TWI285647B

TWI285647B - Prevention, treatment and detection of porcine progressive atrophic rhinitis

Info

Publication number: TWI285647B
Application number: TW093125156A
Authority: TW
Inventors: Maw Sheng Chien; Chih Ming Liao; Cheng I Liu
Original assignee: Univ Nat Chunghsing
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2007-08-21
Also published as: TW200607812A; US20060039923A1; US20090226965A1; US20090238842A1; US8067203B2

Description

1285647 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明是有關於進行性萎縮性鼻炎（progressive atrophic rhinitis, PAR)的預防、治療與偵測，其中多殺性 5 巴氏桿菌毒素（尸mw/MczWa toxin，PMT)的三種次單位（subunit)被使用作為進行PAR的預防、治療與偵測的活性組份。本發明也有關於能防治至少PAR的動物用多價疫苗，該疫苗包含有三種針對PAR的PMT次單位以及至少一種與其他的動物疾病有關聯的病原性抗原或其抗原決 10 定位來作為疫苗的活性組份。【先前技術】豬萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis，AR)，又稱豬進行性萎縮性鼻炎（progressive atrophic rhinitis，PAR)，是豬隻常見的上呼吸道細菌性疾病，它會造成豬鼻甲介骨萎縮與鼻 15 吻變形以及影響全身骨骼發育，進而導致豬隻生長遲緩，且致使豬隻容易染患繼發複合性肺炎，而造成養豬業者的莫大損失。 PAR的病因曾引起諸多的爭議，直到de Jong等人（de Jong MF? Oei HL, Terenburg JG. AR-pathogenicity-tests for 20 Pasteurella multocida isolates. IPVS 6th Congress, 2115 1980)以及Rutter與Rojas (Ri. 7?%·，110:531-535，1982)證實PAR主要是由多殺性巴氏桿菌（户似mw/icx/t/a) D 型產毒株感染所引起。多殺性巴氏桿菌 mw/MczWa)存在於豬上呼吸道的常在菌叢内，在不論是否 1285647 罹患有PAR的豬隻身上皆可分離到此細菌，而依據莢膜抗原在血清學上可區分為A、B、D、E與F等五種血清型（R· B. Rimler and K. R. Rhoades (1987), J. Clin. Microbiol., 25: 615-8)，其中A型菌株的莢膜中含有玻尿酸（hyaluronic acid) 5 而使得菌落呈黏液狀，而D型菌株的莢膜所含玻尿酸則較少。此外，D型菌株被發現會與σ丫唆黃（acrifiavine)產生凝集反應（G.R. Carter and P. Subtonto (1973)，Jm. /· FW·及以·， 34:293-294)。但是，僅有在罹患PAR的豬隻體内才可分離到產毒株（Brim 以 α/· (1986)，I.P.V.S· 9th Congress，ρ· 237; 10 Lariviere et al. (1992), J. Clin. Microbiol., 30: 1398-1401; Nielsen W a/· (1986)，I.P.V.S. 9th Congress，p· 239) o D型多殺性巴氏桿菌的毒素基因已被選殖（cloned)、定序（sequenced)以及表現（expressed)，並被命名為βχΑ基因 (S.K. Petersen et al. (1989), Infect. Immun., 57:3907-3913) 15 (SEQ ID NO:l)，且完整的毒素基因被發現包含有4,380個核苷酸序列（nucleotide sequence)，G+C%為 34.6%，而起始密碼子（start codon)係位於第219個核苷酸，且於PMT基因的上游可能存在有一個轉錄抑制子（TxaR)來調控toxA 基因的表現（S.K· Petersen (1990)，Mo/· M/croMo/·，4:821-20 830)。Kamps等人利用根據部分PMT基因序列所製造的探針來進行南方墨點分析（Southern Blotting analysis)，所得結果顯示非產毒株亦呈現有微弱的反應，因而認為非產毒株也可能具有部分或不完整的毒素基因（Kamps AMIE W a/· (1990)，乂 C/h· MkrMb/·，28:1858-1861)。Nagai等人 1285647 利用PCR方法來鑑別多殺性巴氏桿菌分離株，而認為D型產毒株與非產毒株的差異應在於PMT基因的有無（S. Nagai α/· (1994)，/· C7/w. M/crc)6/o/·，32:1004-1010)。但是，除D型多殺性巴氏桿菌外，A型多殺性巴氏桿 5 菌亦常在罹患PAR豬隻中被分離出來（T. Sakano M a/· (1992)，乂 FW· Md 5W·，54:403-7)。Foged以胎牛肺臟細胞及單株抗體來檢測A型與D型分離株而發現這兩種血清型的毒素蛋白質皆可產生相似的細胞病變， 56:1901-1906, 1988)，而Frandsen等人也發現A型多殺性巴 10 氏桿菌可產生分子量相近的毒素蛋白質產物（/. MW.， 3 8:344-452, 1991)，這顯示A型與D型多殺性巴氏桿菌所產生的PMT毒素性質應極為相似，因此A型產毒株亦常被提及是造成PAR的病原當中的一種（T· Sakano “/· (1992)，「以· Met/· Scz··，54:403-7) 〇 15 但是，A型與D型多殺性巴氏桿菌所產生的PMT毒素暨其編碼基因的異同性仍未被證實。此外，不論是A型或 D型多殺性巴氏桿菌，它們有許多野外分離株經重複的豬隻感染實驗後並無法導致任何典型的PAR病變，這引起 PMT產毒株與非產毒株的爭議，而導致目前在PMT毒素蛋 20 白質與編碼基因的研究上仍存在有諸多疑點，亦即從某些多殺性巴氏桿菌分離株所萃取出的蛋白質產物即使以極高濃度被加入時也不會導致任何的細胞病變，而這些非產毒株究竟是否在PMT基因的上游具有調控因子而因此抑制PMT的表現，抑或是因為完全不具有PMT基因，或者是 1285647 因為基因缺損不全而導致無法製造完整的ΡΜΤ，迄今這些推論都未獲得證實。多殺性巴氏桿菌Α型與d型虞毒株間的ΡΜΤ基因與蛋白質序列的相似程度仍然未知，而目前已被登錄於 5 Genbank的PMT基因序列皆為〇型產毒株，因此目前有關A 型與D型產毒株的PMT基因序列的比對並無完整的報告。此外，多殺性巴氏桿菌亦為許多動物的呼吸道内的常在菌當中的一種，亦是造成家禽的禽霍亂的一個主要病原。因此，無論是在多殺性巴氏桿菌的快速檢驗或其他實驗研究 10 上，針對所分離出的菌株若能建立一快速精確的鑑別系統以供菌株類型的區別以及PMT生成與否的確認，實存在有一迫切需要。一分子量約為146 kDa的多殺性巴氏桿菌毒素 toxin，PMT)已從D型多殺性巴氏桿 15 菌被萃取出（Rutter and Mackenzie (1984)，7?%·，114: 89-90)，該毒素經肌肉注射可引發豬隻呈現典型的PAR病變，因而PMT毒素被証實是造成鼻甲骨萎縮變形的致病因子（N. Chanter “/· (1986)，J· Gew· 132:1089- 1097)。經純化的 PMT是一單一的多肽（Ν·Τ· Foged (1988)， 2〇 /衫/% ί. TVw所⑽·，56:1901-1906)’其經定序分析被確$忍含有 1,285個胺基酸，分子量為 146 kDa (R· Felix 以 α/· (1992)， /mm⑽.，60:4984-4988) ’且該毒素的胺基酸組成是以麵胺酸（glutamic acid)、天冬胺酸（aspartic acid)、甘胺酸（glycine)、脯胺酸（prolin)、丙胺酸（alanine)與白胺酸 1285647 (leucine)佔較大的比例（Τ· Nakai α/· (1984), Infect. /mmww·，46:429-434) ο PMT的胺基酸序列（SEQ ID N0:2)可從NCBI網站查得，寄存編號（accession number)為 CAA35885。 5 若將純化的毒素保存於去離子水（DW)中，或予以置放於高於pH 10或低於pH 4的溶液中，皆會使毒素不穩定。因此傳統用於預防豬萎縮性鼻炎的疫苗抗原是利用福馬林（formaldehyde)將PMT不活化，以使PMT成為失去毒性但保有抗原性的類毒素（toxoid)，以供作為PAR疫苗的主 10 要抗原組份。但是，生產PMT類毒素的製程耗時繁複，首先，需於37°C下以血液培養基來培養多殺性巴氏桿菌產毒株歷時26小時，或是以腦心浸出物肉湯培養基（brain heart infusion broth，BHI broth)予以培養歷時72小時，然後進行 PMT的萃取與濃縮，所收穫的毒素於37°C下以1 %福馬林予 15 以去活化處理4天之後，才能得到低毒性但仍具抗原性的類毒素。因此，除了製程繁複以外，傳統PAR類毒素疫苗所需的生產成本亦極高，因而成為台灣地區目前自國外進口的豬用細菌性疫苗（swine bacterial vaccines)中單價最為昂貴的種類。 20 又，由於PMT類毒素在製造過程中需使用福馬林予以長時程處理，而可能使該毒素的抗原性產生一些無法預估的化學結構性變化，進而影響到疫苗的效力，因此在台灣農民使用PAR疫苗的意願並不高。另外，多殺性巴氏桿菌本身的抗藥性極高，諸多抗生素藥物已無法有效控制 1285647 PAR，造成此病的罹患率在台灣境内一直居高不下。因此，對於獲得一種具有生產時間短、效率高、生產成本低廉、無毒性、高安全性及高免疫保護效力特點的PAR疫苗，存在有一迫切需求。 5 另外，假性狂犬病（pseudorabies，PR)亦為豬隻的一種高傳染性與致死性疾病，哺乳仔豬及離乳幼豬感染此病後的死亡率甚至可高達100%，而即使耐過此病的豬隻也會因生長遲緩而導致換肉率變差，而懷孕母豬若感染本病則會造成流死產（H. J· Nauwynck (1997)，M/croZno/·，55: 10 3-11)。為撲滅此疾病，台灣規定需使用gE基因缺損的病毒來作為製造疫苗的病毒株，而因為此病毒株的gE基因被完全去除而使得該病毒在複製時，不能產生gE醣蛋白（gE glycoprotein)，以致於所生成的病毒外套上缺少gE醣蛋白。於是，以此種疫苗予以免疫的豬隻將不會產生對抗gE 15 蛋白的抗體（van Oirschot，J· Τ· W <2/· (1986)，J. Gm· FzW.，67:1179_82)，配合針對gE的酵素聯結免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELIS A)的檢測，即可與因感染野生型病毒而於體内產生有抗gE抗體的陽性豬隻作明顯區別，而後將gE抗體陽性豬隻淘汰，而達到撲 20 滅 PR的目的（P· C. Yang (1996)，·/· C/ζ/π· 5^c· Fei· 5c/·，22: 323-30)。多價疫苗（multi-valent vaccine)為現今疫苗發展的主要趨勢，其優點是經免疫後能同時預防多種疾病的感染，並可大幅降低因免疫多種疫苗所導致的多重壓力 -10- 1285647 (multiple stress)以及減少接種疫苗的人工成本。由於年齡越小的豬隻在感染PAR和/或PR後所產生的症狀會越形嚴重，而以這兩種疾病的疫苗來免疫懷孕母豬的時機是相接近的，為了避免懷孕母豬因多次免疫而產生壓力進而造成 5 流產，若能開發出針對PAR與PR的雙價疫苗並藉由免疫懷孕母豬後所產生的移行抗體，將能有效達到保護仔豬免於這兩種疾病的早期感染的目的。此外，疫苗的價格、疫苗用於豬隻身上的安全性以及能否在豬隻體内激起良好的抗體保護效力等，也都是良好疫苗所必須滿足的條件。 10 PMT是一種非分泌型的内毒素，而且對熱敏感。由於致病所需PMT的量十分的低，而且PMT的免疫原性低’自然感染下不易引發宿主對PMT的免疫反應，因而在感染 PAR的豬隻身上難以測得大量的中和抗體。 PMT的偵測方式有多種，就細菌的分離而言，可利用 15 小白鼠致死實驗（mouse lethal test，MLT)、天竺鼠皮膚壞死實驗（GPST)、EBL細胞與非洲綠猿腎臟細胞株（Vero cell line)的細胞病變（CPE)、三明治ELISA (Ν·Τ· Foged d β/· (1988), J. Clin. Microbiol.^ 26:1419-1420) > PCR (S. Nagai 此 a/· (1994)，J· C/h· M/cmho/·，32:1004-1010)等方法來 20 作檢測，俾以偵測PAR產毒株的存在與毒力。關於監測PAR疫苗的免疫效力以及進行豬群感染時的監控’用來檢測血清中和抗體效價的傳統方法是利用 PMT對 EBL細胞（E.M. Kamps ei· α/· (1987)，似· M/crM紿/·， 13:235-248)與 Vero細胞（α·Μ· Pennings and Ρ· K. Storm -11 - 1285647 (1984)，9:503·508)的細胞病變（CPE)或是小鼠致死試驗（MLT)。由於EBL細胞並非細胞株，這造成檢測上的一大限制。Vero細胞雖為細胞株，但培養細胞的步驟耗時且繁瑣，所需要的操作時間及費用均高，而且在 5判定上易受人為主觀及細胞狀態的影響。使用小鼠致死試驗（MLT)時’需要注射待測血清和pmt的混合液至小鼠身上，因而操作時間長且必須犧牲動物，故也有不利的地方。因此，若能建立一快速檢驗方法來偵測抗-PMT抗體，將可解決在PAR感染時以及免疫後抗體效價的檢測問 10 題，而有利於評估豬群的免疫狀況。此外，佐劑（adjuvant)在疫苗的製備上可能扮演一重要角色。佐劑是非抗原性物質，其可以顯著提升抗原的免疫能力，其中所涉及的作用機制可能是佐劑會改變蛋白質分子上的抗原決定位（epitopes)的電荷或構造因而增加蛋 15白質分子的抗原性。佐劑還能延緩抗原被吸收及釋出的速率以及促使抗原與免疫細胞結合，藉此而提升免疫者的免疫反應（R. Edelman (1980)，£)以·，2:370-383)。佐劑也能促使少量抗原產生高效力且長時效的免疫反應’俾以降低疫苗的生產成本（r.K. Gupta and G.R. Siber 20 (1995)，厂⑽―，13:1263-76)。佐劑依來源可分成四種，第一種為植物源性，如植物皂素（saponin)或聚葡萄糖（glucan)萃取物；第二類為細菌源性，如 trehalose dymicolate、霍亂毒素（choleric toxin)、單磷醯脂質A (monophosphoryl lipid A)、脂多醣 -12- 1285647 (lipopolysaccharides)暨此等的衍生物；第三類為化學物質，如氫氧化銘（aluminum hydroxide)、表面活性劑 (surfactants)以及乳劑（emulsions);第四類則包含細胞激素 (IFN或GM-CSF)與性激素二羥表雄甾酮 5 (dihydroxyepiandrosterone, DHEA)(F.M. Audibert and L.D. Lise (1993)，/mmwwo/· 14:281-4) 〇在疫苗製造上慣用的佐劑包括：銘化合物[Aluminum compounds，又稱紹膠（aluminum gel)]，其中以氫氧化銘 (aluminum hydroxide， A1(0H)3)與破酸銘（aluminum 10 phosphate，AIPO4)最為常見，此外還有硫酸銘鉀鹽 (potassium aluminum sulfate，KAl(S〇4)2.12H20)等 |呂化合物（D.E.S. Stewart-Tull (1996)，Aluminum adjuvants, /w Vaccine protocols, Robinson，A·，G. H·，and C. N. Wiblin， Farrar Human Press. Totoga，New Jersey，USA. pp. 15 135-139);弗倫氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant， FCA)、弗倫氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant， FIA);油包水型（water-in-oil，W/O)乳劑以及水包油型 (oil_in-water，O/W)乳劑等。刀豆素A (Concanavalin A，Con A)是一種有效的免疫 20 反應刺激物，它可以活化T淋巴球並使其產生增殖與活化，而經活化的Τ淋巴球會分泌IL-2以及其他細胞激素進而啟動相關的免疫反應。李玲玫等人從白鳳豆中萃取出Con A，並在小白鼠接種癌細胞之時或之後給予連續口服Con A，結果有口服Con A的小白鼠身上 -13- 1285647 的癌細胞面積均顯著小於未給予Con A的對照組，因而白鳳豆所含的Con A被推測可活化免疫系統而具有抗癌效果 (李玲玟等人（1995)，中華癌醫學會雜誌，11:27-34)。另外，已知β-葡聚醣（β-glucan)可以和白血球上的受 5 器結合，具有使白血球活化進而調節免疫與防衛能力（丁· Miura, et al. (1997), Biol. Pharm. Bull., 20:1103-1107 ； J. Soltys and M.T. Quinn (1999), Am. Sci. Microbiol., 67:244-252)，可增加巨噬細胞的呑噬作用，以及在感染狀態下也可以抑制炎症早期細胞素的生成而降低疾病造成的死亡 10 率（J. W· Hadden (1993)，/mmwwo/· 14:275-280; Roitt， I. M.? J. Brostoff, and D. K. Male. 1998. Immunology, 5th ed·，Mosby Company，Tavistock Square，London，UK) 〇由於β-葡聚醣可以有效刺激非專一性免疫反應，它已被廣泛使用於佐劑、抗腫瘤、抗感染等方面（Hadden (1993)，如 15 上述；Roitt Wa/· (1998)，如上述；I. Suzuki Wa/. (1990)， Int· J. Immunopharmacol., \2··6Ί5-6^A、。因此，基於佐劑確實具有增強抗原的免疫原性的效用，若一抗原在免疫後所激發的中和抗體效價不夠高，但在攻毒後能產生出高效價的中和抗體，這時即可以考慮使 20 用佐劑來加強該抗原的免疫原性。基於以上所述，提供具有生產時間短、生產成本低廉、無毒性、高安全性以及高免疫保護效力等特點的豬用疫苗以及用以監控PAR的快速檢測工具，俾以解決肉畜市場以及養豬工業上長久以來因PAR所蒙受的重大損失，存 -14- 1285647 在有一迫切需要。【發明内容】發明概要於是，在第一個方面，本發明提供一種針對進行性萎 5 縮性鼻炎（progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用疫苗，其包含有： (a) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素（尸toxin， PMT)蛋白質的2-486胺基酸殘基； 10 (b) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於 PMT蛋白質的486-986胺基酸殘基；以及 (c) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於 PMT蛋白質的986-1281胺基酸殘基。在第二個方面，本發明提供一種能防治至少 15 (progressive atrophic rhinitis, PAR)的動物用多價疫苗，其包含有： (i) 與進行性萎縮性鼻炎有關的抗原組份： (a) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素（PMT)蛋白質的2-486 20 胺基酸殘基； (b) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質的486-986胺基酸殘基；以及 (c) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質的986· 1281胺基酸殘基；以及 -15- I285647 (11)至少一種與其他的動物疾病有關聯的病原性抗原或其抗原決定位。本發明的上述以及其他目的、特徵與優點，在參照以下的洋細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得 5 明顯。【實施方式】發明的詳細說明在臨床上，由PAR病豬鼻腔分離病原時，除了多殺性巴氏桿菌D型菌株以外，常常會分 1〇離到許多A型菌株，而這些A型菌株常造成鑑別上與判定是否亦為PMT產毒株的困擾。在夕救性巴氏桿函A型及D型菌株的傳統鑑別方法中，若單以血清學進行凝集試驗時，在A型及D型菌株之間常會有抗原交叉反應而無法正確區 15別’若是僅利用玻尿酸酵素抑制試驗進行鑑定A型菌株時，雖可觀察到某些程度上的抑制結果但是不易區分。而若進行吖啶黃（acriflavine)凝集試驗來鑑定d型菌株時，又常會因細菌濃度不同或細菌太老等因素而有偽陽性或偽陰性的情形，因此，若只單純應用生化鑑定結果常會導致 20在判讀上的困擾，特別是因操作或判讀人員不同時更常導致不同判定結果。此外，在豬隻鼻道間亦常分離到許多非產母株或其他呼吸道常在細菌，因而增加許多診斷分析上的困擾。因此，申請人於本發明中嘗試利用rflp&Rapd_pcr -16- 1285647 方法來建立多殺性巴氏桿菌Aww/icx/心）A型與 D型菌株的不同基因型別，俾以於未來能利用所建立的分子差異性比對來快速鑑定多殺性巴氏桿菌 mw/ioczWa)的菌株類型。 5 申請人在RFLP實驗結果中發現，當以//Aal對所萃取的多殺性巴氏桿菌mw/ioczWfl)染色體DNA進行 RFLP分析後，可利用所呈現的主要7kb的切割片段來區分 D型與A型菌株。此外，當以DNA探針進雜和反應，更發現所有PMT產毒株經//ΑαΙ作用後在2 kb及9 kb處也會呈現 10 特異性的切割片段，而可藉此來進一步區分產毒株與非產毒株。而在分析PMT基因上的///^1切割位時，發現PMT基因上存有3個的切割位（分別位在2219、2393、4331殘基處），所以PMT基因經切割後應會有174 bp、1938 bp及另一未知長度的片段。申請人另由南方雜合反應結果得 15 知，該未知長度的片段大小為9 kb，因此，申請人推論在 PMT基因的上游約7 kb處應有另一 ///^1切割位，故會形成約9 kb與2 kb的基因反應片段。

