KR20240026204A - 사포바이러스 백신 - Google Patents

사포바이러스 백신 Download PDF

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KR20240026204A
KR20240026204A KR1020247002882A KR20247002882A KR20240026204A KR 20240026204 A KR20240026204 A KR 20240026204A KR 1020247002882 A KR1020247002882 A KR 1020247002882A KR 20247002882 A KR20247002882 A KR 20247002882A KR 20240026204 A KR20240026204 A KR 20240026204A
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앨런 존 영
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브이에스티 엘엘씨 디비에이 메디진 랩스
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Abstract

본 발명은 설사병을 야기하는 병원체에 대한 면역화에 사용될 수 있는 항원을 포함하는 사포바이러스 항원 이외의 항원을 함유하는 면역원성 조성물을 포함하는 사포바이러스의 면역원성 폴리펩티드를 함유하는 면역원성 조성물을 기재한다. 또한, 개시된 면역원성 조성물로 면역 반응을 유도하는 방법 및 사포바이러스 감염의 치료 방법이 기재되어 있다.

Description

사포바이러스 백신
본 발명은 일반적으로 사포바이러스(Sapoviruses)에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사포바이러스의 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물 (예를 들어, 백신)에 관한 것이다. 또한, 면역원성 조성물은 사포바이러스 항원 이외의 항원을 함유할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물로 면역 반응을 유도하는 방법 및 사포바이러스 감염의 치료 방법이 기재되어 있다.
사포바이러스 (삿포로-유사 바이러스라고도 함)는 급성 위장염의 원인균 (etiological agents)이다. 사포바이러스는 단일-가닥의 양성-센스 게놈 RNA를 함유하는, 직경 27-35 nm의 작은, 비외피(nonenveloped) 바이러스의 칼리시비리대 과 (Caliciviridae family)의 구성원이다.
바이러스의 자연 숙주(Natural hosts)는 인간 및 돼지이다. 바이러스는 구강/대변 접촉을 통해 전염된다. 가장 흔한 증상은 설사 및 구토를 포함한다. 사포바이러스는 1977년 일본 삿포로의 고아원에서 발생한 위장염에서 처음 발견되었다.
1-4일의 잠복기(incubation period) 이후, 질병의 징후가 나타나기 시작한다. 사포바이러스의 증상은 노로바이러스의 증상과 매우 유사하다. 가장 흔한 증상은 구토 및 설사이다; 그러나, 추가적인 증상이 발생할 수도 있다 - 발열은 매우 드물다. 개체는 1-4일의 잠복기 이후 증상이 가장 자주 나타나기 시작하지만, 개체가 무증상인 경우도 있었다. 개체는 증상을 나타내지 않더라도, 여전히 일반적인 전염 방식인 구강-대변 경로를 통해 바이러스를 퍼뜨릴 수 있다.
사포바이러스 감염과 관련된 위장염을 앓고 있는 피험자를 치료하기 위한 개선된 요법 및 감염 확산의 예방 방법이 여전히 필요하다.
본 발명은 특히 아단위 백신의 일부로서 사포바이러스 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
실시예에서, 면역보조제(adjuvants)와 혼합되거나 또는 공동-발현될 수 있는 사포바이러스-유래 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 제조 방법이 개시된다. 면역원성 조성물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 및/또는 면역보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 설사병을 야기하는 병원체에 대한 면역화에 사용될 수 있는 다른 항원, 예를 들어 로타바이러스로부터 유래된 항원을 포함할 수 있다.
실시예에서, 폴리펩티드 발현을 유도하는 조건 하에 본 명세서에 기재된 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법이 개시된다. 관련 측면에서, 사포바이러스 단백질은 재조합 기술에 의해 발현될 수 있으며, 재조합 항원 아단위를 포함하는 면역원성 조성물을 개발하는데 사용될 수 있고, 여기서 이러한 발현된 폴리펩티드는 바큘로바이러스(baculovirus)/곤충 세포 방법론을 이용하여 생성된다.
하나의 측면에서, 사포바이러스 유래 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 화학적 합성에 의해 (적어도 부분적으로) 제조되는 핵산의 제조 방법이 개시된다. 관련 측면에서, 방법은 프라이머-기반 증폭 방법 (예를 들어, PCR)을 이용하여 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 관련 측면에서, 이러한 반응에 대한 프라이머는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 22, 23, 24, 25, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 측면에서, 사포바이러스 유래 폴리펩티드 또는 이의 단편을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 단백질 복합체의 제조 방법이 개시된다. 관련 측면에서, 방법은 사포바이러스-유래 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함한다. 추가의 관련 측면에서, 조성물은 서열번호: 2, 서열번호: 8, 서열번호: 15, 서열번호: 21 또는 이들의 조합에 제시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 관련 측면에서, 사포바이러스 폴리펩티드는 VP1을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조성물은 하나 이상의 사포바이러스 VP1을 함유할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 VP1은 하나 이상의 균주로부터 유래된다.
실시예에서, 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 면역학적 반응을 유도하는 방법이 개시된다. 관련 측면에서, 방법은 면역보조제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 추가의 관련 측면에서, 방법은 면역원성 조성물을 국소, 비경구 또는 점막 경로를 통해 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 투여는 다중 투여일 수 있으며, 여기서 제 1 면역원성 조성물 및 제 2 면역원성 조성물은 동일하다. 또 다른 측면에서, 제 1 면역원성 조성물 및 제 2 면역원성 조성물은 상이하다.
