TWI287577B - Androgen receptor complex-associated protein - Google Patents

Description

1287577 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎之蛋白質及編碼此等 【先前技術】 表腫瘤細胞中相對於健康細胞會過度 診斷之“標的:在‘邊 類固醇受體(例如男性荷爾蒙受體)數量顯5加肝腫瘤細胞中 荷爾蒙通常係經由結合至其特定之細胞核受體以形 步扮演轉賴子之複合物的方絲現其生理學效席。該 序列（類轉絲咖__絲目針^叙核狀 【發明内容】 本發明主要是發現在肝癌病患中，相對於週邊正常組織， 一人類蛋白質係過度表現於肝癌細胞。而且，發現此一人類蛋 白質會與躲荷_蒙受體結合，進—步增醜雜荷爾蒙受體 轉錄激活男性荷爾蒙-反應性基因的能力。因此，本發明所發 ，的人體蛋白質被定名為「男性荷爾蒙受體複合物—關聯蛋白 質」（androgen receptor complex associated protein)或 ARCAP。本發明已將此人類蛋白質ARCAP cDNA全長基因，包括 標有底線之起始密碼及終止密碼，定序如下：

CCGGCTCAGGCAGAGCCATGTCTCGGGGTGGCTCCTACC

CACACCTGTTGTGGGACGTGAGGAAAAGGTCCCTCGGG 1287577

CTGGAGGACCCGTCCCGGCTGCGGAGTCGCTACCTGGG

AAGAAGAGAATTTATCCAAAGATTAAAACTTGAAGCAAC

CCTTAATGTGCATGATGGTTGTGTTAATACAATCTGTTGG

AATGACACTGGAGAATATATTTTATCTGGCTCAGATGACA

CCAAATTAGTAATTAGTAATCCTTACAGCAGAAAGGTTTT

GACAACAATTCGTTCAGGGCACCGAGCAAACATATTTAG

TGCAAAGTTCTTACCTTGTACAAATGATAAACAGATTGTA

TCCTGCTCTGGAGATGGAGTAATATTTTATACCAACGTTG

AGCAAGATGCAGAAACCAACAGACAATGCCAATTTACGT

GTCATTATGGAACTACTTATGAGATTATGACTGTACCCAAT

GACCCTTACACTTTTCTCTCTTGTGGTGAAGATGGAACTG

TTAGGTGGTTTGATACACGCATCAAAACTAGCTGCACAA

AAGAAGATTGTAAAGATGATATTTTAATTAACTGTCGACG

TGCTGCCACGTCTGTTGCTATTTGCCCACCAATACCATATT

ACCTTGCTGTTGGTTGTTCTGACAGCTCAGTACGAATATA

TGATCGGCGAATGCTGGGCACAAGAGCTACAGGGAATTA

TGCAGGTCGAGGGACTACTGGAATGGTTGCCCGTTTTAT

TCCTTCCCATCTTAATAATAAGTCCTGCAGAGTGACATCT

CTGTGTTACAGTGAAGATGGTCAAGAGATTCTCGTTAGTT

ACTCTTCAGATTACATATATCTTTTTGACCCGAAAGATGAT

ACAGCACGAGAACTTAAAACTCCTTCTGCGGAAGAGAG

AAGAGAAGAGTTGCGACAACCACCAGTTAAGCGTTTGA

GACTTCGTGGTGATTGGTCAGATACTGGACCCAGAGCAA

GGCCGGAGAGTGAACGAGAACGAGATGGAGAGCAGAG

TCCCAATGTGTCATTGATGCAGAGAATGTCTGATATGTTA

TCAAGATGGTTTGAAGAAGCAAGTGAGGTTGCACAAAG

CAATAGAGGACGAGGAAGATCTCGACCCAGAGGTGGAA

CAAGTCAATCAGATATTTCAACTCTTCCTACGGTCCCATC

AAGTCCTGATTTGGAAGTGAGTGAAACTGCAATGGAAGT 6 1287577

AGATACTCCAGCTGAACAATTTCTTCAGCCTTCTACATCC

TCTACAATGTCAGCTCAGGCTCATTCGACATCATCTCCCA

CAGAAAGCCCTCATTCTACTCCTTTGCTATCTTCTCCAGA

CAGTGAACAAAGGCAGTCTGTTGAGGCATCTGGACACC

ACACACATCATCAGTCTGATAACAATAATGAAAAGCTGA

GCCCCAAACCAGGGACAGGTGAACCAGTTTTAAGTTTGC

ACTACAGCACAGAAGGAACAACTACAAGCACAATAAAA

CTGAACTTTACAGATGAATGGAGCAGTATAGCATCAAGTT

CTAGAGGAATTGGGAGCCATTGCAAATCTGAGGGTCAGG

AGGAATCTTTCGTCCCACAGAGCTCAGTGCAACCACCAG

AAGGAGACAGTGAAACAAAAGCTCCTGAAGAATCATCA

GAGGATGTGACAAAATATCAGGAAGGAGTATCTGCAGAA

AACCCAGTTGAGAACCATATCAATATAACACAATCAGATA

AGTTCACAGCCAAGCCATTGGATTCCAACTCAGGAGAAA

GAAATGACCTCAATCTTGATCGCTCTTGTGGGGTTCCAG

AAGAATCTGCTTCATCTGAAAAAGCCAAGGAACCAGAA

ACTTCAGATCAGACTAGCACTGAGAGTGCTACCAATGAA

AATAACACCAATCCTGAGCCTCAGTTCCAAACAGAAGCC

ACTGGGCCTTCAGCTCATGAAGAAACATCCACCAGGGAC

TCTGCTCTTCAGGACACAGATGACAGTGATGATGACCCA

GTCCTGATCCCAGGTGCAAGGTATCGAGCAGGACCTGGT

GATAGACGCTCTGCTGTTGCCCGTATTCAGGAGTTCTTCA

GACGGAGAAAAGAAAGGAAAGAAATGGAAGAATTGGAT

ACTTTGAACATTAGAAGGCCGCTAGTAAAAATGGTTTATA

AAGGCCATCGCAACTCCAGGACAATGATAAAAGAAGCC

AATTTCTGGGGTGCTAACTTTGTAATGAGTGGTTCTGACT

GTGGCCACATTTTCATCTGGGATCGGCACACTGCTGAGC

ATTTGATGCTTCTGGAAGCTGATAATCATGTGGTAAACTG

CCTGCAGCCACATCCGTTTGACCCAATTTTAGCCTCATCT 7 1287577

GGCATAGATTATGACATAAAGATCTGGTCACCATTAGAAG

AGTCAAGGATTTTTAACCGAAAACTTGCTGATGAAGTTAT

AACTCGAAACGAACTCATGCTGGAAGAAACTAGAAACA

CCATTACAGTTCCAGCCTCTTTCATGTTGAGGATGTTGGC

TTCACTTAATCATATCCGAGCTGACCGGTTGGAGGGTGA

CAGATCAGAAGGCTCTGGTCAAGAGAATGAAAATGAGG

ATGAGGAATAATAAACTCTTTTTGGCAAGCACTTAAATG

TTCTGAAATTTGTATAAGACATTTATTATATTTTTTTCTTTA

CAGAGCTTTAGTGCAATTTTAAGGTTATGGTTTTTGGAGT

TTTTCCCTTTTTTTGGGATAACCTAACATTGGTTTGGAAT

GATTGTGTGCATGAATTTGGGAGATTGTATAAAACAAAA

CTAGCAGAATGTTTTTAAAACTTTTTGCCGTGTATGAGGA

GTGCTAGAAAATGCAAAGTGCAATATTTTCCCTAACCTTC

AAATGTGGGAGCTTGGATCAATGTTGAAGAATAATTTTCA

TCATAGTGAAAATGTTGGTTCAAATAAATTTCTACACTTG

CCATTTGCATGTTTGTTGCTTTCTAATTAAAGAAACTGGT TGTTTTAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC (SEQ ID N0:3) 編碼人類ARCAP蛋白質之核苷酸序列（亦即由起始核酸密碼 ATG至序列辨識編號:3之終止核酸密碼前一核酸密碼）經編列 為序列辨識編號：1;而經上述cDNA編碼之ARCAP胺基酸序列 顯不如下：