為更客觀防止基因組DNA (genomic DNA)常因萃取純度不一而有酵素切割不全的困擾，進而影響到RFLP的呈 20 現與判讀結果，申請人另外於實驗中再應用8-10員的隨機引子（random primers)來進行RAPD篩檢，實驗並利用相同萃取的DNA同時以RFLP進行雙重驗證，俾以更客觀評估D 型與A型菌株的區分比對的準確性。結果發現，若以隨機引子 J-20 (aagcggcctc)(SEQ ID NO:13)來進行 RAPD後，D -17- 1285647 型菌株可於2.8 kb大小處產生一段與A型菌株具明顯鑑別性的擴增產物（amplicon)。綜合以上分子鑑別結果，當從豬隻鼻腔分離出疑似多殺性巴氏桿菌（尸菌落後，可應用此快 5 速又簡便的方法取代傳統鑑別A型及D型的生化試驗，且更可利用J-20隨機引子進行RAPD-PCR來再次確定其血清型別。申請人又嘗試確認，多殺性巴氏桿菌（尸不管是A型或D型菌株，其會是產毒株是否取決 10 有無具有一 PMT毒素基因。於是，申請人針對本身實驗室所分離鑑別出的多株包含多殺性巴氏桿菌 D型及A型的野外分離株以及標準菌株，利用小白鼠致死試驗、天竺鼠皮膚壞死試驗、Vero細胞毒性試驗、PMT毒素蛋白質電泳分析與西方墨點法分析，來進行 15 該等菌株是否會產生毒素以及是否有PMT基因存在的重複交叉比對試驗。結果顯示，在所選擇10株受測菌株中，共有3株菌株 (PMA2、PMD20及PMD21)與傳統測試結果不符合。關於 PMD 20，其在小白鼠接種未直接導致小白鼠死亡，但在 20 天竺鼠皮膚壞死性試驗中所造成的紅腫病變已超出陽性的判定標準，故應予以判定為D型產毒株；但是，若經由 Vero細胞毒性試驗、蛋白質電泳分析、西方墨點法分析、 RFLP及PCR偵測PMT基因的結果，它應被判定為非產毒株。 -18- 1285647 另外，PMA 2及PMD 21原本在小白鼠致死性試驗以及天竺鼠皮膚壞死性試驗中皆無法造成死亡或明顯病變，故以往被歸納為非產毒株，但若以Ver〇細胞毒性試驗、蛋白質電泳分析 '西方墨點法分析、RFLP及PCR偵測pmt基因 5的結果，則應判定為產毒株。由上述結果可知，若單純利用傳統小白鼠致死性試驗以及天竺鼠皮膚壞死性試驗鑑定產毒株，則很可能由於人為操作上的疏失或敏感性不夠等原因，而造成偽陰性或偽陽性的結果。相對地，若利用Ver〇細胞毒性試驗、PMT毒 10素蛋白質電泳分析以及利用PCR來偵測PMT基因，所得結果皆能精確地相互符合，且皆具高專一性。但若以操作簡便及快速診斷而言，則應以利用PCR來直接偵測PMT基因最為實用，此法可於分離到疑似菌落後數小時内即得知初步檢驗結果’並能正確判定該菌株是否具有PMT基因。 15 為更明瞭非產毒株無法製造PMT毒素的原因，除直接不具有毒素基因外，抑或是由於其基因有調控因子在控制其基因的表現，申請人根據petersenm發表的pmt基因 (S.K· Petersen (1990)，如前述）而設計出多組專一性引子 (參見下面實施例1中的表丨），以PCR的方法來進行毒素基 20因的擴增偵測，結果D型與A型產毒株皆可擴增出預期大小的PCR產物，而非產毒株即使降低引子的黏合溫度至4〇 °C ’亦無預期大小的PCR擴增產物生成。為驗證非產毒株是否仍具有部份PMT毒素基因的可能性’申請人又以完整的PMT基因作為模版，再以 -19- 1285647

Hexamers的隨機引子來製造同位素標定的探針，並利用它們來進行南方雜合反應，俾以檢測非產毒株是否具有部分的毒素基因存在。結果發現，僅有產毒株有雜交反應訊號產生，而在Vero細胞中毫無細胞病變的非產毒株則完全無 5 雜合反應。綜合以上結果驗證得知，不論D型與A型產毒株與非產毒株的主要差異應在於PMT基因的有無，且只有多殺性巴氏桿菌mw/ioczWfl)產毒株才具有PMT基因並且會導致PAR的臨床病徵，而D型與A型的非產毒株則完全 10 不具有完整或部分的PMT基因也亦無法產生PMT毒素，此一結果排除了非產毒株是受其他因子的調控，而使PMT基因不能表現進而無法製造出足量的PMT毒素造成病害。此結論不同於Kamps等人所提出者（Kamps，AMIE α/· (1990)，乂 C/M· MzcmMo/·，28:1858-1861)，但與Nagai等人 15 的推論結果較為一致（S. Nagai 以 α/· (1994)，/· C7/«. M/croZn·。/·，32: 1004-l〇i〇) 〇申請人復利用J1J2引子（參見下面實施例1中的表1)，以PCR反應來檢測10株分離自禽類的多殺性巴氏桿菌，結果也同時證實禽類來源的多殺 20 性巴氏桿菌mw/ioc/心)A型菌株皆完全不具有 PMT基因。為進一步探討多殺性巴氏桿菌（尸 D型與A型產毒株的PMT基因的同源相似性，申請人再選取D型及A型產毒株各三株，以PCR產物進行自動定序分 -20- 1285647

析，並利用已發表的D型PMT基因序列進行比對分析。結果發現，在被定序出的4206核苷酸殘基（由114到43 19核苷酸殘基）中，在台灣本土所分離的D型及Α型產毒株的ΡΜΤ 基因序列100%完全相同，且與Laxs等人（AJ Lax W «/· 5 (1990)，乂 Gd 136: 81-87)以及 Buys 等人（WE

Buys α/· (1990)，TVwc/e/c dc/A 18:2815- 2816)在國外不同區域所分離的菌株的PMT基因序列也完全相同。再經與八丁(：(：標準產毒株（1^丁(：12178)的？]^丁基因序列（8£(^ ID NO: 1)比較後發現也僅有一個胺基酸殘基的改變。由此 10 可知，PMT基因是一個十分安定的基因，且不論是分離自台灣本土或其他國家，多殺性巴氏桿菌 D型或A型產毒株的PMT基因序列幾乎完全相同，顯示沒有任何重組或基因變異的情形發生。由此推斷，實驗上所合成的對PMT基因具專一性的各 15 組引子，若被應用在PCR以供檢測PMT基因的專一性 (specificity)及再現性（reproducibility)上，應無分離株血清型別及地域差異性的疑慮。 PMT的分泌量非常微量，約只佔多殺性巴氏桿菌 mw/Mc/t/β)的總細菌蛋白質的1 %，故傳統疫苗 20 需培養極大量的細菌才能萃取足夠濃度的PMT以製成具保護效力的類毒素疫苗。目前對於PAR的防治雖已有商品化疫苗上市，但大多由國外進口，且對PAR的防治只有基本的保護效果，更因價格高昂而仍無法普及使用。於是，本發明提供一種針對進行性萎縮性鼻炎 -21 - 1285647 (progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用疫苗，其包含有： (a) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素mw/hc/c/a toxin， 5 PMT)蛋白質的2-486胺基酸殘基； (b) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於 PMT蛋白質的486_986胺基酸殘基；以及 (c) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於 PMT蛋白質的986_1281胺基酸殘基。 0 在一較佳具體例中，該動物用疫苗是供用於防治豬隻的進行性萎縮性鼻炎。在一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌A型分離株的PMT蛋白質。 5 在另一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株的PMT蛋白質。在一更佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株PMD 48 的PMT蛋白質。 3 在一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是合成產物，它們可根據PMT的已知胺基酸序列 (例如，序列表中的SEQ ID ν〇:2所示者）而藉由，例如胺基酸序列合成儀，來予以分別地生成。在另一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的三 -22- 1285647 種多肽組份是重組型產物。在一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的多肽組份（a)係為一第一DNA片段所編碼，該第一 DNA片段具有一核苷酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為模 5 版（template)並以下面前向引子（forward primer) A1與反向引子（reverse primer) B2來進行PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶與//7«ί/ΙΙΙ切割後所形成的一個1456 bp 片段所具有的核苷酸序列：前向引子 10 A1 : 5f-asaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3f (SEQ ID N0:3) 反向引子 B2 : 5T-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3T (SEQ ID NO: 10) ° 在一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿菌A型分離株的PMT編碼基因。 15 在另一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿菌D型分離株的PMT編碼基因。在一更佳具體例中，該 PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。在另一更佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿菌D型分離株PMD 48的PMT編碼基因（參見圖9)。

20 在一較佳具體例中，編碼該多肽組份（a)的該第一DNA 片段被插入於一載體内而形成一第一重組型載體。在一更佳具體例中，該第一重組型載體是重組型載體Toxl。在一較佳具體例中，該第一重組型載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份（a)的經轉形的大 -23- 1285647 腸桿菌細胞。在一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的該多肽組份（b)係為一第二DNA片段所編碼，該第二dna片段具有一核苷酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為 5模版並以如上所述的前向引子八丨與反向引子b2來進行 PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶历win切割後所形成的一個1502 bp 片段所具有的核苔酸序列。在一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿 10菌A型分離株的PMT編碼基因。在另一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿菌D型分離株的pmt編碼基因。在一更佳具體例中，該 PMT編碼基因具有序列表中的SEQ m N〇:1所示的核苷酸序列。在另一更佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴 15氏桿菌D型分離株PMD 48的PMT編碼基因（參見圖9)。在一較佳具體例中’編碼該多肽組份（b)的該第二 DNA片段被插入於一載體内而形成一第二重組型載體。在一更佳具體例中，該第二重組型載體是重組型載體τοχ2。在一較佳具體例中，該第二重組型載體被轉形至大腸 20桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份（b)的經轉形的大腸桿菌細胞。在一較佳具體例中，該動物用疫苗當中所包含的該多肽組份（c)係為一第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核苷酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為 •24- 1285647 模版並以上所述的前向引子A1與反向引子B2來進行pcR 後所彳于到的PCR擴增產物以限制酶所Mm與鳩η切割後所形成的一個8 83 bp历片段所具有的核苗酸序列。 5 在一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏桿菌A型分離株的pmt編碼基因。在另一較佳具體例中，該PMT編碼基因是多殺性巴氏才干菌D型分離株的pMT編碼基因。在一更佳具體例中，該 PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID Ν0··1所示的核苷酸 10序列。在另一更佳具體例中，該ΡΜΤ編碼基因是多殺性巴氏桿菌D型分離株Pmd 48的ΡΜΤ編碼基因（參見圖9)。在一較佳具體例中，編碼該多肽組份（()）的該第三dna 片段被插入於一載體内而形成一第二重組型載體。在一更佳具體例中，該第二重組型載體是重組型載體τ〇χ7。 15 在一較佳具體例中，該第三重組型載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份（c)的經轉形的大腸桿菌細胞。在一較佳具體例中，該動物用疫苗進一步包含有下列的至少一者：PMT類毒素、A型多殺性巴氏桿菌細胞、D 20型多殺性巴氏桿菌細胞以及支氣管敗血博德氏菌細胞。在一較佳具體例中，該動物用疫苗進一步包含有一選自於下列群組中的佐劑：弗倫氏完全佐劑、弗倫氏不完全佐劑、鋁膠、油質佐劑（w/〇/w型）、油包水型（W/〇)乳劑、水包油型（〇/W)乳劑、刀豆素A (Con Α)、β-葡聚醣，以及 -25- 1285647 此等的一個組合。除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所顯示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列（complementary sequences) 以及守恒性類似物（conservative analogs)，例如具有簡併 5 性密碼子取代（degenerative codon substitutions)的同源性序列（homologous sequences)。特別地，簡併性密碼子取代可以經由，例如，在一核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換以其他的核苷酸殘基而被產生。如本文中所用的，“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”等術語 10 可被相互交換使用，且意指一種由胺基酸殘基所構成的聚合物，其中一或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸 (naturally occurring amino acids)或人造化學仿效物。如本文中所用的，“細胞”、“宿主細胞（host cell)”、“轉形宿主細胞（transformed host cell)”與“重組型宿主細胞 15 (recombinant host cell)”等術語可被互換使用，而且不僅指特定的個體細胞（individual cells)還包括繼代培養的子代 (sub-cultured offsprings)或可能的子代（potential offsprings)。子代細胞可能在後續世代中因為突變作用或環境影響而發生特定的遺傳修飾（genetic modification)， 20 而致使子代細胞事實上可能與母細胞並不相一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範_内。適用於進行DNA重組技術的宿主細胞的適當培養基以及培養條件，在生物技術領域中已被詳知。例如，可將宿主細胞培養在本技藝中所慣用的發酵生物反應器、搖動 -26- 1285647 燒瓶、試管、微滴盤與平淺培養皿中，且該培養可在適合於重組型宿主細胞生長的溫度、pH值及氧含量下進行。如本文中所用的，“重組型載體”此術語意指任一種重組型表現系統’其可在任一勝任的宿主細胞（competent 5 host cell)内構成地（constitutively)或誘導地（inducibly)表現依據本發明的該第一 DNA片段、該第二DNA片段或該第三DNA片段。該重組型載體可為一線性或環形表現系統，且涵蓋保持游離基因形式或是被整合至宿主細胞的基因組内的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我 10 複製的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。根據本發明，術語“轉形（transformation)”可與術語“轉染（transfection)”交替地使用，並且泛指將一核酸分子被引進一選定的宿主細胞内的方式。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子（例如，一重組型DNA建構物或一重組型 15 載體）可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞内，例如填酸妈或氣化#5媒介的轉染作用（transfection)、電穿孑L 法（electroporation)、微注射法（microinjection)、粒子撞擊法（particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用 (liposome- mediated transfection)、利用細菌嗤菌體的轉染 20 作用或其他方法。另外，現今有關動物疫苗的製造，相關研究人員亦有嘗試開發能有效防治至少一種標的疾病的多價疫苗。以豬隻常見的疾病而言，除了進行性萎縮性鼻炎（PAR)以外，尚有假性狂犬病、豬口蹄疫（porcine foot-and-mouth -27- 1285647 disease)等筹：。於是’申請人於本發明中亦提供一種能防治至少 (progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用多價疫苗，其包含有： 5 (i)與進行性萎縮性鼻炎有關的抗原組份： U) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素 mw/Md如toxin，PMT)蛋白質的2-486胺基酸殘基； 10 (b) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質的486_986胺基酸殘基；以及 (0 —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質的986· 1281胺基酸殘基；以及 (ii)至少一種與其他的動物疾病有關聯的病原性抗原 15 或其抗原決定位。在一較佳具體例中，該動物用多價疫苗所包含的組份 (i)(a)、（i)(b)與（i)(c)的特徵是如前面就多肽組份（a)、（b) 與（c)所描述的。在一較佳具體例中，該動物用多價疫苗所包含的組份 20 (ii)是去活化的假性狂犬病gE缺損病毒（inactivated pseudorabies gE defective virus)，以供防治假性狂犬病。本發明將就下面實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實驗例僅為例示說明而已，而不應被解釋為本發明的實施的限制。 -28- 1285647 實施例1· A型舆D型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)的分子級鑑定以及PMT編碼基因的核苷酸序列比對 I、材料舆方法： 5 A、菌株來源：申請人以台灣中部的台中市、台中縣、彰化縣與南投縣這四個縣市的監控豬場内所淘汰的保育豬隻為對象，進行豬萎縮性鼻炎疫情調查、採樣與病理學檢查，在經生化鑑定為.多殺性巴氏桿菌的分離株中，利用Vero細胞的CPE 10 效應試驗而選取出D型產毒株（PMD14、PMD 21、PMD 48)、D型非產毒株（PMD 20、PMD 27)、A型產毒株（PMA2、 PMA 10、PMA 23)以及 A型非產毒株（PMA 33、PMA 59) 共10個分離株，並另外採用標準參考菌株（D型產毒株 NCTC 12178係購自食品工業發展研究所菌種中心，而A型 15 非產毒株ATCC 12945以及D型非產毒株ATCC 7707是購自於美國菌種保存中心）來進行多殺性巴氏桿菌的分子鑑別。 B、PMT蛋白質的製備：將試驗菌株以lxl〇7菌落數培養於含7%脫纖維綿羊血 20 的血液培養基上，於37°C培養24小時後，加入2 mL PBS (pH 7.2)以將細菌刮洗下來。另一方式是，於37°C下將細菌培養於HI肉湯培養基内歷時26小時，之後以離心來收集菌塊，並以十分之一培養體積的PBS (pH 7.2)予以懸浮。以超音波（Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，輸出 -29- 1285647 功率20%，作用30分鐘）將細菌擊碎後，以10,000xg進行高速離心歷時30分鐘。取上清液，以孔徑為0.45 μηι及0·22 μηι 的過濾膜來過濾，而經兩次過濾的過濾液即為粗製的多殺性巴氏桿菌毒素（crude ΡΜΤ)。以 Bio-Rad protein assay來 5 測定蛋白質濃度，並分裝保存於-20°C冰箱内備用。 C、天竺鼠皮膚試驗及小鼠致死試驗（MLT): 取體重約400 g成熟的天竺鼠，並參考de Jong等人的方法（de Jong MF， Oei HL， Terenburg JG. AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocida isolates. 10 IPVS 6th Congress，211，1980)來進行天竺鼠皮膚試驗。先將天竺鼠背部兩側的毛剔除，再取0.2 mL的上述製備的粗製PMT來進行皮内注射，於注射後48小時觀察皮膚病變的大小及程度，病變區域的直徑大於1公分者判定為陽性。關於BALB/c小鼠致死性試驗，取0.5 mL的上述製備的 15 粗製PMT來進行腹腔注射，每組6隻，於注射後10天死亡數多於3隻者即判定為陽性。 D、 PMT蛋白質對於非洲綠猿腎臟細胞株(Vero cell)的細胞病變效應（CPE)舆最小毒性劑量（minimum toxin dose; MTD)的測定： 20 Vero細胞的CPE測定方法主要是參考de Jong等人的方法（de Jong MF， Oei HL， Terenburg JG. AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocida isolates. IPVS 6th Congress，211，1980)並稍做修改後進行。先將 Vero細胞濃度調成2x105細胞/mL，以每井100 μί的數量予 -30- 1285647 以加入至96井組織培養盤中，並於被設定為37°C且含有 5% C02的培養箱中進行培養24〜48小時，待有細胞單層 (monolayer of cells)形成後，移除培養液並予以加入以不含胎牛血清的杜貝可氏改良的依格氏培養基（Dulbecco 5 modified Eagle medium，DMEM)，繼而將經2倍連續稀釋的上述製備的粗製PMT分別以100 pL的數量置入各井内，每個稀釋倍數的粗製PMT各進行四個重複試驗，並以只含2% 胎牛血清的DMEM作為對照組。培養細胞歷時5天並於每曰觀察細胞的形態變化，將最高稀釋倍數但仍可造成所有 10 四井細胞皆呈現病變的毒素濃度定為最小毒性劑量 (minimal toxicity dose, MTD) 〇 E、PMT蛋白質的SDS-PAGE分析以及西方墨點分析 (Western blotting)：製備10%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠（polyacrylamide 15 gel)，將1 mg/mL的上述製備的粗製PMT加入等體積的2X 樣品緩衝液（sample buffer)，所形成的混合物在煮沸歷時5 分鐘後被裝填至備妥的凝膠上，在以80伏特進行電泳後，膠片以固定液（45%曱醇、10%乙酸、45%去離子水）予以固定歷時10分鐘，繼而以含0.1%孔瑪西亮藍R-250 20 (Coomassie brilliant blue R-250)的染色液進行染色。另外進行相同的凝膠電泳處理但不予染色，所得到的電泳膠片利用轉潰半乾式電泳槽（TRANS-BLOT SD， semi-dry transfer cell ; Bio-Rad)，以 120 mA予以轉印到石肖基纖維素膜（nitrocellulose membrane, NC membrane)上。 -31 - 1285647 以5%脫脂乳（skimmed milk)進行封阻處理（blocking)歷時 30分鐘後，加入抗-PMT單株抗體1B2A3 (得自ATCC)，並於室溫下作用1小時，繼而以PBST (0.5% Tween 20 in PBS) 清洗，再加入結合有驗性填酸酶的二次抗體（secondary 5 antibody conjugated with alkaline phosphatase) 5 最後力口入受質（NBT/BCIP，Tris緩衝液）來進行呈色反應。 F、染色醴DNA的萃取及濃度測定：此實驗是參照 Short protocols in molecular biology II 的方法（Moore DD· Preparation and analysis of DNA. In: 10 Ausubel FM，Brent R，Kingston RE, Moore DD，Seidman JG， Smith JA, Struhl K，ed. Short protocols in molecular biology II. John Wiley & Sons, New York, 2.10-2.11, 1992) 來進行。將各實驗菌株培養於5 mL BHI肉湯培養基（BHI broth) 15 中，於37°C下培養歷時14〜18小時後，於4°C下以5,000xg 進行離心歷時5分鐘。在去除上清液後，予以加入1〇〇 μί ΤΕ緩衝液（Tris 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)以及 10 μΐ^溶菌酶（lysozyme)(200 mg/mL)，令混合物混合均勻並於37°C 下作用30分鐘，然後加入315 μί TEN (Tris 10 mM; EDTA 1 20 mM，pH 8.0; NaCl 100 mM)、50 pL 10% SDS、25 μΧ RNase A (10 mg/mL)並於56°C下作用歷時1小時，之後再加入5 μι 蛋白酶K (proteinase K)(10 mg/mL)並於56°C下作用歷時2 小時，然後以酌7氯仿（phenol/chloroform)以及氣仿進行萃取，以含0.3 Μ醋酸鈉的絕對酒精來沈澱DNA，以100 μΐ^ -32- 1285647 滅菌水來溶解被沈澱的DNA，並以吸光值A26G/28q來測定 DNA的濃度與純度。 G、限制片段長度多型性分析（Restriction fragment length polymorphism, RFLP): 5 取各為10 pg的DNA樣品，分別加入不同的限制酶 (5amHI、、/ίϊΜΙΙΙ、C7al及77/^1)並於37°C 下作用歷時4小時。以1%瓊脂糖凝膠（agarose gel)進行電泳，經溴化乙錠（ethidium bromide)染色後，置於波長312 nm的紫外光顯像器（VILBER LOURMAT)上觀察並照相。 10 Η、PMT編碼基因的聚合晦連鎖反應（Polymerase Chain Reaction; PCR):

