動物、貓科 豬科動物、羊屬動物、兔類動物及其 、本發月之胎盤幹細胞可用來治療因受傷而需要更 或再生組織之任何種類的外傷傷口。這類的外傷狀況包 中樞神、,.工系統傷害(CNS),如腦部、脊魏、中極神經周 組織至周邊神經系統(PNS)或是身體任何部位的傷害。 類外傷可能是由意外事故或是由正常或不i常的醫療 序所le成,例如手術或血管擴張術所產生的外傷。這類 傷可能與血·管破裂或血管阻塞有關,例如中風或靜脈炎 在一些特殊較佳實施例中,將這些細胞用於自體組織或 體組織置換或再生之治療或程序中,包括用於角膜上皮 損治療(corneal epithelial defect)、軟骨修復、顏面磨皮 (facial dermabrasion)、口 鼻黏膜(mucosal membrane)、 膜、腸道内襯組織(i n t e s t i n a 1 1 i n i n g)、神經結構(如視 膜、基底膜中的的聽覺神經、嗅覺上皮中的嗅覺神經) 皮膚之燒傷或創傷修復,或是用來重建其他受創或患病 器官或組織,且該些細胞之用途並不僅限於此。此外損 亦可能由特殊情況或疾病所造成,包括心肌梗塞、癲癇 多發性硬化症、中風、低血壓、心跳停土、再灌注損 接 在 來 齧 動 他 換 括 圍 此 程 外 〇 異 缺 術 鼓 網 之 傷 18 1299752 發炎反應、因老化所造成認知能力退化、放射線傷害、腦 性麻痺、神經退化性疾病、阿茲海默症(A1 z h e i m e r ’ s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s diease)、腦脊鑛病變 (L e i g h ’ s d i s e a s e)、愛滋病癡呆综合症、喪失記憶、肌萎 縮側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、缺血 性腎臟病、腦部或脊髓損傷、心肺繞道手術、青光眼、視 網膜再灌注損傷、視網膜外傷、先天性代謝疾病、腎上腺 腦白質退化症、纖維囊種、肝醣儲積症、甲狀腺功能低下 症、鐮刀型血球貧血症、皮爾森氏症(Pearson syndrome)、 魔氏症(Pompe’s disease)、苯酮尿症(PKU)、紫質症、楓糖 尿症、高胱胺酸尿症、黏聚醣疾病(mwopiysaaharide no si s)、慢性肉芽腫以及酷胺酸血症、癌症、腫瘤或其他 病理或惡性贅瘤等症狀。 用於治療中的胎盤幹細胞亦可含有一有效劑量之核 酸載體(nucleic acid vector)或生物載體,以指揮患者體内 一指定基因的表現。傳統重組核薇載體的構築與表現方法 均為習知技藝者所熟悉,且該些方法包括記那些載於由 Sam brook 等人所編著之「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols 1-3 (2d ed· 1 989),Cold Spring Harbor Laboratory Press」中的相關技術。 上述核酸載體可包含在一生物載體内,例如病毒與細 菌,尤以包含在一非致病性或減活微生物中為佳,其包括 減活後的病毒、細菌、寄生蟲以及類病毒粒子。 可利用體外基因治療方法gene therapy 19 1299752 protocol)將上述核酸載體或生物載體導入細胞中,此方法 包括自一患者身體中切除細胞或組織、將核酸載體或生物 載體導入切出的細胞或組織中、以及將切出之細胞重新植 回患者體内(請參考 Knoe11 et a1·,Am· J· Health Syst· Pharm· 55:899-904,1 998; Raymon et al·,Exp. Neurol. 144:82-9 1, 1 997; Culver et al·, Hum. Gene Ther. 1:399-4 1 0,1 990; Kasid et al·,Proc. Natl· Acad· Sci· U.S.A. 87:473-477,1 990)。可利用如磷酸鈣媒介轉染法 (calcium phosphate-mediated transfection)來將核酸載體 或生物載體導入切出的細胞或組織中(Wigler et al.,Cell 14:725,1 9 7 8; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham and Van der Eb,Virology 52:456, 1 973)。