Met ser arg gly gly ser tyr pro his leu leu trp asp val arg lys arg ser leu gly leu glu asp pro ser arg leu arg ser arg tyr leu gly arg arg glu phe ile gin arg leu lys leu glu ala thr leu asn val his asp gly cys val asn thr ile cys trp asn asp thr gly glu tyr ile leu ser gly ser asp asp thr lys leu val ile ser asn pro tyr ser arg lys val leu thr thr ile arg ser gly his arg ala asn ile phe ser ala lys phe leu pro cys thr asn asp lys gin ile val ser cys ser gly asp gly val ile phe tyr thr asn val glu gin asp ala glu thr asn arg gin cys gin phe thr cys his tyr gly 8 1287577 thr thr tyr glu ile met thr val pro asn asp pro tyr thr phe leu ser cys gly glu asp gly thr val arg trp phe asp thr arg ile lys thr ser cys thr lys glu asp cys lys asp asp ile leu ile asn cys arg arg ala ala thr ser val ala ile cys pro pro ile pro tyr tyr leu ala val gly cys ser asp ser ser val arg ile tyr asp arg arg met leu gly thr arg ala thr gly asn tyr ala gly arg gly thr thr gly met val ala arg phe ile pro ser his leu asn asn lys ser cys arg val thr ser leu cys tyr ser glu asp gly gin glu ile leu val ser tyr ser ser asp tyr ile tyr leu phe asp pro lys asp asp thr ala arg glu leu lys thr pro ser ala glu glu arg arg glu glu leu arg gin pro pro val lys arg leu arg leu arg gly asp trp ser asp thr gly pro arg ala arg pro glu ser glu arg glu arg asp gly glu gin ser pro asn val ser leu met gin arg met ser asp met leu ser arg trp phe glu glu ala ser glu val ala gin ser asn arg gly arg gly arg ser arg pro arg gly gly thr ser gin ser asp ile ser thr leu pro thr val pro ser ser pro asp leu glu val ser glu thr ala met glu val asp thr pro ala glu gin phe leu gin pro ser thr ser ser thr met ser ala gin ala his ser thr ser ser pro thr glu ser pro his ser thr pro leu leu ser ser pro asp ser glu gin arg gin ser val glu ala ser gly his his thr his his gin ser asp asn asn asn glu lys leu ser pro lys pro gly thr gly glu pro val leu ser leu his tyr ser thr glu gly thr thr thr ser thr ile lys leu asn phe thr asp glu trp ser ser ile ala ser ser ser arg gly ile gly ser his cys lys ser glu gly gin glu glu ser phe val pro gin ser ser val gin pro pro glu gly asp ser glu thr lys ala pro glu glu ser ser glu asp val thr lys tyr gin glu gly val ser ala glu asn pro val glu asn his ile asn ile thr gin ser asp lys phe thr ala lys pro leu asp ser asn ser gly glu arg asn asp leu asn leu asp arg ser cys gly val pro glu glu ser ala ser ser glu lys ala lys glu pro glu thr ser asp gin thr ser thr glu ser ala thr asn glu asn asn thr asn pro glu pro gin phe gin thr glu ala thr gly pro ser ala his glu glu thr ser thr arg asp ser ala leu gin asp thr asp asp ser 1287577 asp asp asp pro val leu ile pro gly ala arg tyr arg ala gly pro gly asp arg arg ser ala val ala arg ile gin glu phe phe arg arg arg lys glu arg lys glu met glu glu leu asp thr leu asn ile arg arg pro leu val lys met val tyr lys gly his arg asn ser arg thr met ile lys glu ala asn phe trp gly ala asn phe val met ser gly ser asp cys gly his ile phe ile tip asp arg his thr ala glu his leu met leu leu glu ala asp asn his val val asn cys leu gin pro his pro phe asp pro ile leu ala ser ser gly ile asp tyr asp ile lys ile trp ser pro leu glu glu ser arg ile phe asn arg lys leu ala asp glu val ile thr arg asn glu leu met leu glu glu thr arg asn thr ile thr val pro ala ser phe met leu arg met leu ala ser leu asn his ile arg ala asp arg leu glu gly asp arg ser glu gly ser gly gin glu asn glu asn glu asp glu glu (SEQ ID NO:2) 因此，本發明之特點在於含有實質上純的多肽或蛋白質， 包括至少 70% (例如至少 75, 80, 85, 90, 95, 98，或 1〇〇、％) 相同於序列辨識編號· 2之胺基酸序列。如多肽包括相同 於序列辨識編號：2之胺基酸序列，則該多肽可包含至多3〇 個保留性胺基酸取代。本發明亦包括由核酸編碼之實質上純的 夕肽，该核酸係於嚴格之條件下雜交一由序列辨識編號：^之 序列組成的探針。該多肽會與男性荷爾蒙受體結合，並增強該 男性荷时受體轉錄激活雜荷爾蒙—反應性基因的 以下實例所示者。 士發明之另-特點係在於編碼本發明多肽之分離核酸 ΐ ° * 列係由序觸識編號:1 再者’本發明之特點為-種生產多肽之方法，其係將本發 10 1287577 ’雜轉之細細胞中表現 夕狀以及由培養基中分離出多肽。 介_選錢纟雜荷隨受體-媒 i作 物之綠，錢在㈣化合物存在下 多肽，含有男性荷爾蒙受體之蛋㈣複合物接 觸，測$夕肽與蛋白質複合物間的結合程度；及決士入 ίίΐ否低於多肽與蛋白f複合物在候選化合物不存 二口 ％度’當化合物存在下之結合程度低於化合物不存在下之 …合程度時，意指該候選化合物會減少男性荷爾蒙_媒介之轉 錄激活作用。 在本文中提及特定多肽時所用的名詞“實質上純的，，音指 該多肽實質上不含其他生物學之大分子，實質上為純的多^以 乾重計為至少具有75% (例如至少80, 85, 95，或99%)的純 度。可以利用任何合適的標準方法測量純度，例如，管柱層析 法（chromatography )、聚丙烯醯胺膠體電泳法 (electrophoresis)或薄膜層析法（HPLC)等。 “保留性胺基酸取代”是指胺基酸序列中之胺基酸殘基被 其他具有化學上相似之側鏈的殘基所取代。具有相似側鏈的胺 基酸殘基已在此方面技藝中被分類定義，包括具鹼性側鏈之胺 基酸（例如：離胺酸、精胺酸、組胺酸），具酸性側鏈之胺基 酸（門冬胺酸、谷胺酸），具非帶電極性側鏈之胺基酸（甘胺 酸、門冬醯胺、谷醯胺、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸），具無 極性側鏈之胺基酸（丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯 胺酸、苯基丙胺酸、曱硫胺酸、色胺酸），具/?-分支側鏈之 胺基酸（蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）和具芳族側鏈之胺基酸 (酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。 在“嚴格條件下”雜交意指雜交反應係於65 X，0.5 XSSC 緩衝液中進行，接著在45 °C，0. 1 X SSC緩衝液中洗滌。 1287577 兩種胺基酸序列或兩種核酸序列之“百分比相同性，，係 利用 Karlin 及 Altschul 之演算法（pr〇c. Natl. Acad. Sci、 USA 87:2264-2268，1990)以 Karlin 及 Altschul 之方式修鄭 (Proc· Natl· Acad. Sci· USA 90:5873-5877，1993)而決 此種演算法係併入Altschul等人之NBLAST及XBLAST程式中 (J· Mol· Biol· 215··403-410，1990)，BLAST 核苷酸檢索係 利用NBLAST程式(score = 100，字長=12)進行，BLAST蛋白 質檢索係利用XBLAST程式(score = 50，字長=3)進行。當兩 個序列間存在裂口時，則以Altschul等人所述之方式利;

Gapped BLAST (Nucleic Acids Res· 25:3389-3402， 1997)， 當利用BLAST及Gapped BLAST程式時，則採用個別程式(例如 XBLAST及NBLAST)之系統設定參數，參見 bii£lZ/www· ncbi.nlm.nih· gov 〇 分刀離之核酉夂思才曰一種核酸結構不同於任何天然生成的 1酸’或不同於天然生成之跨越超過三個個別基因之基因組核 ，的任何片段。因此，這個名詞涵蓋例如（a) 一種DNA，^ $有天^發生基因組麵分子的部分序列，但並未被兩個編碼 列，，’該編碼序列係涵蓋有機體之天然生成的基因組内分 =j邛刀，（b) —種核酸，其係被嵌入載體或被嵌入原核 枱細胞的基因組DNA，其嵌入方式係使生成的分子不同於 l iif存在的載體或翻組疆者；⑷—種獨立的分子 ϋ +、基因組片段、或藉聚合酶鏈反應（PCR)生成的基因 除者下m碼融合蛋白質的基因。由此定義特定排 或基因細胞株，例如在DNA庫(如C驗 (單it可Λ於^生專一性結合至臟蛋白質之抗體 ^ 廷~抗體可用來檢測ARCAP在組織及細胞分隔 12 1287577 中之存在及分佈情形，例如，此等抗體可用來藉由測定ARCAp 蛋白質在組織中是否表現或過度表現之方式診斷癌化肝組 織:類似地，本發明核酸可藉測定ARCAP mRNA在組織或細胞 中疋否表現或過度表現之方式診斷肝癌，此等核酸可用作以 PCR為基礎之檢測方法中的引子，或作為核酸墨點法（例如 Northern墨點法）中之標幟探針。 本發明之其他特點或優點將可由以下之詳細說明以及申請 專利範圍中明窺得知。 【實施方式】 本，明係關於新穎之ARCAP蛋白質及編碼此等蛋白質之核 酸本此等蛋白質係於肝癌細胞中（相對於正常之肝細胞)過度表 2示表現外，經發現，ARCAP會結合至男性荷爾蒙 其轉賴活作赔性；這些發現及其他描述於下 拉順p經由雜荷爾蒙受體複合物可活化男性荷爾 絲分裂(mitogenic)基因(亦即啟動子含有男 =爾豕反應性70件之基因），以及顯示ARGAp之過度表現， 齡之雜拥蒙反雜促有絲分 s 激活作用，會導致癌症；以及顯示抑制arcap之 # ί/你〗/減少這些男性荷爾蒙反應性促有絲分裂基因之 之表型，因此歷係—新顆之 本發明之鹿用 35列分析、監督臨床試驗屬 13 1287577 質（例如經由在基因治療應用令之載體細胞中的重組表現載 ，），檢測ARCAP舰（例如於生物學樣品中檢測）或檢測 ARCjP基因中的基因改變情形，或調節ARCAp活性。蛋 ^質可用來治賴ARGAP基質不足或過度產生或目腦P抑制 產生而造成之疾病；此外，ARCAp蛋白質可用來篩檢天然生 f之ARCAP基質，篩檢調節ARCAP活性之藥劑或化合物，以及 篩才欢/口療因ARCAP蛋白質不足或過度產生或因活性在與狀cap 野生型蛋白質相較下已減少 '異常或未達要求之ARCAp蛋白質 型式產生而造成之疾病（例如肝癌）用之藥劑或化合物；再 f二本發明之抗-ARCAP抗體可用於檢測及分離ARCAP蛋白質， 调節ARCAP蛋白質之生物可利用性，及調節ARCAp活性。 士本發明亦提供一評估可與主題ARCAp多肽交互作用（例如：

，合）之化合物的方法，此方法包括：將化合物與主題ARCAP 多肽接觸；以及評估化合物與主題ARCAP多肽交互作用（例 如:結合或與主題ARCAP多肽形成複合物）的能力。此方法可 體外（例如於無細胞系統中）進行或於活體内（例如以雙雜 父，互作用陷阱分析（切〇—hybrid interaction trap assay) 進行’Y此方法可用於辨識可與主題ARCAp多肽交互作用之天然 生成分子，其亦可用於尋找主題ARCAp多肽之天然或合成之抑 制劑。 篩選分妍 1 發I月提供一種方法（本文亦稱之為“篩選分析”）以供 辨識調節子’亦即會結合至ARCAP蛋白質而對例如ARCAP表現 或ARCAP活性具刺激或抑制效應，抑或對例如ARCAp基質之表鲁 現或活性具鑛輪概應之候選細試之化合物或試劑（例 如蛋白質、、狀、擬肽、類肽(peptoid)、小分子、或其他藥物）， 如此辨識出之化合物可用於治療計晝中調節標的基因產物(例 # ARCAP &因）之活性，或詳盡展現標的基因產物之生物學功 14 1287577 能’或辨識會打斷正常標的翻交互侧之化合物。 物^乃提供轉ARGAP蛋自f或乡肽或其生 基質之候選或測試化合物；在本發明之另-中’本發明提供—分析法以供_會結合至ARap蛋白 肽或其生物學活性部分或調節其活性之㈣或測試化 本叙明測试化合物可利用此方面技藝已知之任何一種組合 ^方法（combinatorial library methods)獲得，包括生物& >料庫，類肽(peptoid)庫（具肽的功能但具新穎、非肽主幹分 子之庫，該等非肽主幹對酵素降解作用具抗性但並不會保留生

物活性；可參見 Zuckermann，R.N· ei 从（1994)/^/· 37:2678-85);可空間搜尋之平行式固相或液相庫；需 去旋渦處理(deconvolution)處理之合成庫方法；‘一珠一化 合物，庫方法；以及利用親和性層析選擇之合成庫方法。其中 生物學資料庫及類肽庫方案受限於肽庫，但其他四種方案可用 於肽、非肽寡聚物、或化合物之小分子庫（Lam，K. S. (1997) Anti cancer Drug Des. 12:145) ° 分子庫之合成法例子可參考已知技藝例如DeWitt等人 (1993) 户roc·你"·如政 5b入 G 5： A 90:6909; Erb 等人

(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 91:11422;

Zuckermann 等人（1994) / 37:2678; Cho 等人 (1993) 5b/e/?ce261:1303; Carrell 等人（1994)β?孤 //?ί·及/·及设入 33:2059; Carell 等人（1994)如获此 /;?ί·及/·及设人 33:2061;及 Gallop 等人（1994)/· ⑦部·

37:1233 。 化合物庫可存在於溶液中（例如Houghten (1992) 汾沉汉加/职怒13:412-421)、珠粒上（Lam (1991)W"re 354:82-84)、晶片上（Fodor (1993) 364:555-556)、 細菌（Ladner, USP 5, 223, 409)、孢子(Ladner USP ’ 409)、質 15 1287577 體(Cull 等人(1992) 89:1865-1869)、 或噬菌體上(Scott 及 Smith.(1990) 6b/e7?ce 249:386-390; Devlin (1990) 5b/e/?ce 249:404-406; Cwirla 等人（1990)

Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici(1991) J. Mol. 及〇/· 222:301;如新述之 Ladner)。 於一具體例中，有一種以細胞為主之分析法，其中將表現 ARCAP蛋白質或其生物學活性部分之細胞與一測試化合物接 觸’並測定測試化合物調節ARCAP活性之能力，測定測試化合 物调郎ARCAP活性之能力可藉貞測’例如，細胞周期經調節之 細胞定位而完成，該細胞可為來自哺乳動物（例如人類）者。 測試化合物調節ARCAP結合至化合物（例如男性荷爾蒙受體 複&物）之肥力或結合至ARCAP之能力亦可被評估，此點可藉 如下方式達成：將化合物（例如基質）與放射性同位素或酵素 標幟偶合，以便該化合物（例如基質）與ARCAp之結合可藉檢測 複合物中經標示化合物（例如基質）之方式測定。選擇地，ARCAp 可與放射性同位素或酵素標幟偶合以偵測測試化合物調 ARCAP結合至複合物中之ARCAP基質的能力，例如：化 如體P基質）可用^ i，S、“C^H直接或間接標^ 其放射性同位素則藉由直接計算放射線或藉閃爍計數之 巧測。選擇地，化合物可經，例如，辣根過氧化酶、驗性鱗^ 酶^蟲榮光素酶予轉素標示，並藉測定適當歸轉 之情形檢測該酵素標示。 刃 化合物（例如ARCAP基質）與具或不具任何交 ^ ARCAP , (mCr〇PhyS1〇meter)可用來檢測化合物 = ARCAP標示之ARCAP的交互作用情形，參見刪:物， 等人（1992)如㈣257:1906-1912;此處所使用之‘‘微生理 定感應器（LAPS)來測量細胞酸化其環境之速率，此種酸化速/率 16 1287577 之改變可作為化合物與廳Ap間交互作用 arcap (例如ARCAP蛋白質或其具生物學活性部分） t可^解及/或_結合之型式可用於本發明之I細胞 ^备採用蛋白質之薄膜結合型式時，宜使用助溶劑，此類助 Γ4 ίΐΐί非離子性清潔劑’例如：正-辛基葡糖苦、正-t-烧基祕H十二錄麥芽糖普、辛醯基_N_甲基葡糖 酉胺、，醯基-N-甲基葡糖醯胺、Tri toj/xy 〇〇、Tri tonh工4、 =sit異十二烧基聚（乙二醇驗)n、3-[(3-膽胺丙基)二甲胺 基]-1-丙烷磺酸鹽（CHAPS)、3-[(3-膽胺丙基）二甲胺基]_2一 羥基-1-丙烧續酸鹽(CHAPS0)、或N-十二烷基-N，心二甲基一3一 胺基-1-丙烧續酸鹽。 無細胞分析法涉及在足以使標的基因蛋白質及測試化合物 兩種成分交互作用及結合之條件及時間下製備該二成分之反 應混合物’因而形成可移除及/或檢測之複合物。 亦可利用例如螢光能量轉換(FET)檢測兩種分子間的交互 作用（可參見Lakowicz等人之美國專利第5,631，169號；

Stavrianopoulos等人之美國專利第4, 868,103號）。選用第 一個供體，分子上之螢光團標籤以便發射之螢光能量可被 第一個接受體分子上之螢光標籤吸收，其接著即因吸收能 量而發螢光。選擇地，該“供體”蛋白質分子可單純利用色胺 酸殘基之天然螢光能量，選擇放射不同光波長之標籤，以便 “接受體”分子標籤可與“供體”的標籤區分；由於標籤間 之能量轉換效率與分子間的距離有關，因此可評估分子間的空 17 !287577 間，，係’ 子間發生結合現象時，於此分析法巾之“接受 體为子才示籤螢光放射量最大，經由此方面技藝已知之標準榮 光檢測裝置(例如利用$光計）可方便地測量到FET結合事件 發生。 於另-具體例中，可即時之生物分子交互作用分析 (BIA)測定ARCAP蛋白質結合至標的分子之能力（參見例如

Sjolander，S·及 Urbaniczky，C· (1991)也a/· a?e/z7.· 63:2338-2345 ^Szabo#A(1995)^rr. Ορια Struct Biol. ^699-705)。表面電漿共振或“ΒΙΑ”即時檢測生物專一性之 父互作=無需標示任何交互作用子（例如BIAc〇re)。在結合表 面之大$改變（結合事件之指標）導致接近表面的光折射率改 變（表面電漿共振⑽)之光學現象），產生_可_之訊號， 此訊號可作為生物學分子間即時反應之指標。 於一具體例中，標的基因產物或測試物質乃錨接至固相 上，錨接至固相上之標的基因產物/測試化合物複合物可於反 應終了時被測得，較佳地，標的基因產物可被錨接至固體表面 上’而測試化合物（未錨接）可以本文中討論之可偵測標籤直 或間接地標示。 有可能宜將ARCAP、抗-ARCAP抗體或其標的分子固定化， 以便將一或兩種蛋白質之複合物由未複合型式中分離出，以及 使此分析法可自動化。測試化合物結合至ARCAp蛋白質，或者 ARCAP蛋白質與標的分子在候選化合物存在或不存在下之交互 作用，可於任何適合包含此等反應物之容器中完成，此類容器 土括微量滴定盤、試管、及微離心管。於一具體例中可提供二 ό蛋白，其增加一允許一或兩種欲結合至基質之蛋白質的區 域，例如麩胱甘肽-S-轉換酶/ARCAP融合蛋白或麩胱甘肽一^一 f換酶β票的融合蛋白可吸附至麩胱甘肽瓊脂糖（sephar〇se) J曰粒（Sigma Chemical，St· Louis，M0)或甦胱甘肽衍生之微 里滴疋盤上，其接著與測試化合物結合，或與測試化合物及未 18 1287577 的或ARQP蛋白f結合’且該混合物在有助於 匕δ 乂成之條件下培育（例如在鹽及pH之生理條件下择 ，），在培育後，洗滌該珠粒或微量滴定盤 二 合之成份，在珠粒之航下_定化㈣。可藉上^ 測定複合物，選擇地，複合物可由基i分 用標準技術败就AP之結合或雜等級。 ^ 衽蛋自f或標的蛋自f固定至基質上的技術包 素鏈黴’蛋白之結合作用，生物素化之趙P ^白負或‘的分子可由生物素-MS(N-祕-伽醢亞胺）利用 此方面技藝已知之技術製備（例如生物素化工具，Pierce jiaiucals’ Rockford，IL)，且於鏈黴菌卵蛋白-塗覆之恥井 盤（Pierce Chemical)中固定化。 了進行本分析，添加未固定之成份至含有錨接成份之塗 上’在反應完成後，於任何形成之複合物仍將保持固定 ^固ί表面上的條件下，移除未反應之成份(例如藉洗務），檢 為接至固體表面上的複合物可料多方法完成，當先前未固 ^化之成份被預先標科，檢_定至表面上的標籤顯示複合 成：當先前未固定化之成份未經預先標示時，可採用間 ^鐵檢_接至表面上的複合物；例如利用對固定化成份 有專一性之經標示抗體（此抗體可依次經，例如，已標示之抗 -Ig抗體直接標示或間接標示）。 於一具體例中，此分析係利用可與ARCAp蛋白質或標的分 ί反應但*會干擾細P蛋自質結合至其標时子之抗體進 Ζ二此種抗ί可衍生至盤的井中，而未結合之標喊ARCAP蛋 貝於井2藉抗體結合侧予以捕捉。制此種複合物之方法 ，了那些前述供檢測GST-固定化複合物者之外，尚包括利用 ARCAP蛋白質或標的分子反應之抗體免疫檢測複合物之

ί 以及酵素-連結之分析法，此分析法係依賴檢測與ARCAP 蛋白貝或標的分子相關聯之酵素活性。 19 1287577 選擇地，無細胞分析可於液相中進行，於此分析中，反應 產物係由未反應成份中分離出，其可藉許多標準技術進行，這 些技術包括但不限於差示離心分離（可參見例如Rivas，G•及

Minton，Α·Ρ·，（1993)rre；3Q^e/oc/?e/»5W 18:284-7);層析 法（凝膠過濾層析法、離子交換層析法）；電泳法(可參見例如

Ausubel，F·等人之 Current Protocols in Molecular Biology 1999，J· Wiley: New York);及免疫沈澱法（可參見例如 Ausubel，F·等人之 Current Protocols in Molecular

Bijogf 1999，J· Wiley: New York)。此等樹脂及層析技術 為^ έ $亥項技術者已知者（可參見例如Heegaard, n. Η.，（1998) / 射此c_yni:141 - 8; Hage，D.S·及 Tweed，S.A· (1997) JC^r=mt〇gr β Bl〇/ned Sci AppL m ••棚―娜）。再者，蠻 光能量轉換法亦可如本文所述之方式方便地用來檢測結合與 否而無需由溶液中純化該複合物。 〃 於一較佳之具體例中，分析法包括將ARCAp蛋白質或其具 生物學活性部分與一會結合ARCAP以形成分析混合物之已知 士合物（例如男性荷爾蒙受體)接觸，將分析混合物與一測試化 δ物接觸，並測定此化合物與ARCAP蛋白質交互作用之能力， 其中測定酬試化合物與AIOP蛋自質交互作狀能力係包 定該賴化合物在與已知化合物浦下，優先結合至 )RCAP或其具生物學活性部分的能力，或調節標的分子活性之 能Λ。 =狀標的翻絲在活㈣可與—或乡種細胞或胞外 旳列如蛋白質）交互作用，為了此方面討論，此種細胞或 子在本文中稱之為“結合夥伴”，破壞此種交互作用 尤HP二丄勿可用來調節標的基因產物之活性，此類化合物包括但 狀分子··抗體、胜肽及小分子。驗此具體例之 的基因/產物為本案所辨識出的ARCAP基因，於一選擇 /、豆例中’本發明提供測定測試化合物調節ARCAP蛋白質活 20 1287577 性之能力，其係經由調節ARCAP標的分子之下游作用子活性而 ，行，例如前述者，可測定作用子分子對適當標的之活性， 測定作用子結合至適當標的之情形。 一 ^ 了辨識可干擾標的基因產物與其細胞或胞外結合夥伴間 的^互作用’需製備含有該干擾標的基因產物與結合夥伴之反 ，混合物，其係於足令該二產物形成複合物之條件及時間下進 $ °為了測試一抑制劑，反應混合物係於測試化合物存在或不 存^下提供，測試化合物可先包含於反應混合物中，或可於添 加才了的基因與其細胞或胞外結合夥伴後添加。控制組反應混合 ΐ係於不含測試化合物或含安慰劑之情況下培育，然後檢測i 標的，因產物與其細胞或胞外結合夥伴間形成之任何複合 物，複合物於控制組中形成但未於含測試化合物之反應混合 物中形成之現象，意指該化合物干擾標的基因產物與交互作用 之結合夥伴間的交互作用。再者，於含有測試化合物與正常標 的基因產物之反應混合物中形成複合物之情形，亦可與含有 試化合物與突變標的基因產物之反應混合物中形成&合物^ 情形相比較，此種比較在欲辨識會中斷突變標的基因產物之交 用但不會中斷正常標的基因產物之交互作用之化合物時 可月t*很要0 這些分析可以-綱質或均f之型式進行，非均f的分 涉及將標的顧產物或結合夥伴織至_上的步驟，並 應終了檢測錨接至固相上的複合物；於均質的分析中，則整個 反應係於液相巾進行。任-種方式其添加反麟之次序可 以獲得有關受測化合物之不同訊A，例如會干擾( 方式)標的顧絲與結合夥_較互仙之化 在測試物存在下進行反應之方式加以辨識；選擇地，會分^ 形成之複合物的測試化合物(例如具較高結合係數^由^ 物置換其中1之化合物)可藉複合物形錢添加測試化合^ 至反應混合物中之方式職，各種型式將扼要說明 21 1287577 於非均質分析系統中，標的基因產物或交互作用之細胞或 胞外結合夥伴係織至固體表面上(例如微制定盤），然而未 錫接者則抑直接或標示；難者可赫賴或共價接 ΐίϊί固定化，選擇地，對欲錨接者具專一性的固定：抗體 亦可用來將其錨接至固體表面。 為了進行刀析，經固疋化處理者其夥伴係經曝露至具或不 ^1!!化it之塗覆表面上，當反應完成後，移除未反^之成 =⑷如猎洗滌方式），而任何形成之複合物將保持固定於固體 表f上；當未經固定化者業經預標示，檢測到固定於表面上之