Petersen所發表的多殺性巴氏桿菌（尺所 NCTC 12178分離株的PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID ΝΟ··1所示的核苷酸序列（參見Petersen SK. Mol 15 4: 821-830，1990 ; NCBI accesson no. X51512)。在此實驗中，根據該核苷酸序列設計出如表l中所示的引子來進行聚合酶連鎖反應，反應條件如下：在1〇〇反應溶液中含有模版DNA 0.2 pg、2 U Γ叫聚合酶、IX反應緩衝液、2_5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs以及20 pmole弓| 子， 20 將反應溶液置入聚合酶素連鎖反應器（Omnigene Temperature Cycler; Hybaid)中，反應條件設定為 95 C 40 秒、55°C 30秒、72°C 1分鐘，進行30次循環；在反應結束後，以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳膠片以溴化乙錠染色觀察並照相分析。 -33- 25 1285647 表1.被設計用來進行PMT編碼基因的PCR擴增反應的引子引子核苷酸序列（5’—3·) 對應於PMT編碼基因内的核苷酸殘基位置前向 A1 agaggttatesatcceaaaacaaaacatttt (SEQ ID NO:3) 206-236 A2 atagtagaagaagaattaca (SEQ ID NO:4) 1689-1708 A3 ctaacatagaggccatggatatgaaaacaaaaca (SEQ ID NO:5) 199-232 A4 acttcgtacagccatgaatgaaatggctggaaaa (SEQ ID NO:6) 2300-2333 J1 actcaattagaaaaagcgct (SEQ ID NO:7) 2202-2221 反向 J2 ctactacagttgctggtatt (SEQ ID NO:8) 3429-3410 B1 attgttaagacgtaccagacga (SEQ ID NO:9) 1787-1766 B2 ctcttgttaaectascctttetgaaaagaggag (SEQ ID NO: 1 0) 4068-4036 B3 ttcttcccttaaatcttcag (SEQ ID NO:ll) 3638-3619 B4 tcactggtttttccagccatttcattcatggc (SEQ ID NO:12) 2341-2310 I、南方雜合反應（Southern hybridization): 雜合反應用的探針是以PCR合成完整的PMT編碼基因開放閱讀架構（ORF，213 bp-4076 bp)的片段作為模版， 5 利用Hexamers的隨機引子（random primers)以及Klenow片段（Klenow fragment)來進行32P_DNA探針的合成。雜合反應簡述如下：將以限制酶切割的DNA電泳後，膠片先以0.5 N NaCl及0.5 N Tris_HCl各處理15分鐘，再以轉潰緩衝液 (blotting buffer，10X SSC)將 DNA 轉潰至 NC 膜上，並以紫 10 外線進行交叉連結反應後陰乾。在NC膜經前雜合處理 (pre-hybridization treatment)後予以加入32P-DNA探針，並於42°C下進行雜合反應至隔夜，之後以水清洗多次，再以 X光底片壓片顯影。 J、隨機擴增的多型性DNA分析（Random Amplified 15 Polymorphic DNA, RAPD)：利用OPERON公司合成的10員引子（10-mer primers) 來進行聚合酶連鎖反應，操作方式如上述G項中所述，但 -34- 1285647 是將引子改用一隨機引子10 pmol、反應總體積改為50 μΕ 以及將反應條件改為在95°C 40秒、42°C 30秒、72°C 1 分鐘的狀態下進行30次循環。 K、PMT基因自動化定序分析（Automatic sequencing): 5 定序用DNA模版的製作：選取D型產毒株及A型產毒株各3株（PMA 2、PMA 10、PMA 23、PMD 14、PMD 21、 PMD 48)來進行PMT編碼基因定序。以所設計的引子來進行PCR反應以製備定序分析用的DNA模版。PCR反應條件如前述，惟獨反應條件改為進行25次循環。被收集的PCR 10 產物以PEG-8,000進行DNA沉澱，以100 μί滅菌水來溶解被沈澱的DNA，並以吸光值Α26〇測定DNA的濃度。定序PCR反應及自動化定序分析是依照ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit {PERKIN 的操作手冊來進行實驗。取5X定序緩衝液 15 (sequencing buffer) 160 pL、dNTP mix 40 pL、各20 μΐ^的 dNTP染料終止劑（dye terminator)(A—綠色、T--紅色、C--藍色、G—黑色）、AmpliTaq DNA聚合酶以及F.S 40 μι來混合配製成反應預混物（reaction premix)。取模版DNA (經純化的PCR產物）90 ng、適當的定序用引子（參見表1) 10 20 pmole以及8 pL反應預混物，最後加入滅菌水至總體積為 20 pL。以 GeneAmp PCR System 9600 DNA Thermal Cycler (Applied Biosystems Prims)來進行 PCR 反應，於 96°C 10 秒、50°C 5秒、60°C 4分鐘的情況下進行25次循環。反應結束後立刻將所形成的產物置於冰上，並予以加入2 pL 3 -35- 1285647 M CH3COONa及50 μΐ^ 95°/❶酒精，靜置於冰上歷時10分鐘以沉澱DNA，再於室溫下以13,500 rpm來離心歷時15分鐘，將酒精吸乾淨，再用70%酒精及95%酒精各潤溼一次，最後於室溫中倒置待酒精蒸乾。以pL EDTA/甲醯胺 5 (formamide)來溶解沉澱丸（pellet)，於90°C加熱2分鐘後置於冰上備用。配製4% TBE-聚丙烯醯胺凝膠，並裝填以定序用的反應產物，在2,500 V、40 mA、40 W下進行電泳，使用自動化定序儀（automatic sequencer，Applied Biosystems 373 DNA sequencer，STRETCH)，並以镭射感 10 應器掃8¾，以及藉由ABI PRISM Factuare software來進行資料分析，而得到自動記錄的原始數據（raw data)，再將原始數據輸入Mac Vector software以進行分析比對。 Π、結果： A、Vero細胞的CPE試験、天竺鼠皮膚壞死性試驗以及小 15 鼠致死試驗的比較

各試驗菌株對Vero細胞的最小毒性劑量（MTD)被顯示於表2，其中 ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27 及PMA33即使加入1 mg/mL的粗製PMT，亦無法造成結節樣的 CPE，因在匕判定 NCTC 12178、PMD 48、PMD 21、PMA 20 2、PMA 10 及 PMA 59為產毒株，而 ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33為非產毒株。 -36- 1285647 表2. A型與D型多殺性巴氏桿菌的產毒株與非產毒株之間的小鼠致死試驗（MLT)、天竺鼠皮膚壞死性試驗、Vero 細胞MTD試驗以及用於PMT編碼基因的檢測的西方墨點分析與PCR結果的比較多殺性巴氏桿菌分離株 jk清型小鼠致死試驗 (MLT) 天竺鼠皮膚壞死性試驗 (48小時） Vero細胞 MTD (ng) SDS-PAGE 與西方墨點分析以PCR檢測 PMT編碼基因的結果 NCTC 12178 D + ND 186 + + ATCC 7707 D — ND — - - ATCC 12945 A - ND — - — PMD 21 D 一 — 189 + + PMD 48 D + + ; Η 140 + + PMD 20 D — + ; Η — — — PMD 27 D — — — — — PMA 2 A — — 182 + + PMA 10 A + + ; Η 182 + + PMA 33 A — — — — — PMA 59 A — — — 一 — 5 “ +，，：陽性反應；“一，，：陰性反應；“ND” ：未測定；“H” ：出血（hemorrhage)。比較Vero細胞的CPE試驗、天竺鼠皮膚壞死性試驗以及小鼠致死試驗的結果，發現PMD 20、PMA 2及PMD 21 的檢驗結果不一致：PMA2及PMD 21依小鼠致死性試驗及天竺鼠皮膚壞死性試驗結果應判定為非產毒株，而依Vero 10 細胞的CPE試驗則判定為產毒株；另外，PMD 20原本判定為產毒株，而依Vero細胞的CPE試驗則判定為非產毒株。 B、蛋白質電泳及西方墨點分析：參見圖 1，NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD 21 及PMD 48在146 kDa處可看見有明顯的蛋白質帶，而ATCC 15 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33 等菌株在 146 kDa 處並無蛋白質帶，此結果與Vero細胞的CPE試驗的結果相符合。濃縮粗製PMT的蛋白質電泳結果亦相同。另外，以抗-PMT單株抗體1B2A3進行西方雜合反應，結果發現 NCTC 12178、PMD 48、PMD 21、PMA 2及PMA 10在 146 -37- 1285647 kDa處的蛋白質帶可明顯地被單株抗體1B2A3所辨識，而 ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33 等在 146 kDa 處並未出現可被單株抗體1B2 A3所辨識的蛋白質帶（圖2)。 C、染色《DNA酵素切割圖譜分析： 5 選用 5amHI、五aRI、历·πί/ΙΙΙ、C7al及///^1等限制酵素來進行染色體DNA酵素切割圖譜（圖3)比較時發現，以使用//ΑβΙ進行切割後的電泳圖譜具較佳區分性。在i/Aal 切割後的電泳圖上可見約於5 kb以下的酵素切割片段大致相同，而在6 kb以上即可看到具鑑別性的片段，其中D 10 型多殺性巴氏桿菌（NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)於7 kb處較A型的菌株（ATCC 12945、PMA 2、PMA 10 及PMA 33)多了一條酵素切割片段；此外，D型及A型的產毒株（NCTC 12178、PMD 48、PMA 2及PMA 10)則於9 kb 處較非產毒株（ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA33) 15 多了一條酵素切割片段。而在使用心mHI等其他限制酵素進行切割時，於電泳圖上則無法看到可明顯具鑑別性的酵素切割片段。因此，使用//ΑαΙ進行多殺性巴氏桿菌的染色體DNA酵素切割後的電泳圖譜可作為區別Α型與D型及產毒株與非產毒株的依據。 20 D、南方雜合反應：將以ifAal進行染色體DNA切割進行電泳後，轉潰到硝基纖維素膜（NC membrane)上，核酸探針的製作是以標準產毒株NCTC 12178的A3B2 PCR產物[包含整段PMT基因的開放閱讀架構（open reading frame)]為模版，以32p標定 -38- 1285647

後製作成32P_DNA探針（probe)，於42°c下進行雜合反應。結果顯示D型及A型的產毒株（NCTC 12178、PMA2、PMA 10、PMD 48)皆有二個明顯的雜合反應帶分別位於2 kb及9 kb處，而非產毒株（ATcc 12945、PMD 20、PMD 27、PMA 5 33)則無任何的雜交反應（圖4)，這顯示只有產毒株才具有 PMT基因。 E、PMT基因的聚合酵素連鎖反應（PCR): 根據Petersen發表的多殺性巴氏桿菌（NCTC 12178) PMT編碼基因核苷酸序列（S.K. Petersen (1990)，如前述） 10 而合成的10個引子（表1)分別配對成A1B1、A1B4、A4B2、 A2B3、A3B1、A3B2、J1J2 等 7組來進行 PCR，其中 A1B1 的PCR產物為1587個驗基對（base pairs)、A1B4為2135個驗基對、八462為1768個鹼基對、八283為1949個鹼基對、人361 為1588個鹼基對、A3B2為3869個鹼基對（包含整段PMT基 15 因的開放閱讀架構）、J1J2為1227個鹼基對（圖5、圖7)，如下面表3所示：表3· PMT的PCR產物大小 PCR引子對 PCR 產物(bp) A1B1 1587 A1B4 2135 A4B2 1768 A2B3 1949 A3B1 1588 ' A3B2 3869 J1 J2 1227 結果發現，產毒株NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、 -39- 1285647 PMD 21及PMD 48在各組均有預期大小的PCR擴增產物被生成，而与t產毒株（ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、 PMD 27和PMA 33)即使在引子的黏合溫度被降低至42°G 下，亦無預期大小的PCR擴增產物被生成（圖6)。 5 F、隨機擴增的多型性DNA (Random Amplified

Polymorphic DNA, RAPD)：在利用隨機引子PCR來區分D型多殺性巴氏桿菌 (NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)以及 A型多殺性巴氏桿菌（ATCC 12945、PMA 2、PMA 10 及 PMA 33)時， 10 在篩選過大約200個隨機引子後發現，以J-20 (aagcggcctc)(SEQIDNO:13)來進行RAPD-PCR時，各菌株大約在1 kb、2 kb以及2.5 kb處均有近似大小的擴增產物，但是於2_8 kb附近，D型菌株可產生一條與A型菌株具鑑別性的PCR擴增產物電泳帶（圖8)。 15 G、自動化定序分析：將台灣境内分離的D型產毒株及A型產毒株各3株的 PMT編碼基因直接以PCR產物進行自動化定序，結果PMA (多殺性巴氏桿菌A型）共定出4214個核苷苷酸序列（由核苷酸殘基106到4319，圖9)，而PMD(多殺性巴氏桿菌D型） 20 共定出4206個核苷酸序列（由核苷酸殘基114到4319,圖9)。就所定出的核苷酸序列，經由網路搜尋並與Genbank 中Petersen所發表的多殺性巴氏桿菌（NCTC 12178)的PMT 編碼基因核苷酸序列相比較，結果台灣本土所分離出的D 型產毒株及A型產毒株與NCTC 12178的PMT編碼基因的 40- 1285647 核苷酸序列大致相同，只有在核苷酸殘基1128-1129處有不同（由eg改變為gc)，而胺基酸殘基由精胺酸（Arginine) 改變為丙胺酸（Alanine)，而且PMA 10在核苷酸殘基108處 [在起始密碼子（start coden)前的第111個核苷酸殘基]尚多 5 了一個胞嘴唆（cytosine)。在分析PMT基因上的//Afll切割位時，發現PMT基因上有3個的切割位（分別位在2219、2393、433 1 核苷酸殘基處），所以PMT基因經切割後應會出現有174 bp、193 8 bp (2 kb處的雜合反應帶）及另一未知長度的 10片段，而由多殺性巴氏桿菌分離株的染色體DNA的南方雜合反應結果得知該未知長度的片段大小為9 kb。由此推論在PMT基因的上游約7 kb處應該還有另一個 //ΛαΙ切割位，故會形成約9 kb與2 kb的基因反應片段，這與實驗結果相符。 15 於本實施例中，申請人嘗試利用RFLP及RAPD-PCR方法來建立A與D型多殺性巴氏桿菌的不同基因型別的分子級差異性比對，俾供用於未來快速診斷鑑定多殺性巴氏桿菌分離株。而在RFLP實驗結果中發現，當以對所萃取的多殺性巴氏桿菌染色體DNA進行RFLP分析後，可利 2〇用所呈現的主要7kb的切割片段來區分D型與A型菌株，並可利用所呈現的主要9kb的切割片段來區分產毒株與非產毒株。此外’當以DNA探針進雜和反應，更發現所有pmt 產毒株經尺/^1作用後在2 kb及9 kb處也會呈現專一性的切割片段，亦可進一步正確區分產毒株與非產毒株。 -41 - 1285647 為更客觀防止基因組DNA (genomic DNA)常因萃取純度不一而有酵素切割不全的困擾，進而影響到rFLp的呈現與判讀結果，於實驗中再應用8_10員的隨機引子來進行 RAPD篩檢，並且相同的DNA萃取物同時以rflP進行雙重 5 驗證’此目的旨在能更客觀地評估區分D型與A型菌株比對的準確性。結果發現，若以隨機引子j_2〇 (aageggeete) (SEQ ID NO:13)進行RAPD後，D型菌株可於2.8kb大小處產生一段與A型菌株具明顯鑑別性的擴增產物（ampHc〇n)。綜合以上分子鑑別結果，當從豬隻鼻腔分離出疑似多 10殺性巴氏桿菌菌落後，可應用此快速又簡便的方法取代傳統鑑別A型及D型的生化試驗，且更可利用j_2〇隨機引子來進行RAPD-PCR以再次確定其血清型別。此外，一旦再配合PMT編碼基因的專一性引子（諸如η J2等）來進行偵測毒素基因的PCR反應後，將可同時在極短時間内快速鑑別分 15離菌株的血清型以及是否為PMT的產毒株。而日後若再配合抗-PMT單株抗體即可以進一步開發出eusa檢測方式，而將可大幅提高診斷精確性與縮短診斷所需的時間，亦可做為未來研究多殺性巴氏桿菌上的準確分析方法。從以上結果亦歸納出：在能導致…⑺細胞產生特異性 2〇細胞病變的分離株中，不論A型或D型的分離株皆具有完整的PMT基因，但不會造成細胞病變的菌株則不具有ρΜτ 基因，也不會導致實驗BALB/C小鼠死亡及褚隻的臨床病徵。而A型及D型PMT的基因序列的比較進一步顯示出台灣本土的這兩種血清型的產毒株所具1>]^丁核酸序列完全 -42- 1285647 相同，而當與Genbank登錄的D型PMT基因相比較也僅出現一個胺基酸的差異，這顯示ΡΜΤ編碼基因是一穩定而不易變異的毒素基因，而於分析過程中所萃取的這兩型ΡΜΤ毒素在細胞與動物實驗上的性狀也相當一致，而且在測試方 5 法上以Vero細胞毒素測定最為敏感，而可做為判定豬隻中和抗體效價的依據。因PMT為單一毒素的細胞作用機制且pmt編碼基因的同源性咼’在目前的PAR防治上，養諸業者可經由以pmt 的類毒素蛋白來進行免疫而在豬隻體内激發具良好保護 10性的中和抗體的生成，並可藉由母豬移行抗體而保護小豬在出生2-4週間的易感染期。但實際上，因pmt在自然多殺性巴氏桿菌菌體内的產量極低，例如在液態培養液中 PMT約僅佔多殺性巴氏桿菌本身所產生的總蛋白質數量的0.05-0.1%，實不敷成本以製造有效的高濃度類毒素蛋白 15質來供疫苗的製造使用。因此，若能選殖PMT基因並進行大量表現後，將可作為日後研究PMT的致病機轉與進行次單位疫苗防治上的應用。於下面實施例中，本發明使用所鑑定出的D型多殺性巴氏桿菌分離株PMD-48來進行編碼PMT次單位的£^八選 20 殖株的建立以及各項試驗與檢測。實施例2·編碼PMT次單位的DNA選殖株的建立 A、PMT編碼基因的選殖： pmt編碼基因的pcr反應：依照實施例1中的I、材料與方法中的F項、染色體 -43- 1285647 DNA的萃取及濃度測定，而從D型多殺性巴氏桿菌PMD-48 菌株培養物中得到DNA總萃取物，並以吸光值A26〇/28〇測定 DNA的濃度與純度。在進行PMT編碼基因的選殖時，以上述所得的DNA總 5 萃取物作為模版，並使用一組示於表1中的引子對A1B2來進行PCR: 前向引子 A1 : 5,-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3T (SEQ ID N0:3)