亦可使用其他方法將核酸載體導入宿主細胞中 中,例如電穿孔法(electrop〇ration)(Neumann et al.,EMBO J. 1:841-845, 1982) ° 本發明之細胞亦可配合其他藥劑共同使用,例如其他 種類之細胞、生長因子與抗生素。其他藥劑之種類可由席 之技藝者決定。 需明白於實施例或他處内容中所顯示之成分用量、反 應條件等數字或是本申請說明書内容所使用之數字均為 大約數值。因此,除非文中特別注明,本說明書之上述數 字參數均為近似值’其可根據欲求得之本發明結果而加以 變化。並且,這些參數並非用來限定與本發明申請專利範 圍均等之原理’而是應用正常操作技術下所得到之較佳數 20 1299752 據。 雖然上述用來指出本發明之最大範圍之數據範 參數均為近似值,但上述特定較佳實施例中所記述之 值已盡可能地精準。然而各個測量實驗均有其標準偏 因此任何數據值必有部分誤差。 須明白到,若無特別於上下文中清楚記述其他意 則說明書内容及後附申請專利範圍中所使用之如 (a)」、「以及(and)」與「該(the)」等特定用語均包含 數型態。 除非另行定義,文中所使用之所有專業與科學用 習知技藝者所熟悉之意義相同。此外,任何與所記載 相似或均等之方法及材料皆可應用於本發明方法中。 所述之較佳實施方法與材料僅做示範之用。 於本申請書中所提到之所有參考文獻均全體納 考,以揭露並敘述該文獻所記載之相關方法及/或材 此外,文中所討論之文獻僅揭露本發明申請曰前之習 術。並且無任何文獻顯示本發明内容曾為習知技術 露。本發明内容所得到之實際數據會因個別的實施條 與本發明揭露於說明書内容中之數據有所不同。 各種實施本發明之方法技術及/或實驗程序(統稱 法」)包含任何可達成相同目的之習知方法,但不能限 本說明書之特定的方法範例。此外,雖已於說明書之 内容中敘述部分方法,然該些方法係作示範本發明之 並非用來限定本發明内容。 圍及 數據 差, 義, r — 其複 語與 内容 文中 入參 料。 知技 所揭 件而 「方 定為 特定 用, 21 1299752 以下藉由數個較佳實施例來說明本發明,並非作限定 本發明之用。 整佳實施例1 歷盤幹細胞之分離與培養 係先取得由剖腹生產或自然分娩之健康母親捐贈,且 附有經人體試驗委員會認證僅將此胎盤作研究目的用之同 意書的足月胎盤(約懷孕3 8至4 0週之胎盤)。小心地將此 胎盤切塊’並以罐酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline, PBS)清洗數次。將收取的產後胎盤組織小塊以剪刀切成更 小的碎片,並以0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)溶液使組織 碎片於3 7 °C下進行酵素分解1 〇分鐘。隨後離心以沈澱細 胞,並以磷酸鹽緩衝溶液清洗細胞一次後,再將細胞懸浮 於含有10 %小牛血清(Hyclone)、100 U/ml盤尼西林(Gibco) 及100 11/1111鏈黴素(〇丨1^〇)的〇]\^]\4培養液(〇丨1^〇)中。於 3 7 °C且含有5 %二氧化碳之飽和濕度環境下培養該細 胞,並每週更新培養液兩次。當細胞數量覆蓋8 〇 %的培養 皿面積時’以0.25%騰蛋白酶-EDTA(Gibco)溶液來收取細 胞,再以1 : 2至1 : 3的比例將細胞重新分盤。隨後使細 胞於盤中至少成長9天後,即可進行分析試驗。 較佳實施例2 胎盤幹細胞之脂肪細胞分化輿硬骨細胞公仆 22 1299752 以脂肪細胞培養液(adipogenic medium)或硬骨細胞培 養液(〇 s t e 〇 g e n i c m e d i u m)來培養根據較佳實施例1所獲付 之細胞,其中,脂肪細胞培養液中含有0.5 m M曱基異丁 基黃嘌呤、1 μΜ腎上腺皮質酮、1〇 μΜ胰島素與60 μΜ消 炎痛(indomethacin)(Dennis et al·,J. Bone and Mineral Research 14:700-709,1 999),硬骨細胞培養液含有 0·1μΜ 腎上腺皮質嗣、10 mM β·鱗酸甘油酯(β-glycerol phosphate) 與50 μιη抗壞血酸鹽(即維他命C)(Jaiswal et al·,J Cell Biochem. 64:2 95-3 1 2,1 99 7)。隨後利用 Oil Red 染色法對 細胞内累積的中性脂肪液泡進行染色以評估脂肪細胞的形 成情況(Conget and Minguell, J. Cellular Physiology 1 8 1:67-73,1 999)。