하나의 측면에서, 투여는 2회 이상 수행된다.
실시예에서, 치료적 유효량의 상기 면역원성 조성물을 포함하는, 사포바이러스에 의한 감염의 치료를 필요로 하는 피험자에서 사포바이러스에 의한 감염의 치료에 사용하기 위한 약제가 개시된다.
실시예에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물을 사포바이러스에 의한 감염의 치료를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 사포바이러스에 의한 감염의 치료 방법이 개시된다.
관련 측면에서, 방법은 치료적 유효량의 하나 이상의 사포바이러스 항원을 포함하는 제 1 면역원성 조성물을 점막 투여하는 단계 및 치료적 유효량의 하나 이상의 사포바이러스 항원을 포함하는 제 2 면역원성 조성물을 국소 또는 비경구 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 측면에서, 다중 치료적 유효 용량의 면역원성 조성물을 피험자에게 투여한다. 또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 로타바이러스 항원을 포함한다.
실시예에서, 사포바이러스 VP1 단백질을 인코딩하는 분리된 재조합 핵산이 개시되며, 여기서 인코딩 핵산은 i) 서열번호: 1, 서열번호: 7, 서열번호: 14, 서열번호: 20, 및 이들의 조합을 포함하는 서열, 또는 ii) 서열번호: 1, 서열번호: 7, 서열번호: 14, 서열번호: 20 또는 이들의 조합에 제시된 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함한다.
하나의 측면에서, 인코딩 핵산은 벡터와 재조합된다. 관련 측면에서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다. 또 다른 관련 측면에서, 벡터는 숙주 세포에 함유되어 있다. 추가의 관련 측면에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다.
개시된 본 발명의 이러한 실시예 및 다른 실시예는 본 발명의 관점에서 통상의 기술자에게 쉽게 떠오를 것이다.
본 조성물, 방법, 및 방법론을 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 조성물, 방법, 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 조성물, 방법, 및 조건은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 전문용어는 단지 특정 실시예를 기재하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위로만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산, 및/또는 본 발명 등을 판독 시 통상의 기술자에게 명백해질 본 명세서에 기재된 유형의 조성물을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으며, 변형 및 변화는 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함됨을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약", "대략", "실질적으로" 및 "상당히 (significantly)"는 통상의 기술자에 의해 이해될 것이며, 이들이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 해당 용어가 사용되는 문맥에서 통상의 기술자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우, "약" 및 "대략"은 특정 용어의 + 또는 - <10%를 의미할 것이며, "실질적으로" 및 "상당히"는 특정 용어의 + 또는 - >10%를 의미할 것이다. 실시예에서, 조성물은 특정 성분 또는 성분들의 군을 "함유", "포함" 또는 "본질적으로 이루어질" 수 있으며, 여기서 숙련된 기술자는 후자를 청구범위가 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로(materially) 영향을 미치지 않는 것들"로 제한된다는 것을 의미하는 것으로 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "사포바이러스" 및 "삿포로-유사 바이러스"는 양성-센스, 단일-가닥 RNA, 비외피 바이러스의 칼리시비리대 과의 사포바이러스 속의 구성원을 나타낸다. 용어 사포바이러스는 바이러스의 모든 유전자군 (genogroups)에 있는 균주를 포함한다. 현재, 사포바이러스 균주는 이들의 캡시드 (VP1) 서열을 기준으로 5개의 유전자군 (GI-GV)으로 나뉜다. 용어 사포바이러스는 삿포로 바이러스 종, 런던/29845 바이러스 종, 맨체스터 바이러스 종, 휴스턴/86 바이러스 종, 휴스턴/90 바이러스 종, 및 파크빌 바이러스 종을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다수의 사포바이러스 분리주는 부분적으로 또는 완전히 시퀀싱되었다. 또한, 용어 사포바이러스는 출원 당시 특징지어지지 않은 분리주를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 고분자를 나타내며, 생성물의 최소 길이에 제한되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등은 정의 내에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편은 둘 다 정의에 포함된다. 또한, 용어는 폴리펩티드의 발현-후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환 (일반적으로 사실상 보존적)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 나타낸다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)을 통한 것과 같이 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우발적일 수 있다.
"실질적으로 정제된"은 물질이 존재하는 시료의 대부분을 포함하도록, 일반적으로 물질 (화합물, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 폴리펩티드 조성물)의 분리를 나타낸다. 일반적으로 시료에서, 실질적으로 정제된 성분은 시료의 약 50%, 약 80%-85%, 또는 약 90-95%를 포함한다. 관심 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 정제하는 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강을 포함한다.
