TWI293089B - Oxygen indicator and package - Google Patents

Description

1293089 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關使用酶之氧指示器，及具備該氧指示器 之包裝物者。 【先前技術】 從超市購買食品材料，在各家庭中加以調理而食用之 傳統的飮食生活型態，更上一層的，最近由於夫婦都在工 作沒時間調理，或爲獲取較多之自己興趣的時間等理由，而 產生使家事簡便化之意向；直接購買於超市等之後院、中 央廚房調理的即可食用食品，在家中享用的型態，日漸增加 〇 另一方面，在超市、便利商店之即可食用食品中，販賣 即可食用之便利性的各種食品之味道、容量等，迎合消費者 所好之商品的開發，甚爲活躍，而有各式各樣的食品投入市 場；又，超市、便利商店等之飯菜銷售業者，爲提供消費 者強烈要求之材料的可口度及回應安心、安全、健康之意向 ，一直在探尋提供減少食品防腐劑等之飯菜；但是，減少 食品防腐劑時，食品就提早開始腐敗，必須要有食品之安全 對策；又，由相關食品腐敗的硏究中，確知空氣中氧之影 響極爲重要；因此，包裝物內以無氧狀態包裝之種種方法 ，被提出討論；以防止食品腐敗爲目的之包裝物內在無氧 狀態的保存方法有，包裝物內以真空狀態包裝之真空包裝 、包裝物內使用氧吸收劑之無氧包裝、包裝物內以所期望 -5- 1293089 (2) 之氣體密封的氣體取代包裝等等。 例如，真空包裝時，包裝物內至真空狀態之故’可以 防止食品之氧化等的腐敗；又，能簡易的以目視確認判 斷包裝物內是否保持在真空狀態，是否有空氣流入；又 ，真空包裝在保管、陳列空間之點上具有優勢，大多使 用於必要較長期保存的情況；不過，包裝物內係真空之 故，係以大氣壓使食品密著於薄膜等之包裝型態，不能 賦予容積感，食品之型態成爲壓扁狀，從美觀性之觀點 而言，尙有問題存在。 另一方面，包裝物內使用氧吸收劑，以具有氧吸收層 之包裝材料包裝的方法，及包裝物內以所期望氣體密封 的氣體取代包裝之方法，不會被大氣壓壓壞，能顯示食品 原本製作之形狀；因此之故，此等方法能使商品看起來 可口，即所謂顯示效果，設計商品之差別化爲其優點；因 而，在欣賞滋味期限爲數天至一個月之較短期間的商品 ，進行以氧吸收之無氧包裝、氣體取代包裝的檢討爲主 〇 不過，在以氧吸收之無氧包裝、包裝物內以所期望 之氣體密封的方法（氣體取代包裝）中，目視包裝物內 之氣體環境，判斷包裝物內是否適合在氣體大氣下保存 ，極爲困難；因而，探尋著判定包裝物內之在氣體大氣 下是否具適應性的方法；期待開發能檢測對食品腐敗尤 其具有甚大影響之氧的有無之氧指示器。 如此之氧指示器，例如有特開昭5 4 - 1 3 8 4 8 9號公報 （ 1293089 (3) 專利文獻1)上，以亞甲藍、糖類、鹼性物質、水分及抗 .壞血酸所成，當含有氧時，在氧指示器內之水分中溶解 的氧，會使亞甲藍氧化而顯示藍色，當不含氧時，鹼性糖 溶液會使亞甲藍還原而顯示無色之脫氧指示器的揭示； 又，例如有特表200 1 _5 03 3 5 8號公報（專利文獻2)上，適 當選擇A氧化還原著色指標材料之酶催化劑，與氧反應而 受色之氧指示器的揭示；此等氧指示器，附在包裝容器 內、或一部份由容器外側粘貼於氧氣透過性處所所成包 裝容器之該處所的結構；包裝容器內之氧的有無，藉由 亞甲藍、其他氧化還原著色指標材料之變色，可用目視 確認，是其優點。 不過，以專利文獻1爲代表之亞甲藍、糖類、鹼性物 質及水份所成的氧指示器，在包裝物內有二氧化碳存在 時，例如，使用以食品保存之觀點而言爲不活性的氮氣 及有抑菌作用之二氧化碳的混合氣體包裝之氣體取代包裝 時，對水之溶解性比氧高的二氧化碳，溶解於氧指示器內 之水份，致pH產生變化之故，不能使亞甲藍發生還原作用 ，而有色彩變化不明確的問題；又，隨情況之不同，即使 在無氧狀態，由於二氧化碳之影響，使亞甲藍顯示藍色，會 誤判爲含有氧之問題存在；進而，從抑菌、殺菌效果之觀 點而言，在氣體取代包裝中使用醇時，受此醇存在之影響 ，有會使檢測氧之能力降低的問題存在；如此之採用亞 甲藍的氧指示器，只能使用於沒有二氧化碳、醇存在， 或其濃度極低之不得已的各種必要條件之情況；而且， 1293089 (4) 判斷氧之有無，依賴亞甲藍本身的氧化還原之故，感度 過於敏銳，變色之氧濃度的極限値之設定、變色速度等 依所期望之設定，有甚爲困難的問題；又，亞甲藍以外 之色素，從穩定性、耐候性之觀點而言，有難以使用等 之問題存在；又，含有鹼性物質之故’在誤食誤飮時， 亦有危害人體之問題。 利用酶反應之專利文獻2上記載的氧指示器，爲在包 裝物內有二氧化碳存在之氣體取代包裝時，由於緩衝、液 的存在能緩衝pH之變動，可以降低對氧檢測之影響；但 是，氧檢測之感度遲鈍、酶本身之穩定性缺乏，經過長 時間後，色彩變化不明確而氧檢測之能力下降，依情》兄 之不同，有將氧侵入亦誤判爲在無氧狀態的問題。 尤其是，近年來超市、便利商店等之飯菜販售業者 儘量提供可口之材料，並探尋減少食品防腐劑等之健康意 向的飯菜之提供；但是，減少食品防腐劑時，食品即提早 開始腐敗，必須要有食品的安全對策之故，就不使用食品防 腐劑等添加物而能提高食品之貯藏性的方法之氣體取代包裝 加以檢討；氣體取代包裝，係以不活性氣體之氮、氬等將 包裝物內密封，可抑制食品因氧而氧化劣化的方法；從防 止食品之微生物學的污染觀點而言，此氣體取代技術更上一 層的，將其他氣體混合於不活性氣體中，可達到抑制微生物 等之繁殖、及殺菌的目的；抑制微生物等之繁殖所使用的 氣體、及殺菌所使用的氣體之例，從低成本、食品安全的觀 點而言’有二氧化碳、醇類等等；二氧化碳以抑制微生物 -8- 1293089 (5) 之繁殖爲主，具有抑菌作用；而醇類以具有微生物之殺菌 作用爲主；近年來之氣體取代包裝中的不活性氣體，由食 品安全性之觀點而言，大多使用將二氧化碳等之抑制微生物 繁殖氣體、與醇類等之微生物殺菌氣體混合的氣體組成； 因此，期望亦可使用此不活性氣體、及二氧化碳等之抑制微 生物繁殖氣體、醇類等之微生物殺菌氣體的混合組成之氧 指示器。 [專利文獻1]特開昭54- 1 38489號公報 [專利文獻2]特表200 1 -50335 8號公報 【發明內容】 [發明之揭示] 本發明之課題爲提供，在二氧化碳、醇類之存在環境下 ，亦能長時間以穩定之高感度明確的檢測氧之有無的氧指 示器者。 又，本發明之課題爲提供，具備容器內或袋內之氣體組 成在控制範圍，於二氧化碳、醇類之存在環境中亦能明確檢 測氧之有無的採用酶之氧指示器的包裝物者。 本發明的工作同仁，爲達成上述之課題，經深入探討， 不斷硏究之結果，完成本發明。 即，本發明爲如下所述者。 (1) 一種氧指示器’其特徵爲採用基質在氧之存在下 ，藉由酶之催化作用，使光吸收波長產生變化反應的氧指 示器者：係含有至少含發色性基質、與氧化還原酶、及將 -9 - 1293089 (7) (10) 如上述（1)〜（9)項中任一項記載之氧指示劑 ’其中上述氧感應性溶液，爲另含有與上述光吸收波長變化 反應競爭而和氧反應之化合物，或吸附氧之化合物者。 (11) 一種包裝物，係包含容器或袋所成之包裝物者； 其特徵爲藉由該容器內或袋內含有上述（1)〜（10)項中任 一項記載之氧指示器，或藉由上述（1)〜（10)項中任一項 記載之氧指示器，如堵塞似的裝配於該容器或袋之開口處 ，能檢測該容器內或袋內之氧濃度者。 (12) 如上述（11)記載之包裝物，其係真空包裝者 〇 (13) 如上述 （11)記載之包裝物，其係在上述容器 或袋內塡充不含氧之氣體的氣體取代包裝者。 