BamHl 10 反向引子 B2 ·· 5f-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3f (SEQ ID NO:10)

Nhel 由於PMT編碼基因序列内不具與TVT^I限制酵素切割位，在設計前向引子A1 (對應於Mxd的核苷酸殘基 I5 206〜236)與反向引子Β2 (對應於的核苷酸殘基 4068〜4036)時，乃分別引入與#心1的限制酵素切割位，即為以底線標示的部分。利用A1B2引子對可得到一長度約為3.8 kb的PCR擴增產物。 PMT編碼基因的PCR反應條件如下：在100 μί反應溶 20 液中，以取自上述所萃取得到的DNA做為模版（0.2 pg)，其中加入以2 U Taq聚合酶、1倍反應緩衝液、2.5 mM MgCl2、0.25 mM dNTPs以及各20 pmoles的引子（A1B2)。反應溶液被置入於聚合酶連鎖反應器（Omnigene

Temperature Cycler; Hybaid)中，反應條件設定為：95°C， 25 40秒；55°C，30秒；以及72°C，1分鐘，並作30次循環。 -44- 1285647 PCR反應產物的回收：取上述PCR擴增產物10 μΐ^並加入2 μί DNA染劑予以混合均勻後，再使用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳後將兩側含標記的凝膠切下，先經溴化乙錠（0.5 pg/ml)染色10 5 秒鐘，再予以水洗脫色歷時5分鐘。之後，將未染色的膠片與已呈色的標記（marker)共置於紫外線照明箱上對齊，利用刀片將分子量對應於3.8 kb的PCR擴增產物切下，並置於乾淨的微量離心管中以回收瓊脂糖凝膠中的DNA片段。首先將膠片稱重，以1 g當作1 mL的方式加入3倍體積 10 的QG溶液，再加入1倍體積的異丙醇（isopropanol);將此溶液加入QIAquick spin column (QIAquickTM 凝膠萃取套組，iQiagM公司）中，以10,000 rpm來離心歷時1分鐘，丟棄濾液；將750 μΐ PE緩衝液加入至管柱中並進行清洗，於室溫下靜置5分鐘；以10,000 rpm來離心歷時1分鐘，丟棄 15 濾液，再次離心2分鐘以避免酒精殘留，之後將管柱置於新的微量離心管上，加入30 μΐ洗提緩衝液（elution buffer) 並靜置1分鐘，再以12,000 rpm離心歷時1分鐘。收集濾液並保存於-20°C中備用。之後進行限制酵素切割及接合反應。 20 限制酵素切割：經回收的PCR產物（25 pL)，加入5 μϊ^的10倍反應緩衝液，加滅菌去離子水（DDW)至48 μΐ^，再加入 20U (lOU^L)，於37°C水浴進行限制酶剪切反應至隔夜。待限制酶剪切作用完成後，回收DNA片段的步驟同前述， -45- 1285647 最後將其溶於25pLDDW内。另外加入5gL的10倍反應緩衝液，加DDW至46 μι，再加入#心1 20U (5 υ/μΙ〇，於37°C水浴進行反應2小時至隔夜。而如此所回收得到的分子量約為3.8 kb的DNA片段最後被溶於DDW内。 5 選殖載體的切割與接合反應：取 1 pg 表現載體 pET 25b(+)(5574 bp，Novagen)以及(New England Biolabs)來分別剪切，並從瓊脂糖凝膠中回收呈線形的載體pET25b(+)DNA。將回收的載體DNA (100 ng)及3.8 kb的PMT編碼DNA選殖片段（300 10 ng)予以混合後，加入2 μΐ^的10倍的接合緩衝液及0.8 μΕ T4 DNA接合酶（400 υ/μΙ〇,最後補滅菌去離子水至總體積為 20 pL，於16°C水浴中進行反應，作用時間約16小時。轉形作用：取已培養好的大腸桿菌勝任細胞（NovaBlue strain， 15 Novagen)，經低溫離心使菌塊沈澱，再加入轉形溶液（60 mM CaCl2 ; 15%甘油；10 mM HEPES，ρΗ7·0)並置於冰上 15分鐘。取5 μ!^已完成接合的接合產物加入至1〇〇 μί已處理過的大腸桿菌勝任細胞均勻混合，再於冰上靜置30分鐘。之後利用42°C、2分鐘的熱休克（heat shock)方式，將 20 所形成的重組型載體轉形至大腸桿菌中。於冰上靜置5分鐘後，加入0.8 ml LB肉湯培養基來作混合，並於37°C下以 250 rpm震盪培養歷時1小時。之後，取出150 pL培養菌液，並使用滅菌玻棒將菌液塗佈於含胺苄青黴素（ampicillin， 100 gg/ml)的LB肉湯培養基上，於37°C中培養歷時12〜16 -46- 1285647 小時，之後挑選單一菌落進行篩選。重組型載體的篩選：挑選單一菌落接種至2 ml LB肉湯培養基（含100 pg/ml胺苄青黴素），於37°C下以250 rpm震盪培養隔夜。菌 5 液離心後去除上清液，以QIAprep® Miniprep kit進行重組型載體的萃取。首先將細菌以250 μίΡΙ緩衝液懸浮，然後以250 μί Ρ2緩衝液將細菌溶解，再以350 μί Ν3緩衝液進行中和，以10,000 rpm離心歷時10分鐘，取上清液加入至 QIAprep管柱中，以10,000 rpm離心歷時1分鐘，丟棄渡 10 液，加入750 μι PE緩衝液至管柱中進行清洗，以10,000 rpm離心歷時1分鐘，丟棄濾液，再次離心2分鐘以避免酒精殘留。之後，將管柱置於新的微量離心管上，加入5 0 μί ΕΒ緩衝液並靜置1分鐘，再以10,000卬111離心歷時1分鐘，收集濾液即為重組型載體DNA溶液。 15 取一部分的重組型載體（1 pg)以的限制酵素切割成線狀，並以瓊脂糖凝膠電泳來分析其分子量是否與所預期者相符合。核酸定序：將經限制酵素及PCR確認後的轉型載體進行核酸定 20 序，取得的序列以DNAstar軟體進行序列比對及開放閱讀架構（open reading frame)分析，經上述方式痛認後的重組型載體被命名為Tox6,並做為進行下面選殖編碼PMT次單位的DNA片段時的基礎DNA模版選殖株。重組型載體Τοχ6 攜帶有一編碼PMT的3 844 bp的DNA片段。 -47- 1285647 編碼PMT次單位的DNA片段的選殖：取上面所得的重組型載體Tox6 2 pg，分別以、仞/^III於37°C水浴進行反應至隔夜後，對所得到的反應溶液（10 μί)予以加入2 μΐ^的裝填染料（loading dye)，混合均 5 勻後以0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳後，將兩側含標記片段的凝膠切下，先經溴化乙鍵（0.5 pg/ml)染色10秒鐘，再水洗脫色5分鐘。將未染色的膠片與已染色的標記共置於紫外線照明箱上對齊，儘快用刀片分別將内有對應於分子量1456 bp及1502 bp的DNA片段的凝膠區切下，置於乾 10 淨的微量離心管中稱重並回收瓊脂糖凝膠中的DNA片段，回收方式如上所所述。取回收的1456 bp及1502 bp的 DNA片段300 ng，分別與100 ng表現載體pET32b與pET32a DNA進行接合反應後，並進行載體的轉形、筛選及定序等確認，方法如上所述。於此所得到的重組型載體經確認後 15 分別被命名為Toxl與Tox2。另外取重組型載體Τοχ6，分別以及TV/^Ι於37 °(：水浴進行反應至隔夜後，回收883 bp kb的DNA片段並與 pET32b表現載體DNA進行接合反應，經載體的轉形、篩選及定序後所得到的重組型載體被命名為Tox7。 20 上述所得到的重組型載體Tox6、Toxl、Τοχ2與Τοχ7 所攜帶的多殺性巴氏桿菌PMT編碼DNA片段對應於PMT 編碼基因的所在位置被示意地顯示於圖10中。而且，在與 D型產毒株NCTC12178的PMT編碼基因作一比對後，上述所得到的 3844 bp、1456 bp、1502 bp以及 883 bp DNA片段 -48- 1285647 被推算出分別編碼基本上由對應於NCTC 12178的PMT蛋白質的2_ 1281、2-486、486-986以及986-1281胺基酸殘基所構成的胜肽。於是，於後文中，由上述重組型載體Tox6、Toxl、 5 Tox2、Tox7所攜帶的多殺性巴氏桿菌PMT編碼DNA片段所表現出來的重組型蛋白質即依各載體的名稱而予以稱為 Tox6、Tox 1、Tox2、Tox7 重組型蛋白質。另外，上面所得到的重組型載體Tox6、Toxl、Τοχ2 與Τοχ7被進行線狀重組型載體瓊脂糖凝膠電泳分析，所得 10 結果被示於圖11中。重組型載體選殖株的表現：將上面所得到的重組型載體Tox6、Toxl、Τοχ2與Τοχ7 選殖株的單一菌落分別接種至10 mL LB肉湯培養基（含有 100 pg/mL胺苄青黴素），分別於37°C、250 rpm/min培養至 15 隔夜，取2 mL隔夜培養的菌液加入100 mL新鮮的LB肉湯培養基，於37°C、250 rpm/min培養至吸光值（波長600 nm) 為大約0.6時，再加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷 (isopropyl -1 -thio-P-D-galactoside? IPTG)使其濃度達 1 mM，於同樣溫度下培養歷時6小時，收集菌體並懸浮於10 20 mL的PBS中，以供後續的分析所用。另將多殺性巴氏桿菌PMD48的單一菌落接種至10 mL BHI肉湯培養基，分別於37°C，250 rpm/min培養一夜，取 2 mL隔夜培養的菌液加入100 mL新鮮的BHI肉湯培養基，於37°C、250 rpm/min培養歷時26小時，收集菌體並 -49- 1285647 懸浮於10 mL的PBS中，以供作為後面進行毒性及免疫原性分析的陽性對照組。多源抗體的製備：取粗製PMT以0.1%福馬林不活化之後，加入等量的弗 5 倫氏完全佐劑，以肌肉注射方式給於豬隻，每14天免疫一次，經多次免疫後採其血清進行中和抗體的測試，確定其具有高中和抗體效價，此即為多源抗體的來源。蛋白質電泳分析及西方墨點反應·· 配製10%的SDS-PAGE，將待分析樣品加入等量的2X 10 樣品缓衝液（sample buffer)，以l〇〇°C煮沸15分鐘後進行裝填（loading);並以Tris-甘胺酸（glycine)緩衝液（pH 8.3)為電泳液，以100伏特進行電泳。當指示染劑至膠片末端時，關掉電源並取出膠片，以固定液（45%甲醇，10%乙酸）固定10分鐘；繼而以含0.1%孔瑪西亮藍（Coomassie brilliant 15 blue) R-250的染色液染色歷時1〇分鐘，隨後再用脫色液 (10%乙酸）脫色，直到各蛋白質帶清楚可見為止，利用 AlphaImagerTM 2200 (Alpha Innotech Corporation)估計各個重組型次單位毒素蛋白質選殖株的表現量。重組型次單位毒素蛋白質的蛋白質電泳結果被示於圖12。 20 另外進行相同的凝膠電泳處理但不予染色，所得到的電泳膠片利用轉潰半乾式電泳槽（TRANS-BLOT SD， semi-dry transfer cell ; Bio-Rad)，以 120 mA轉潰到硝基纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC membrane)上。加入含5%脫脂乳的封阻緩衝溶液（blocking buffer)，於室溫下 -50- 1285647 作用30分鐘後，加入抗PMT的單株抗體（7-10A，申請人的實驗室所自行製備者）或豬抗PMT多源抗體，於室溫下作用1小時，經PBST (0.05% Tween 20 in PBS)清洗後，再加入結合有鹼性磷酸酶的二次抗體（兔抗-豬IgG以及山羊抗-5 小鼠IgG)，最後加入受質（NBT/BCIP，Tris buffer)來進行呈色。西方墨點分析結果被示於圖13與圖14，而各個重組型次單位毒素蛋白質選殖株的表現量分析結果被示於表4。表4.以AlphaImagerTM 2200影像系統分析各個重組型次單位重組型蛋白質/總細胞蛋白質 (%) Toxl 28·2±5·07 Tox2 35·8±6·88 Τοχ6 4·1±0·41 Τοχ7 32.1±6·92 PMT 0·6±0·15 10 實施例3· PMT重組型次單位（rsPMT)的毒力試驗

Vero細胞毒力試驗·· 將以IPTG誘導表現後的rsPMT選殖菌株以5,000xg離心歷時10分鐘以收集細菌，再以無菌PBS來反覆沖洗以使細菌懸浮，以超音波（輸出功率20%，作用30分鐘；Misonix 15 XL2020，Heat Systems Inc·)將細菌擊碎，繼而以 10,000xg 高速離心歷時30分鐘。取上清液，經孔徑0.45 μπι及0.22 μιη 過濾膜過濾，此過濾兩次的過濾液即為表現產物粗製可溶性蛋白質，以此來進行Vero細胞毒力試驗，實驗方式係依照實施例1中的I、材料與方法中的D項、PMT蛋白質對於 -51 - 1285647 非洲綠猿腎臟細胞株（Vero cell)的細胞病變效應 (cytopathic effect，CPE)的測定。Vero細胞毒性分析結果被示於圖15-17中。本實驗係以多殺性巴氏桿菌PMD48所表現的粗製 5 PMT毒素蛋白質作為對照組，並以僅含2%胎牛血清的 DMEM作為空白試驗。所有實驗組、對照組以及空白試驗在培養七曰後進行細胞致病效應（CPE)的觀察，其中將最高稀釋倍數但仍可造成所有四井中的細胞皆呈現病變的毒素濃度訂定為最小毒性劑量（minimum toxin dose， 10 MTD)。於此實驗中，由重組型載體Tox 1、Tox2、Tox 6以及 Tox7所表現的各個重組型蛋白質所測得的MTD值分別為 1.21 mg/ml、1.00 mg/ml、2.81 mg/ml 以及 2.36 mg/ml，且皆不會誘導Vero細胞產生CPE現象。相對地，粗製PMT蛋 15 白質對照組即使在低至140 ng/ml的濃度下仍會誘導Vero 細胞產生CPE現象。當以顯微鏡觀察細胞型態時發現，以粗製PMT蛋白質 (140 ng/ml)處理Vero細胞時會造成節結樣的病變（圖15)，而以rsPMT (Tox 1)處理時，即使所加入的重組型蛋白質的 20 濃度高於1 mg/ml時，亦不會造成典型節結樣的病變（圖 17) ° 小鼠半致死劑量（50% Lethal Dose，· LD5〇)試驗：以上述所製備的可溶性重組型蛋白質與天然PMT蛋白質（PMD-48所產生的）來進行小鼠LD5〇的測定。所用的小 -52- I285647 昧、為無特定病原（sepcific pathogen free，SPF)的 BALB/c小乳’每實驗組各有6隻小鼠，於4週齡時每隻鼠以〇·5 mL的劑量行腹腔注射。注射後觀察丨〇天並記錄是否有死亡或臨床症狀，並以Behrens-Karber方程式來計算各組的UD50。 5 Behrens-Karber 方程式：差距=(次兩於累計死亡5〇%的劑量—次低於累計死亡 50%的劑量）x[(50〇/〇一次低於5〇%的累計死亡扒次高於50%的累計死亡—次低於5〇%的累計死亡 LD5〇=(次低於累計死亡5〇%的劑量差距 10天内死亡或第1〇天仍未死亡者於安樂死後進行解剖，以肉眼檢查並將各臟器組織的採樣標本以1〇%中性福馬林/合液固疋，各標本再以石蠟包埋，以石蠟切片機製成 5¾米切片，經蘇木紫伊紅（如咖⑽沖n_E〇sin，H&E)染色後進行組織病理學檢查。 15 結果：由上述公式所計算出的粗製PMT蛋白質與PMT次單位的重組型蛋白質（rsPMT)對小鼠的半致死劑量（ld5。）結果被示於表5。 -53- 1285647 表5.粗製PMT蛋白質與PMT重組型次單位對於小鼠的半致死劑量組別劑量 (pg/0.5 mL) 死亡率 (死亡數目/總數） LD50 (pg) 1.50 100% (6/6) 1.30 粗製PMT蛋白質 1.20 16.7% (1/6) 1.0 0% (0/6) Toxl 1000 0% (0/6) >1000 800 0% (0/6) Tox2 1000 0% (0/6) >1000 800 0% (0/6) Τοχ7 1000 0% (0/6) >1000 Toxl+Tox2+Tox7 800 1000 0% (0/6) 0% (0/6) >1000 在試驗進行第10天後，將仍未死亡的小鼠進行安樂死犧牲，並與10日内已先行死亡的小鼠一起進行解剖。除了以肉眼檢查各臟器組織外，並以10%中性福馬林溶液來固 5 定所採樣的標本。實施例4·小鼠抗-ΡΜΤ重組型次單位抗體的製備舆測試小鼠的免疫及其脾臟單核細胞（mononuclear cells，MNCs) 的分離z 將上述所製備的可溶性rsPMT蛋白質進行小鼠免疫。 10 所用的小鼠為SPF BALB/c小鼠，於6及8週齡時進行各免疫一次，每隻小鼠免疫的劑量為1〇〇 μ§/〇.5 mL，第1次免疫所使用的佐劑為弗倫氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, Gibco，Grand Island, NY，USA)，而進行第 2次免疫（100 pg/0.5 ml)時則改用為弗倫氏不完全佐劑（Freund’s 15 incomplete adjuvant)。第2次免疫後以致死劑量（2 pg)的天然PMT毒素行腹腔注射攻毒。每組小鼠於第2次免疫後及攻毒後14天取其脾臟以分離MNCs。脾臟分離MNCs後以紅 -54- 1285647 血球溶解緩衝溶液（RBC lysis buffer ;0· 17 Μ ΝΗ4α、0.01 MKHC03)來溶解紅血球，並以無菌PBS清洗細胞3次，最後將MNCs懸浮於含1〇%胎牛血清的RPMI 1640 (Gibco, Grand Island，NY，USA)中備用。 5 抗體分泌細胞分析（antibody-secreting cells ; ASCs) ·· 以酵素斑點分析法（enzyme-linked immunospot ; ELISPOT)來進行抗體分泌細胞的偵測。首先，將上述所製備的可溶性rsPMT蛋白質（20 pg/m卜50 μΐ/井）塗覆至96 井的微量石肖基纖維素平盤（96-well nitrocellulose bottomed 10 plates, Millititer HA，Millipore Corp，Bedford，Mass, USA) 上，於4°C下靜置過夜後，以PBST水洗三次，然後加入封阻緩衝液（1% BSA)並於37°C下反應歷時1小時。以PBST水洗二次後，加入不同稀釋濃度的待測單核細胞細胞液100 μί，於37°C、5% C02培養箱中培養6小時。以PBST水洗三 15 次後，加入100 μΐ^以封阻緩衝液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標示的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體（goat anti-mouse IgG antibody)(Sigma)並於37°C下反應歷時1小時。以PBST水洗五次後，加入100 μι受質（NBT/BCIP，Tris緩衝液）並於37 °C下反應15分鐘以便產生呈色，以解剖顯微鏡計數ASCs 20 的數目。小鼠的抗體分泌細胞分析結果如表6所示。於小鼠第二次免疫後以及以粗製PMT毒素攻毒後14 天，由各組小鼠取其脾臟，並且分離脾臟中的單核細胞進行ASCs的分析，在2次免疫後各組小鼠的脾臟呈顯明顯腫大，但在攻毒後，以Toxl及Tox2免疫組的小鼠脾臟則有明 55- 1285647 顯萎縮的現象，但各組小鼠均無死亡。在免疫2次後，由 Tox2免疫組的小鼠脾臟脾臟單核細胞中所測得的ASCs最高（在106個單核細胞中有2993·33±200·33個細胞為專一性的ASCs)，而以傳統類毒素免疫組的asCs最低（在106個單 5核細胞中有^86.671477.21個細胞為專一性的ASCs)。在粗製PMT毒素攻毒後各免疫組小鼠的ASCs亦呈明顯揚升的現象，其中以T〇xl免疫組的小鼠最為明顯，其攻毒後的ASCs數目為ΐ〇233·33±850·49/106單核細胞。此等結果顯示’依據本發明的rsPMT蛋白質能在小鼠體内激發有 10 效的保護力，使小鼠能承受高量粗製PMT毒素的攻擊。雖然部分免疫組小鼠在攻毒後脾臟呈現明顯萎縮現象，仍無損於體液性免疫反應的產生。表6·小鼠抗體分泌細胞的酵素斑點分析 15 組別