以及利用von Kossa染色法或茜素紅染 色法來偵測細胞中鈣累積情況,以評估硬骨細胞的分化情 形(Jaiswal et al·,J Cell Biochem. 64:295-3 1 2,1 997 與 Wan et al·,Chin· J. Traumatol. 5:3 74-3 79,2002)。 第1圖顯示骨髓間葉幹細胞以Oil Red染色法偵測脂肪 細胞分化現象(第1 A圖),及使用v ο η K 〇 s s a染色法偵測硬 骨細胞分化現象(第1 B圖)的結果,以作正對照組之用。第 2圖展現本發明之胎盤幹細胞的分化潛力。第2A圖顯示 進行脂肪細胞分化後尚未染色的胎盤幹細胞。第2B圖顯 示經過脂肪細胞分化過程並以 Oil Red染色的胎盤幹細 胞,以偵測細胞内的脂肪累積情況。第2B圖顯示根據本 發明方法所獲得的胎盤幹細胞可分化成脂肪細胞。本發明 23 1299752 之胎盤幹細胞亦可分化成如第2C與第2D圖所示之造骨 細胞。茜素紅染色(第2C圖)與von Kossa染色法(第2D圖) 兩者均可在培養的胎盤幹細胞中染到造骨細胞。因此,根 據較佳實施例1所獲得之胎盤幹細胞具有分化成多種細胞 的能力。 較佳膏施例3 胎盤幹細胞之敕骨細胞分化 軟骨母細胞(chondroblast)是一種當其被基質包圍時, 會分泌軟骨基質並成為軟骨細胞的細胞。使用微量培養技 術來誘導上述較佳實施例1中所獲得的胎盤幹細胞進行軟 骨母細胞分化(Barry et al.,Experimental Cell Research 269:1 89-200,200 1 and Zuk et al·,Tissue Engineering 7:2 1 1 · 2 8,2 0 0 1 )。快速地將大約2 0 0,0 0 0個細胞置於一 1 5 ml的聚丙烯圓椎刻度試管中,並以含有1〇 ng/ml轉化生長 因子(TGF)-pl 或 TGF-p3(均講自 R&D systems)、0.1 mM 抗 壞血酸-2-麟酸鹽(ascorbic acid-2-phosphate,Sigma)、 lxlO7 Μ腎上腺皮質酮(Sigma)與1 %胰島素-運鐵蛋白-鈉-亞砸酸鹽培養基(Sigma)的培養液中培養3至6小時。 將該些細胞移至24孔盤中後再培養2至3週。隨後以阿 爾襄藍(Alcian Blue,pHl)對細胞進行染色以偵測出現在 軟骨與其他結缔組織中的蛋白聚醣(proteoglycans)。此 外’將抗-人類第二型膠原蛋白抗體(Santa Cruz 24 1299752
Biotechnology,Inc.)以1 : 1 00之倍率稀釋後,利用免疫細 胞化學方法使細胞與抗體在 4 °C下反應一個晚上來偵測 細胞中的第二型膠原蛋白。隨後,將生物素-抗山羊免疫球 蛋白 G 二次抗體(biotinylated anti-goat IgG secondary antibodies,ABC kit,Vector Labs)以 1 : 500 之倍率稀釋後 與上述細胞於室溫下反應4 5分鐘以進行二次抗體染色。最 後’使用Leica DM IRB倒立式顯微鏡(Leica,Germany)來 觀察細胞。 由第3 A圖與第3 B圖可確認本發明之胎盤幹細胞具有 形成軟骨的潛力。第3 A圖中清楚地顯示一個被阿爾襄藍 染呈藍色的胎盤幹細胞衍生細胞(placental stem cell-derived cell),其表示該細胞製造出蛋白聚醣。第3B 圖亦顯示一個會受到抗第二型膠原蛋白抗體辨識的胎盤幹 細胞衍生細胞,其表示該細胞會製造第二型膠原蛋白,而 第二型膠原蛋白大多出現在軟骨中,並且對於骨絡或其他 結締組織之正常發育過程來說是必要分子。 鮫佳實施例4 胎盤幹細胞之表現复特徵 利用流式細胞儀及/或免疫化學染色法來分析較佳實施 例1中獲得之胎盤幹細胞的細胞標記。分別對根據