本發明之氧指示器，依氣體取代包裝，在二氧化碳、 醇類存在之環境下，亦能長時間穩定而高感度的藉由色 彩等之變化，明確的檢測氧之有無；及具備容器內或袋 內之氣體組成在控制範圍’於二氧化碳、醇類存在之環境 下，亦能明確檢測包裝物內氧之有無的效果。 [用以實施發明之最佳形態] 就本發明，尤其以其適合之型態爲中心’具體的說明如 下。 本發明之氧指示器係’由含有發色性基質 '與氧化還 原酶、特定之還原劑的氧感應性溶 '液’或含有發色性基質' 與氧化還原酶、酶穩定化劑之氧感應性溶液，或含有發色性 -11 - 1293089 (8) 基質、與氧化還原酶、酶穩定化劑、還原劑之氧感應性溶液 所成者；本發明之氧指示器係藉由此等成份之組合，以所 期望之氧濃度做爲極限値，判斷氧之有無者；更詳細的說 ，係藉由從無氧狀態或低氧狀態增加氧而產生之色彩變化檢 測者；還有，本發明所謂氧感應性溶液，係指溶解之發色 性基質以酶的催化作用介入其間，藉由存在其大氣中氧的氧 化，使光吸收波長變化而引起色彩等之改變的溶液而言。 本發明與專利文獻1之先前技術最大的不同爲，二氧化 碳存在於包裝物內時對氧之檢測沒有影響；即，專利文獻1 之氧指示器含有亞甲藍、糖類、及鹼性物質；發色性色素 之亞甲藍，因溶解於溶液之氧而成氧化型（發色狀態）， 以糖類與鹼性物質其還原作用防止，亞甲藍成爲無色之還原 型；因而，溶解於水顯示酸性之二氧化碳存在時，此還原 作用減弱，會影響到氧之檢測。 針對於此，本發明之特徵爲，溶解於溶液之氧，利用氧 化還原酶的催化作用，使發色性基質氧化，而改變光吸收波 長；因此，在溶液中溶解有二氧化碳時，藉由判斷氧之有 無的酶反應、及還原劑，亦不影響將氧化之發色性基質還原 的反應。 本發明與專利文獻1之先前技術的另一不同爲，本發明 中，依使用氧化還原酶及發色性基質之組合的種種選擇，可 用所期望之光吸收波長的改變，檢測氧之有無；更上一層 的，酶反應由於基質之選擇性高，亦可以依酶與基質之組合 ，將數種之酶及基質混合使用；例如對一種酶，在酶反應 •12- 1293089 (10) 前者之氧化還原酶可以使用，做爲與氧不同之基質使用 之發色性基質氧化的反應系、不使用如此之發色性基質’使 氧在過氧化氫等之生成物起化學變化的反應系中，顯示催化 作用之酶。 前者之氧化還原酶的例示有，氧化酶系、黃素單（加） 氧酶系、銅氫化單（加）氧酶系、鐵單（加）氧酶系、核 酮糖二磷酸（加）氧酶系、二（加）氧酶系等等；鄰苯二 酚氧化酶 （ECI，10.3.1)、蟲漆酶 （ECI，10.3.2)、膽紅 素氧化酶 （ECI，3.3.5)、抗壞血酸氧化酶 （ECI，10.3.3) 、3-羥基氨茴酸氧化酶 （ECI，10.3.5)、醇氧化酶（ECI ’ 1.3.13)、膽固醇氧化酶 （ECI，1.3.6)、葡萄糖氧化酶 (ECI，1.3.4)等等較適合之具體例。 後者之氧化還原酶有，例如過氧化酶等等；此時之反 應的具體例有，使用藉由酶或非酶的反應生成之過氧化氫， 經過氧化酶（ECI，11.1.7)之催化作用，使發色性基質顯 示呈色反應；使用氫給予體與發色團做爲發色性基質，偶 合而顯示呈色反應等等；還有，此等呈色反應沒有特別的 限制，例如使用「高阪著、酶之測定方法，1 982年醫學書院 ，49〜55頁」上記載之過氧酶共軛呈色反應。 本發明中，依與使用之發色性基質等的組合，可以單獨 使用適當選自此等氧化還原酶者，亦可使用其複數組合者； 上述氧化還原酶之中，從汎用性、成本的觀點而言，以膽紅 素氧化酶 （ECI，3.3.5)、抗壞血酸氧化酶 （ECI，10.3.3) 較爲適合，由酶穩定性之觀點來說，以來自阿庫雷莫尼姆 •14- 1293089 (11) (Acremonium )屬之抗壞血酸氧化酶最爲理想。 氧感應性溶液中之氧化還原酶的濃度，與單獨使用或複 數組合使用之情況無關，以0.01 Pg/ml〜100mg/ml之範圍較爲 適合；一般氧化還原酶溶解於水，容易使稀薄溶液之酶活 性降低，又與其他原料相比爲高價位者；因而，本發明中 ，該濃度在此範圍時，雖亦與使用之氧化還原酶有關，但可 以較穩定的確保貯藏穩定性，同時成本的負擔不成問題； 該濃度，爲調整使用之氧化還原酶的種類及性質、與使用之 發色性基質等其他原料之濃度的組合、做爲原料使用之氧化 還原酶的活性、或做爲氧指示器時檢測之氧濃度的極限値 、檢測所需時間等之目的，以在上述範圍適當選定爲佳； 從酶本身之貯藏穩定性、成本的觀點而言，該濃度以1〜1000 pg/ml之範圍更爲適合。 本發明中所謂之發色性基質，係指在接受酶之催化作用 的基質之中，經與氧不同之基質，該酶的反應，使光吸收波 長改變而檢測氧，所使用之化合物。 本發明中所謂之發色，係指物質之光吸收波長的改變； 藉由氧化還原酶之催化作用，使發色性基質氧化而引起化學 結構、性質之改變，以致光學的波長吸收領域產生變化； 可利用之光吸收波長的波長領域爲，可測定或檢測變化之波 長時，在任何的領域之波長亦可利用；例如，在UV領域中 若有變化域，使用UV測定裝置等可檢測光吸收波長之變化 時，於可視光域（400〜600nm)不必使用測定波長之機械， 以目視可識別色彩之變化。 -15- 1293089 (12) 本發明中所謂之光吸收波長變化反應，係指發色性基質 在氧之存在下，以氧化還原酶之催化作用介入，使光吸收波 長產生變化之反應。 光吸收波長變化之發色性基質的化學結構、性質之改變 ，具體之例有，氫由羥基或氨基等之抽出、雙鍵之形成、基 質相互間之會合偶合、隨電子傳遞之電荷的離域作用等等各 式各樣的變化；本發明中使用之發色性基質的種種選擇， 可用所期望之顏色檢測氧之有無；如此之發色性基質有， 具羥基、氨基、氰基、碳醯基等活性較高之功能基的化合物 ，氧化還原指示劑，氧化還原試劑之酚衍生物，苯胺衍生物 、甲苯胺衍生物、安息香酸衍生物等等；具體之例示有， 對苯二酚、多酚、對苯二胺、菁色素、氨基苯酚、N，N-二 甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、2，4-二氯酚、N·乙基-N- (2-羥基-3·磺基丙基）·3，5-二甲氧基苯胺 （DAOS) 、N-乙基-N·磺基丙基-3，5-二甲基苯胺 （MAPS) 、N-乙基-Ν· (2-羥 基-3-磺基丙基）-3，5-二甲基苯胺 （MAOS) 、N-乙基-Να· 羥基-3-磺 基丙基 ）·間-甲苯胺 (TOOS) 、乙基-Ν·磺基 丙基-間-茴香胺（ADPS) 、Ν-乙基-Ν-磺基丙基苯胺（ALPS) 、N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺（DAPS) 、N-磺 基丙基-3，5-二甲氧基苯胺 （HDAPS) 、N-乙基-N-磺基丙 基-間-甲苯胺 （TOPS) 、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基）-間-茴香胺（ADOS) 、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基）苯 胺（ALOS) 、N- (2-羥基-3-磺基丙基）-3，5-二甲氧基苯胺 (HDAOS) 、N•磺基丙基-苯胺 （HALPS)、鄰-二茴香胺、 -16- 1293089 (13) 聯鄰-甲苯胺、3，3-二氨基聯苯胺、3，3，5，5·四甲基聯 苯胺、Ν-(羧基甲基氨基碳醯基）-4，4-雙（二甲基氨基） 聯苯胺（DA64) 、10·(羧基甲基氨基碳醯基）-3，7-雙（二 甲基氨基）吩噻嗪 （DA67) 、3，5-二硝基安息香酸、5·氨 基水楊酸、3_羥基氨茴酸、3，5-二氨基安息香酸等、4-氨 基安替比林、鄰-苯二胺、1-氨基-2·萘酚-4·磺酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、2-氨基-8-萘酚-6-磺酸、3-甲基-2-苯并噻 嗤琳酬腺、2 -氣基-酣-4-擴酸、2，6 - 一漠-4 -氣基酣、2 ’ 2、 檸樣酸三乙酯（3-乙基苯并噻唑啉-6·磺酸）二銨鹽、2，2乂 連氮基雙 （3·乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽 （ABTS) 、2 ，6-二氯靛酚、兒茶酚、鞣酸、表兒苯酚、表掊兒茶酚等等 ;還有，欲觀察螢光時，因氧化而發螢光之化合物有，例 如均香草酸、4-羥基苯基醋酸、酪胺、對甲酚、二乙醯熒光 生衍生物等；欲觀察化學發光時，有焦掊酚等；於此所示 之物質僅爲其一例，明顯進藉由酶之催化作用而發螢光的反 應之物質全部包含在內；又，複數之化合物偶合而改變光 吸收波長者亦可；例如4-氨基安替比林、2，6-二溴-4-氨基 酚、ABTS等、與苯酚衍生物、苯胺衍生物、心羥基安息香 酸衍生物等之組合等等。 