Toxl Τοχ2 Τοχ7 粗製PMT蛋白皙疫苗接種後的抗體分泌細胞數量（細胞/106 MNC) 2106.67±210.55b 2993.33±200.33a 2120.00±80.00b 1386.67+477.21° 攻毒後的抗體分泌細胞數量（細胞/106 MNC、 10233.33±850.49a 9786.67±201.33a 7750±750b 7483.33±275.38b 表中所示為每lxl〇6個單核細胞（MNCs)中對PMT具專一性的抗體分泌細胞數量。變方分析的組間差異性係以a、b、c來表示。細胞性免疫反應：於96井平底組織培養盤上，每井分別加入5〇 μΙ^ (2χ105細胞/井）的經分離的單核細胞，再以3個重複的方式加入50 pL天然PMT (10Χ MTD)作為刺激原，並以Rpmi 20 1640細胞培養液作為陰性對照，於37°C、5% C〇2培養箱中培養4天。於培養的最後16小時，加入〇·5 3H_胸腺嘴 -56- 1285647 ^(3H-thymidine，Amersham Life science)以標示細胞，並以多重式細胞收穫器（multiple cell harvester，Minimash 200，Dynatech)分別將細胞收集於玻璃纖維濾紙上，於56 °C烘箱乾燥2小時，置入閃爍計數瓶中，加入2 mL的閃爍 5 計數液（EcoscintTMH，Pational diagnostics)，於液態閃燦計數儀（Beckman liquid scintillation system model LS8000)測其CPM (count per minute)以計算淋巴細胞增殖反應情形。淋巴細胞增殖反應情形以刺激指數（stimulation index ; 57)表示，其中57= PMT刺激組的CPM/PMT未刺激 10 組的CPM。參照van Diemen等人的研究（Ri /mmwwo/ Immunopathol., 41:307-321, 1994) 5 當 57大於2時即判定淋巴細胞有增殖反應情形產生。小鼠的細胞性免疫反應結果被示於表7。所有免疫組小鼠於第2次免疫後顯示出其脾臟單核細胞對粗製PMT毒 15 素具有增殖反應，Toxl免疫組的57為2.11±0·27、Tox2免疫組的*S/為3_31±0·95、Τοχ7免疫組的57為2.31土0.26、類毒素免疫組的*S/則為6·02±0.68，這顯示小鼠經2次免疫後有明顯細胞性免疫反應被活化的現象。但是，於攻毒後只有 Τοχ7及ΡΜΤ類毒素免疫組對粗製ΡΜΤ毒素仍有增殖反 20 應，而Toxl及Τοχ2免疫組則對粗製ΡΜΤ毒素的刺激增殖反應明顯降低，這顯示粗製ΡΜΤ毒素的攻毒有可能會部分地抑制細胞性免疫反應的活化。 -57- 1285647 表7.小鼠的細胞性免疫反應分析* 組別疫苗接種後的SI值攻毒後的SI值對照組 0·99±0·26 1·66±0·49 Tox 1 2·11±〇·27 1.06±0·49 Tox2 3·31 土 0·95 0·96±0]9 Τοχ7 2·31±0·26 2.8±0·37 ΡΜΤ蛋白質 6.02 士 0.68 8.07 土 4.13 ••於疫苗接種後14天以及攻毒後14天進行分析，所用的刺激原為ΡΜΤ粗製毒素（10Χ MTD，220 ng)。血清中和抗體效價試驗（Serum Neutralization Antibody 5 Titer Test, SN Test)：於96井組織培養盤内，將所有實驗小鼠的血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續稀釋。在每井内加入5〇 pL經稀釋的待測血清，繼而於各井中加入5 0 pL含5倍MTD的天

然PMT蛋白質（5X MTD，100 ng)，然後將培養盤置於37°C 10下歷時1小時。之後，於各井中加入2xl04細胞/井的Vero 細胞’然後將培養盤置於含5% C〇2的37°C恆溫培養箱中。在培養至7天後，觀察能夠抑制CPE出現的血清最高稀釋倍數，該稀釋倍數為血清的中和抗體效價。小鼠的血清中和抗體效彳貝试驗結果被示於表8。表8_ 小鼠的中和抗體效價分析組別免疫接種後的抗體倍數攻毒德的：Hir被立叙 Τοχΐ <4 八哥,又 wΙΕ Ια 32 Τοχ2 <4 <4 Τοχ7 8 256 粗製ΡΜΤ毒素蛋白質 <4 <4 、一队Α -Γ八J 即為所測得的SN值 15 -58- 1285647 由上述結果得知，經Τοχΐ、T〇x2及T〇x7重組型蛋白質對豬隻進行免疫後，可有效誘導小鼠對粗製ΡΜΤ蛋白質產生具有保護性的中和抗體，且在攻毒後於小鼠體内所激起的抗體具有一定有效效價，其中使用Τοχ 1作為疫苗時， 5所測抓值至少有32，Tox7作為疫苗時，所測SN值至少有 256 ° 小鼠抗-ΡΜΤ單株抗體的製備·· 有關小鼠抗·ΡΜΤ單株抗體的製備係參考Antibodies， Cold Spring Harbar Laboratory，1988 中所描述的一般操作 10 技術來進行。取Τοχ7重組型蛋白質70 pg以及等量的弗倫氏完全佐劑相混合，並以〇·5 ml的數量經腹腔免疫注射至 BALB/cByJ小鼠體内。之後，每隔14日予以補強一次。第一次補強是再取Tox7重組型蛋白質70 加入等量的弗倫 15氏不完全佐劑。第二次補強則以不加佐劑的Τοχ7重組型蛋白質經靜脈注射至小鼠體内。在確定小鼠已有抗體產生時’取出小鼠脾臟，並進行漿細胞（Plasma cell)的分離。接著進行漿細胞與小白鼠骨髓癌細胞NS-1的融合，培養並觀察經融合的細胞的生長，待細胞長成細胞團塊時， 20以£08八來進行抗體分泌的篩選。所選出能分泌抗體的細胞團塊再進一步供以後續的融合瘤單株化篩選。經反覆筛選後所得的單株化融合瘤，係以西方式點墨法來確定抗體的專一性。將所得到的融合瘤細胞大量培養於含2%胎牛血清的 -59- 1285647 RPMI-1640細胞培養液内，並收取被分泌至培養基上清液中的單株抗體以供實驗所用。於是，一針對τ〇χ7重組型蛋白夤的單株抗體被得到，其被命名為“7_ 1 〇Α”。實施例5· ΡΜΤ重組型次單位對於豬隻的免疫效力 5以ΡΜΤ重組型次單位來免疫豬隻的中和抗體效價分析：以上述所製備的可溶性rsPMT蛋白質來進行豬隻免疫。所使用的豬隻為購自一無PAR病例的一貫作業豬場，豬隻於5週齡及7週齡時分別以每劑量含丨mg rspMT蛋白質此合等體積的弗倫氏佐劑來進行免疫，每次於頸部接種 10 一劑量，並於每次免疫後2週採其血清進行中和抗體分析，中和抗體效價測定方式如下面實施例5中的血清中和抗體效價试驗所述。結果被示於表9。表9· PMT重組型次單位對於豬隻的中和抗體效價分析組另J 免疫接種後的SN值攻毒後的SN值 Toxl 32 256 Tox2 8 32 ~ Τοχ7 4 128 經由上述結果得知，以Τ〇χ1、τ〇χ2&τ〇χ7重組型蛋白 15質對豬隻進行免疫後，可有效誘導豬隻對rsPMT蛋白質產生具有保護性的中和抗體，且在攻毒後於豬體内所激起的抗體具有一定有效效價，其中使用τ〇χ1作為疫苗時，所測 SN值至少為256，Τοχ7作為疫苗時，所測81^值至少有128，而Τοχ2作為疫苗時，所測值至少為32。 2〇保護性試驗：自無嚴重AR臨床症狀一貫作業豬場採其懷孕母豬隻 -60- 1285647 血巧進行中和抗體效價測定，選取中和抗體效價低於4倍的懷孕母豬50頭，依照下表所示的疫苗成份，隨機分成 rsPMT細菌疫苗（bacterin)[Toxl、τ〇χ2、τ〇χ7、多殺性巴氏桿菌Α型與D型以及支氣管敗血博德氏菌（及 5 心⑽叩—a)]、rsPMT疫苗（Toxl、Tox2、Tox7)、市售 AR疫苗及類毒素細菌疫苗[類毒素、多殺性巴氏桿菌Α型與D型以及支氣管敗血博德氏菌（及叩心^)]與陰性對照組等5組，分別與氫氧化鋁膠混合後於母豬分娩前5 週及3週時各進行一次免疫，母豬於分娩時收集初乳及3 10日齡新生仔豬血清，測定其中和抗體效價。表10·用於保護性試驗的疫苗的組成成份

RsPMT細菌疫苗* Toxl (0.7 mg)、Tox2 (0.7 mg)、Τοχ7 (0·7 mg)、多殺性巴氏桿菌Α型（109 CFU)與D型（1〇9 CFU)以及支氣 g 敗血馎^ 德氏邊 rsPMT瘛苗 Toxl (0.7 mg)、Tox2 (0.7 mg)以及 Τοχ7 ίθ.7 市售AR疫苗** Boehringer ingelheim aminal health, RTAH 屮 σ 類毒素細菌疫苗類毒素（2 mg)、多殺性巴氏桿菌a型（i〇9 CFU)與D 型（1〇9 CFU)以及支氣管敗血博德氏菌 bronchiseptica)(\〇9 CFU) 所使用的多殺性巴氏桿菌Α與D型細菌是以ΒΗΙ肉湯谇卷美拉盖 :市售疫苗的用量為每劑量2 mb 待母豬生產後，隨機從各組挑出5頭仔豬，於仔豬21 曰齡時以致死劑量的PMT毒素（1 mg)，以肌肉注射方式進行攻毒，並且觀察其臨床症狀及存活率。此外，於每次免疫及攻毒前採血’測定其血清中和抗體效價，實驗期間採取任食。保護性試驗結果被示於表11。 -61 - 20 1285647 表11·具PMT次單位疫苗保護的仔豬經PMT毒素攻擊後的存活率組別存活率（η=10) RsPMT細菌疫苗 100% RsPMT疫苗 100% ~ _類毒素細菌疫苗 100% 市售AR疫苗 0% 對照組 * · Α- ΛΑ 丄 “ · 0% :對照組為一未以任何疫苗免疫的母豬所生的仔豬。仔豬增重試驗： 5 本試驗係於母豬生產後隨機從上述保護性試驗的各組分別挑選出1 0頭仔豬來進行。試驗時，係將所選出的仔豬分成攻毒組和未攻毒組，攻毒組係於仔豬1 8日齡時以肌肉’主射方式將低劑量的ΡΜΤ毒素（〇·2 mg)投予仔豬來進行攻毒，於攻毒前及攻毒後3週測其體重，並且觀察其臨床 10症狀及增重情形和抗體的變化，實驗期間採取任食。仔豬增重的結果如下列表12所示：表12·抗PAR的仔豬的增重試驗結果組別仔豬處理接種前的仔豬體重接種後的仔豬體重 21曰内的平均體重增加值 RsPMT細菌疫苗接種 4-60 + 0.57 8.88±1.75 4.38±1.89 未接種 4.〇〇±1.0〇 8.8±0.84 4.7±0.67 RsPMT疫苗接種 4 · 25土〇·8 6 7.50±1.29 3.25土0.87 未接種 4.5〇±q^j^ 8·87±1·48 410+1 〇8 類毒素細菌疫苗接種 8·00±0·71 1 · A V/ -i-丄· Vf Ο 3.88土0.75 未接種 412 + 0.62 7.00 土 1.4 3.17 + 0 68 對照組接種 4.40 士 ι·ΐ4 8.20±1.64 3·6±0·89* 未接種 4.25 + 0 Q/ς 0 ^ /14- Π Si A 5.16 土 0.28 3主·實驗結果係以t-試驗it-test、氺:“ y . 土U . δΗ· (ρ<0·05) -62- 1285647 田間試驗：先選疋有發生PAR臨床病例及無發生pAR臨床病例的 -貫作業豬場各-場，作為實驗豬場，於實驗開始時所有母豬群以rsPMT細菌疫苗[Tox丨、τ〇χ2、τ〇χ7、多殺性巴氏

5桿菌Α型與D型以及支氣管敗血博德氏菌（反汾㈣以以叩…幻]統一進行免疫一次，並於母豬分娩前5週及3週時各進行-次免疫。在無發生pAR臨床病例的一貫作業豬部分於疫苗使用12個月後，進行母猪分挽時的血清與初乳中和抗體的分析，結果如圖18所示。在有發生pAR 1 〇臨床病例的豬場部分則進行母豬分娩時的血清中和抗體的分析，結果如圖19所示。此外，所有仔豬分別於4及6週齡時亦以rsPMT細菌疫苗[T〇Xl、T〇X2、T〇x7、多殺性巴氏桿菌A型與D型以及支氣管敗血博德氏⑽.〜隊―糾㈣]來進行免疫，於疫 15苗使用12及18個月後，於肉豬出售時自屠宰場取回猪頭，進行鼻甲介骨肉眼檢查，以評估疫苗的效力，鼻甲介骨萎縮程度的判定標準如圖20所示。鼻甲介骨的萎縮程度等級的評分（Score)係依據病變程度的輕重分為—、+/—、+、 ++ +++、++++等六級，其中一表示正常的鼻甲 0 "月，係以鼻甲的背側窩卷由外側旋轉卷曲約】5圈以及其腹側窩卷由外側旋轉卷曲約！ Μ圈來判定，評分時為得 W分’· +/-係以鼻甲的f側寫卷正常以及其腹側寫卷萎縮達！/4以下來判定，評分時為得8分；+係以鼻甲的背侧窩卷輕微萎縮以及其腹側窩卷萎縮達1/4以下來判定，評 -63- 1285647 刀寸為知6刀’ + +係以鼻甲的背側窩卷萎縮以下以及其腹側窩卷萎縮達1/2訂來判定，評分時為得4分；+ + +係以鼻甲”月的背側窩卷顯著萎縮以及鼻中膈已受波及來判定，評分時為得2分’·+ + + +制鼻甲介骨已完全萎縮，評分時為得〇分。該養豬場於疫苗使用之前其臨床發生比例為6〇%，及評分之後其得分為57,其中有3〇%以上的鼻甲介骨為+ + +與+ + + +，於免疫後12及18個月後其鼻甲介骨萎縮程度主要為一、+/—，經評分後的得分分別為94及卯，二 10次的付分與免疫前呈現顯著的差異（ρ<0·005)，這顯示依據本發明的rsPMT細菌疫苗在現場具有極良好的保護效力。申凊人應用聚合酶連鎖反應（pCR)進行全段與次單位 PMT毒素基因的選殖，並以核酸定料方式確認並比對基因序列後，進行各選殖株重組型次單位PMT毒素蛋白質的 15表現，且其表現量可達轉殖細菌總蛋白質濃度的20〇/〇以上，相杈於天然PMT只佔細菌總蛋白質數量的〇 5_1%以下，顯示可大幅提升抗原蛋白製備的效率。其次，被表現的蛋白質以西方墨點法（Western bl〇uing) 來確認其抗原性，而結果顯示所有選殖表現的重組型次單 20位PMT毒素蛋白質皆能被小鼠抗PMT單株抗體或豬抗 PMT多源抗體所辨識，這顯示依據本發明蛋白質能涵蓋與天然PMT相類似的抗原決定位（epit〇pes)。此外，經利用Vero細胞、小鼠及實驗豬隻等進行rspMT 蛋白質的毒性比較試驗’結果顯示天然PMT於140 ng/ml -64- 1285647 的濃度下即可導致Vero細胞產生典型的結節樣（knot)細胞病變（CPE)，但所有重組型次單位毒素蛋白質即使在> 1 mg/ml的高濃度下，Vero細胞仍不會產生典型的結節樣細胞病變，這證實依據本發明的rsPMT蛋白質不具有任何細 5 胞毒性，且於動物毒性試驗中亦顯示這些重組型次單位毒素蛋白質即使在高濃度下對小鼠及實驗豬隻皆不具任何生物毒性，亦即依據本發明的rsPMT蛋白質皆具有高度的安全性。除此以外，經以小鼠及豬隻進行免疫原性的測試中，藉由偵測免疫動物所產生的中和抗體效價與其脾臟内 10 所產生的專一性抗-PMT抗體分泌細胞的數量，並進行實驗動物體液性與細胞性免疫反應的分析，以及以攻毒試驗評估疫苗保護效力的測試，結果顯示，涵蓋部分PMT胺基端或魏基端次單位（amino or carboxyl terminal subunit)的本發明rsPMT蛋白質，皆能在小鼠及豬隻身上產生良好的 15 免疫保護效益。由上述結果得知，依據本發明的rsPMT蛋白質具有生產時間短、效率高、生產成本低廉、無毒性、高安全性及高免疫保護效力的特點，必能有效取代傳統PMT類毒素成為新一代PAR疫苗的主要抗原成分。 20 實施例6.對抗進行性萎缩鼻炎舆假性狂犬病（PAR-PR)的雙價疫苗（Bivalent vaccine)的製備及其免疫效力試驗基於進行性萎縮鼻炎（PAR)與假性狂犬病（PR)皆為豬隻的高傳染性與致死性疾病，申請人進一步嘗試將由實施 -65- 1285647 例2所建立的選殖菌株所表現出的Toxl、Τοχ2、Τοχ7重組型蛋白質來與gE-刪除的去活化假性狂犬病病毒 (pseudorabies virus)組合，俾以製造能對進行性萎縮鼻炎 (PAR)與假性狂犬病（PR)產生良好保護效用的雙價疫苗。 5 A、多殺性巴氏桿菌毒素（PMT)的製備本實施例中所用的多殺性巴氏桿菌毒素（PMT)是參照實施例1的實驗操作程序“B、PMT蛋白質的製備”中所述而被製得。在依照實施例1中所述以Vero細胞檢測最小毒性劑量（MTD)後，將粗製PMT分裝並保存於-20°C冰箱内備 10 用。於本實驗中所用的粗製PMT，經Vero細胞的CPE試驗所測得的MTD為1024倍。 B、含PMT重組型次單位舆PMT類毒素的PAR疫苗的製備將實施例2中所建立的選殖株Toxl、Tox2及Tox7，分 15 別取單一菌落接種至含100 pg/ml胺苄青黴素的LB肉湯培養基中，於37°C下振盪隔夜培養。經兩次繼代後，再取2 ml 的菌液加入至98 ml的LB肉湯培養基（含100 pg/ml胺苄青黴素）中，置於37°C下振盪培養歷時約3小時。之後，加入 1 ml IPTG (100 mM)至最終濃度為1 mM。在誘導表現6小 20 時後，收集菌液並以12,000 rpm離心以去除上清液。以PBS (pH 7.2)反覆沖洗以使細菌懸浮，並以超音波（Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，輸出功率 20%，作用 30分鐘）將細菌擊碎。之後，以10,000xg高速離心30分鐘，將收取的上清液經孔徑0.45 μηι及0.22 μιη過濾膜來過濾，此經兩 -66- 1285647 次過濾的過濾液即為表現產物粗製可溶性蛋白質。利用 Bio-Rad蛋白質分析來測定蛋白質濃度，並以 AlphaImagerTM來估計表現數量以調整蛋白質濃度。另外，將D型多殺性巴氏桿菌PMD-48與A型多殺性巴 5 氏桿菌PMA-8的單一菌落分別接種於BHI肉湯培養基中，於37°C恆溫箱中振盪培養歷時18〜24小時。之後，取1 mi 菌液進行細菌數的計數，結果以菌落形成單位（colonyforming unit， CFU)來表示。其餘菌液加入福馬林（formalin) 至最終濃度為0.2% (v/v) ’並於37 C丨亙溫箱中作振盈去活 10 化（inactivation with shaking)歷時 24〜36小時。將上述所得到的包含Toxl、Tox2及Τοχ7重組型蛋白質的產物（各取0.7 mg)以及去活化的Α與D型多殺性巴氏桿菌（各取lxl09 CFU的數量）混合（佔疫苗總量的70%)，再加入已滅菌的鋁膠（占疫苗總量的30%)(抗原與佐劑的用量 15 比例為70:30，v/v)，予以混和均勻以形成每劑量2 ml的含 PMT重組型次單位與PMT類毒素的PAR疫苗，於下文中簡稱為“PAR疫苗”。 C、多殺性巴氏桿菌半致死劑量（LDS())的測定：自野外臨床病例所分離的多殺性巴氏桿菌PMD-48以 20 不同細菌濃度對BABL/c小鼠進行LD50測定。實驗共分為4 組，每組各有10隻小鼠，第1組至第4組分別以每0.5 ml含 1·44χ1〇6、1·44χ105、1·44χ104 以及 1.44xl03CFU 來進行腹腔注射。注射後連續觀察10天，並記錄小鼠的死亡時間，最後再以Behrens-Karber方程式來計算LD5G。所測得的 67- 1285647 LD5〇結果為 2·1χ103 CFU/0.5 ml。 D、假性狂犬病毒（Pseudorabies virus)的製備：將兔腎細胞株（Rabbit kidney cell line，RK-13細胞）[購自於食品工業發展研究所（FIRDI)，中華民國台灣省300新 5 竹市食品路331號，寄存編號為CCRC 60010]培養於含有 5%胎牛血清（FBS)的DMEM内，當生長成單層細胞後，予以加入 0·05 MOI [傳染的多重性（multiplicity of infection)] 的PR病毒（TNL株）（由高生製藥股份有限公司所提供）以感染RK-13細胞，並置於37°C、5% C02培養箱内培育歷時1 10 小時。之後，將細胞培養於含2% FBS的DMEM中，當細胞病變效應（CPE)達80〜90%時，將細胞連同細胞培養液進行兩次的冷凍-解凍過糕（freeze_thawing process)，接而於 l，000 rpm與4°C下離心歷時20分鐘。收集上層液，即為PR 病毒原液，將PR病毒原液再以上述方式進行2次增殖後’ 15 收取病毒液並依下面所述方法來檢測病毒效價，而後予以分裝並保存於-70°C冰箱内備用。 E、假性狂犬病毒效儐測定： 50% 組織培養物感染效價（50〇//〇 tissue culture infection dose，TCID50) ·· 20 取1.5 ml試管12支’每管加入〇·9 ml不含胎牛血清的 DMEM，取待測病毒液0·1 ml，加入第1管後充份混合均勻，再由第1管混合均勻的病毒液吸取〇·1 ml至第2管，再次混合均勻，依上述方法連續稀釋至第12管。在96井平底細胞培養盤中，將每個稀釋倍數的病毒液以每井1〇〇的 -68- 1285647 數量各接種8井，接而加入100 μΐ的兔腎細胞RK_13 (以含 5%胎牛血清的DMEM予以稀釋至2x105細胞/ml)，並置於 37°C、5%C02恆溫箱中反應歷時72小時。之後，判讀細胞病變（CPE)的產生情形，並以李德-穆克方法（Reed-Muench 5 Method)來計算TCID5G病毒效價，俾供後續實驗的使用。 F、假性狂犬病gE缺損病毒的製備：本實施例中所用的PR疫苗病毒是由高生製藥廠所提供，病毒來源是於民國七十八年（西元1989年）由桃園某養豬場罹患PR的病緒所分離出的強毒株（LC株），該病毒經 10 DNA雜交、兔子接種試驗、抗體染色以及gE、gB醣蛋白分析後，被確定為PR病毒，然後再以遺傳工程方式將此PR 病毒構築成gE醣蛋白基因缺損的PR病毒株，並以gE單株抗體作免疫染色而証明不具有gE醣蛋白，接而再以細胞培養來增殖病毒，而使每ml病毒液中所含病毒效價約為108 15 TCID5〇以上，再加入0·1 Μ二元次乙亞胺（Binary ethylenimine，ΒΕΙ)至最終濃度為0.2%，並於37°C下進行去活化作用歷時10小時。高生藥廠使用此病毒所製造的PR gE缺損去活化油劑 (W/0/W)疫苗（病毒數量為2108 TCID5〇)，經免疫於無PR抗 20 體的兔子或豬隻後，均可產生抗PR野外株的中和抗體，但不會產生抗gE醣蛋白抗體。 G、 PAR-PR雙價疫苗的製備：將前述所製備的PAR疫苗抗原（含2.1 mg PMT重組型次單位蛋白質、lxl〇9CFU的去活化A型多殺性巴氏桿菌以 -69- 1285647 及lxl09 CFU的去活化D型多殺性巴氏桿菌）以及gE缺損去活化PR病毒株（108 TCID5〇)依等比例混和均勻，再加入已滅菌的油質佐劑（W/0/W型）（由高生製藥股份有限公司提供），製成每劑量2 ml的油劑PAR-PR雙價疫苗。 5 Η、血清中和試驗（serum neutralization test，SN test): PMT血清中和試驗：於96井平底細胞培養盤内，將已去活化（56°C，30分鐘）的待測血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續稀釋。在每井内加入50 μΐ^經稀釋的待測血清，繼而於各井 10 内加入50 μΐ的PMT (5Χ MTD)，然後將培養盤置於37°C、 5% C02恆溫箱中反應歷時1小時。每個待測血清均作二個重覆試驗。之後，於各井中加入100 μΐ Vero細胞（以含2% 胎牛血清的DMEM調成3x105細胞/ml)，並將培養盤置於37 °C、5% C02恆溫箱中反應歷時7天，而後以倒立顯微鏡來 15 作觀察。能夠抑制節結樣細胞病變（CPE)出現的最高血清稀釋倍數，即為該血清的中和抗體效價。 PR血清中和試驗··