ίϋΐίί物已形成；#未經111定化者未經預標示，則可採 接於表面上之複合物，例如糊對初始未固 疋 > 具專性之經標示抗體，此抗體可再經，例如，經標示 抗辭喊接賴接標示；視反應成份之添加次序而 可仏測能抑制複合物形成或分裂預形成複合物之化 物0 &擇地’此反應可於_巾侧試化合物存在或不存在下 應產物由未反應成份中分離出，複合物檢測可利用例 °、？錯接至溶液中形成之任何複合物的任—結合成份且專一 檢測鋪複合物之其他夥伴具專二性的 不抗體，職地，視反應物添加至㈣目之次序而定，可 硪能抑制複合物形成或分_形成複合物之測試化合物。 具體财，可湖—種均f分析法，例如製備 產交互侧之細胞或胞外結合夥伴產物之獅 複的基因產物或其結合夥伴係經標示，但由於 4 it声:?:產生之訊號會消滅(可參見美國專利第 ㈣、:从^/、係顧此種方式於免疫分析）；添加會與預 :!5: 置換之測試物將導致背景上方產生訊號，』 試物。；’11辨齡裂標的基因產物-結合料交互作用之測 22 1287577 然而另一方面，ARCAP蛋白質在雙-雜交分析或三-雜交分析 中可用作為“誘餌蛋白質”（例如參見美國專利第5, 283, 317 號；Zervos 等人（1993) 6W/ 72·· 223-232 ; Madura 等人⑽93) 乂汾ο/· 6¾棚· 268:12046-12054; Bartel 等人（1993) 奶14:920-924; Iwabuchi 等人(1993) 8··1693-1696，·及 Brent W094/10300)以辨識其他結合至 ARCAP 1與ARCAP交互作用（“ARCAP-結合蛋白質，，或 ARCAP-bp”）且涉入ARCAP活性之蛋白質，此等ARCAP-bp可 為ARCAP蛋白質或ARCAP標的訊號之活化劑或抑制劑，其可作 為ARCAP-媒介之訊號途徑的下游元素。 /一久-雊父系既你以大部分轉譯因子的模組性質為基礎，其 係由可分離之DM-結合及活化區域組成，簡單而言，此 係利用兩種不同的DNA構造，於一構造中，編碼腿p蛋白質 ，基因係融合至-編碼已知轉譯因子的麵結合區域之基因 (例如GAL-4)，於另一構造中，來自DNA序列資料庫之一 未辨識的蛋白質（“獵物”或“樣品，，）ma序列係融合至 二子的活化區域之基因’（選擇地，腿p蛋 白貝可融合至活化子區域），若“誘餌，，及“獵物” 互作用形成腿P—依存之複合物，則轉ί因 反二艟u係可操控地連結至對轉譯因子有 反應之轉澤調節位置；報導基因之表現可=八：冗 能性轉譯目子之細胞部落可被分離ώ細、 因，此基因係編碼與腳蛋白質交互作用之基 另一具體例係辨識ARCAP表現之袖γ f 物或無細胞之混合物與—麵之彳二卜例如》細胞混合

_或蛋白質相對於腿p _ 白HP 在下之表現，當ARCAP _A或蛋白質之#2，化5物不存 在時較輯化合㈣存树在^I化合物存 貝J候遥化合物被認定是 23 1287577 蛋白質表現之調節劑；選擇地，當腦p mRNA 選::：==:=: 併二，明係關於將本文所述之二或多種分析法合 法:以辨，哉:且:c利用-以細胞為基礎或無細胞之分析 内確認ί如;4tiTiRC?p蛋白質活性之能力可於活體 列々於動物體内，像是肝癌之動物模式。 此月=於f+由新述筛選分析法辨識出之新穎製劑，因 意如船P調節劑、反 田—、lm式巾晰以此種製継_功效、毒性、 i之新^制1^^屬本發明範嚕；此外’以前述筛選方法辨 識之新穎製射絲治療癌症，例如肝癌。 就用ARCAP分土^盖抱戈標幡之廄丐 為藥劑活性之標幟、以為罹病潛因之標幟、作 本文所述之方法ϊ檢之用 或存在量，且1可up分子之存*、不存在及/ 本發明ΑΚΓΑΡ^Ϊϋ^内一或多種生物學狀態有關，例如 &刀子可作為一或多種障礙或疾病狀態之替代桿 之钱輯。減歧使用ΐ 存規之生化標幟，其係與疾病或障礙之不 或不存在）ΐ病或障礙之進展有關（例如肝癌存在 評估時(例如早期腫瘤)’替代微用：;= 24 1287577 ^險之臨床終點前脾估疾病進展時(例如在錢梗塞或完 ϋ展之娜發展至不欲的臨床結果前，可利用膽固醇含量 評估心血管疾病之替代標幟，以及可利用HIVRNA含量作 ^析HIV感染之替代標幟），利用替代標幟於此方面技藝之 κ =括該等描述於Κο_等人⑽〇)之，#紙加伽历 9πα I I264 ^ ；&ΐη6δ 〇994)^ AIDS Treatjn^t News Archive 中者。 發明ARCAP分子亦可用作藥效標幟，如此處所使用者， 〜樂，幟”朴為-種客觀之生化標㈣，其係與藥劑效果有特 ^^1聯性’藥效標幟之存在或存在量與藥劑制的疾病狀態 或IV礙無關，因此標幟之存在或存在量為藥劑在個體内存在或 f性之指標’例如：藥效標幟可為藥劑在生物組織巾濃度之指 其中f幟於與細含量有關植織巾係經表現或轉譯或未 广現或轉#。以此種方式，藥劑之分配或吸收可藉藥效標幟偵 同樣地，#效標幡之絲或存在量可能與藥劑代謝產物之 存在或存在量有關，因此標幟賴齡活體_對瓦解速率之 ί旨標1藥效標幟特別可用於增加檢測藥劑效果之敏感性，特別 疋备藥劑係以低劑量施用時尤然，由於即使小量的藥劑可能足 以活2標幟(你^如ARCAP標幟)轉譯或表現多次，經放大之標幟 其數置可能較藥劑本身容易被測得，再者，由於標幟本身的性 質，標幟可能較容易被測得；例如利用本文所述之方法，抗 :ARCAP抗體可用於以免疫為基礎之ARCAp蛋白質標蛾用檢測 糸統，或者ARCAP-專一性之經放射標示之探針可用於檢測 ARCAP mRNA標幟。再者，使用藥效標幡可提供以機轉為基# 之危險預測’預測由於藥物治療超出可直接觀察到的範圍外之 危險’此方面技藝使用藥效標幟之例乃述於齟士如乜等人之美 國第 6, 033, 862 號專利；Hattis 等人(1991)之 Env· Health

Perspect 90:229-238; Schentag (1999) ^ / Health^Syst 户如r瓜 56 Suppl· 3:S21-S24;及 Nicolau (1999) J風 / 25 1287577 如/沩-私（卿.56S_l. 3:S16-S20。 本^明，AP ”亦可作為遺傳__，如此處所使用 藥理纖為—種客觀之生化標幟，其係與個體内 樂劑，'應或易感性有關聯性(可參見McLeod等人 ΐίΐίίΓΛ對特定_或藥物類別在藥物施 個體中—或多種遺傳藥理標幟的存在 例如根據個體内特定腫瘤標幟之驗 $ 能存在之特_的__。同===== ^条理域允縣職適合之治療於各個個體而無需施行治 遺傳藥理輋 本發明ARGAP分子以及_彳，或是以 常或不欲之讎活性辕 採此種治療可同時考慮遺傳藥理學(亦究、個::癌)’ 個體對外來化合物或藥劑之回應間3基因型及 ϊίίί:ί?==藥之劑㈣ 用'相關遺傳藥理學研究中所獲得之二

为子或ARCAP調節劑以及調整用ARCAp分 =fAP 療之劑量及/或治療支配。 次ARCAP调郎劑治 ia傳藥理學係處理臨床上重要之请值 藥劑配置及受影響者體内異常作參由 26 1287577

UcheUmm，1 等Clin. &P. Hiarmcoi. Physiol. 23:983-985 及 Linder, M. W.等人（1997) 瓜 ^:254-266，一般而言，可區分兩種遺傳藥理狀況類型，基因 狀況係以改變藥物作用於個體之途徑（改變藥物作用）之單一 因子型式傳送，或者基因狀況係以改變個體對藥物起作用之方 式（改變藥物代謝作用）之單一因子型式傳送，這些遺傳狀 況可以罕見之基因瑕㈣式献然形成之多形性型式^生； 例如··葡萄糖-6-磷酸酯去氫酶缺乏(G6PD)為一常 ^ =素病，其中主要之臨床症為攝食氧化性 j匕顧胺劑、止痛劑、石肖基,夫喃)後的溶血現象 耗性疾病。 制可預鋪物反應之細的遺㈣ 2基因組-寬締合”，其主要係依賴由已知與基因有 類ί=因的多，可變之位置組二= 裡文化之雙對偶基因之基因標幟圖譜），此種冥經狀夕装 意義的數目之由Π/ΠΙ期藥物試驗中ί 物反應:以;乍二固較;;一特定觀察到的藥 人類Α因二：ΓΓ私幟，4擇地，此種高解析圖譜可由 而杰Ύ中數千4已知之'^錄酸多態性標記(SNPs)组A =。如本文所使用者，“SNP”為DNA之單-核普酸 ί ^；7ΝΡ 1000 ^ ^ 假設-基因數可能與疾病沒關聯， 基因組中的狀職而ί，麵其個7 Ϊ方ΐ療在類似個體中可能共通的特質列:考 調整至基因類似個體的族群。 測Situ”咐材时辨識可預 又據此方法’右編碼藥物標的物之基因為 27 1287577 已知者(例如本㈣之ARGAP蛋自f)，絲 可於人群中㈣地辨識出，而且可測定是否該基 另一版本與特定藥物反應有關聯。 版本對 選擇地，一稱作“基因表現輪廓，，的方法可用來 測樂物反應之基因，例如、_物(例如本發明之船p又^員 ARCAP調節船_之_其基因表現 =^ 因途徑是否已開啟。 關之基 〜由;！或多種遺傳藥理學方案產生的資訊可用於測定滴 备之浏1及治療法以預防或治療性處理個體， ^ 以ARCAP分子或ARCAP調節劑（例如以本文所述之例示性 分析法辨識之調節劑）治療個體時可提高治療或預防之功效^ 本發明進一步提供辨識新藥劑或組合物之方法，其/ =劑為基礎，該辨識劑係調節一或多種藉一或多^本發明 ARCAP基因編碼之基因產物的活性，其中這些產物可能與ς胞 對治^劑的抗性有關聯。特別地，藉本發明ARCAp基因編碼之 蛋，質，活性可作為辨識克服抗藥性製劑的基礎，藉由阻斷一 士夕種抗性蛋白質之活性，對於未經修飾之標的細胞會抵抗之 某劑冶療，標的細胞(例如人類細胞)將變得敏感。 j貞測藥劑對ARCAP蛋白質之表現或活性之影響可應用至臨 床試驗，例如藉由本文所述之篩選分析法測定之藥劑增加 ARCAP基因表現、蛋白質程度、ARCAp活性之效用可於ARCAp 基因表現、蛋白質程度、arcap活性呈現減低之個體其臨床試 驗中被俄測；選擇地，藉由篩選分析法測定藥劑減少ARCAP基 因表=、蛋白質程度、ARCAP活性之效用可於ARCAP基因表現、 蛋白質程度、ARCAP活性呈現增加之個體其臨床試驗中被偵 測’於此等臨床試驗中，ARCAP基因之表現或活性以及，較佳 ，其他已涉入之基因，例如ARCAP-相關聯之疾病可用作特 定細胞之遺傳表型的“讀出值，，或標幟。 28 1287577 如他分麵彻树狀錄及核酸，而 引外之事物，於本案中援 ΛΜ 材料及方法 病患摄品 本研九之肝細胞癌病患係招募自台灣台北榮民總醫院外科 epartment of Surgery, Veterans General Hospital, ® =rn)。、肝癌之診斷係藉超音波掃描、血管攝影、 次j : T描及/或核磁共振影像進行。紀錄每一病患之臨床 1料，匕括病患的年紀、性別、血清阿法胎兒蛋白量、肝功能、 2大小、腫瘤位置、病症階段、無疾病間隔、復發時間及腫 f復發位置。取得每-病患之受朗意書。針對每—肝癌病 心，自腫瘤收取組織，以及週邊腫瘤之正常肝組織。 、RNA萃取及互補DNA之逆轉錄。組織樣本經手術切除後立即 冷凍並貯存於—8〇°c。如 Chomczynski 等人，（1987) Anal Biochem· 162:156-159所述，使用硫氰酸胍及酚/氯仿萃取 醒。使用均質機(polytron)將約〇· 5克之冷凍組織與4毫升 RNAzol B(Biotecx Laboratories，Houston, Texas)均質。使 用具B型研杵之Douncer剪切DNA。添加〇· 4毫升氯仿，劇烈 震盡，並靜置於冰上5分鐘後，將混合物在41下以12 〇〇〇g 離心15分鐘分離。以等體積異丙醇沉殿含有總之上層水 相。 曰 互補DNA係合成自1微克之總RNA。逆轉錄係在3〇微升體 積，含有RNA及lx第一標準緩衝液（lOmMDTT、50〇eMdNTP、 50 ng/ml寡-dT及100單位MMLV逆轉錄酶）中進行。樣品接著 29 1287577 在95°C下變性5分鐘。 PCR放大 cDNA (1微升)在含有〇·8微莫耳濃度引子、5〇微升之每一 dNTP(Takara)、IxPCR緩衝液及125單位TaQ聚合酶 (Pharmacia)中進行PCR放大。為控制cDNA品質，使用人類運 鐵蛋白基因引子Tref8(GGAACATTTTGGCAAAGACA[序列辨識編 號:4];衍生自運鐵蛋白cDNA序列之971-990核苷酸及Tref9 (ATTCATGATCTT(C/T)GCGATGC[序列辨識編號:5];衍生自運鐵 蛋白cDNA序列之1307-1288核苷酸））進行PCR反應試驗。此 等引子序列係分別選自人類運鐵基因之第8及第9外顯子。使籲 用94°C下起始變性10分鐘進行pcr;接著94°c下1分鐘之· 個循環，及7沈下i分鐘；接著在72t:下進行、 鐘。一成功的PCR產生336bp產物，指出cDNA模板為自聚w) 端（nt 2362)之至少 1.4kb。 類固醇受體群選殖物藉由使用編碼高度保留之序列部分 (位於類固醇受體之臟結合區域之鋅手指）之簡併引子，基於 胺基酸同源PCR而產生。引子編碼胺基酸序列])YSTGYHY(序列 辨識編號:6)、CKXFFKRC序列辨識編號:7)及CPACRFXKC(序列 辨識編號：8) ’其所有描述於Maksymowych等人，（1992)， 春 Receptor 2:225-240。前向及逆向引子序列為 · RCAYTTIIIIARICKRCAIKMNKGRCA(序列辨識編號·u)及 GAYRARKCIWCIGGIWRICAYT(序列辨識編號：⑵。在高度嚴格條 件下（55°C/72°C)放大模板前，在低度嚴格煉合/延長條^ (42°C/65°C)下進行5個循環的PCR。PCR產物係次選殖至'TA · 載體（Invitrogen)，並將所得質體用於轉形廳^；細胞。隨機 挑取選殖物並檢驗約170 bp大小之插入物（對應至鋅手指=長 度）。高頻度選殖物大約包含該大小之插入物(85-90%)广 、 1287577 宏殖物並使用 Applied Bic)sys1:ems mQdel 377 腦 367-4SQ^i〇^ BUSm^^(^ehetner f Λ ^ (1994) Nature 成昌夕AT V )为析經選殖序列。挑選帶有類似於類固醇受體群 選殖物作為進—步分析。在此等選殖物中， 冉為ARCAP之選殖物係經特徵化並完全如此中所述選殖。 金ΛΜΜ物之公離