本發明中，依與使用之氧化還原酶之組合，由此等發色 性基質之中適當選擇者，可以單獨使用，亦可複數組合使用 ;上述發色性基質之中，從汎用性、發色性基質本身之穩 定性、成本的觀點而言’以安息香酸衍生物、2 ’ 2 ^連氮基 雙（3·乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽（ABTS) 、1，2-二羥 -17- 1293089 (16) 又，與上述之特定還原劑不同的一般還原劑有’例如鹼 性物質與還原糖類、亞鐵氰化鉀、連二亞硫酸鹽、硫代硫酸 鹽、亞硫酸鹽、抗壞血酸、異抗壞血酸、草酸、丙二酸、及 此等有機酸之金屬鹽，其他專利文獻2、其他文獻記載之還 原劑等等；本發明中，與使用之氧化還原酶等的組合，由 此等一般之還原劑中適當選擇者，可以單獨使用，亦可複數 組合使用；該還原劑之中，從汎用性、成本的觀點而言， 以抗壞血酸、異抗壞血酸、草酸、丙二酸、及此等有機酸之 金屬鹽較爲適合，由安全衛生性的觀點來說，以抗壞血酸、 異抗壞血酸、及此等之金屬鹽更爲理想；氧感應性溶液中 上述之一般還原劑的濃度，沒有特別的限制；使用上述特 定之還原劑做爲還原劑時，亦可以不使用上述之一般的還原 劑；上述一般之還原劑的濃度，可爲因應欲以所期望之氧 濃度做爲極限値，判斷氧之有無而使用的氧化還原酶、發色 性基質之濃度，所調整的濃度；從溶解性、成本的觀點而 言，該一般之還原劑的濃度以500mM以下較爲適合；還有， 上述一般之還原劑，亦可與上述特定之還原劑適當組合使用 ；如此之組合爲，上述特定之還原劑具有不使酶活性劣化 之作用，一般之還原劑具有成本上的優勢之組合，更爲適合 〇 本發明所用之酶穩定化劑，以選擇適合於所用之酶者爲 佳；具體的例示，爲抗壞血酸氧化酶時，有甘露糖醇等之 糖類、明膠或牛血淸白蛋白等之蛋白類等等；爲膽紅素氧 化酶時，有乙二胺四乙酸（EDTA)、天冬氨酸等等；適當 -20- 1293089 (17) 選擇之酶穩定化劑，可單獨使用，亦可複數組合使用；氧 感應性溶液中該劑之濃度，與單獨使用或複數組合使用之情 況無關，爲有效的發揮酶之穩定化作用，以上爲佳 ;酶穩定化劑之濃度的上限，沒有特別的限制’依酶而言 大量使用亦有酶穩定化作用完全沒有改變之情況’從成本的 觀點來說，該濃度以在50mM以下爲宜。 本發明之工作同仁，特別以0.2重量％水溶液之表面張 力爲0.06N/m以下的非離子性化合物，做爲酶穩定化劑而添 加，發現比其他之酶穩定化劑的反應活性保持能力高，而且 氧檢測能力顯著的提升；藉此，可使氧指示器之製品的氧 檢測能力長時間又有效的穩定化，而且能以更高之精確度檢 測氧；該表面張力之値在〇.〇6N/m以下時，雖然其理由未有 定論，但含有該非離子性化合物之氧感應性溶液的氧感應性 顯著的提高；表面張力，爲更提升氧之檢測能力，以在 0.05N/m以下更是理想；另一方面，表面張力之下限，本發 明之工作同仁精心硏究之結果發現，將表面張力較低之化合 物溶解時，氧感應性溶液之氧感應性更高，因而沒有特別的 限制；還有，本發明中之表面張力，係以非離子性化合物 之0.2重量％水溶液爲測定試料，使用杜繆氏表面張力計（ 吊環法）在23 °C測定之値；又，替代非離子性化合物，例 如使用十二烷基硫酸鈉等之離子性化合物時，酶會鈍化而失 去做爲氧指示器的功能。 本發明中使用之所謂非離子性化合物，係指在水中離子 不離解的化合物；具體之例示有，非離子性之水溶性聚合 -21 - 1293089 (18) 物、非離子性之界面活性劑等等。 非離子性之界面活性劑有，例如甘油衍生物、蔗糖、山 梨糖醇等之脂肪酸酯類、醇附加物等等；本發明在此等非 離子化合物之中，從酶穩定化作用的觀點而言，以非離子性 之水溶性聚合物更爲適合。 本發明中使用之非離子性的水溶性聚合物，具體之例有 ，乙烯醇共聚物或部份皂化聚乙烯醇等之聚乙烯醇類，聚甘 油衍生物，甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖 維素等纖維素衍生物等之中的水溶性、且0.2重量％水溶液 之表面張力在0.06N/m以下者；此等水溶性聚合物之中，從 溶解等處理的難易、成本之觀點而言，以部份皂化聚乙烯醇 、羥基丙基甲基纖維素特別適合；添加此等水溶性聚合物 ，以提升本發明之氧指示器的功能，在使用抗壞血酸氧化 酶爲氧化還原酶、使用ABTS爲發色性基質時，特別顯著。 本發明中使用爲酶穩定化劑之非離子性化合物，自此等 之中適當選擇者，可以單獨或複數組合使用；氧感應性溶 液中該化合物之濃度，與單獨使用或複數組合使用之情況無 關，以0.01重量％以上爲佳；該化合物之濃度在0.01重量 %以上時，可以有效的提高氧感應性溶液之氧感應性；爲更 有效的發揮酶穩定化作用，該化合物之濃度以0.03重量％ 以上更適合；該化合物之濃度的上限，沒有特別的限制， 該化合物大量使用時，氧感應性的提升作用完全沒有改變之 故，從成本的觀點而言，該化合物之濃度以2重量％以下爲 宜c -22- 1293089 (19) 還有，本發明中，上述之還原劑及酶穩定化劑的任一種 ，可單獨使用，亦可兩者一起使用。 本發明中，氧感應性溶液更含有pH緩衝劑，以抑制該 溶液顯著的pH變化、防止酶活性之變動，可以更長期穩定 的進行氧之檢測；pH緩衝劑有，例如醋酸緩衝劑、檸檬酸緩 衝劑、蘋果酸緩衝劑、磷酸緩衝劑等一般做爲pH緩衝劑使 用者；此等沒有任何限制，可適當選擇適合於所使用之氧 化還原酶者；pH緩衝劑之適當選擇者可單獨使用，亦可複數 組合使用；氧感應性溶液中之pH緩衝劑的濃度，可因應氧 感應性溶液中之其他物質的濃度，適宜的設定；具體的說 ，與單獨使用或複數組合使用之情況無關，爲有效的發揮氧 感應性溶液之緩衝作用，以至少在10mM以上爲宜；pH緩衝 劑之濃度的上限，從溶解性、成本的觀點而言，以在1M以 下爲宜。 進而，本發明之氧指示器爲兼備氧吸收劑之性能的目 的、爲調整氧指示器之氧檢測延遲等之檢測時間的目的、 爲使因酶而起之光吸收波長變化反應的氧濃度極限値改變爲 激烈的目的、或爲調整氧指示器之氧檢測感度的目的，氧 感應性溶液中亦可含有與發色性基質在氧之存在下，以氧 化還原酶之催化作用介入，使光吸收波長變化之反應相競 爭的與氧反應之化合物，或吸附氧的化合物，如此之競爭 的化合物，爲在酶反應時，所使用之酶顯示極高的基質選 擇性之化合物，例如抗壞血酸氧化酶中之抗壞血酸、膽紅 素氧化酶中之膽紅素等等；在非酶反應時，有一氧化氮 -23- 1293089 (20) .等等；另一方面，吸附化合物有，血紅蛋白、鈷二價配位 化合物、薩聯配位化合物、氟代烴化合物等等；該化合物 沒有任何限制，可因應目的適當選擇適合者，可以單獨 使用或複數組合使用；氧感應性溶液中之該化合物的濃度 ’可因應氧感應性溶液中之其他物質的濃度，適當設定。 