於96井平底細胞培養盤内，將已去活化的待測血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續稀釋。在每井内加入50 20 μΐ^經稀釋的待測血清，繼而於各井中加入50 μΐ含100 TCID5〇 (即2xl03 TCID5〇/ml)濃度的病毒液，並將培養盤置於37°C的恆溫箱中反應歷時1小時。每個待測血清均作二個重覆試驗。之後，於各井内加入1〇〇 μΐ豬腎細胞PK-15 [購自於食品工業發展研究所（FIRDI)，寄存編號為BCRC -70- 1285647 60057](以含5%胎牛血清的DMEM調成2x105細胞/ml)，並將培養盤置於37°C、5%C02恆溫箱中反應歷時3天。之後，以倒立顯微鏡來作觀察。能夠抑制融合樣細胞病變（CPE) 出現的最高血清稀釋倍數，即為該血清的中和抗體效價。 5 除了豬腎細胞PK-15以外，本試驗亦可使用兔腎細胞 RK-13來進行。 I、PAR-PR雙價疫苗對小鼠的效力試驗： PAR-PR雙價疫苗對抗多殺性巴氏桿菌的保護效力試驗：對小鼠（BALB/c)皮下注射以0.2 ml上面所製備的含油 10質佐劑的PAR-PR雙價疫苗，進行兩次免疫且當中間隔2〇天，並於第2次免疫後20天進行攻毒試驗。免疫組於兩次免疫後分別被腹腔注射以2xl06或2xl07 CFU/0.2 ml的多殺性巴氏桿菌PMD-48活菌液，而對照組則分別被腹腔注射以2xl02、2xl〇2與2xl〇4CFU/ml的多殺性巴氏桿菌PMD_48 15活菌液。在攻菌後連續觀察14天，並記錄小鼠的死亡時間，最後再以Behrens-Karber方程式來計算LD5〇，並換算成免疫組的防紫指數。 PAR-PR雙價疫苗對抗Ρίί的保護效力試驗·· 對小鼠（BALB/c)皮下注射以〇·2 ml上面所製備的含油 20質佐劑的1>八11-1>11雙價疫苗，進行兩次免疫且當中間隔2〇天，並於第2次免疫後2〇天進行攻毒試驗。免疫組與對照組都腹腔注射以1〇倍LDm PR病毒（TNL株）。在攻菌後連續觀察14天’並記錄小鼠的死亡時間。 -71 - 1285647 J、 PAR-PR雙價疫苗對兔子的免疫效力試驗：選取平均體重二公斤的紐西蘭兔（New Zealand rabbit) 共5隻，3隻以含有油劑的雙價疫苗來作免疫，而剩餘的2 隻不做任何處理以作為對照組。以肌肉注射來施行免疫兩 5次而當中次間隔1〇天，注射部位為左後大腿肌肉，免疫劑量為2 ml。兔子於免疫前以及兩次免疫後的第10天分別予以採血，以檢測兔血清對於PMT及PR的中和抗體效價。上述6隻已接受雙價疫苗免疫的兔子以及2隻對照組兔子接著在兩次免疫後第17天以1〇〇倍LD5G PR病毒（TNL 1〇株）來進行攻毒試驗，接種部位為右後大腿肌肉。攻毒後連續觀察10天，並記錄臨床症狀以及死亡時間。整個實驗期間採任食飼養。1〇天後仍存活者予以安樂死，全部實驗兔子皆進行組織病理學檢查。 K、 PAR-PR雙價疫苗的田間試驗： 15 PAR-PR雙價疫苗對懷孕母豬的免疫效力試驗·· 於一個無發生PAR臨床病例的一貫養豬場（位於花蓮縣）進行PAR_PR雙價疫苗田間試驗。自豬場選取懷孕約85天母豬共4〇頭，分成4組，第1 、组免疫2 ml含有鋁膠佐劑雙價疫苗，第2組免疫4 ml含有鋁膠佐劑雙彳貝疫苗，第3組免疫2 ml含有油質佐劑雙價疫 ^ 第4組免疫4 mi含有油質佐劑雙價疫苗，四組皆以肌肉主射方式進行一次免疫，並於免疫後3週採血以檢測 PMT及pR的中和抗體效價。 -72- 1285647 結果： PAR-PR雙價疫苗對抗多殺性巴氏桿菌的保護效用試驗：小鼠經皮下注射本實施例所製備的par_pr雙價疫苗來作兩次免疫後14天，以7xl07、7xl06與7xl05 CFU/0.5 ml 5 的多殺性巴氏桿菌活菌液來作攻毒試驗，而對照組則是使用 1·44χ1〇5、1·44χ104與 1·44χ103 CFU/0.5 ml的多殺性巴氏桿菌活菌液。結果對照組小鼠的LD50為2·1χ1〇3 CFU。至於免疫組的LDm為3.2xl06 CFU。因此，依據免疫組與對照組的LDm結果，免疫組的防禦指數為1524 [防禦指數= 10 (3·2χ1〇6 CFU/2-lxlO3 CFU)]。表 13 顯示依據本發明的 PAR-PR雙價疫苗對於小鼠的抗多殺性巴氏桿菌效力。表1 3 · PAR-PR雙價疫苗對於小鼠的多殺性巴氏桿菌效力試驗結果組別小鼠攻毒劑量死亡存活死亡存活死亡率（％) —^_數目（CFU/0.2 ml)數目數目累積累積（死亡/總數）LD501 2 PAR-PR 疫 1〇 7x107 1〇〇 22 0 loo 苗（W/O/W) 1〇 7xl°6 l〇〇 12 0 loo 3.2X106 10 7xl05 2828 20 10 1.44xl05 10 0 16 0 i〇〇對照組 10 1.44x10 6 4 6 4 60 2 1 y 103 -73- 1

_10 1.44X1Q3 0 10 〇 14 Q 2 以Behrens-Karber方程式來計算對照組的ld50。 PAR-PR雙價疫苗對抗假性狂犬病毒的保護效用試驗： 15 小鼠經皮下注射本實施例所製備的PAR-PR雙價疫苗來作兩次免疫，免疫後第14天，以5x105、5x1 〇4與5x103 TCID5〇/0.5 ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液來作攻毒否式驗’而對照組則疋使用lxl〇4、1x10]與lxl〇2 TCID50/O 5 ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液。結果對照組小鼠的 20 LD50為 429 TCID5〇。至於免疫組的 Ld5〇為 >5χ1〇5 。 1285647 因此，依據免疫組與對照組的ld5G結果，免疫組的防禦指數為大於 1166 [防禦指數=(>5xl〇5 TCID5G/429 TCID5G)]。表14顯示依據本發明的paR-PR雙價疫苗對於小鼠的抗假性狂犬病病毒效力。表1 4. PAR-PR雙價疫苗對於小鼠的假性狂犬病病毒效力試驗結果組別小鼠數目攻毒劑量死亡 (CFU/0.2 ml)數目存活數目死亡累積存活死亡率（％) (死亡/總數） ld50* PAR-PR 疫 10 5xl05 0 10 0 30 0 苗（W/0/W) 10 5xl04 0 10 0 20 0 >5χ1〇5 10 5xl03 0 10 0 10 0 10 lxlO4 10 0 20 0 100 對照組 10 lxlO3 8 2 10 2 80 429 10 lxlO2 2 8 2 10 20 *以Behrens-Karber方程式爽計笪斟昭细的τ/Πα。 PAR-PR雙價疫苗對於兔子的免疫效用：對照組的兔子於攻毒前的PMT中和抗體效價平均值為32倍，而PR中和抗體呈陰性反應（< 2倍）。以含油質佐 10劑的雙價疫苗予以免疫的兔子在免疫前的pmt中和抗體效價平均值為86倍，而PR中和抗體為5.33倍；而經兩次免疫後’ PMT中和抗體效價的平均升高為130.67倍，而PR中和抗體為74.6倍（圖21和圖22)。經兩次免疫的兔子連同對照組以100倍LD5G PR病毒 15 (TNL株）進行攻毒，結果以含油質佐劑的雙價疫苗予以免疫的兔子於攻毒後第8天有1隻死亡，而對照組的2隻兔子在攻毒後第4天皆出現劇癢症狀並死亡（表丨5)。 -74- 1285647 表15· PAR-PR雙價疫苗對於兔子的Pr保護效用試驗結果組別兔子數目攻毒前PR中和抗體效價 (平均值+標準偏差）死亡數目攻毒後死亡時間（曰）搔癢症狀兔子數目 PAR-PR ^ 苗（W/0/W) 3 74.6±36.95 1 8 0 對照組 2 <2 2 4 2 死亡的兔子在組織病變中可見劇癢部位的大腿肌肉出血、氣管黏膜層出血、肺泡腔内充滿粉紅均質的水腫液’其中以含鋁膠佐劑的雙價疫苗予以免疫並在攻毒後第 5 $天死亡的兔子其肝臟呈多發局部性壞死灶。 PAR-PR雙價疫苗對懷孕母豬的免疫效力·· 將含銘膠佐劑與油質佐劑的雙價疫苗分成2 ml及4 ml 兩種劑量且以肌肉注射來免疫懷孕母豬，並於免疫後3週採血以檢測PMT及PR中和抗體效價。在含鋁膠佐劑的雙價 10疫苗方面’以2 ml劑量予以免疫的母豬所測得的pmt中和抗體效價平均為88.4倍，而PR中和抗體效價平均為9〇.4 倍；以4 ml劑量予以免疫的母豬所測得的pmt中和抗體平均效價為75·2倍’而PR中和抗體平均效價為99·2倍。在含油質佐劑的雙價疫苗方面，以2 ml劑量予以免疫的母豬所 15測得的PMT中和抗體平均效價為88.8倍，而PR中和抗體平均效價為92.8倍；以4 ml劑量予以免疫的母豬所測得的 PMT中和抗體平均效價為1〇1·2倍，而卩尺中和抗體平均效價為110·5倍（圖23和24)。在本實施例中所使用的PAR疫苗組份與pR疫苗組 20伤，以小鼠來分別進行安全性與免疫效力試驗，結果証實這兩個疫苗組份皆具有良好的保護效力。將兩種疫苗組份 -75- 1285647 以鋁佐4膝或油質佐劑混合成par_pr雙價疫苗再進一步檢測其對小鼠的免疫效用，結果證實pAR_pR雙價疫苗對 PR病毋的攻擊亦可產生良好保護性。

進一步在分析不同佐劑對抗體揚升的比較上，兔子經 5 3 ’由貝佐劑的雙價疫苗予以免疫時所測得的抗PMT和PR 中和抗體效價平均值則分別為13〇·67倍和74.6倍。此外，在豬場的田間試驗中，懷孕母豬經以含鋁膠佐劑或油質佐劑的雙價疫苗免疫後，所產生的1>八11與1>11抗體效價均可揚升至64倍以上（圖23與24)，這顯示雙價疫苗能 10使母豬產生良好免疫保護的中和抗體效價，且由經免疫的母豬所分娩的新生仔豬也能藉由移行抗體而避免pAR與 PR的早期感染。於本說明書中被引述的所有文獻資料以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本發明的說明（包 15含界定在内）將佔上風。雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明的範圍和精神下，可作出很多的修改和變化。因此思欲的是’本發明只受如隨文檢附的申請專利範圍所示者的限制。 20 -76- 1285647 序列表 <110>國立中興大學 <120〉豬進行性萎縮性鼻炎(PAR)的預防、治療與偵測 <130> CP-19850 <160〉 13 <170> Patentln version 3.2 <210〉 1 <211> 4380 <212〉 DNA <213>多殺性巴氏桿菌(PMiei/re/h皿//ί) <220〉 <221> CDS <222〉（219)..(4076) <400〉 1 aacaagggaa aatagctaga ttagacgata tcgataatat cataaataat atttaaaaat tacgcccctt gacctagagg ggctttttta ttacatcaaa aaaataaacc caaacactgc gaatgtttgg ggttttattt ataaccaaaa tacattaata tgtttattaa gtaagcatta tcttacttta ggaataaact aacatagagg ttatggat atg aaa aca aaa cat ttt Met Lys Thr Lys His Phe 1 5 ttt aac tea gat ttt act gta aaa gga aaa agt gcc gat gaa att ttt Phe Asn Ser Asp Phe Thr Val Lys Gly Lys Ser Ala Asp Glu lie Phe 10 15 20 aga aga ttg tgt act gat cat cct gac aag caa tta aac aat gta aaa Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Pro Asp Lys Gin Leu Asn Asn Val Lys 25 30 35 tgg aaa gaa gtt ttt att aat cgt ttt ggt cag atg atg eta gat act Trp Lys Glu Val Phe He Asn Arg Phe Gly Gin Met Met Leu Asp Thr 40 45 50 cct aat ccg aga aag att gta gaa aaa att att aat gaa ggg ett gaa Pro Asn Pro Arg Lys He Val Glu Lys He He Asn Glu Gly Leu Glu 55 60 65 70 aaa caa ggc ctg aaa aat ata gat cct gaa act aca tat ttc aac att Lys Gin Gly Leu Lys Asn lie Asp Pro Glu Thr Thr Tyr Phe Asn lie 75 80 85 60 120 180 236 284 332 380 428 -77- 476 1285647 ttt tea tet tet gac age tee gat ggg aac gtt ttt cat tat aac tet 524

Phe Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Asn Val Phe His Tyr Asn Ser 90 95 100 tta tea gaa tee tat ega gtt act gat gee tgc eta atg aat att ttt 5Ί2

Leu Ser Glu Ser Tyr Arg Val Thr Asp Ala Cys Leu Met Asn He Phe 105 110 115 gtg gag cgt tat ttt gat gat tgg gac ttg eta aat age tta gee agt 620

Val Glu Arg Tyr Phe Asp Asp Trp Asp Leu Leu Asn Ser Leu Ala Ser 120 125 130 aat gga ata tat tea gta gga aaa gaa gga get tat tat cct gat cat 668

Asn Gly lie Tyr Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His 135 140 145 150 gat tat ggt cca gaa tat aac cct gtt tgg gga cca aac gaa caa att 716

Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gin He 155 160 165 tac cat tet aga gtg att gca gat ate ett tat get ege tee gta tgg 764

Tyr His Ser Arg Val He Ala Asp He Leu Tyr Ala Arg Ser Val Trp 170 175 180 gat gaa ttt aaa aaa tac ttc atg gag tat tgg caa aaa tat get cag 812

Asp Glu Phe Lys Lys Tyr Phe Met Glu Tyr Trp Gin Lys Tyr Ala Gin 185 190 195 ett tat acc gaa atg tta tet gat aca ttt ett gca atg get att cag 860

Leu Tyr Thr Glu Met Leu Ser Asp Thr Phe Leu Ala Met Ala He Gin 200 205 210 caa tat aca ega caa aeg ett act gat gaa ggc ttt ett atg gtt tgt 908

Gin Tyr Thr Arg Gin Thr Leu Thr Asp Glu Gly Phe Leu Met Val Cys 215 220 225 230 aac aca tat tat ggc aat aag gaa gaa gtt caa ata act eta eta gat 956

Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Lys Glu Glu Val Gin lie Thr Leu Leu Asp 235 240 245 ate tat gga tac cct tee act gat ata att tgt ata gag caa aaa ggg 1004

He Tyr Gly Tyr Pro Ser Thr Asp lie He Cys He Glu Gin Lys Gly 250 255 260 ett cct act cct aaa gtg ata ett tac att cct gga gga aca caa cca 1052

Leu Pro Thr Pro Lys Val He Leu Tyr He Pro Gly Gly Thr Gin Pro 265 270 275 -78- 1100 1285647 ttt gtt gaa ttt ctt aat aca gat gat ctg aaa caa tgg att gca tgg