Pittenger 等人(Science 284:1 43- 147,1 999)、Reyes 等人 (Blood 98:2615-1625,2001)之方法所取得的骨髓細胞,以 25 1299752 及根據Erices等人之方法所取得的臍帶血(Br. J. Haematol 1 09:23 5-242,2000)和較佳實施例 1中所獲得之胎盤幹細 胞(MPSC)進行細胞標記比較,並將各細胞之細胞標記比較 結果列於表一中。 表一 細胞標記 Pittenger 等 人 (骨髓) Reyes等人 (骨髓) Erices等人 (臍帶血) MPSC CD9 (+ ) (+ ) CD13 (+ ) (+ ) (+ ) CD14 (一) (-) (一) CD29 (+ ) (+ ) (+ ) CD34 (一) (一) (-) (一) CD44 (+ ) (+ ) (+ ) CD45 (一) (-) (-) (-) CD90/Thy· 1 (+ ) (+ ) (+ ) CD105/SH2/内皮 因子 (+ ) (+ ) CD1 17/c-kit (-) (-) AC or CD133/2 (-) CD166 (+ ) (+ ) SH3 (+ ) (+ ) (+ ) SH4 (+ ) (+ ) (+ ) 間絲蛋白 (+ ) 細胞角質蛋白7 ㈠ 溫偉伯氏因子 (-) (-) (-) HLA-ABC (+ ) (一) (+ ) HLA-DR (-) (-) ㈠ HLA-G (-) 血型醣蛋白 A (-) ㈠ SSEA-4 (+ ) TRA-1-60 (+ ) TRA-1-81 (+ ) β -人類絨毛性腺 激素 (-) 胎盤鹼性磷酸酶 (,) 說明書中所引用之參考資料均清楚記載,並於此處將 之全文納入參考。本說明書内的較佳實施例僅作說明本發 26 1299752 明之較佳實施例之用,而非 溢A 非用以限制本發明範圍。習知技 勢者需明白,本發明尚涵篕吝 蚩盥普η , & ^ 涵盍夕種其他較佳實施例,且說明 达直斗丨#阁&田 八貝際精神與範圍當由後附申 看專利範圍所界定 【圖式簡單說明】 第1圖顯示對照組之骨體問筆私 h W “間葉幹細胞之染色結果,作 為正對照組之用,若使用0il Red 人l 、 卞巴法來偵測脂肪細胞 刀化現象,則正對照組之染色結果 芸佶田 ^ 士 勹馬紅色(如第1A圖), 若使用von Kossa染色法來偵 料阳▲、九Δ Λ丄田上 月、、、田胞分化現象,則正 對照組之染色結果為為棕色(如第1Β圖)。 第2圖顯示本發明較佳實施例 月0盤幹細胞之染色結 果,以證明本發明之胎盤幹細胞具 的4处丄 够,Α 々刀化成其他種類之細 胞之此力。第2A圖顯示未染色的 m β · 譴幹細胞,以及第2Β 圖顯不以0 i 1 R e d對細胞進行举多 ^ 偵測出脂肪細胞(圖中 呈紅色之細胞)。第2C圖顯示經茜素 ^ ^ gs - I a杂色後的細胞,以 及第2D顯不以Von K〇ssa染色法所 木色的細胞,第2C與 2D兩圖均顯示在培養的胎盤幹細胞 Α 中偵測到骨母細胞(分 別為呈現紅色與棕色)。 第3圖展示本發明較佳實施 軟骨母細胞的潛力。第3Α圖顯示J盤幹細胞具有分化 ’、、、 、主阿爾襄該毕劑(Alcian
Blue dye)染色後呈現藍色的胎盤幹細 真” ^ . ... a ^ ^ 皰竹化細胞,其暗示 該細胞會表現蛋白聚醣(或稱蛋多 变曰夕騎)。第3B圖顯示一種 27 1299752 可與抗第二型膠原蛋白抗體結合的胎盤幹細胞衍化細胞 【元件代表符號簡單說明】 28
Claims (1)
1299752
公舌恭 十、申請專利範圍 1. 一種取得一胎盤幹細胞之方法,其至少包括: a. 取得一產後胎盤; b. 利用酵素分解該胎盤,以從該產後胎盤製備出 胎盤細胞的單離細胞懸浮液; c. 培養該胎盤細胞;以及 d. 由該胎盤細胞中篩選得一胎盤幹細胞; 其中該胎盤幹細胞對細胞標記 C D 1 1 7 / c k i t、胎盤鹼性 磷酸酶與 HLA-DR 呈陰性反應,並且對細胞標記 HLA-ABC呈陽性反應。 2. 如申請範圍第1項所述之方法,其中該胎盤為人 類胎盤。 3. 如申請範圍第1項所述之方法,其中該胎盤幹細 胞為多能型。 4. 一種培養一胎盤幹細胞之方法,其至少包括: a. 取得一產後胎盤; b. 利用酵素分解該胎盤,以從該產後胎盤製備出 胎盤細胞的單離細胞懸浮液; 29 1299752 C.培養該胎盤細胞; d. 取得一胎盤幹細胞;以及 e. 培養該胎盤幹細胞; 其中該胎盤幹細胞對細胞標記 CD1 1 7/ckit、胎盤鹼性 磷酸酶與 HLA-DR 呈陰性反應,並且對細胞標記 HLA-ABC呈陽性反應。 5. 如申請範圍第4項所述之方法,其中該胎盤為人 類胎盤。 6. 如申請範圍第4項所述之方法,其中該胎盤幹細 胞為多能型。 7. 一種利用如申請專利範圍第 1項所述之方法取 得之多能型胎盤幹細胞。 8. 如申請範圍第7項所述之胎盤幹細胞,其中該胎 盤幹細胞為人類胎盤幹細胞。 9. 一種具有至少一下列特徵之已分離胎盤幹細胞, a.