=到ARCAP之完整開放讀框1胤Αρ部分選殖物探查 噹細胞株之商業化cj)驗庫。此外，肝癌⑼碰庫係構築 由^癌腫瘤及正常人類肝組織(二者均*死於外傷之男性病 心所I贈）所分離之·A。約5微克之mRNA用於逆轉錄。使用 λζΑΡ /1系統(Stratagene)製備CDNA庫。該庫係放大自 1· 1x10 PFU之初級重組選殖物。平均插入大小為丨· 2肋。超 過95%之選殖物為重組體。

為自肝cDNA庫分離新穎選殖物，使用補充32p-標示之dcTp 之PCR反應製備輻射標示之探針。特別地，1〇〇微升之標示反 應包^ 1 X緩衝液（1· 5微莫耳濃度MgC12、〇· 5微升Taq聚合酶 (25單位/毫升）、2〇〇微莫耳濃度之每一 dGTp，dTTp，及 df? ’及25-50微莫耳濃度之dCTP)及5微升之32Ρ_ α -dCTP)。 製造經標示探針之pCR之條件係本質上相同於上述放大基於 保留區域之類固醇受體選殖物。

適度密度(每15()毫米盤16,000 PFU)篩選⑸财庫。起始 f 遥 20 盤。在 55°C 下於 5xSSC、2xDenhardt’ s、100 毫克/ 宅升單股娃魚精子DMA及0· 1% SDS中進行預雜交。雜交在相 同溶液中進行，但補充變性lxl07cpm/毫升之PCR標示探針溶 液:在55°C培養20小時後，在室溫下使用2xSSC，0.1% SDS 進行低度嚴格清洗60分鐘。使用Kodak X-AR底片及一增感屏 (發光增加）。 31 1287577 泛’ -RACE及3’ -RACE之撰猶 RACE為已知内部位置及在5’或3’端之未知序列間放大 cDNA 模板之程序（Fronhman 等人，（1988)，proc. Natl. Acad.

Sci· USA 85:8998-9001)。在此研究所進行的基本程序係描述 於隨Clontech之RACE套組所附之印刷品。 GSPKTCTGGTGGTTGCACTGAGCT ;序列辨識編號：13)及 GSP2(ACAATGTCAGCTCAGGCTC ;序列辨識編號：14)引子係在實 驗室内’基於ARCAP序列設計。人類肝癌細胞株G2mRNA係作 為合成第一股cDNA之模板。該合成係使用引子 3’ -CDS(AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT30圓；序列辨識編號·· 15)以3 RACE進行或Smart-寡(T25NN ;序列辨識編號：16) 加上 5’ -CDSCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG;序列辨識 編號：17)以5 RACE進行。 合成第一股cDNA後，使用Smart及GSP1引子藉PCR進行 5’ RACE。針對3’ RACE，使用GSP2及3’ CDS引子進行PCR。 PCR後，將母一片段選殖入pGEM-簡易(pGEM-easy)載體 (Promega)。篩選後，挑取正確的選殖物，並純化質體DNA。 接著得到全長ARCAP cDM序列。 ARCAP抗體之製造 使用EcoRl消化ARCAP選殖物並插入PGEX2T以產生 ARCAP-GST表現質體(Pharmacia)。此質體用於轉形乩21細 滅’其接者使用IPTG誘導以產生融合蛋白。使用麵胱苦肽 Sepharose 4B親和性色層分析自細菌溶解物純化融合蛋白。 使用抗-GST抗體藉西方墨潰法檢測ARCAP蛋白質。將20微克 融合蛋白注射於Balb/c小鼠以產生ARCAP抗血清。 ARCAP表現分析 為檢測ARCAP之mRNA表現模式，製備自組織及細胞株之 32 1287577 樣品係藉北方墨潰圖分析。20微克之得自肝、胎兒腦部、衍 生自肝(HepG2，Hep3B，VGH/22T，VGH/59T)之四個細胞株、血 球細胞株(K562，U932，Ramos，Jurkat)及HeLa細胞之每一總 RNA係分離於甲醛膠並轉移至濾膜。經標示探針在42°c下，於 5xSSC、5xDenhardt, s、5毫克/毫升變性鮭魚精子DNA、50% 甲醯胺及0· 1%SDS進行膜雜交。首先在室溫下於 2xSSC/(hl%SDS進行清洗30分鐘，並接著在55°C下，於 0· 2xSSC/0· 1%SDS進行最後清洗30分鐘。使用一增感屏暴光 自動輻射圖底片72小時。 針對定位雜交，肝癌組織切片係得自上述病患樣品。使用 部分ARCAP選殖及生物素標示套組製備ARACp之核醣探針鲁 (Hboprobe)。根據所建立方案進行雜交及清洗。針對arcap 、 蛋白質表現，使用如此中所述的GST—ARCAP融合表現載體產生 抗體。該抗體接著用於鑑定各種組織切片中ARCAp蛋白質的存 ， 男蒙-反應性基里棘—激活

培養於80微升緩衝液z及1〇微 。48小時後，收取 φ 光活性。 33 1287577 升0-硝苯基-/5比喃半乳糖(4毫克/毫升）中2小時。添加 50微升之1莫耳濃度Na2C〇3終止反應。使用MR5000平盤讀取 儀(Dynatech)得到“ο值，並如此中所述計算活性。轉染進行 三重複並至少重複三次。 將肝癌A2細胞次培養於補充10%胎牛血清之DMEM培養基 (Life Technologies，Inc·)。轉染前，細胞以 lxlO5細胞/孔 接種於35毫米孔中至少24小時。為研究檢測AR及ARCAP-1 間之交互作用，細胞培養於補充以10%塗覆葡聚糖之碳胎牛血 清之DMEM。使用Fugene 6轉染細胞8小時期間，清洗並培養 於含有媒劑或類固醇之培養基。轉染後48小時收取細胞並如 上述分析。 當選殖入異源基因時，發現一 450鹼基片段，其含有得自 由ATG起始密碼位置起算之人類阿法-胎兒蛋白啟動子4385 bp 部分之男性荷爾蒙-反應性元件(TGGGTACATTTTGTTC;序列辨識 編號：9)，具有轉錄激活反應能力。藉PCR自人類基因組 DNA(Clontech)放大該片段。包含序列TGGGTA迎TTTTGCTC(序 列辨識編號：10 )之男性荷爾蒙反應元件藉位置導向突變製 得。經突變核苷酸以下標線標示。此產品係選殖入PGEM-簡易 載體(Promega)，及元件之序列係藉定序確認。插入的DNA次 選殖於發光酶報導質體pGL3basic(Promega)上之適當位置。 AR及ARCAP係利用EcoRI位置融合至載體pEGFP-Nl(Clontech) 之增強GFP(EGFP)之胺端框架。該質體用於轉形至尤 a?"(DH5)。使用微質體製備及限制酶分析鑑定正選殖物。藉 定序確認所篩選構築體。C0S7及A2細胞培養於補充以1〇%胎 牛血清、盤尼西林/鏈黴素（100微克/毫升)及L-麩胺酸(2微 莫耳濃度）之DMEM。次融合單層（106細胞於1〇〇毫米孤中）係 藉磷酸鈣以10微克之AR及ARCAP cDNA轉染。30小時後，以 補充DHT(10 nM)之培養基取代新鮮培養基。使用螢光顯微鏡 (Nikon)觀察細胞。 34 1287577 免疫沉激 上編碼男性荷爾蒙受體，ARA70，及ARCAP-iM或ARCAP-Xpress ^原表=融合蛋白之表現質體係使用Ec〇Ri以pCDNA ΠΙ製 轉染至C0S7細胞後，使用體外—偶合轉錄及轉譯套組併入 35S:T硫胺酸以標記蛋白質。增補1〇訄〇财於培養物。將細 ，洛裂，並將溶裂物培養於〗毫升沉澱緩衝液(5〇毫莫耳濃度 :邱7· 5、l5G毫莫耳濃度就卜G· 2毫莫耳濃度池孤、 曲5jNomdet ρ—40、1毫莫耳濃度苯f基磺醯基氟、1毫莫耳 =度二硫秀克轉(dithiQthreitQ1)、25微克/白抑酵素狀 eu^ptin)、25微克/毫升抑肽酶(apr〇tinin)及25微克/毫 升抑胃蛋白酶肽(pepstatin)。溶裂物接著與AR、耿或e ίϊϊϊϊΓΓ)混合並培養於冰上60分鐘，在該時間添加 价i升弋气白貝“epha騰株(pharmacia)。免疫沉澱物在 ϋ以連績混合培養16小時。在4°C下藉2000 rpm離心收 ，免疫沉殿複合物。清洗團塊化株3次並與SDS樣品緩衝液混 曰。樣品於200V再溶解於8%聚丙烯醯胺凝膠45分鐘。 在〗〇%丙醇及10%乙酸中固定3〇分鐘、浸潰^