Phe Val Glu Phe Leu Asn Thr Asp Asp Leu Lys Gin Trp lie Ala Trp 280 285 290 cat tta aaa gat aac aaa cat atg gtc cga ttc cgc aaa cat ttc teg

His Leu Lys Asp Asn Lys His Met Val Arg Phe Arg Lys His Phe Ser 295 300 305 310 eta aaa caa cgt cag gaa gga gaa aeg ttt aca ggt ata gat aaa gca

Leu Lys Gin Arg Gin Glu Gly Glu Thr Phe Thr Gly lie Asp Lys Ala 315 320 325 ctt caa tat att gca gaa gag tcc cct gaa tgg cct gcc aat aaa tac

Leu Gin Tyr He Ala Glu Glu Ser Pro Glu Trp Pro Ala Asn Lys Tyr 330 335 340 ate ctt tat aat ccg aca cat tta gaa aca gaa aat tta ttt aac ate

He Leu Tyr Asn Pro Thr His Leu Glu Thr Glu Asn Leu Phe Asn He 345 350 355 atg atg aag cga aca gaa cag egg atg ctt gaa gat agt gat gta cag

Met Met Lys Arg Thr Glu Gin Arg Met Leu Glu Asp Ser Asp Val Gin 360 365 370 att aga tea aat tea gaa get acc cgt gac tat get ctt tea tta etc

He Arg Ser Asn Ser Glu Ala Thr Arg Asp Tyr Ala Leu Ser Leu Leu 375 380 385 390 gaa acc ttt att tea cag tta tet gca ata gat atg tta gta cca gca

Glu Thr Phe lie Ser Gin Leu Ser Ala He Asp Met Leu Val Pro Ala 395 400 405 gta ggt ate cca att aat ttt gcc eta tea get aca gca tta gga ctt

Val Gly He Pro He Asn Phe Ala Leu Ser Ala Thr Ala Leu Gly Leu 410 415 420 age teg gat att gta gtt aat gga gat tea tat gaa aag aga aaa tat

Ser Ser Asp He Val Val Asn Gly Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Lys Tyr 425 430 435 gga att ggg tcc tta gtg caa tet gca tta ttc aca gga att aat ctt

Gly He Gly Ser Leu Val Gin Ser Ala Leu Phe Thr Gly He Asn Leu 440 445 450 att cca gtt att teg gaa acc gca gaa att tta tet tet ttc tet aga lie Pro Val lie Ser Glu Thr Ala Glu He Leu Ser Ser Phe Ser Arg 455 460 465 470 1148 1196 1244 1292 1340 1388 1436 1484 1532 1580 1628 -79- 1285647 aca gaa gaa gat att cca get ttt ttc act gaa gaa caa get tta get 1676

Thr Glu Glu Asp He Pro Ala Phe Phe Thr Glu Glu Gin Ala Leu Ala 475 480 485 caa ege ttt gaa ata gta gaa gaa gaa tta cat tet ate tea cct gat 1724

Gin Arg Phe Glu He Val Glu Glu Glu Leu His Ser He Ser Pro Asp 490 495 500 gat cct cct ega gaa att act gac gaa aat tta cat aaa att cgt ctg 1772

Asp Pro Pro Arg Glu He Thr Asp Glu Asn Leu His Lys lie Arg Leu 505 510 515 gta cgt ett aac aat gaa aat caa cct tta gtt gtg tta ega aga tta 1820

Val Arg Leu Asn Asn Glu Asn Gin Pro Leu Val Val Leu Arg Arg Leu 520 525 530 gga gga aat aaa ttt ate aga ate gag cct ata aca ttc cag gaa ata 1868

Gly Gly Asn Lys Phe lie Arg lie Glu Pro He Thr Phe Gin Glu lie 535 540 545 550 aaa ggt tet tta gta agt gaa gtt ata aat cca gtg act aat aaa aeg 1916

Lys Gly Ser Leu Val Ser Glu Val lie Asn Pro Val Thr Asn Lys Thr 555 560 565 tac tac gta age aat get aaa eta tta ggg ggc tet cct tat agt cct 1964

Tyr Tyr Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Ser Pro 570 575 580 ttc cgt att gga tta gaa ggt gtt tgg aca cca gag gta tta aaa gca 2012

Phe Arg He Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr Pro Glu Val Leu Lys Ala 585 590 595 aga get tee gtt att gga aag cct att gga gaa tea tat aaa aga ata 2060

Arg Ala Ser Val He Gly Lys Pro He Gly Glu Ser Tyr Lys Arg lie 600 605 610 tta gee aaa eta caa aga ata cat aac agt aat ate tta gat gag ega 2108

Leu Ala Lys Leu Gin Arg He His Asn Ser Asn lie Leu Asp Glu Arg 615 620 625 630 caa ggt tta atg cat gaa etc atg gag ett att gat ett tat gaa gaa 2156

Gin Gly Leu Met His Glu Leu Met Glu Leu He Asp Leu Tyr Glu Glu 635 640 645 teg caa cct tet tea gag cgt ttg aat get ttt cgt gaa ctg cgt act 2204

Ser Gin Pro Ser Ser Glu Arg Leu Asn Ala Phe Arg Glu Leu Arg Thr 650 655 660 -80- 1285647 caa tta gaa aaa gcg ctt tat ctt cct gaa atg gaa gca tta aaa aaa 2252

Gin Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Leu Pro Glu Met Glu Ala Leu Lys Lys 665 670 675 caa ata eta cag att cct aac aaa ggt tet ggt gcc get ega ttt tta 2300

Gin He Leu Gin He Pro Asn Lys Gly Ser Gly Ala Ala Arg Phe Leu 680 685 690 ctt cgt aca gcc atg aat gaa atg get gga aaa acc agt gaa age aeg 2348

Leu Arg Thr Ala Met Asn Glu Met Ala Gly Lys Thr Ser Glu Ser Thr 695 700 705 710 get gat tta ata ege ttt gcc ttg caa gat aca gta att tea gcg cct 2396

Ala Asp Leu lie Arg Phe Ala Leu Gin Asp Thr Val He Ser Ala Pro 715 720 725 ttt ege gga tat get ggt gcg att cca gag gca ata gac ttt cct gta 2444

Phe Arg Gly Tyr Ala Gly Ala He Pro Glu Ala He Asp Phe Pro Val 730 735 740 aaa tat gta ata gaa gac ata tet gta ttt gat aaa ata cag aca aat 2492

Lys Tyr Val He Glu Asp He Ser Val Phe Asp Lys He Gin Thr Asn 745 750 755 tac tgg gaa ctt cct get tat gaa age tgg aac gaa gga agt aat age 2540

Tyr Trp Glu Leu Pro Ala Tyr Glu Ser Trp Asn Glu Gly Ser Asn Ser 760 765 770 ega tta ctg cct ggt ttg tta cgt gaa teg caa age aag ggg atg tta 2588

Arg Leu Leu Pro Gly Leu Leu Arg Glu Ser Gin Ser Lys Gly Met Leu 775 780 785 790 agt aag tgt cgt ate ata gaa aat age ctt tat att gga cat age tat 2636

Ser Lys Cys Arg He He Glu Asn Ser Leu Tyr He Gly His Ser Tyr 795 800 805 gaa gaa atg ttt tac age att tet cca tat tea aac cag gtt gga ggg 2684

Glu Glu Met Phe Tyr Ser He Ser Pro Tyr Ser Asn Gin Val Gly Gly 810 815 820 cct tat gaa tta tat cct ttc act ttt ttc agt atg ctt caa gaa gta 2732

Pro Tyr Glu Leu Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Ser Met Leu Gin Glu Val 825 830 835 caa ggt gat tta gga ttt gag cag gcc ttt gcc aca cgt aac ttt ttc 2780

Gin Gly Asp Leu Gly Phe Glu Gin Ala Phe Ala Thr Arg Asn Phe Phe 840 845 850 -81 - 1285647 aat act ctt gtt tct gat cga eta tee tta atg gaa aat aeg atg tta 2828

Asn Thr Leu Val Ser Asp Arg Leu Ser Leu Met Glu Asn Thr Met Leu 855 860 865 870 ctt aca gaa agt ttt gat tat aca cct tgg gat get att tat gga gat 2876

Leu Thr Glu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Trp Asp Ala lie Tyr Gly Asp 875 880 885 att aat tat gat gaa caa ttt get gca atg tct att aat gaa ege ata 2924

He Asn Tyr Asp Glu Gin Phe Ala Ala Met Ser He Asn Glu Arg lie 890 895 900 gaa aaa tgt atg aat acc tat aga ggt gtg gca ttc caa aac tct tea 2972

Glu Lys Cys Met Asn Thr Tyr Arg Gly Val Ala Phe Gin Asn Ser Ser 905 910 915 aaa agt att gac ttt ttc eta aat aat eta acc aca ttc att gat aat 3020

Lys Ser He Asp Phe Phe Leu Asn Asn Leu Thr Thr Phe He Asp Asn 920 925 930 gga eta acc gaa att get ata tct gat tta ccg tat gat att gtg caa 3068

Gly Leu Thr Glu He Ala lie Ser Asp Leu Pro Tyr Asp He Val Gin 935 940 945 950 caa gaa ate tct caa ttc tta caa gga agt aat gaa tgg aaa aca ctt 3116

Gin Glu He Ser Gin Phe Leu Gin Gly Ser Asn Glu Trp Lys Thr Leu 955 960 965 gat gcc atg tta ttt aac tta gat aaa gga gat att aat ggt get ttc 3164

Asp Ala Met Leu Phe Asn Leu Asp Lys Gly Asp He Asn Gly Ala Phe 970 975 980 aga aag ctt ctg caa tea gca aaa gat aat aat ata aaa ttt aga get 3212

Arg Lys Leu Leu Gin Ser Ala Lys Asp Asn Asn lie Lys Phe Arg Ala 985 990 995 ata ggg cat tea gat aat tct gtt ccg cca ttt aat aac cct tat 3257 lie Gly His Ser Asp Asn Ser Val Pro Pro Phe Asn Asn Pro Tyr 1000 1005 1010 aag tct tta tat tat aaa gga aat ata ata get gaa gca att gaa 3302

Lys Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Asn He lie Ala Glu Ala He Glu 1015 1020 1025 aaa eta gat cga gaa ggt caa aaa ttt gtt gta ttt get gat agt 3347

Lys Leu Asp Arg Glu Gly Gin Lys Phe Val Val Phe Ala Asp Ser 1030 1035 1040 -82- 1285647 tct ctg etc aac age aeg cct ggg aca ggt cgt cct atg cca gga 3392

Ser Leu Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly 1045 1050 1055 eta gtt caa tat tta aaa ata cca gca act gta gta gat age gat 3437

Leu Val Gin Tyr Leu Lys lie Pro Ala Thr Val Val Asp Ser Asp 1060 1065 1070 ggt gca tgg caa ttt ett cca gat gta get tea age aga gtt cct 3482

Gly Ala Trp Gin Phe Leu Pro Asp Val Ala Ser Ser Arg Val Pro 1075 1080 1085 att gaa gtt aca gag tta gaa aat tgg caa gtc tta act cct cca 3527 lie Glu Val Thr Glu Leu Glu Asn Trp Gin Val Leu Thr Pro Pro 1090 1095 1100 caa ggt aag att ett gga tta aag caa ttt aag tta aeg gca ggt 3572

Gin Gly Lys He Leu Gly Leu Lys Gin Phe Lys Leu Thr Ala Gly 1105 1110 1115 ttt cca aca gaa caa agt ege tta cct ett tta gag aat teg gtt 3617

Phe Pro Thr Glu Gin Ser Arg Leu Pro Leu Leu Glu Asn Ser Val 1120 1125 1130 tct gaa gat tta agg gaa gaa tta atg caa aag att gat gca ata 3662

Ser Glu Asp Leu Arg Glu Glu Leu Met Gin Lys He Asp Ala He 1135 1140 1145 aaa aat gat gtg aaa atg aat agt tta gtg tgt atg gaa get ggc 3707

Lys Asn Asp Val Lys Met Asn Ser Leu Val Cys Met Glu Ala Gly 1150 1155 1160 tct tgt gat tea gta age cct aag gta get gee cgt ett aaa gat 3752

Ser Cys Asp Ser Val Ser Pro Lys Val Ala Ala Arg Leu Lys Asp 1165 1170 1175 atg ggg tta gaa get ggg atg ggt get tct att acc tgg tgg aga 3797

Met Gly Leu Glu Ala Gly Met Gly Ala Ser He Thr Trp Trp Arg 1180 1185 1190 cgt gaa ggc ggg atg gaa ttt tea cat cag atg cat act act get 3842

Arg Glu Gly Gly Met Glu Phe Ser His Gin Met His Thr Thr Ala 1195 1200 1205 tee ttt aaa ttt get ggt aaa gag ttt gee gtg gat get tea cat 3887

Ser Phe Lys Phe Ala Gly Lys Glu Phe Ala Val Asp Ala Ser His 1210 1215 1220 -83- 1285647 tta caa ttt gta cac gac caa tta gat aca act ate ctg ata eta Leu Gin Phe Val His Asp Gin Leu Asp Thr Thr He Leu lie Leu 1225 1230 1235 ect gta gat gat tgg get tta gaa ata get caa aga aat egg get Pro Val Asp Asp Trp Ala Leu Glu lie Ala Gin Arg Asn Arg Ala 1240 1245 1250 att aat cct ttt gtg gaa tat gtt agt aaa aca gga aac atg tta lie Asn Pro Phe Val Glu Tyr Val Ser Lys Thr Gly Asn Met Leu 1255 1260 1265 gca etc ttc atg cct cct ett ttc aca aag cct ege tta aca aga Ala Leu Phe Met Pro Pro Leu Phe Thr Lys Pro Arg Leu Thr Arg 1270 1275 1280 gca eta taa ctaattaaaa actgtattaa ageettatat tataaggett Ala Leu 1285 taattttctt tcaagaatta ttaagtagaa gaatcaaaat caatgagata gataaaatca aatgttatta ccaatacaac tttcttaagt atactttttg aattttttgc gttaataaat ttataatacc cttaactcaa taaaagaagt tattgagaag tttaaatctt gtgagcaaga tgaagatata atttcagcaa tegatettat tagegettea tatagaaggg ctgtggatgc agtggaacaa agattcggtt ctag <210〉 2 <211> 1285 <212〉 PRT <213> 多殺性巴氏桿菌(i/a ) <400〉 2 Met Lys Thr Lys His Phe Phe Asn Ser Asp Phe Thr Val Lys Gly Lys 15 10 15 Ser Ala Asp Glu He Phe Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Pro Asp Lys 20 25 30 Gin Leu Asn Asn Val Lys Trp Lys Glu Val Phe He Asn Arg Phe Gly 35 40 45 Gin Met Met Leu Asp Thr Pro Asn Pro Arg Lys He Val Glu Lys lie 50 55 60 He Asn Glu Gly Leu Glu Lys Gin Gly Leu Lys Asn lie Asp Pro Glu 65 70 75 80 3932 3977 4022 4067 4116 4176 4236 4296 4356 4380 -84- 1285647

Thr Thr Tyr Phe Asn He Phe Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Asn 85 90 95

Val Phe His Tyr Asn Ser Leu Ser Glu Ser Tyr Arg Val Thr Asp Ala 100 105 110

Cys Leu Met Asn He Phe Val Glu Arg Tyr Phe Asp Asp Trp Asp Leu 115 120 125

Leu Asn Ser Leu Ala Ser Asn Gly He Tyr Ser Val Gly Lys Glu Gly 130 135 140

Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp 145 150 155 160

Gly Pro Asn Glu Gin He Tyr His Ser Arg Val He Ala Asp lie Leu 165 170 175

Tyr Ala Arg Ser Val Trp Asp Glu Phe Lys Lys Tyr Phe Met Glu Tyr 180 185 190

Trp Gin Lys Tyr Ala Gin Leu Tyr Thr Glu Met Leu Ser Asp Thr Phe 195 200 205

Leu Ala Met Ala He Gin Gin Tyr Thr Arg Gin Thr Leu Thr Asp Glu 210 215 220

Gly Phe Leu Met Val Cys Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Lys Glu Glu Val 225 230 235 240

Gin He Thr Leu Leu Asp lie Tyr Gly Tyr Pro Ser Thr Asp lie He 245 250 255

Cys He Glu Gin Lys Gly Leu Pro Thr Pro Lys Val lie Leu Tyr He 260 265 270

Pro Gly Gly Thr Gin Pro Phe Val Glu Phe Leu Asn Thr Asp Asp Leu 275 280 285

Lys Gin Trp lie Ala Trp His Leu Lys Asp Asn Lys His Met Val Arg 290 295 300

Phe Arg Lys His Phe Ser Leu Lys Gin Arg Gin Glu Gly Glu Thr Phe 305 310 315 320

Thr Gly He Asp Lys Ala Leu Gin Tyr He Ala Glu Glu Ser Pro Glu 325 330 335

Trp Pro Ala Asn Lys Tyr lie Leu Tyr Asn Pro Thr His Leu Glu Thr 340 345 350

Glu Asn Leu Phe Asn lie Met Met Lys Arg Thr Glu Gin Arg Met Leu 355 360 365 -85- 1285647

Glu Asp Ser Asp Val Gin lie Arg Ser Asn Ser Glu Ala Thr Arg Asp 370 375 380

Tyr Ala Leu Ser Leu Leu Glu Thr Phe lie Ser Gin Leu Ser Ala He 385 390 395 400

Asp Met Leu Val Pro Ala Val Gly He Pro lie Asn Phe Ala Leu Ser 405 410 415

Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ser Ser Asp He Val Val Asn Gly Asp Ser 420 425 430

Tyr Glu Lys Arg Lys Tyr Gly He Gly Ser Leu Val Gin Ser Ala Leu 435 440 445

Phe Thr Gly lie Asn Leu lie Pro Val He Ser Glu Thr Ala Glu lie 450 455 460

Leu Ser Ser Phe Ser Arg Thr Glu Glu Asp lie Pro Ala Phe Phe Thr 465 470 475 480

Glu Glu Gin Ala Leu Ala Gin Arg Phe Glu lie Val Glu Glu Glu Leu 485 490 495

His Ser He Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu lie Thr Asp Glu Asn 500 505 510

Leu His Lys He Arg Leu Val Arg Leu Asn Asn Glu Asn Gin Pro Leu 515 520 525

Val Val Leu Arg Arg Leu Gly Gly Asn Lys Phe lie Arg He Glu Pro 530 535 540

He Thr Phe Gin Glu He Lys Gly Ser Leu Val Ser Glu Val lie Asn 545 550 555 560

Pro Val Thr Asn Lys Thr Tyr Tyr Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly 565 570 575

Gly Ser Pro Tyr Ser Pro Phe Arg lie Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr 580 585 590

Pro Glu Val Leu Lys Ala Arg Ala Ser Val He Gly Lys Pro He Gly 595 600 605

Glu Ser Tyr Lys Arg lie Leu Ala Lys Leu Gin Arg lie His Asn Ser 610 615 620

Asn He Leu Asp Glu Arg Gin Gly Leu Met His Glu Leu Met Glu Leu 625 630 635 640

He Asp Leu Tyr Glu Glu Ser Gin Pro Ser Ser Glu Arg Leu Asn Ala 645 650 655 -86- 1285647

Phe Arg Glu Leu Arg Thr Gin Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Leu Pro Glu 660 665 670

Met Glu Ala Leu Lys Lys Gin lie Leu Gin lie Pro Asn Lys Gly Ser 675 680 685

Gly Ala Ala Arg Phe Leu Leu Arg Thr Ala Met Asn Glu Met Ala Gly 690 695 700

Lys Thr Ser Glu Ser Thr Ala Asp Leu lie Arg Phe Ala Leu Gin Asp 705 710 715 720

Thr Val lie Ser Ala Pro Phe Arg Gly Tyr Ala Gly Ala He Pro Glu 725 730 735

Ala lie Asp Phe Pro Val Lys Tyr Val He Glu Asp lie Ser Val Phe 740 745 750

Asp Lys lie Gin Thr Asn Tyr Trp Glu Leu Pro Ala Tyr Glu Ser Trp 755 760 765

Asn Glu Gly Ser Asn Ser Arg Leu Leu Pro Gly Leu Leu Arg Glu Ser 770 775 780

Gin Ser Lys Gly Met Leu Ser Lys Cys Arg He He Glu Asn Ser Leu 785 790 795 800

Tyr He Gly His Ser Tyr Glu Glu Met Phe Tyr Ser He Ser Pro Tyr 805 810 815

Ser Asn Gin Val Gly Gly Pro Tyr Glu Leu Tyr Pro Phe Thr Phe Phe 820 825 830

Ser Met Leu Gin Glu Val Gin Gly Asp Leu Gly Phe Glu Gin Ala Phe 835 840 845

Ala Thr Arg Asn Phe Phe Asn Thr Leu Val Ser Asp Arg Leu Ser Leu 850 855 860

Met Glu Asn Thr Met Leu Leu Thr Glu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Trp 865 870 875 880