本發明中，爲達上述目的而調整氧指示器之氧檢測性 能’除上述化合物以外，藉由與酶之抑制劑、基質類似物 、包合物等共存，可使光吸收波長變化反應遲緩、或使感度 下降；抑制劑有，例如迭氮基、二乙基二硫氨基甲酸、硫 代硫酸鹽、氟化物、氰化、PCMB、EDTA、二價或三價之金 屬類等；基質類似物，依所使用之酶，適當選定化合物； 包合物有環糊精等等；所舉出者僅爲一例，本發明沒有任 何限制，可以因應所使用之酶、基質的目的，適當組合種類 、濃度而使用。 本發明之所謂利用酶之光吸收波長變化反應，係通常在 溶媒中進行之溶液反應；爲溶解於溶液中的氧與發色性基 質，在酶之存在下起氧化還原反應者；溶媒，可使用不抑 制上述之反應，而且氧溶存之溶媒；使用於食品包裝之氧 指示器時，從處理性、食品衛生上之觀點而言，以水、或 以水爲主體（超過50重量％)之水與乙醇的混合液，較爲 適合。 本發明之氧指示器，在其製造時或氧監控前之保管時 ’氧感應性溶液不與氧接觸之結構，即酶及發色性基質、與 氧隔離之結構，爲必要者；具體的說，氧濃度低於0.05重 -24- 1293089 (21) 量％之低氧狀態，無氧狀態更適合；氧感應性溶液以氧氣阻 •擋性薄膜包裝並保存，使用時將氧氣阻擋性薄膜去除或破 裂，使與大氣中之氧接觸而檢測氧的方法；或者，酶溶 液及發色性基質溶液各別在與氧隔離之狀態，分別以氧氣 阻擋性薄膜包裝並保存，使用時將氧氣阻擋性薄膜去除 或破袋，酶溶液與發色性基質溶液混合，同時與大氣中之 氧接觸而檢測氧的方法；此時，在氧感應性溶液與大氣中 的氧之間，有氧透過性薄膜存在時，藉由選擇具有適度 之氧透過性的薄膜，可以控制氧之檢測時間。 本發明中，氧感應性溶液浸漬於載體或載體中含有氧感 應性溶液而使用，從處理上的觀點而言，比直接使用液體狀 之氧感應性溶液，更爲適合；所使用之載體有，塑料、金 屬、陶瓷、結晶性纖維素、無機粒子、凝膠、紙等等；不 妨害上述之光吸收波長變化反應，直接原封不動或加工成固 形狀態者’任何一種均可使用；此等載體之浸漬或含有的 方法有’例如在此等中塗佈、表面塗佈、浸漬等等；具體 的說’在塑料、金屬、陶瓷所成之多孔性成型品、不織布、 紙 '編織布等上將氧感應性溶液浸漬者；在阿比謝魯（商 品名’旭化成股份有限公司製）等之結晶性纖維素、矽藻 土等之無機粒子中含有而壓錠成型者；明膠、瓊脂等之包 含於凝膠者’以具有適度氧透過性薄膜、容器被覆等之結構 物。 還有’本發明中，使用塑料做爲上述載體及被覆材料時 ’考量焚燒之際的燃燒卡路里低，土中分解等，以使用生物 -25- 1293089 (22) 分解性塑料較爲適合；生物分解性塑料有，例如聚乳酸、 聚乙醇酸、聚己內酯、聚丁酸、聚戊酸、此等之共聚物等之 羥基羧酸所成脂肪族聚酯類，乙二醇與己二酸等之多價醇類 與多價羧酸類之聚縮合物所成脂肪族聚酯類，及此等與對苯 二甲酸等之芳香族多價化合物共聚合的脂肪族芳香族共聚合 聚酯類，澱粉系、纖維素系等之天然高分子類等等；生物 分解性塑膠之規格有，例如日本之生物分解性塑料硏究會所 定的規格、美國之ASTM-D-6400、德國之DIN-V-54900等等 〇 本發明之氧指示器，其形狀可加工爲小袋狀、標籤狀 、膠帶狀、片劑狀、罩蓋狀等之結構物使用；例如，將含 有奶油等容易氧化劣化之油脂的糕點等無氧包裝時，將火腿 等之加工肉食品真空包裝時，將本發明的氧感應性溶液浸 漬之吸水性紙，以氧透過性薄膜被覆而成小袋形狀之結構 物；將此做爲本發明之氧指示器置入包裝物內，可以檢測 包裝物內的氧之有無；又，在氣體取代包裝之飯菜、便當 之容器中，小袋恐會被小孩、老人誤食時，可在容器之 內側膠粘加工成自粘標籤形狀的本發明之氧指示器而使 用，亦可在包裝容器內爲進行氣體取代之目的所形成的 該容器開口部，如堵塞似的膠粘而使用。 還有，本發明之所謂氣體取代包裝，亦稱爲改良大氣 包裝、氣體塡充包裝、控制大氣包裝之包裝技術；一般 ，因應包裝內容物而調整適當容器或袋內之氣體組成； 通常容器或袋內之氣體成份，以不活性氣體之氮氣、氬 -26- 1293089 (23) 氣取代；爲抑制菌類之繁殖，容器或袋內之氣體組成以 無氧爲佳；進而，具抑菌作用之二氧化碳的氣體組成以3 重量％以上更佳；甚至，具殺菌作用之乙醇的氣體組成以 0 · 5重量％以上最爲理想；而且，在飮料之透明頂蓋的內 側’依形狀設置本發明之氧指示器，如碳酸飮料等有二氧 化碳存在之情況似的，不能採用先前之使用亞甲藍的氧 指示器之用途，亦能藉由色彩等的變化確認氧之有無。 本發明之氧指示器，在上述之食品包裝領域以外，於 有必要確認封閉空間內的氧之有無的任何用途均可使用； 例如，精密機械構件包裝、螺絲等金屬構件包裝、電子 基板等電機構件包裝、醫藥品化粧品等包裝之使用；本發 明之包裝物，例如使用袋狀、容器狀等一般包裝材料之 型態時，任何型態者均可使用；所使用之材質，爲保持 包裝物內之真空、或極力抑止包裝物內之氣體組成的變 動，以具有氣體阻擋性者爲佳；包裝物之材質有，塑料 、金屬、木材、紙、玻璃等之單體或此等之層合材料等 等；其氣體阻擋性，係將包裝物內之氣體組成的變動， 對各別所用氣體在標準狀態下 （2 3 °C，5 0 % R Η)，抑止 至1 0°/。以下之變動較爲適合；還有，所謂容器，係指具有 接受容器及蓋所成之型態、使內容物置入的器具而言； 例如容器與蓋之一邊，以鉸鏈部介入而接合之所謂食物 包亦可。 在任何情況，本發明之氧指示器，均可判斷氧之有無 ；於監控之前（尤其在保管時），不發生或極少發生光 -27- 1293089 (24) 吸收波長變化反應；爲與氧隔離，以氣體阻擋性之材質 包裝的氣體取代包裝較爲適合；例如使用金屬、玻璃等 之氧氣體阻擋性高的容器、以氧氣體阻擋性高之薄膜施 行袋包裝的保存等等；又’更適合的是，爲吸收保存環 境內極少量之氧、及透過氧氣體阻擋性保存袋滲入之氧 ，亦可在保存袋內置入脫氧劑等氧吸收劑。 就本發明之氧指示器，以具體例及圖樣說明。 圖1爲，將氧感應性溶液1，置入以氧氣體透過性薄膜 製成之袋2中，保持在低氧狀態下包裝，另在其外側以氧 氣體阻擋性薄膜製成之袋3中包裝的氧指示器之透視圖與 其A-A'面的剖面圖。 圖2爲，將氧感應性溶液1，置入具有氧氣體透過之塑 料容器4中，保持在低氧狀態下包裝，另在其外側以氧氣 體阻擋性薄膜製成之袋3中包裝的氧指示器之透視圖與其 B - B ^面的剖面圖。 圖3爲，將氧感應性溶液1，在保持低氧狀態下直接浸 漬於多孔性成型品、如不織布之片狀物、使用結晶性纖維 素或無機粒子等之片劑成型品、明膠或瓊脂等之凝膠、吸 水性濾紙等之小片5中，置入以氧氣體透過性薄製成之袋2 ，保持在低氧狀態下包裝，另於其外側以氧氣體阻擋性薄 膜製成之袋3中包裝的氧指示器之透視圖與其C-C'面的剖 面圖。 圖4爲，在低氧狀態下之濾紙5中將氧感應性溶液1浸 漬，在雙面具有自粘層之氧氣體阻擋性自粘膠帶7之一邊 -28- 1293089 (25) 的自粘面上，將浸漬之濾紙5膠粘；於其上以氧透過性薄 膜6將濾紙5覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘膠帶7之自粘力 膠粘；氧透過性薄膜6之上以氧氣體阻擋性膠帶7f覆蓋， 藉由氧氣體阻擋性自粘膠帶7的自粘力膠粘之結構的氧指 示器之透視圖與其D-W面的剖面圖。 圖5爲，在單面具有自粘層之氧氣體阻擋性自粘標籤 的自粘面上，於低氧狀態下將濾紙5膠粘，使氧感應性溶 液1浸漬，其上以氧透過性薄膜6將濾紙5覆蓋，藉由氧氣 體阻擋性自粘標籤8之自粘力膠粘；氧透過性薄膜6之上以 氧氣體阻擋性膠帶P覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤8 的自粘力膠粘之結構的氧指示器之透視圖與其E-E'面剖面 圖。 