Amplify(Amersham Pharmacia Biotech)30 分鐘、直介下妒如〇0、 並在70 C下暴露於X-射線軟片4至24小時。 、 酵母菌Ψ雜夺公批 為獨立選殖ARCAP ’雜荷时受體係作為 選媒合酵母菌雙雜交庫(clGntech)。簡而 ^體序列之全·人物選殖人齡1(clQnte⑻ 體用=細錄造者程序，仙_g^ γ 之酵母菌雙雜交睪丸庫。二十萬個經轉c 月匕後盍於不含色胺酸、白胺酸及腺嗓吟，但補充】微择 之二氫睪固酮之培養基。分離腺嘌呤_正、L '耳=度 正選殖物，並自其得到質體眶。將質體轉形至大腸=^~ 35 1287577 coif) i 1 ) ° 人I用在PACT2對聽基因為專一性之引子藉菌落PCR鑑定 3有cDNA之PACT2質體。藉檢測存有GAL4DBD:hAR融合蛋白 =cDNA選殖物之液體LacZ活性相對於僅有GAL4DBD存在之活 ^測定與人類男性荷爾蒙受體(hAR)之交互作用之專一性。定 1並檢測GenBank資料庫後，測定由ARCAP所編碼之交互作用 選殖物。 酵母菌雙雜交系統亦活性地用於確認ARCAp與hAR之交互 1用。根據製造者的方案（Q〇ntech)，pAS2構築體盥 PACT2-ARCAP或pACT2之一共轉染於酵母菌γ187宿主。將Trf 正、Leu-正菌落三重複接種於鑑別培養基並於丨微莫耳濃卢 贿存在或缺乏下在30°C下生長過夜。樣品稀釋至“為〇· 2 且再生長至Aeoo為〇· 6-0· 8。樣品分成每一為1毫升的等量樣 本。細胞藉由14,〇〇〇rpm離心5分鐘回收，以緩衝液z(〇 i莫 耳濃度磷酸鈉，ΡΗ7· 0，10毫莫耳濃度KC1及1〇毫莫耳濃产 MgSf)清洗一次，並再懸浮於8〇〇微升之含有21微升2—巯^ 乙醇（2-mercaptoethanol)之緩衝液Z。接著，添加〇. 之10微升，接著添加50微升氯仿。震盪樣品丨分鐘及在3〇它 了立口養’並接著添加200微升之〇-石肖苯基喃半乳糖 苷（4宅克/¾升於緩衝液z)。紀錄反應時間並於觀察到顯著1 色或添加500微升之1莫耳濃度Na£〇31小時後終止反廡。^ 定樣品的A·，並如下計算活性：（A42QXl〇〇〇)/(iUx時間1 : ^ 有分析皆進行三重複並重複至少三次。 結果 全長ARCAP cDNA及其編碼之蛋白質係如上所述。使用北方 墨潰法在正常人類組織及各種細胞株（包括肝癌細胞株 ARCAP mRNA量。ARCAP僅檢測於正常人類心臟及骨骼机組$ 在肝癌細胞（包括3B、22T、Huh7、G2及A2)檢測到大量、 36 1287577 表現 織。使用北方m 1離成對肝軸及週邊於腫瘤之正常組 S於週邊的正貌頓。使關CAP專- =體HRCAP蛋白質存在於腫瘤組織及週 位於細胞核，指㈣CAP為核蛋白。 ^蛋白被疋 、☆酵母菌雙雜交系統用於檢測是否ARCAp、结合至男 =體。全長男性荷爾蒙受體選殖週邊GAL4麵結合區域並作 為自人類媒合肝臟庫(Cl〇ntech)_ His3-正選殖物之引諉 ，。AR及ARCAP在體内之交互作用藉本研究確認。為進一 確認ARCAP、结合至男性荷爾蒙受體，ARCAp及男性荷爾蒙受體 係共表現為融合蛋自。由於雜荷爾蒙受體之免疫沉殿導^ ARCAP分離及ARCAP之免疫沉澱導致男性荷爾蒙受體分離， ARCAP及男性荷爾蒙受體之物理交互作用被確認。 、為測定男性荷爾蒙受體與ARCAP蛋白質間之物理結合是否 為生化學上顯著的，將α_胎兒蛋白基因啟動子係用於螢光 酶報導子構築α—胎兒蛋白（AFP)基因為研究基因表現發展栌 制之模型系統。AFP在胎兒肝中大量表現，但其轉錄在^生& 快速下降且在成人難以檢測。然而，當肝癌或畸胎瘤發展， 基因通常再活化至大量（Shulman等人（1995) Z^roc·舱" 5bi· Z/似92:8288-8292)。在AFP啟動子之增強子區域 包含男性荷爾蒙反應性元件(ARE)。包含突變ARE之控制組同 源螢光酶報導子亦用於本研究以測定是否ARE對中介任何生 化作用具反應性。 37 1287577 報導子及(1)mmm，⑵編碼男性荷爾蒙 又體之NA，⑶編碼ARCAP之DNA，或⑷編碼男性^ f ί，=rMA 轉染 m 1現^性何爾蒙報導子，營光酶活性增加至少2/

迷地，男性荷爾蒙受體及施:AP的同時增加導致，相對二八J 報導子，增加約3-4 “二== 活^性。&強在AFP啟動子上之男性荷爾蒙受體之轉錄激 杲nm導子實驗係料111 _在下_。為確認此效 ^依^睪_/男性荷爾蒙受體複合物，野生型報導子，在ί Τ4^ηΤ^Ύ ^ ^ ΣίΪΪΜ么碼ARCAP之疆，或⑷編碼男性荷爾黑 aRCip之男嫌之dna共轉染。結果清楚地指出由於 可爾象之增強的轉錄激活活性係依賴睪固酮。 &SA體實施何 非明 = 系經其詳細說明描述，前述說明係欲闡明並 優點及修飾係在本發明範圍内乾圍疋義其匕硯點、 38 1287577 序列表 <110>行政院國軍退除役官兵輔導委員會台北榮民總醫院 % * <12〇>男性荷爾蒙受體複合物相關蛋白 <130> VGH58-P00166 <140〉 091100704 <141> 2002-1-17 <160> 17 <170〉FastSEQ, Windows 4 ·0 版；

<210> 1 <211> 2580 <212〉 DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtctcggg gtggctccta cccacacctg ttgtgggacg tgaggaaaag gtccctcggg ctggaggacc cgtcccggct gcggagtcgc tacctgggaa gaagagaatt tatccaaaga % ttaaaacttg aagcaaccct taatgtgcat gatggttgtg ttaatacaat ctgttggaat gacactggag aatatatttt atctggctca gatgacacca aattagtaat tagtaatcct tacagcagaa aggttttgac aacaattcgt tcagggcacc gagcaaacat atttagtgca aagttcttac cttgtacaaa tgataaacag attgtatcct gctctggaga tggagtaata ttttatacca acgttgagca agatgcagaa accaacagac aatgccaatt tacgtgtcat tatggaacta cttatgagat tatgactgta cccaatgacc cttacacttt tctctcttgt ggtgaagatg gaactgttag gtggtttgat acacgcstca aaactagctg cacaaaagaa gattgtaaag atgatatttt aattaactgt cgacgtgctg ccacgtctgt tgctatttgc ccaccaatac catattacct tgctgttggt tgttctgaca gctcagtacg aatatatgat cggcgaatgc tgggcacaag agctacaggg aattatgcag gtcgagggac tactggaatg gttgcccgtt ttattccttc ccatcttaat aataagtcct gcagagtgac atctctgtgt tacagtgaag atggtcaaga gattctcgtt agttactctt cagattacat atatcttttt gacccgaaag atgatacagc acgagaactt aaaactcctt ctgcggaaga gagaagagaa gagttgcgac aaccaccagt taagcgtttg agacttcgtg gtgattggtc agatactgga cccagagcaa ggccggagag tgaacgagaa cgagatggag agcagagtcc caatgtgtca ttgatgcaga gaatgtctga tatgttatca agatggtttg aagaagcaag tgaggttgca caaagcaata gaggacgagg aagatctcga cccagaggtg gaacaagtca atcagatatt tcaactcttc ctacggtccc atcaagtcct gatttggaag tgagtgaaac tgcaatggaa gtagatactc cagctgaaca atttcttcag ccttctacat cctctacaat gtcagctcag gctcattcga catcatctcc cacagaaagc cctcattcta ctcctttgct atcttctcca gacagtgaac aaaggcagtc tgttgaggca tctggacacc acacacatca tcsgtctgat aacaataatg aaaagctgag ccccaaacca gggacaggtg aaccagtttt aagtttgcac tacagcacag aaggaacaac tacaagcaca ataaaactga actttacaga tgaatggagc agtatagcat caagttctag aggaattggg agccattgca aatctgaggg tcaggaggaa tctttcgtcc cacagagctc agtgcaacca ccagaaggag acagtgaaac aaaagctcct gaagaatcat cagaggatgt gacaaaatat caggasggag tatctgcaga aaacccagtt gagaaccata tcaatataac acaatcagat aagttcacag ccaagccatt ggattccaac tcaggagaaa gaaatgacct caatcttgat cgctcttgtg gggttccaga agaatctgct tcatctgaaa aagccaagga accagaaact tcagatcaga ctagcactga gagtgctacc 2 ：1287577 aatgaaaata acaccaatcc tgagcctcag ttccaaacag aagccactgg gccttcagct catgaagaaa catccaccag ggactctgct cttcaggaca cagatgacag tgatgatgac ccagtcctga tcccaggtgc aaggtatcga gcaggacctg gtgatagacg ctctgctgtt gcccgtattc aggagttctt cagacggaga aaagaaagga aagaaatgga agaattggat aotttgaaca ttagaaggcc gctagtaaaa atggtttata aaggccatcg caactccagg acaatgataa aagaagccaa tttctggggt gctaactttg taatgagtgg ttctgactgt ggccacattt tcatctggga tcggcacact gctgagcatt tgatgcttct ggaagctgat aatcatgtgg taaactgcct gcagccacat ccgtttgacc caattttagc ctcatctggc atagattatg acataaagat ctggtcacca ttagaagagt caaggatttt taaccgaaaa cttgctgatg aagttataac tcgaaacgaa ctcatgctgg aagaaactag aaacaccatt acagttccag cctctttcat gttgaggatg ttggcttcac ttaatcatat ccgagctgac cggttggagg gtgacagatc agaaggctct ggtcaagaga atgaaaatga ggatgaggaa <210> 2 <211> 860

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Pro His Leu Leu Trp Asp Val Arg Lys 15 10 15

Arg Ser Leu Gly Leu Glu Asp Pro Ser Arg Leu Arg* Ser Arg Tyr Leu 20 25 30

Gly Arg Arg Glu Phe lie Gin Arg Leu Lys Leu Glu Ala Thr Leu Asn 35 40 45

Val His Asp Gly Cys Val Asn Thr lie Cys Trp Asn Asp Thr Gly Glu 50 55 60

Tyr lie Leu Ser Gly Ser Asp Asp Thr Lys Leu Val lie Ser Asn Pro 65 70 75 80

Tyr Ser Arg Lys Val Leu Thr Thr lie Arg Ser Gly His Arg Ala Asn 85 90 95 lie Phe Ser Ala Lys Phe Leu Pro Cys Thr Asn Asp Lys Gin lie Val 100 105 110