Asp Ala He Tyr Gly Asp He Asn Tyr Asp Glu Gin Phe Ala Ala Met 885 890 895

Ser He Asn Glu Arg He Glu Lys Cys Met Asn Thr Tyr Arg Gly Val 900 905 910

Ala Phe Gin Asn Ser Ser Lys Ser He Asp Phe Phe Leu Asn Asn Leu 915 920 925

Thr Thr Phe He Asp Asn Gly Leu Thr Glu He Ala He Ser Asp Leu 930 935 940 -87- 1285647

Pro Tyr Asp He Val Gin Gin Glu He Ser Gin Phe Leu Gin Gly Ser 945 950 955 960

Asn Glu Trp Lys Thr Leu Asp Ala Met Leu Phe Asn Leu Asp Lys Gly 965 970 975

Asp lie Asn Gly Ala Phe Arg Lys Leu Leu Gin Ser Ala Lys Asp Asn 980 985 990

Asn He Lys Phe Arg Ala He Gly His Ser Asp Asn Ser Val Pro Pro 995 1000 1005

Phe Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Asn lie He 1010 1015 1020

Ala Glu Ala He Glu Lys Leu Asp Arg Glu Gly Gin Lys Phe Val 1025 1030 1035

Val Phe Ala Asp Ser Ser Leu Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly 1040 1045 1050

Arg Pro Met Pro Gly Leu Val Gin Tyr Leu Lys He Pro Ala Thr 1055 1060 1065

Val Val Asp Ser Asp Gly Ala Trp Gin Phe Leu Pro Asp Val Ala 1070 1075 1080

Ser Ser Arg Val Pro lie Glu Val Thr Glu Leu Glu Asn Trp Gin 1085 1090 1095

Val Leu Thr Pro Pro Gin Gly Lys He Leu Gly Leu Lys Gin Phe 1100 1105 1110

Lys Leu Thr Ala Gly Phe Pro Thr Glu Gin Ser Arg Leu Pro Leu 1115 1120 1125

Leu Glu Asn Ser Val Ser Glu Asp Leu Arg Glu Glu Leu Met Gin 1130 1135 1140

Lys lie Asp Ala He Lys Asn Asp Val Lys Met Asn Ser Leu Val 1145 1150 1155

Cys Met Glu Ala Gly Ser Cys Asp Ser Val Ser Pro Lys Val Ala 1160 1165 1170

Ala Arg Leu Lys Asp Met Gly Leu Glu Ala Gly Met Gly Ala Ser 1175 1180 1185

He Thr Trp Trp Arg Arg Glu Gly Gly Met Glu Phe Ser His Gin 1190 1195 1200

Met His Thr Thr Ala Ser Phe Lys Phe Ala Gly Lys Glu Phe Ala 1205 1210 1215 •88- 1285647

Val Asp Ala Ser His Leu Gin Phe Val His Asp Gin Leu Asp Thr 1220 1225 1230

Thr lie Leu He Leu Pro Val Asp Asp Trp Ala Leu Glu lie Ala 1235 1240 1245

Gin Arg Asn Arg Ala He Asn Pro Phe Val Glu Tyr Val Ser Lys 1250 1255 1260

Thr Gly Asn Met Leu Ala Leu Phe Met Pro Pro Leu Phe Thr Lys 1265 1270 1275

Pro Arg Leu Thr Arg Ala Leu 1280 1285 <210> 3 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉人工的 <220〉 <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引子 <400〉 3 agaggttatg gatccgaaaa caaaacattt t 31 <210〉 4 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工的 <220〉 <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引子 <400〉 4 atagtagaag aagaattaca 20 <210> 5 <211〉 34 <212〉 DNA <213>人工的 <220〉 <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引子 <400> 5 -89- 1285647 ctaacataga ggccatggat atgaaaacaa aaca <210〉 6 <211〉 34 <212〉 DNA <213>人工的 <220〉 <223〉多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引子 <400〉 6 acttcgtaca gccatgaatg aaatggctgg aaaa <210〉 7 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工的 <220〉 <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引子 <400〉 7 actcaattag aaaaagcgct <210〉 8 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人工的 <220> <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引子 <400〉 8 ctactacagt tgctggtatt <210〉 9 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工的 <220〉 <223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引子 <400〉 9 1285647 attgttaaga cgtaccagac ga <210〉 10 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉 <220〉人工的 <223〉多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引子 <400〉 10 ctcttgttaa gctagccttt gtgaaaagag gag <210〉 11 <211〉 20 <212〉 DNA <213> <220〉人工的 <223> 多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引子 <400〉 11 ttcttccctt aaatcttcag <210〉 12 <211〉 32 <212> DNA <213〉 <220〉人工的 <223〉多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引子 <400〉 12 tcactggttt ttccagccat ttcattcatg gc <210〉 13 <211〉 10 <212〉 DNA <213〉人工的 <220〉 <223>合成的隨機引子 1285647 <400〉 13 aagcggcctc 1285647 【圖式簡單說明】圖1與2分別顯示9個多殺性巴氏桿菌分離株的pmt 蛋白質電泳及西方墨點分析結果，其中道Μ :標記；道 1 : ATCC 12945 ;道2 : ΡΜΑ 33 ;道3 : ΡΜΑ 2 ;道4 : 5 ΡΜΑ 10 ;道 5 : PMD 20 ;道 6 : ATCC 7707 ;道 7 : PMD 21 ;道8 : PMD 48 ;以及道9 : NCTC 12178 ; 圖3與圖4分別顯示使用丑/^ /來消化多殺性巴氏桿菌分離株的染色體DNA所進行的限制片段長度多型性分析（Restriction fragment length polymorphism， 10 RFLP)結果以及多殺性巴氏桿菌分離株的PMT編碼基因的南方雜合反應結果，其中道M:標記；道1: ATCC 12945 ;道2 : PMA 33 ;道3 : PMA 2 ;道4 : PMA 10 ; 道 5 : PMD 27 ;道 6 : PMD 20 ;道 7 : PMD 48 ;以及道 8 : NCTC 12178 ；

15 圖5顯示藉由PCR方法使用不同的引子來檢測PMT 編碼基因的結果，其中道M:標記；道1 : J1J2 (1227 bp); 道2 : A3B2 (3869 bp);道3 : A3B1 (1 588 bp);道4 : A2B3 (1949 bp);道 5: A4B2 (1768 bp);道6: A1B4 (2135 bp);以及道7 : A1B1 (1 587 bp); 2〇圖6顯示於42°C下使用引子A3B2來鑑定多殺性巴氏桿菌分離株的PMT編碼基因的結果，其中道Μ :標記；道 1 : ΡΜΑ 33 ;道 2 : ATCC 12945 ;道 3 : ΡΜΑ 2 ; 道4 : PMA 10 ;道 5 : PMD 27 ;道 6 : PMD 20 ;道 7 : ATCC 7707 ;道8 : PMD 21 ;道9 : PMD 48 ;以及道 1〇 : -93- 1285647 NCTC 12178 ；圖7顯示使用所設計的J1J2引子以1 %瓊脂糖凝膠電泳來進行多殺性巴氏桿菌分離株的Ρ Μ T編碼基因 PCR分析的結果，其中道Μ ·· 1 kb標記；道1 : ΡΜΑ 33 ; 5 道 2 : PMA 59 ;道 3 : PMA 2 ;道 4 : PMA 10 ;道 5 : PMD 20 ;道6 ·· PMD 27 ;道7 : PMD 48 ;以及道8 : PMD 21 ;

圖8顯示使用J-20隨機引子來進行多殺性巴氏桿菌分離株的隨機擴增的多型性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)分析的結果，其中道 μ : 1 kb 10 標記；道 1 : PMA 33 ;道 2 : PMA 59 ;道 3 : PMA 2 ;道 4 : PMA 10 ;道 5 : PMD 20 ;道 6 : PMD 27 ;道 7 : PMD 48 ;以及道 8 : PMD 21 ; 圖 9顯示使用 DNASTAR®W MegAlign pr〇gram來進行台灣本土的多殺性巴氏桿菌分離株與D型多殺性巴 15氏桿菌（NCTC 12178)的PMT編碼基因的核苷酸序列比較；圖10示意說明依據本發明所選殖出的編碼pMT次單位的DNA片段分別對應於PMT編碼基因的所在位置；圖11顯示攜帶有依據本發明所選殖出的編碼PMT 20次單位的DNA片段的線形重組型載體的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中道1 : NEB i kb標記；道2 :對照組載體（空載體pET 32a，5900 bp);道3 :重組型載體τ〇χ1 (7326 bp);道4 :重組型載體τ〇χ2 (74〇8 bp);道5 :重組型載體T〇x7 (6790 bp);道6:對照組載體（空載體ρΕτ -94· 1285647 25b，5547 bp);以及道 7:重組型載體 Τοχ6 (9356 bp); 圖12顯示由本發明所得到的重組型載體選殖株的表現而收穫的重組型PMT次單位的SDS-PAGE結果，其中道 1 : BIO-RAD廣範圍標記（BI〇_RAD Broad Range 5 Standards);道2 : Toxl 重組型蛋白質（86 kDa);道3 :

Tox2重組型蛋白質（86 kDa);道4 : Tox7重組型蛋白質 (5 5.4 kDa);道 5 : Τοχ6 重組型蛋白質（158 kDa);道 6 : 天然 PMT蛋白質（155 kDa);以及道 7 : pET 32b/BL21 (DE3)； ίο 圖13與圖14分別顯示由本發明所得到的重組型載體選殖株的表現而收穫的重組型PMT次單位在使用抗 -PMT單株抗體7-1 0A與多源抗體下的西方式點墨法分析結果’其中道1 : BIO-RAD廣範圍標記；道2 : τ〇χι 重組型蛋白質（86 kDa);道3 : Toχ2重組型蛋白質（86 15 kDa);道 4 : Τοχ7重組型蛋白質（55_4 kDa);道 5 : Τοχ6 重組型蛋白質（158 kDa);道6 :天然PMT蛋白質（155 kDa)；以及道7 : pET 32b/BL21 (DE3); 圖1 5 -17顯示由本發明所得到的重組型載體選殖株的表現而收穫的重組型PMT次單位對於非洲綠猴腎纖 20維細胞（Ver〇 cell)的細胞毒性，其中圖15 : Ver〇細胞的正常細胞型態；圖1 6 :使用天然pmt蛋白質的最小毒性劑量（140 ng/ml)來處理Vero細胞後造成結節細胞病變；以及圖17 :以Toxl重組型蛋白質（1 mg/ml)來處理 Vero細胞，並沒有產生結節細胞病變； -95- 1285647 圖18是養於一沒有PAR病例的一貫作業豬場内的母豬’於懷孕第85天時以rsPMT細菌疫苗予以免疫，並於分娩時採集其初乳及血清來進行中和效價分析的結果；、" 5 圖19是養於一有par病例的一貫作業豬場内的母豬’於懷孕第85天時以rsPMT細菌疫苗予以免疫，並於分挽時所採集的血清與初乳的中和抗體效價分析結果；、口圖20是圖1 9中所檢測的母豬所產下的仔豬分別於 1〇 4與6週大時，以rsPMT細菌疫苗予以免疫，並於疫苗接種的12與18個月之後，於宰殺後取豬頭來進行鼻甲介骨肉眼檢查的結果；圖21顯示兔子在以本發明的Par-pr雙價疫苗來免疫之前與之後的血清PMT中和抗體變化情形，其中橫轴為免疫次數，而縱轴為中和抗體效價（L〇g2); 圖22顯示兔子在以本發明的PAr_pr雙價疫苗來免疫之則與之後的血清PR中和抗體變化情形，其中橫軸為免疫次數，而縱軸為中和抗體效價（L〇g2); 圖23顯示懷孕母豬在以本發明的Par-Pr雙價疫苗 2 0 來备产疫之前與之後的血清PMT中和抗體變化情形，其中車由為抗體效價，而縱軸為母豬頭數；以及圖24顯示懷孕母豬在以本發明的par_pr雙價疫苗 '免疫之前與之後的血清Pr中和抗體變化情形，其中車由為抗體效價，而縱軸為母豬頭數。 -96- 1285647 【主要元件符號說明】 (無）

Claims

十、申請專利範圍：第093125156號專利申請案申請專利範圍修正本修正日期：96年06月 1. 一種針對進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR) 的動物用疫苗，其包含有： (a) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素（尸asiwreZ/a toxin，PMT)蛋白質（SEQ ID NO:2)的2-486胺基酸殘基； (b) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質 (SEQIDNO:2)的486-986胺基酸殘基；以及 (c) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質 (SEQ ID N0:2)的986-1281 胺基酸殘基。 2. 如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其可供用於防治豬隻的進行性萎縮性鼻炎。 3. 如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌A型分離株的PMT蛋白質。 4·如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株的PMT蛋白質。 5·如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株PMD 48的 PMT蛋白質。 6·如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗所包含的三 1285647 種多狀組份是合成產物。 7·如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是重組型產物。 8.如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該多肽組份(a)係為 5 一第一DNA片段所編碼，該第一DNA片段具有一核苷酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為模版並以一具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列之前向引子A1與一具有SEQ ID NO:1〇所示的核苷酸序列之反向引子B2來進行PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶與奶ndlll切割後所形成的一個1456 bp 10 奶以III片段所具有的核苷酸序列。 9·如申請專利範圍第8項的動物用疫苗，其中該第一 DNA片段被插入於一載體内而形成一第一重組型載體。 10.如申請專利範圍第9項的動物用疫苗，其中該第一重組型載體是重組型載體Toxl。 15 1L如申請專利範圍第9項的動物用疫苗，其中該第一重組型載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份(a)的經轉形的大腸桿菌細胞。 12·如申請專利範圍第^員的動物用疫苗，其中該.多肽組份(b)係為一第二DNA片段所編碼，該第二DNA片段具有一核苷酸序列是 20 實質地對應於以PMT編碼基因作為模版並以如申請專利範圍第8項中所述的前向引子A1與反向引子B2來進行PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶历ndll切割後所形成的一個1502 bp 历以1π-%·μιιι片段所具有的核苷酸序列。 13.如申請專利範圍第12項的動物用疫苗，其中該第二DNA片段被 2 1285647 插入於一載體内而形成一第二重組型載體。 14·如申請專利範圍第13項的動物用疫苗，其中該第二重組是重組型載體Tox2。體 15·如申請專利範圍第13項的動物用疫苗，其中該第二重組型 5 破轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份(b)的經轉形的大腸桿菌細胞。遲 16·=申請專利範圍㈣的動物用疫苗，其中該多肽組份⑷係為 —第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核脊酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為模版並以如申請專利範圍 10 第8項中所述的前向引子A1與反向引子B2來進行PCR後所得到的pCR擴增產物以限制酶出切割後所形成的一個 883 bp片段所具有的核苷酸序列。 17·如申請專利範圍第16項的動物用疫苗，其中該第三DNa片段被插入於一載體内而形成一第三重組型載體。 15 18_如申請專利範圍第Π項的動物用疫苗，其中該第三重組型載體是重組型載體Tox7。 19·如申請專利範圍第π項的動物用疫苗，其中該第三重組型載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份(C)的經轉形的大腸桿菌細胞。 20 2〇 •如申請專利範圍第1項的動物用疫苗，其中該疫苗進一步包含有下列的至少一者·· ΡΜΤ類毒素、Α型多殺性巴氏桿菌細胞、D 型多殺性巴氏桿菌細胞以及支氣管敗血博德氏菌細胞。 •如申請專利範圍第丨項的動物用疫苗，其中該疫苗進一步包含有一選自於下列群組中的佐劑：弗倫氏完全佐劑、弗倫氏不完 21 1285647 全佐劑、鋁膠、油質佐劑(W/0/W型）、油包水型(W/0)乳劑、水包油型（O/W)乳劑、刀豆素A (Con A)、β-葡聚醣，以及此等的一個組合。 22· 一種能防治至少進行性萎縮性鼻炎的動物用多價疫苗，其包含 5 有： ⑴與進行性萎縮性鼻炎有關的抗原組份： (a) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於多殺性巴氏桿菌毒素CPasieMreZZa toxin，PMT)蛋白質 (SEQIDN0:2)的2-486胺基酸殘基； 10 ^ (b) —多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質（SEQIDNO:2)的486-986胺基酸殘基；以及 (c) 一多肽，其具有一胺基酸序列是大體上對應於PMT蛋白質（SEQIDN0:2)的986-1281胺基酸殘基；以及 (u)至少一種與豬隻疾病有關聯的病原性抗原或其抗原決定位。女申叫專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其可供用於防治豬隻的進行性萎縮性鼻炎。 Λ 如申4專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗所包含的—種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌Α型分離株的ρΜτ蛋白質。 20 25 μ ^ Ώ凊專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗所包含的-種夕肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株的ρΜτ蛋白質。 26·如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺性巴氏桿菌D型分離株腦48 4 1285647 的PMT蛋白質。 27·如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗所包含的三種多肽組份是合成產物。、 28.如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗所包含 5 的三種多肽組份是重組型產物。 29·如申請專利範圍第22項的動物用疫苗，其中該多肽組份(a)係為一第一DNA片段所編碼，該第一DNA片段具有一核苷酸序列是貫λ地對應於以PMT編碼基因作為模版並以一具有seq id N0:3所示的核苷酸序列之前向引子Ai與一具有犯〇 ID _:1〇所 10 示的核苷酸序列之反向引子B2來進行PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶與历μΙΠ切割後所形成的一個1456冲片段戶斤具有的核苷酸序列。 30.如申請專利範圍第29項的動物用多價疫苗，其中該第一DNA片段被插入於一載體内而形成一第一重組型載體。 15 31·如申請專利範圍第30項的動物用多價疫苗，其中該第一重組型載體是重組型載體Τοχΐ。 32·如巾請專祕圍第3G項的動物用多價疫苗，其中該第一重組型載體被轉形至大腸桿g細軸，因而形成能生成該多肽組份⑻ 的經轉形的大腸桿菌細胞。 2〇 33.如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其巾該多肽組份(b) 係為-第：DNA片段所編碼，該第：DNA片段具有一核㈣序列是實質地對應於以PMT編瑪基因作為模版並以如申請專利範圍第29項中所述的前向引子M與反向引子B2來進行pcR後所得到的PCR擴增產物以限制酶付切割後所形成的一個碉 1285647 1502 5ρ/^>^/ΙΙΙ-///ηπΐΙ片段所具有的核苷酸序列。 34. 如申請專利範圍第33項的動物用多價疫苗，其中該第二DNA片段被插入於一載體内而形成一第二重組型載體。 35. 如申請專利範圍第34項的動物用多價疫苗，其中該第二重組型 5 載體是重組型載體Τοχ2。 36. 如申請專利範圍第34項的動物用多價疫苗，其中該第二重組型載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份(b) 的經轉形的大腸桿菌細胞。 37. 如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該多肽組份⑷ 10 係為一第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核苷酸序列是實質地對應於以PMT編碼基因作為模版並以如申請專利範圍第29項中所述的前向引子A1與反向引子B2來進行PCR後所得到的PCR擴增產物以限制酶ί^ηύίΙΙΙ與iV/iel切割後所形成的一個883 bp/Z/ndlll-TV/^I片段所具有的核苷酸序列。 15 38.如申請專利範圍第37項的動物用多價疫苗，其中該第三DNA片段被插入於一載體内而形成一第三重組型載體。

39. 如申請專利範圍第38項的動物用多價疫苗，其中該第三重組型載體是重組型載體Tox7。 40. 如申請專利範圍第38項的動物用多價疫苗，其中該第三重組型 20 載體被轉形至大腸桿菌細胞内，因而形成能生成該多肽組份(c) 的經轉形的大腸桿菌細胞。 41. 如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其包含有去活化的假性狂犬病gE缺損病毒作為組份(ii)，以供防治假性狂犬病。 42. 如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗進一步 6 1285647 包含有下列的至少一者·· PMT類毒素、A型多殺性巴氏桿菌細胞、D型多殺性巴氏桿菌細胞以及支氣管敗血博德氏菌細胞。 43.如申請專利範圍第22項的動物用多價疫苗，其中該疫苗進一步包含有一選自於下列群組中的佐劑··弗倫氏完全佐劑、弗倫氏 5 不完全佐劑、鋁膠、油質佐劑(W/O/W型）、油包水型（W/0)乳劑、水包油型（0/W)乳劑、刀豆素A (Con A)、β-葡聚醣，以及此等的一個組合。 7 1285647 七、指定代表圖： (一）本案指定代表圖為：第（10)圖。 (二）本代表圖之元件符號簡單說明： (無）八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）