圖6爲，將圖5所示之自粘標籤狀氧指示器，在具有開 口部之蓋上，如堵塞似的膠粘於該開口部而使用之情況的 示意透視圖；此時，以氧氣體阻擋性自粘標籤8堵塞該開 口部之故，該容器內爲以氣體阻擋性材料與外界隔離之密 閉狀態，該容器內之氣體組成的變動成爲被控制者；另一 方面，該指示器爲，使用氧感應性溶液1浸漬之濾紙5，以 氧透過性薄膜覆蓋的結構之故，濾紙5以氧透過性薄膜6介 入與該容器內之大氣接觸’該指示器成爲可以監控該容器 內之氧濃度者。 【實施方式】 [實施例] -29- 1293089 (26) .[實施例1] 使用膽紅素氧化酶（ECI，3.3.5、天野製藥公司製， BO-3)做爲氧化還原酶，ABTS (東京化成工業公司製’高 品質分析試藥）做爲發色性基質’氧濃度4PPm2 50mM_ 酸緩衝液（ρΗ==6·0，和光純藥工業公司製’以試藥特級之 磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀調製）做爲溶媒；將該酶10 、該基質3mg分別溶解於100 μΐ之磷酸緩衝液’即得前調製 酶溶液、及前調製基質溶液；進而’將磷酸緩衝液2800 W 、前調製酶溶液100 μΐ、前調製基質溶液丨00 W混合’將做 爲還原劑之谷胱甘肽（還原型、和光純藥工業公司製’試 藥特級）以可達〇.6mM之量溶解，即調製成酶及基質之混合 溶液；如圖1所示，將此酶及基質之混合溶液（氧感應性溶 液）1置入以氧氣體透過性薄膜製成之袋2中，保持在低氧狀 態下包裝；另在其外側以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋3中 包裝，即得氧指示器；僅將檢測氧之包裝物外側的以氧 氣體阻擋性薄膜製成之袋3撕開，檢測包裝物內之氧，於 無氧狀態爲無色，與空氣接觸時，變爲藍綠色；又，測 定環境之氧濃度1%時爲透明，氧濃度2%時著色成藍綠色 ，顯示敏銳之著色；使用與氧吸收劑一起以氧氣體阻擋 性薄膜製成之袋3包裝的狀態製成該氧指示器後，於5 t 下保管1 0天者，與上述同樣的檢測氧之有無；測定環境 之氧濃度1°/。時爲透明，氧濃度2%時著色成藍綠色；該氧 指示器剛製作完成時，與5 °C保管1 0天後之氧檢測能力 沒有差別，判斷爲保存穩定性優異者。 •30- 1293089 (27) [實施例2] .使用膽紅素氧化酶（ECI，3.3.5，天野製藥公司製， BO-3)做爲氧化還原酶，皂化度80 mol%之聚乙烯醇（和 光純藥工業公司製，試藥特級，〇 · 2重量％水溶液之表面 張力=0.0 5 1 N/m)做爲酶穩定化劑；將此等與事先調製之 200mM磷酸緩衝液（ρΗ = 6·0，和光純藥工業公司製，以試 藥特級之磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀調製）一起溶解於蒸餾 水，即調製成膽紅素氧化酶爲0.35 pg/ml，聚乙烯醇爲 0.01%，磷酸緩衝液爲50nM之酶溶液 （A1);使用ABTS (東 京化成工業公司製，高品質分析試藥）做爲發色性基質， 谷胱甘肽（還原型，和光純藥工業公司製）做爲還原劑， 上述之聚乙烯醇做爲酶穩定化劑；將此等與事先調製之 200mM磷酸緩衝液 （pH = 6.0) —起溶解於蒸餾水，即調製成 ABTS爲0.1mg/ml，谷胱甘肽爲1.2mM，聚乙烯醇爲0·01%， 磷酸緩衝液爲50mM之基質溶液（Β1);將酶溶液（Α1)與 基質溶液（B1)在氧濃度30ppm之低氧環境下，分別以氮氣 泡沖至溶解氧濃度達0.00mg/L (以梅特拉特雷德公司製之溶 解氧計M0128測定）後，將該酶溶液 （A1)與該基質溶液 (B1)分別量取100 μΐ混合，即調製成氧感應性溶液（C1); 接著，將該氧感應性溶液（C1)之一部份，如圖3所示，保 持原來的低氧狀態浸漬於濾紙（瓦特曼公司製，色層光譜 紙3MMCh〇 ，使用以氧氣體透過性薄膜（旭化成公司製， 〇PS薄膜25 μπι厚）製成之袋保持在低氧狀態下包裝，即製 作成氧指示器（D 1 ):更將保持在低氧狀態之所得氧指 •31 - 1293089 (28) 示器 （D 1)，包裝於和氧吸收劑一起以氧氣體 膜（旭化成帕庫斯公司製之飛龍系列規格袋） 接著，測定環境內使用二氧化碳氣體、氮氣氣 與氧氣之混合氣體，以二氧化碳氣體之氣 50V〇1%、調整氧之氣體成份至所定濃度 （C l.OVol%，2Vol%，以蘭先薩公司製之捷庫波1 ，使所得氧指示器 （D 1)在測定環境內僅將外 氣體阻擋性薄膜製成袋撕開，檢測氧之有無； 之氧濃度〇 . 5 %時爲透明，氧濃度1 %時著色成藍 濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使用與 一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀態 指示器 （D1)後，於5 。(：下保管30天者，與上 檢測氧之有無；測定環境之氧濃度〇 . 5 %時爲透 度1 %時著色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値，敏 之存在；該氧指示器 （D1)剛製作完成時，與 3 0天後之氧檢測能力沒有差別，判斷爲長期之 性優異者。 [實施例3] 使用膽紅素氧化酶 （ECI，3.3.5)做爲氧化還原 取代度1.9及羥基丙基甲基取代度0.25之羥基丙 維素（信越化學工業公司製之梅特洛玆60S Η-1ί 量％水溶液之表面張力=0.047 N/m)做爲酶穩定 此等與事先調製之200mM磷緩衝液 （ρΗ = 6·5) 阻擋性薄 製成之袋； 體及氮氣 體成份爲 L5Vol%， 爹特測定） 側的以氧 測定環璘 綠色；氧 氧吸收劑 製成該氧 述同樣的 明，氧灌 :銳顯示氧 5 °C保管 保存穩定 酶，甲基 基甲基纖 ;，0.2 熏 化劑；將 一起溶解 -32- 1293089 (29) 於蒸餾水，即調製成膽紅素氧化酶爲2.0 μ§/ιη1，羥基丙基 甲基纖維素爲0.5%，磷酸緩衝液爲50mM之酶溶液（A2) ‘; 用ABTS做爲發色性基質，N-乙醯基半胱氨酸（和光純藥工 業公司製，試藥特級）做爲還原劑，上述羥基丙基甲基纖 維做爲酶穩定化劑；將此等與事先調製之200mM磷酸緩衝液 (pH = 6.5)—起溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲3.0 mg/ml， 乙醯基半胱氨酸爲4.OmM，羥基丙基甲基纖維素爲0.5%， 磷酸緩衝液爲50mM之基質溶液（B2);將酶溶液（A2)與 基質溶液（B2)在氧濃度30ppm之氧環境下，分別以氮氣泡 沖至溶解氧濃度達〇.〇〇mg/L後，將該酶溶液（A2)與該基質 溶液 （B2)分別量取1〇〇 μΐ混合，即調製成氧感應性溶液 (C2);接著，將該氧感應性溶液（C2)之一部份’如圖3所 示，保持原來的低氧狀態浸漬於濾紙’使用以氧氣體透過性 薄膜製成之袋保持在低氧狀態下包裝’即製作成氧指示器 (D2);更將保持在低氧狀態之所得氧指示器（D2)包裝 於和氧吸收劑一起以氧氣體阻撞性 '薄膜製$之袋；丨妾著 ，與實施例2同樣的’使所得氧指示器（D2)在測定環境 內僅將外側的以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋撕開，檢測 氧之有無；測定環境之氧濃度〇·5%時爲透明’氧濃度1% 時著色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧之存 在；使用和氧吸收齊彳起以氧氣^ ϋ卩且檔f生_ _ _成1之^ @ 包裝狀態製成該氧指示器（D 2 )後，於5 °c下保管3 0天 者，與上述實施例2同樣的檢、測_ &有* # ; 濃度0 · 5 °/。