對細胞標記 CD9、CD1 3、CD29、CD44、 CD90/Thy-1 、 CD 105/SH-2/ 内皮因子(endoglin)、 30 1299752 CD 1 66、SH-3、SH-4、間絲蛋白(vimentin)、S SEA-4、 TRA-1-6 0與TRA-1-81之測試呈陽性反應; b·對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD13 3/2、細胞角質蛋白7(cytokeratin 7)、溫偉伯氏因 子(von Willebrand factor)、HLA G、血型膽蛋白 A(glycophorin A)與β-人類絨毛膜性腺激素(β-human chorionic gonadotropin)之測試呈陰性反應;或 c.對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、C D 1 0 5 / S Η - 2 / 内皮因子、C D 1 6 6、S Η 3、 SH-4、間絲蛋白、SSEA-4、TRA· 1-60 與 TRA-1-8 1 之 測試呈陽性反應,且對細胞標記C D 1 4、C D 3 4、C D 4 5、 AC或CD133/2、細胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA G、血型醣蛋白Α與β -人類絨毛膜性腺激素之測試呈陰 性反應; 其中該胎盤幹細胞對細胞標記CD 1 1 7/ckit、胎盤鹼 性磷酸酶與HLA-DR呈陰性反應,並且對細胞標記 HLA-ABC呈陽性反應。 10·如申請範圍第9項所述之已分離胎盤幹細胞,其 中該胎盤幹細胞為多能型。 11·如申請範圍第7或9項所述之已分離胎盤幹細 31 1299752 胞,其中該胎盤幹細胞為胎盤幹細胞均質細胞群,該群均 質細胞群中至少包含約7 0 %、8 0 %、9 0 %、9 2 %、9 6 % 或99 %之實質相同的胎盤幹細胞。 12. 一種包含如申請專利範圍第7或9項所述之胎盤 幹細胞的組合物。 13. 一種包含如申請專利範圍第7或9項所述之胎盤 幹細胞的藥學組合物。 14. 如申請專利範圍第7或9項所述之胎盤幹細胞, 其中該胎盤幹細胞以冷凍保存。 15. 一種使用如申請專利範圍第7或9項所述之胎盤 幹細胞來製備用以醫療藥物的用途。 16. 一種取得一胎盤幹細胞之方法,該方法包括: a. 取得一產後胎盤; b. 利用酵素分解該胎盤,以從該產後胎盤製備出 胎盤細胞的單離細胞懸浮液; c. 培養該胎盤細胞;以及 d. 取得一胎盤幹細胞; 32 1299752 e ·分離出具有至少一下列特徵之胎盤幹細胞; 反 或 因 毛 反 伯 A 反 性 記 i) 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44 CD90/Thy-1 、 C D 1 0 5 / S Η - 2 / 内皮因子 CD166、SH-3、SH-4、間絲蛋白、SSEA-4 TRA-1-60與 TRA-1-81 之測試呈陽性 應 , ii) 對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC CD 13 3/2、細胞角質蛋白 7、溫偉伯氏 子、HLA G、血型醣蛋白A與β-人類絨 膜性腺激素之測試呈陰性反應;或 iii) 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44 CD90/Thy-1 、 CD 105/SH-2/ 内皮因子 CD166、SH-3、SH-4、間絲蛋白、SSEA-4 TRA-1-60與 TRA-1-81 之測試呈陽性 應,且對細胞標記C D 1 4、C D 3 4、C D 4 5 AC或CD 13 3/2、細胞角質蛋白7、温偉 氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白 與β -人類絨毛膜性腺激素之測試呈陰性 應; 其中該胎盤幹細胞對細胞標記 CD1 1 7/ckit、胎盤鹼 磷酸酶與 HLA-DR 呈陰性反應,並且對細胞標 HLA-ABC呈陽性反應。 33 1299752 17. 如申請範圍第16項所述之方法,其中該胎盤幹 細胞為多能型。 34
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