Ser Cys Ser Gly Asp Gly Val lie Phe Tyr Thr Asn Val Glu Gin Asp 115 120 . 125

Ala Glu Thr Asn Arg Gin Cys Gin Phe Thr Cys His Tyr Gly Thr Thr 130 135 140

Tyr Glu lie Met Thr Val Pro Asn Asp Pro Tyr Thr Phe Leu Ser Cys 145 150 155 160

Gly Glu Asp Gly Thr Val Arg Trp Phe Asp Thr Arg lie Lys Thr Ser 165 170 175

Cys Thr Lys Glu Asp Cys Lys Asp Asp lie Leu lie Asn Cys Arg Arg 180 185 190

Ala Ala Thr Ser Val Ala lie Cys Pro Pro lie Pro Tyr Tyr Leu Ala 195 200 205

Val Gly Cys Ser Asp Ser Ser Val Arg lie Tyr Asp Arg Arg Met Leu 210 215 220

Gly Thr Arg Ala Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Arg Gly Thr Thr Gly Met 225 230 235 240

Val Ala Arg Phe lie Pro Ser His Leu Asn Asn Lys Ser Cys Arg Val 245 250 255

Thr Ser Leu Cys Tyr Ser Glu Asp Gly Gin Glu lie Leu Val Ser Tyr 260 265 270

Ser Ser Asp Tyr lie Tyr Leu Phe Asp Pro Lys Asp Asp Thr Ala Arg 275 280 285

Glu Leu Lys Thr Pro Ser Ala Glu Glu Arg Arg Glu Glu Leu Arg Gin 290 295 300 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580

3 1287577

Pro Pro Val Lys Arg Leu Arg Leu Arg Gly Asp Trp Ser Asp Thr Gly 305 310 315 320

Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ser Glu Arg Glu Arg Asp Gly Glu Gin Ser 325 330 335

Prx? Asn Val Ser Leu Met Gin Arg Met Ser Asp Met Leu Ser Arg Trp 340 345 350

Phe Glu Glu Ala Ser Glu Val Ala Gin Ser Asn Arg Gly Arg Gly Arg 355 360 365

Ser Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ser Gin Ser Asp lie Ser Thr Leu Pro 370 375 380

Thr Val Pro Ser Ser Pro Asp Leu Glu Val Ser Glu Thr Ala Met Glu 385 390 395 400

Val Asp Thr Pro Ala Glu Gin Phe Leu Gin Pro Ser Thr Ser Ser Thr 405 410 415

Met Ser Ala Gin Ala His Ser Thr Ser Ser Pro Thr Glu Ser Pro His 420 425 430

Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ser Pro Asp Ser Glu Gin Arg Gin Ser Val 435 440 445

Glu Ala Ser Gly His His Thr His His Gin Ser Asp Asn Asn Asn Glu 450 455 460

Lys Leu Ser Pro Lys Pro Gly Thr Gly Glu Pro Val Leu Ser Leu His 4 65 470 475 480

Tyr Ser Thr Glu Gly Thr Thr Thr Ser Thr lie Lys Leu Asn Phe Thr 485 490 495

Asp Glu Trp Ser Ser lie Ala Ser Ser Ser Arg Gly lie Gly Ser His 500 505 510

Cys Lys Ser Glu Gly Gin Glu Glu Ser Phe Val Pro Gin Ser Ser Val 515 520 525

Gin Pro Pro Glu Gly Asp Ser Glu Thr Lys Ala Pro Glu Glu Ser Ser 530 535 540

Glu Asp Val Thr Lys Tyr Gin Glu Gly Val Ser Ala Glu Asn Pro Val 545 550 555 560

Glu Asn His lie Asn lie Thr Gin Ser Asp Lys Phe Thr Ala Lys Pro 565 570 575

Leu Asp Ser Asn Ser Gly Glu Arg Asn Asp Leu Asn Leu Asp Arg Ser 580 585 590

Cys Gly Val Pro Glu Glu Ser Ala Ser Ser Glu Lys Ala Lys Glu Pro 595 600 605

Glu Thr Ser Asp Gin Thr Ser Thr Glu Ser Ala Thr Asn Glu Asn Asn 610 615 620

Thr Asn Pro Glu Pro Gin Phe Gin Thr Glu Ala Thr Gly Pro Ser Ala 625 630 635 640

His Glu Glu Thr Ser Thr Arg Asp Ser Ala Leu Gin Asp Thr Asp Asp 645 650 655

Ser Asp Asp Asp Pro Val Leu lie Pro Gly Ala Arg Tyr Arg Ala Gly 660 665 670

Pro Gly Asp Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg lie Gin Glu Phe Phe Arg 675 680 685

Arg Arg Lys Glu Arg Lys Glu Met Glu Glu Leu Asp Thr Leu Asn lie 690 695 700

Arg Arg Pro Leu Val Lys Met Val Tyr Lys Gly His Arg Asn Ser Arg 705 710 715 720

Thr Met lie Lys Glu Ala Asn Phe Trp Gly Ala Asn Phe Val Met Ser 725 730 735

Gly Ser Asp Cys Gly His lie Phe lie Trp Asp Arg His Thr Ala Glu 740 745 750

His Leu Met Leu Leu Glu Ala Asp Asn His Val Val Asn Cys Leu Gin 4 ' 1287577 755 760 765

Pro His Pro Phe Asp Pro lie Leu Ala Ser Ser Gly lie Asp Tyr Asp 770 775 780 lie Lys lie Trp Ser Pro Leu Glu Glu Ser Arg lie Phe Asn Arg Lys 785' 790 795 800

Leu Ala Asp Glu Val lie Thr Arg Asn Glu Leu Met Leu Glu Glu Thr 805 810 815

Arg Asn Thr lie Thr Val Pro Ala Ser Phe Met Leu Arg Met Leu Ala 820 825 830

Ser Leu Asn His lie Arg Ala Asp Arg Leu Glu Gly Asp Arg Ser Glu 835 840 845

Gly Ser Gly Gin Glu Asn Glu Asn Glu Asp Glu Glu 850 855 860 <210> 3 <211> 3016 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (18).·.(2597) <400> 3 ccggctcagg cagagcc atg tct egg ggt ggc tcc tac cca cac ctg ttg 50

Met Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Pro His Leu Leu 15 10 tgg gac gtg agg aaa agg tcc etc ggg ctg gag gac ccg tcc egg ctg 98

Trp Asp Val Arg Lys Arg Ser Leu Gly Leu Glu Asp Pro Ser Arg Leu 15 20 25 egg agt ege tac ctg gga aga aga gaa ttt ate caa aga tta aaa ett 146

Arg Ser Arg Tyr Leu Gly Arg Arg Glu Phe lie Gin Arg Leu Lys Leu 30 35 . 40 gaa gca acc ett aat gtg cat gat ggt tgt gtt aat aca ate tgt tgg 194

Glu Ala Thr Leu Asn Val His Asp Gly Cys Val Asn Thr lie Cys Trp 45 50 55 aat gac act gga gaa tat att tta tct ggc tea gat gac acc aaa tta 242

Asn Asp Thr Gly Glu Tyr lie Leu Ser Gly Ser Asp Asp Thr Lys Leu 60 65 70 * 75 gta att agt aat cct tac age aga aag gtt ttg aca aca att cgt tea 290

Val lie Ser Asn Pro Tyr Ser Arg Lys Val Leu Thr Thr lie Arg Ser 80 85 90 ggg cac ega gca aac ata ttt agt gca aag ttc tta cct tgt aca aat 338

Gly His Arg Ala Asn lie Phe Ser Ala Lys Phe Leu Pro Cys Thr Asn 95 100 105 gat aaa cag att gta tcc tgc tct gga gat gga gta ata ttt tat acc 386

Asp Lys Gin lie Val Ser Cys Ser Gly Asp Gly Val lie Phe Tyr Thr 110 115 120 aac gtt gag caa gat gca gaa acc aac aga caa tgc caa ttt aeg tgt 434 482 51287577

Asn Val Glu Gin Asp Ala Glu Thr Asn Arg Gin Cys Gin Phe Thr Cys 125 130 135 cat tat gga act act tat gag att atg act gta ccc aat gac cct tac H!士 Tyr Gly Thr Thr Tyr Glu lie Met Thr Val Pro Asn Asp Pro Tyr 140 145 150 155 act ttt etc tet tgt ggt gaa gat gga act gtt agg tgg ttt gat aca Thr Phe Leu Ser Cys Gly Glu Asp Gly Thr Val Arg Trp Phe Asp Thr . 160 165 170 ege ate aaa act age tgc aca aaa gaa gat tgt aaa gat gat att tta Arg lie Lys Thr Ser Cys Thr Lys Glu Asp Cys Lys Asp Asp lie Leu 175 180 185 att aac tgt ega cgt get gee aeg tet gtt get att tgc cca cca ata lie Asn Cys Arg Arg Ala Ala Thr Ser Val Ala lie Cys Pro Pro lie 190 195 200 cca tat tac ett get gtt ggt tgt tet gac age tea gta ega ata tat Pro Tyr Tyr Leu Ala Val Gly Cys Ser Asp Ser Ser Val Arg lie Tyr 205 210 215- gat egg ega atg ctg ggc aca aga get aca ggg aat tat gca ggt ega Asp Arg Arg Met Leu Gly Thr Arg Ala Thr Gly Asn Tyr Ala Gly Arg 220 225 230 235 ggg act act gga atg gtt gee cgt ttt att cct tee cat ett aat aat Gly Thr Thr Gly Met Val Ala Arg Phe lie Fro Ser His Leu Asn Asn 240 245 250 aag tee tgc aga gtg aca tet ctg tgt tac agt gaa gat ggt caa gag Lys Ser Cys Arg Val Thr Ser Leu Cys Tyr Ser Glu Asp Gly Gin Glu 255 260 265 att etc gtt agt tac tet tea gat tac ata tat ett ttt gac ccg aaa lie Leu Val Ser Tyr Ser Ser Asp Tyr lie Tyr Leu Phe Asp Pro Lys 270 275 280 gat gat aca gca ega gaa ett aaa act cct tet geg gaa gag aga aga Asp Asp Thr Ala Arg Glu Leu Lys Thr Pro Ser Ala Glu Glu Arg Arg 285 290 295 gaa gag ttg ega caa cca cca gtt aag cgt ttg aga ett cgt ggt gat Glu Glu Leu Arg Gin Pro Pro Val Lys Arg Leu Arg Leu Arg Gly Asp 300 305 310 315 tgg tea gat act gga ccc aga gca agg ccg gag agt gaa ega gaa ega Trp Ser Asp Thr Gly Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ser Glu Arg Glu Arg 320 325 330 gat gga gag cag agt ccc aat gtg tea ttg ctg cag aga atg tet gat Asp Gly Glu Gin Ser Pro Asn Val Ser Leu Met Gin Arg Met Ser Asp 335 340 . 345 530 578 626 674 722 770 818 866 914 962 1010 1058 atg tta tea aga tgg ttt gaa gaa gca agt gag gtt gca caa age aat Met Leu Ser Arg Trp Phe Glu Glu Ala Ser Glu Val Ala Gin Ser Asn 1106 6 1287577 350 355 360 aga gga cga gga aga tct cga ccc aga ggt gga aca agt caa tea gat 1154

Arg Gly Arg Gly Arg Ser Arg Pro Arg Gly Gly Thr Ser Gin Ser Asp 、，365 370 375 att tea act ett cct aeg gtc cca tea agt cct gat ttg gaa gtg agt 1202 lie Ser Thr Leu Pro Thr Val Pro Ser Ser Pro Asp Leu Glu Val Ser 380 385 390 395 gaa act gca atg gaa gta gat act cca get gaa caa ttt ett cag cct 1250

Glu Thr Ala Met Glu Val Asp Thr Pro Ala Glu Gin Phe Leu Gin Pro 400 405 410 tct aca tee tct aca atg tea get cag get cat teg aca tea tct ccc 1298