時爲透明’氧濃度1 %時著色成藍綠色；氧濃度 -33- 1293089 (30) 1%爲極限値，敏銳顯示氧之存在；該氧指示器（D2) il 製作完成時，與5 。(：保管3 0天後之氧檢測能力沒有差別 ，判斷爲長期之保存穩定性優異者。 [實施例4] 使用膽紅素氧化酶（ECI，3.3.5)做爲氧化還原酶’ 聚合度10之聚癸酸甘油酯（理硏維他命公司製，頗耶姆〇 781，0.2重量％水溶液之表面張力=0.057 N/m)做爲酶穩定 化劑；將此等與事先調製之400mM磷酸緩衝液（pH = 5.0) — 起溶解於蒸餾水，即調製成贍紅素氧化酶爲20 pg/ml ’聚癸 酸甘油酯爲10%，磷酸緩衝液爲100mM之酶溶液（A3);使 用ABTS做爲發色性基質，草酸錳（和光純藥工業公司製， 二水合物）做爲還原劑，上述聚癸酸甘油酯做爲酶穩定化 劑；將此等與事先調製之400mM磷酸緩衝液（pH = 5.0) —起 溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲1.0 mg/ml，草酸錳爲lOmM ，聚癸酸甘油酯爲10%，磷酸緩衝液爲100mM之基質溶液 (B3);將酶溶液（A3)與基質溶液（B3)在氧濃度30ppm之 低氧環境下，分別以氮氣泡沖至溶解氧濃度達0.00mg/L後， 將該酶溶液（A3)與該基質溶液（B3)分別量取1〇〇 μ丨混合 ，即調製成氧感應性溶液（C3);接著，將該氧感應性溶液 (C3)之一部份，如圖4所示，在保持低氧狀態下浸漬於濾紙 ，於雙面具有自粘層之氧氣體阻擋性自粘膠帶（薩斗烏細 魯公司製PET厚度75 μηι)之一邊的自粘面上，將浸漬之濾 紙膠粘；於其上以氧透過性薄膜將該濾紙覆蓋，藉由氧氣 -34- 1293089 (31) 體阻擋性自粘膠帶之自粘力膠粘；該氧透過性薄膜之上以 氧氣體阻擋性膠帶（旭化成帕庫斯公司製，阿魯密拉密薄 膜）覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘膠帶的自粘力膠粘，即 製作成氧指示器（D3);更將保持在低氧狀態之所得氧指 示器（D3)包裝於和氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製 成之袋；接著，與實施例2同樣的，使所得氧指示器（D3) 在測定環境內，將外側的以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋撕開 ，去除氧氣體阻擋性膠帶，檢測氧之有無；測定環境之氧 濃度0.5%時爲透明，氧濃度1%時著色成藍綠色；氧濃度1% 爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使用和氧吸收劑一起以氧 氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀態製成該氧指示器 (D3)後，於5 °C下保管30天者，與上述實施例2同樣的 檢測氧之有無；測定環境之氧濃度0 · 5 %時爲透明，氧濃 度1 %時著色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧 之存在；該氧指示器 （D3)剛製作完成時，與5 °C保管 3 〇天後之氧檢測能力沒有差別，判斷爲長期之保存穩定 性優異者。 [實施例5] 使用抗壞血酸氧化酶 （ECI，10.3.3，旭化成公司製 A SOM)做爲氧化還原酶，甲基取代度1.8之甲基纖維素 (信越化學工業公司製，梅特洛玆S Μ -1 5，0 · 2 重量％水溶 液之表面張力=〇·〇54 N/m)做爲酶穩定化劑；將此等與 事先調製之400mM檸檬酸緩衝液 （ρΗ = 4·0，和光純藥工 -35- 1293089 (32) 業公司製，以試藥特級之檸檬酸與檸檬酸鈉調製）一起 溶解於蒸餾水，即調製成抗壞血酸氧化酶爲10 Kg/ml ’甲 基纖維素爲2.0%，檸檬酸緩衝液爲50mM之酶溶液 （A4); 使用ABTS做爲發色性基質，半胱氨酸鹽酸鹽（和光純藥工 業公司製，一級試藥）做爲還原劑，上述甲基纖維素做爲 酶穩定化劑；將此等與事先調製之400mM檸檬酸緩衝液 (pH = 4.0) —起溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲8.0 mg/ml， 半胱氨酸鹽酸鹽爲10mM，甲基纖維素爲2.0%，檸檬酸緩衝 液爲50Mm之基質溶液（B4);將酶溶液（A4)與基質溶液 (B4)在氧濃度30ppm之低氧環境下，分別以氮氣泡沖至溶 解氧濃度達0.00mg/L後，將該酶溶液 （A4)與該基質溶液 (B4)分別量取100 μΐ混合，即調製成氧感應性溶液（C4); 接著，將該氧感應性溶液（C4)之一部份，如圖4所示，保 持原來的低氧狀態浸漬於濾紙，於雙面具有自粘層之氧氣體 阻擋性自粘膠帶之一邊的自粘面上，將浸漬之濾紙膠粘； 於其上以氧透過性薄膜將該濾紙覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自 粘膠帶之自粘力膠粘；該氧透過性薄膜之上以氧氣體阻擋 性膠帶覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘膠帶的自粘力膠粘，即 製作成氧指示器（D4);更將保持在低氧狀態之所得氧指 示器 （D4)包裝於和氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜 製成之袋；接著，與實施例2同樣的，使所得氧指示器 (D4)在測定環境內，將外側的以氧氣體阻擋性薄膜製成 之袋撕開，去除氧氣體阻擋性膠帶，檢測氧之有無；測 定環境之氧濃度0.5 %時爲透明，氧濃度1 %時著色成藍綠 -36- 1293089 (33) 色；氧濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使用和氧 .吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀態製 成該氧指示器 （D4)後，於5 °C下保管30天者，與上述 實施例2同樣的檢測氧之有無；測定環境之氧濃度〇 · 5 %時 爲透明，氧濃度1 %時著色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値 ，敏銳顯示氧之存在；該氧指示器 （D4)剛製作完成後 ，與5 °C保管3 0天後之氧檢測能力沒有差別，判斷爲長 期之保存穩定性優異者。 [實施例6] 使用抗壞血酸氧化酶（ECI，10.3.3)做爲氧化還原酶 ，溶解於蒸餾水，即調製成5 mg/ml之抗壞血酸氧化酶母液； 使用皂化度80mol%之聚乙烯醇（和光純藥工業公司製試藥 特級，0.2重量％水溶液之表面張力=0.051N/m)做爲酶穩定 化劑，溶解於蒸餾水，即調製成1重量％之聚乙烯醇母液； 將抗壞血酸氧化酶母液及聚乙烯醇母液，與事先調製之 400mM醋酸緩衝液（pH = 4.5，和光純藥工業公司製，以試藥 特級之醋酸與醋酸鈉調製）一起溶解於蒸餾水，即調製成 抗壞血酸氧化酶爲1〇〇 Kg/ml，聚乙烯醇爲0.05%，醋酸緩衝 液爲100mM之酶溶液 （A5) l〇〇ml;使用ABTS做爲發色性基 質，溶解於蒸餾水，即調製成25 mg/ml之ABTS母液；使用L-抗壞血酸（和光純藥工業公司製試藥特級）做爲還原劑， 溶解於蒸餾水，即調製成l〇〇mM之L-抗壞血酸母液；與上述 同樣的，使用上述聚乙烯醇做爲酶穩定化劑，溶解於蒸餾水 -37· 1293089 (34) ，即調製成1重量％之聚乙烯醇母液；將ABTS母液、L-抗 壞血酸母液、及聚乙烯醇母液，與事先調製之400mM醋酸緩 衝液 （pH = 4.5) —起溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲8.0 mg/ml，L-抗壞血酸爲25mM，聚乙烯醇爲0.05%，醋酸緩衝 液爲100mM之基質溶液 （B5) 100ml;將酶溶液（A5)與基 質溶液（B5)分別置入附有單向閥之容器內，在不與大氣 接觸之情況下以氮氣泡沖至溶解氧濃度達〇.〇〇 mg/L後，分 別以微量泵等量逐一輸送至混合器，連續的將該酶溶液 (A5)與該基質溶液 （B5)混合，即調製成氧感應性溶液 (C5);將該氧感應性溶液（C5)之一部份，在氧濃度30ppm 之低氧環境下，如圖5所示，於單面具有自粘層之氧氣體阻 擋性自粘標籤（薩斗烏細魯公司製PET厚度75 μπι)的自粘 面上，將浸漬之濾紙膠粘；其上以氧透過性薄膜（旭化成 公司製OPS薄膜25 μιη厚）將該濾紙覆蓋，藉由氧氣體阻擋 性自粘標籤之自粘力膠粘；氧透過性薄膜之上以氧氣體阻 擋性膠帶覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤的自粘力膠粘， 即製作成氧指示器（D5);更將保持在低氧狀態之所得氧 指示器（D5)包裝於和氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜 製成之袋中；接著，與實施例2同樣的，使所得氧指示器 (D5)在測定環境內，將外側的以氧氣體阻擋性薄膜製成之 袋撕開，去除氧氣體阻擋性膠帶，檢測氧之有無；測定環 境之氧濃度0.5%時爲透明，氧濃度1%時著色成藍綠色；氧 濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使用和氧吸收劑一 起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀態製成該氧指示 -38- 1293089 (35) 器.（D5)後，於5 °C下保管30天者，與上述實施例2同樣 的檢測氧之有無；測定環境之氧濃度〇 · 5 %時爲透明，氧 濃度1 %時著色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値，敏銳顯示 氧之存在；該氧指示器（D5)剛製作完成時，與5 °C保 管3 0天後之氧檢測能力沒有差別’判斷爲長期之保存穩 定性優異者。 [實施例7] 使用抗壞血酸氧化酶 （ECI，10.3.3)做爲氧化還原 酶，溶解於蒸餾水，即調製成5mg/ml之抗壞血酸氧化酶 母液；使用甲基取代度1.9與羥基丙基甲基取代度0.25之 羥基丙基甲基纖維素（信越化學工業公司製梅特洛玆 60311-15，0.2 重量％水溶液之表面張力=0.047>1/111)做爲 酶穩定化劑，溶解於蒸餾水，即調製成2重量％之羥基丙 基甲基纖維素母液；將抗壞血酸氧化酶母液及羥基丙基 甲基纖維素母液，與事先調製之1M醋酸緩衝液 （pH = 3.5) 一起溶解於蒸餾水，即調製成抗壞血酸氧化酶爲200 gg/ml ，羥基丙基甲基纖維素爲0.1%，醋酸緩衝液爲200mM之酶溶 液 （A6) 100ml;使用ABTS做爲發色性基質，溶解於蒸餾水 ，即調製成25mg/ml之ABTS母液；使用L-抗壞血酸鈉做爲第 一還原劑，溶解於蒸餾水，即調製成500mM之L-抗壞血酸鈉 母液；使用N-乙醯基半胱氨酸做爲第二還原劑，溶解於蒸 餾水，即調製成200mM之N-乙醯基半胱氨酸母液；與上述同 樣的，以上述羥基丙基甲基纖維素做爲酶穩定化劑，溶解於 -39- 1293089 (36) 蒸餾水，即調製成2重量％之羥基丙基甲基纖維素母液；將 ABTS母液、L-抗壞血酸鈉母液、N-乙醯基半胱氨酸母液、 及羥基丙基甲基纖維素母液’與事先調製之1M醋酸緩衝液 (pH = 3.5) —起溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲4.0 mg/ml， L_抗壞血酸鈉爲200mM，N-乙·基半腕氨酸爲80mM ’羥基 丙基甲基纖維素爲0.1%，醋酸緩衝液爲200mM之基質溶液 (B6) 100ml;將酶溶液（A6)與基質溶液（B6)分別置入附 有單向閥之容器內，在不與大氣接觸之情況下以氮氣泡沖至 溶解氧濃度達〇.〇〇mg/L後，分別以微量泵等量逐一輸送至混 合器，連續的將該酶溶液（A6)與基質溶液（B6)混合’ 即調製成氧感應性溶液（C6);將該氧感應性溶液（C6)之 一部份，在氧濃度30ppm之低氧環境下，如圖5所示，於單 面具有自粘層之氧氣體阻擋性自粘標籤的自粘面上，將浸漬 之濾紙膠粘；其上以氧透過性薄膜將該濾紙覆蓋，藉由氧 氣體阻擋性自粘標籤之自粘力膠粘；氧透過性薄膜之上以 氧氣體阻擋性膠帶覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤之自粘 力膠粘，即製作成氧指示器 （D6);將大氣中取出之該氧 指示器（D6)包裝於和氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜 製成之袋中而成氮氣取代包裝；接著，與實施例2同樣的， 使所得氧指示器（D6)在測定環境內，將外側的以氧氣體 阻擋性薄膜製成之袋撕開，去除氧氣體阻擋性膠帶，檢測氧 之有無；測定環境之氧濃度0.5%時爲透明，氧濃度1%時著 色成藍綠色；氧濃度1 %爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使 用和氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀 -40- 1293089 (38) 製成氧感應性溶液（C7);將該氧感應性溶液（C7)之一部 份，在氧濃度30ppm之低氧環境下，如圖5所示，於單面具 有自粘層之氧氣體阻擋性自粘標籤（薩斗烏細魯公司製PET 厚度75 μιη)的自粘面上，將浸漬之濾紙膠粘；其上以氧透 過性薄膜（旭化成公司製OPS薄膜25 μιη厚）將該濾紙覆蓋 ，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤之自粘力膠粘；氧透過性薄 膜之上以氧氣體擋性膠帶覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤 的自粘力膠粘，即製作成氧指示器 （D7);更將保持在低 氧狀態之所得氧指示器 （D7)包裝於和氧吸收劑一起以氧 氣體阻擋性薄膜製成之袋中；接著，與實施例2同樣的， 使所得氧指示器（D7)在測定環境內，將外側的以氧氣體 阻擋性薄膜製成之袋撕開，去除氧阻擋性膠帶，檢測氧之有 無；測定環境之氧濃度0.5%與1%時爲透明，氧濃度2%時著 色成藍綠色；氧濃度2%爲極限値，顯示氧之存在；使用和 氧吸收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的狀態製 成該氧指示器 （D7)，於5 °C下保管1〇天者，與上述實 施例2同樣的檢測氧之有無；測定環境之氧濃度0.5%與1 % 時爲透明，氧濃度2 %時，亦著色成藍綠色但僅淺淡者； 該氧指示器（D 7)剛製作完成時，與5 °C保管1〇天後之 氧檢測能力有顯著的差別。 [實施例9] 使用抗壞血酸氧化酶（ECI，10.3.3)做爲氧化還原酶 ，溶解於蒸餾水；使用皂化度80mol%之抗壞血酸氧化酶母 -42 - 1293089 (39) 液；使用皂化度80mol%之聚乙烯醇（和光純藥工業公司製 .試藥特級，0.2重量％水溶液之表面張力=0.051N/m)做爲酶 穩定化劑，溶解於蒸餾水，即調製成1重量％之聚乙烯醇母 液；使用此抗壞血酸氧化酶母液及聚乙烯醇母液，與事先 調製之400 mM醋酸緩衝液 （pH = 4.5，和光純藥工業公司製 ，以試藥特級之醋酸與醋酸鈉調製）一起溶解於蒸餾水， 即調製成抗壞血酸氧化酶爲100 Mg/ml，聚乙烯醇爲0.05%， 酸緩衝液爲100mM之酶溶液 （A8) 100ml;使用ABTS做爲發 色性基質，溶解於蒸餾水，即調製成25mg/ml之ABTS母液； 與上述同樣的，以上述聚乙烯醇做爲酶穩定化劑，溶解於蒸 餾水，即調製成1重量％之聚乙烯醇母液；不添加還原劑； 將ABTS母液及聚乙烯醇母液，與事先調製之400mM醋酸緩 衝液 （pH = 4.5) —起溶解於蒸餾水，即調製成ABTS爲 8.0mg/ml，聚乙烯醇爲0.05%，醋酸緩衝液爲100mM之基質 溶液（B8) 100ml;將酶溶液（A8)與基質溶液（B8)分別 置入附有單向閥之容器內，在不與大氣接觸之情況下以氮氣 泡沖至溶解氧濃度達〇.〇〇mg/L後，分別以微量泵等量逐一輸 送至混合器，連續的將該酶溶液 （A8)與基質溶液 （B8) 混合，即調整成氧感應性溶液（C8);將該氧感應性溶液 (C8)之一部份，在氧濃度30ppm之低氧環境下，如圖5所示 ，於單面具有自粘層之氧氣體阻擋性自粘標鐵（薩斗烏細 魯公司製PET厚75 μιπ)的自粘面上’將浸漬之濾紙膠粘； 其上以氧透過性薄膜（旭化成公司製〇PS薄膜25 μιτι厚）將 該濾紙覆蓋，藉由氧氣體阻擋性自粘標籤之自粘力膠粘； -43- 1293089 (40) 氧透過性薄膜之上以氧氣體阻擋性膠帶覆蓋， 檔性自粘標籤的自粘力膠粘，即製作成氧指 更將保持在低氧狀態之所得氧指示器（D8)包 收劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋中； 測定環境內之氧氣體成份調整爲〇 . 〇 V 0 1 %、 0 · 5 V ο 1 % (以蘭先薩公司製之捷庫波音特測定 他都和實施例2同樣的進行；使所得氧指示器 定環境內，將外側的以氧氣體阻擋性薄膜製 ’去除氧熱體阻擋性膠帶，檢測氧之有無； 氧濃度〇 . 〇 %時爲透明，氧濃度0 · 2 %時著色成 濃度〇 . 2 %爲極限値，敏銳顯示氧之存在；使 劑一起以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋包裝的 氧指示器 （D8)後，於5 °C保管30天者，與 檢測氧之有無；測定環境之氧濃度0.0%時爲 度0.2%時著色成藍綠色；氧濃度0.2%爲極限 示氧之存在；該氧指示器 （D8)剛製作完成 保管3 0天後之氧檢測能力沒有差別，判斷爲 穩定性優異者。 [產業上利用性] 本發明之氧指示器，極適合使用於避免氧 體取代包裝之領域。 【圖式簡單說明】 奢由氧氣體阻 示器 （D8); i裝於和氧吸 接著，除將 0.02V〇1% ^ :)以外，其 (D8)在測 成之袋撕開 測定環境之 藍綠色；氧 用和氧吸收 狀態製成該 上述同樣的 透明，氧濃 値，敏銳顯 時，與5 長期之保存 之存在的氣 -44- 1293089 (41) .圖1，本發明氧指示器之製造例的示意透視圖，及其 A - A '面之剖面圖。 圖2，本發明氧指示器之製造例的示意透視圖，及其 B - B ^面之剖面圖。 圖3，本發明氧指示器之製造例的示意透視圖，及其 C-C'面之剖面圖。 圖4，本發明氧指示器之製造例的示意透視圖，及其 D-Df面之剖面圖。 圖5，本發明氧指示器之製造例的示意透視圖，及其 E-E'面之剖面圖。 圖6，圖5例示之本發明氧指示器的使用例示意透視圖 主要元件對照表 1 氧感應性溶液 2 以氧氣體透過性薄膜製成之袋 3 以氧氣體阻擋性薄膜製成之袋 4 塑料容器 5 吸水性濾紙等之小片 6 氧透過性薄膜 7 氧氣體阻擋性自粘膠帶 V 氧氣體阻擋性膠帶 8 氧氣體阻擋性自粘標籤 -45-

Claims (1)

1293089 ⑴*辟巧ϋ(更>正本 拾、申請專利範圍 L------ 第93 107532號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國96年8月23日修正 1·一種氧指示器，其爲基質在氧存在下，經由酶之催化 作用’使用到光吸收波長變化反應的氧指示器，其特徵爲含 有氧感應性溶液，該氧感應性溶液含有：0.01〜1〇()()mg/ml 發色性基質；與 選自鄰苯一酌氧化酶、蟲漆酶、膽紅素氧化酶、抗壞血酸氧 化酶、3-羥基氨茴酸氧化酶、醇氧化酶、膽固醇氧化酶、葡 萄糖氧化酶所成群之至少一種以上之0.01 // g/ml〜 1()〇mg/ml 之氧化還原酶；與 使被氧化之發色性基質還原的還原劑，其被氧化時， 產生二硫基之含毓基化合物之150mM以下的還原劑。 2.—種氧指示器，其爲基質在氧之存在下，經由酶之催 化作用，使用到光吸收波長變化反應的氧指示器，其特徵爲 含有氧感應性溶液，該氧感應性溶液含有：0.01〜lOOOmg/ml 發色性基質；與 選自鄰苯二酚氧化酶、蟲漆酶、膽紅素氧化酶、抗壞血酸氧 化酶、3-羥基氨茴酸氧化酶、醇氧化酶、膽固醇氧化酶、葡 萄糖氧化酶所成群之至少一種以上之〇.〇leg/ml〜100mg/ml 之氧化還原酶；與 0.2重量％水溶液之表面張力爲〇.〇6N/m以下的非離子性化 (2) 1293089 合物之0.01〜2重量％之酶穩定化劑。 3·—種氧指示器，其爲基質在氧之存在下，經由酶之催 化作用，使用到光吸收波長變化反應的氧指示器，其特徵爲 含有氧感應性溶液，該氧感應性溶液含有0.01〜lOOOmg/ml 發色性基質；與 選自鄰苯二酚氧化酶、蟲漆酶、膽紅素氧化酶、抗壞血酸氧 化酶、3-羥基氨茴酸氧化酶、醇氧化酶、膽固醇氧化酶、葡 萄糖氧化酶所成群之至少一種以上之〇.〇1 V g/ml〜丨00 mg/ml之氧化還原酶；與 0·2重量％水溶液之表面張力爲〇.〇6N/m以下的非離子性化 合物之0.01 wt%〜2wt%酶穩定化劑；與使被氧化之發色性基 質還原的還原劑，其被氧化時，產生二硫基之含酼基化合物 之150mM以下的還原劑者。 4. 如申請專利範圍第2或3項之氧指示器，其中該非離 子性化合物爲水溶性聚合物。 5. 如申請專利範圍第4項之氧指示器，其中該水溶性聚 合物爲水溶性聚乙烯醇類、水溶性聚甘油類或水溶性纖維素 衍生物者。 6·如申請專利範圍第1~3項中任一項之氧指示器，其中 氧化還原酶爲抗壞血酸氧化酶或膽紅素氧化酶者。 7. 如申請專利範圍第1〜3項中任一項之氧指示器，其中 該氧感應性溶液係含緩衝劑者。 8. 如申請專利範圍第1〜3項中任一項之氧指示器，其中 該氧感應性溶液，進而含有與該光吸收波長變化反應競爭而 1293089 ， (3) 和氧反應之化合物，或吸附氧之化合物者。 9. 一種包裝物，係包含容器或袋所成之包裝物，其特徵 爲藉由該容器內或袋內含有如申請專利範圍第1〜8項中任一 項之氧指示器，或藉由使如申請專利範圍第1〜8項中任一項 ‘ 之氧指示器，以堵塞般安裝於該容器或袋之開孔部而能檢測 該容器內或袋內之氧濃度者。 1〇·如申請專利範圍第9項之包裝物，其係真空包裝者 1 1 ·如申請專利範圍第9項之包裝物，其係該容器或袋 內塡充不含氧氣體的氣體取代包裝者。 -3 -