Ser Thr Ser Ser Thr Met Ser Ala Gin Ala Kis Ser Thr Ser Ser Pro 415 420 425 aca gaa age cct cat tct act cct ttg eta tct tct cca gac agt gaa 1346

Thr Glu Ser Pro His Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ser Pro Asp Ser Glu 430 435 440 caa agg cag tct gtt gag gca tct gga cac cac aca cat cat cag tct 1394

Gin Arg Gin Ser Val Glu Ala Ser Gly His His Thr His His Gin Ser 445 450 455 gat aac aat aat gaa aag ctg age ccc aaa cca ggg aca ggt gaa cca 1442

Asp Asn Asn Asn Glu Lys Leu Ser Pro Lys Pro Gly Thr Gly Glu Pro 460 465 470 475 gtt tta agt ttg cac tac age aca gaa gga aca act aca age aca ata 1490

Val Leu Ser Leu His Tyr Ser Thr Glu Gly Thr Thr Thr Ser Thr lie 480 485 490 aaa ctg aac ttt aca gat gaa tgg .age agt ata gca tea agt tct aga 1538

Lys Leu Asn Phe Thr Asp Glu Trp Ser Ser lie Ala Ser Ser Ser Arg 495 500 505 gga att ggg age cat tgc aaa tct gag ggt cag gag gaa tct ttc gtc 158 6

Gly lie Gly Ser His Cys Lys Ser Glu Gly Gin Glu Glu Ser Phe Val 510 515 520 cca cag age tea gtg caa cca cca gaa gga gac agt gaa aca aaa get 1634

Pro Gin Ser Ser Val Gin Pro Pro Glu Gly Asp Ser Glu Thr Lys Ala 525 530 535 cct gaa gaa tea tea gag gat gtg aca aaa tat cag gaa gga gta tct 1682

Pro Glu Glu Ser Ser Glu Asp Val Thr Lys Tyr Gin Glu Gly Val Ser 540 545 550 555 gca gaa aac cca gtt gag aac cat ate aat ata aca caa tea gat aag 1730

Ala Glu Asn Pro Val Glu Asn His lie Asn lie Thr Gin Ser Asp Lys 560 565 570 ttc aca gcc aag cca ttg gat tcc aac tea gga gaa aga aat gac etc 1778

Phe Thr Ala Lys Pro Leu Asp Ser Asn Ser Gly Glu Arg Asn Asp Leu 575 580 585 71287577 aat ctt gat cgc tct tgt ggg gtt cca gaa gaa tct get tea tet gaa Asn Leu Asp Arg Ser Cys Gly Val Pro Glu Glu Ser Ala Ser Ser Glu 590 595 600 瓤* % · aaa gee aag gaa cca gaa act tea gat cag act age act gag agt get Lys Ala Lys Glu Pro Glu Thr Ser Asp Gin Thr Ser Thr Glu Ser Ala 605 610 615 acc aat gaa aat aac acc aat cct gag cct cag ttc caa aca gaa gee Thr Asn Glu Asn Asn Thr Asn Pro Glu Pro Gin Phe Gin Thr Glu Ala 620 625 630 635 act ggg cct tea get cat gaa gaa aca tee see agg gac tct get ctt Thr Gly Pro Ser Ala His Glu Glu Thr Ser Thr Arg Asp Ser Ala Leu 640 645 650 cag gac aca gat gac agt gat gat gac cca gtc ctg ate cca ggt gca Gin Asp Thr Asp Asp Ser Asp Asp Asp Pro Val Leu lie Pro Gly Ala 655 660 665 1826 1874 1922 1970 2018 agg tat ega gca gga cct ggt gat aga cgc tct get· gtt gee cgt att Arg Tyr Arg Ala Gly Pro Gly Asp Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg lie 670 675 680 cag gag ttc ttc aga egg aga aaa gaa agg aaa gaa atg gaa gaa ttg Gin Glu Phe Phe Arg Arg Arg Lys Glu Arg Lys Glu Met Glu Glu Leu 685 690 695 gat act ttg aac att aga agg ccg eta gta aaa atg gtt tat aaa ggc Asp Thr Leu Asn lie Arg Arg Pro Leu Val Lys Met Val Tyr Lys Gly 700 705 710 715 cat cgc aac tee agg aca atg ata aaa gaa gee aat ttc tgg ggt get His Arg Asn Ser Arg Thr Met lie Lys Glu Ala Asn Phe Trp Gly Ala 720 725 730 aac ttt gta atg agt ggt tct gac tgt ggc cac att ttc ate tgg gat Asn Phe Val Met Ser Gly Ser Asp Cys Gly His lie Phe lie Trp Asp 735 740 745 egg cac act get gag cat ttg atg ctt ctg gaa get gat aat cat gtg Arg His Thr Ala Glu His Leu Met Leu Leu Glu Ala Asp Asn H'is Val 750 755 760 gta aac tgc ctg cag cca cat ccg ttt gac cca att tta gee tea tct Val Asn Cys Leu Gin Pro His Pro Phe Asp Fro lie Leu Ala Ser Ser 765 770 775 ggc ata gat tat gac ata aag ate tgg tea cca tta gaa gag tea agg Gly lie Asp Tyr Asp lie Lys lie Trp Ser Pro Leu Glu Glu Ser Arg 780 785 790 7 95 att ttt aac ega aaa ctt get gat gaa gtt ata act ega aac gaa etc lie Phe Asn Arg Lys Leu Ala Asp Glu Val lie Thr Arg Asn Glu Leu 800 805 810 2066 2114 2162 2210 2258 2306 2354 2402 2450 1287577 atg ctg gaa gaa act aga aac acc att aca gtt cca gcc tct ttc atg Met Leu Glu Glu Thr Arg Asn Thr He Thr Val Pro Ala Ser Phe Met 815 820 825 ttg* agg atg ttg get tea ett aat cat ate ega get gac egg ttg gag Leu Arg Met Leu Ala Ser Leu Asn His lie Arg Ala Asp Arg Leu Glu 830 835 840 ggt gac aga tea gaa ggc tct ggt caa gag aat gaa aat gag gat gag Gly Asp Arg Ser Glu Gly Ser Gly Gin Glu Asn Glu Asn Glu Asp Glu 845 850 855 gaa taataaactc tttttggcaa gcacttaaat gttctgaaat ttgtataaga Glu 860 catttattat atttttttct ttacagagct ttagtgcaat tttaaggtta tggtttttgg agtttttccc tttttttggg ataacctaac attggtttgg aatgattgtg tgcatgaatt tgggagattg tataaaacaa aactagcaga atgtttttaa aactttttgc cgtgtatgag gagtgetaga aaatgcaaag tgcaatattt tccctaacct tcaaatgtgg gagettggat caatgttgaa gaataatttt catcatagtg aaaatgttgg ttcaaataaa tttctacact tgccatttgc atgtttgttg etttetaatt aaagaaactg gttgttttaa aaaaaaaaaa aaggaattc <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> PCR乏引子 <400> 4 ggaacatttt ggcaaagaca <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉PCR之引子 <400> 5 attcatgatc ttygegatge <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223〉 motif <400> 6 Asp Tyr Ser Thr Gly Tyr His Tyr 2498 2546 2594 2647 2707 2767 2827 2887 2947 3007 3016 20 1287577 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <221> VARIANT <222> (1)…（7) <223〉Xaa =任何胺基酸 <223> motif <400> 7

Cys Lys Xaa Phe Phe Lys Arg 1 5

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <221> VARIANT <222> (1)···.(9) <223〉Xaa =任何胺基酸 丨. ； <223> motif <400> 8

Cys Pro Α1ό Cys Arg Phe Xaa Lys Cys 1 5

<210> 9 <211〉 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgggtacatt ttgttc

<210> 10 <211〉 16 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>突變之核酸序列 <400> 10 tgggtaggtt ttgctc 16

<210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 '1287577 <220〉 <223>簡併引子 <221> misc—feature <H2> 7-1〇7 13, 19 <223〉η =肌苷 <221> misc_feature <222> 22 _ <223〉 n = A, T, G,戎 C <400> 11 rcayttnnnn arnckrcank mnkgrca

<210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>簡併引子 ' <221> misc一feature <222> 9, 12, 15, 18 <223> n =肌苷 <400> 12 gayrarkcnw cnggnwrnca yt <210> 13 .

<211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉合成之簡併引子 <400> 13 tctggtggtt gcactgagct

<210> 14 <211〉 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223〉合成之簡併引子 <400> 14 acaatgtcag ctcaggctc <210> 15 <211> 57 <212> DNA <213〉人工序列 <220>

II 1287577 <223〉合成之簡併引子 <221> misc一feature <222> (1).7. (57)

<223〉 n = A,T,C 或 G <400> 15 aagcagtggt aacaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttnn

<210> 16 <211〉 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> misc一feature <222> (1).7.(27)

<223〉 n = A,T,C 或 G <223>合成之簡併引子 <400> 16 tttttttttt tttttttttt tttttnn

<210〉 17 <211> 30 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220〉 <223〉合成之簡併引子 <400> 17 aagcagtggt aacaacgcag agtacgcggg

Claims (1)

1. 中華民國專利申請案第091100704號 隻至蓋·無劃線之專利申請嚴圍替掉f Π〇〇7年4月、 拾、申請專利範圍： -種實質上純的男性荷爾蒙受體複合物相關多狀 (ARCAP) &含序列辨識編號·. 2之胺基酸序列。 2. -種分離核酸’編碼申料利㈣第1項之多狀。 3. -種載體，其包含申請專利範圍第2項之核酸。 4. -種經培養宿主細胞，其包含申請專利第2 核酸。 、 5.:種製造纽之方法’财法包含在培養物中培養如 I請專利難第4項之經培養教細胞，在該經培養 伤主^胞中表現多肽，及自培養物中分離多肽。 種締L可降低男性制蒙受體巾介之轉錄激活作用 之化合物之方法，該方法包含·· 在候選化合物存在下，將申請專利範圍第】 狀與包含男性荷爾蒙受體之蛋白質複合物接觸； 測定該多肽及蛋白質複合物間結合的範圍；及 測定結合範圍是否少於缺乏候選化合物下該多; 、蛋白$複合物間之結合制，其巾候選化合物存在_ :::靶圍少於缺乏候選化合物的結合範圍指出該☆

   δ物可降低男性荷爾蒙受體巾介之⑽激活作用 -種檢測生物樣品中是否含有癌細胞之方法，_ 包含： 提供得自人類病患之生物樣品； 1 1287577 檢測該生物樣品中之具有序列辨識編號：2之胺基 酸序列之男性荷爾蒙受難合物相關之乡肽基因表現； 其中該生物樣品中之男性荷爾蒙受體複合物相關 之多肽基因表現高於正常生物樣品中之男性荷爾蒙受 體複合物相關之多肽基因表現指出該生物樣品含有癌 細胞。 〜 根據申請專觀圍第7項之方法，其中癌細胞為肝腫 瘤細胞。 9. 其係可與申請專利範圍第1項之多肽專一 一禋杌體 性結合。 10.根據申請專利範圍第9項之抗體，其係可用於治療因 ARCAP異常表現之癌症。 U·根據申請專利範圍第10項之抗體，其中該癌症為肝 癌。 13 12. -種診_ARCAP異常表現之癌症之方法，係使用 申請專利範圍第2項之核酸相或其基因 症細，或組織中ARCAP基因核酸的表現。 螓 一種師選可調節男性荷爾受體(AR)媒介之轉錄激活 =用昇降之化合物的方法，該方法包含在候選化合物 :在=情形下’使中請專利範圍第1項的男性荷爾蒙 又體複合物相關多肽和—個含有AR的蛋白質聚合物 目互作用；檢測該多肽和該蛋白質聚合物相互作用程 平疋疋否以上相互作用程度較不含有候選化合 物柃該多肽和該蛋白質聚合物相互作用的程度差，其 1287577 中含有候選化合物時的相互作用程度低於不含有候選 化合物時的相互作用程度表示該候選化合物可降低 AR媒介之轉錄激活作用。