폴리펩티드를 언급할 때, "분리된(isolated)"은 표시된 분자가 사실상 발견되거나 또는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대-분자가 실질적으로 존재하지 않는 전체 유기체 또는 세포와 분리되고 이산(discrete)됨을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 관하여 용어 "분리된"은 사실상 일반적으로 이와 관련된 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 결여된 핵산 분자; 또는 사실상 존재하나, 이와 관련된 이종 서열을 갖는 서열; 또는 염색체에서 분리된 분자이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는 방사성 동위원소, 형광체, 화학발광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드 (예를 들어, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 검출할 수 있는 분자를 나타낸다. 용어 "형광체"는 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이의 일부를 나타낸다. 사용될 수 있는 표지의 특정 예는 플루오레세인, 로다민, 단실(dansyl), 움벨리페론 (umbelliferone), 텍사스 레드, 루미놀, 아크라디뭄 에스터(acradimum esters), NADPH 및 α-β-갈락토시다제를 포함한다.
"상동성(Homology)"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 부분 사이의 퍼센트 동일성을 나타낸다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 서열이 정의된 길이의 분자에 대해 적어도 약 50% 서열 동일성, 적어도 약 75% 서열 동일성, 적어도 약 80%-85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 및 적어도 약 95%-98% 서열 동일성을 나타낼 때 서로 "실질적으로 상동"이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동은 또한 명시된 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 나타낸다. 하나의 측면에서, 본 명세서에 개시된 항원은 자연적으로 발생하는 사포바이러스 서열 (즉, 자연적으로 발생하는 사포바이러스 VP1 아미노산 서열과 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 자연적으로 발생하는 핵산 서열)을 제외할 수 있다.
일반적으로, "동일성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 나타낸다. 퍼센트 동일성은 서열을 정렬하며, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치의 수를 세고, 더 짧은 서열의 길이로 나누며, 그 결과에 100을 곱함으로써 2개의 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교하여 결정될 수 있다. 펩티드 분석을 위해 [Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981]의 로컬 상동성 알고리즘을 적용시킨 [ALIGN, Dayhoff, M. O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff, ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, D.C.]과 같은 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석에 도움을 줄 수 있다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.에서 구입가능함), 예를 들어, 또한 Smith 및 Waterman 알고리즘에 의존하는 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램에서 구입 가능하다. 이러한 프로그램은 제조업체에 의해 권장되며 상기에 언급된 Wisconsin Sequence Analysis Package에 기재된 기본 매개변수와 함께 쉽게 이용된다. 예를 들어, 기준 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 기본 점수표 및 6개 뉴클레오티드 위치의 갭 페널티와 함께 Smith 및 Waterman의 상동성 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 퍼센트 동일성을 확립하는 또 다른 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되며 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)에 의해 배포된 에든버러 대학교(University of Edinburgh)에 의해 저작권이 있는 프로그램의 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이 패키지 제품군에서, 기본 매개변수가 점수표 (예를 들어, 12의 갭 개방 페널티, 1의 갭 확장 페널티, 및 6의 갭)에 사용되는 경우 Smith-Waterman 알고리즘을 사용할 수 있다. 생성된 자료로부터, "일치(Match)" 값은 "서열 동일성"을 나타낸다. 서열 간의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수와 함께 사용된 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 하기의 기본 매개변수를 이용하여 사용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 여과기=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 기대=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50 서열; 정렬 기준=높은 점수; 데이터베이스=비-중복(non-redundant), GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+스위스 단백질+Spupdate+PIR. 이러한 프로그램에 대한 상세한 내용은 쉽게 이용할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 명세서에 개시된 항원은 자연적으로 발생하는 사포바이러스 서열 (즉, 자연적으로 발생하는 사포바이러스 VP1 아미노산 서열과 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 자연적으로 발생하는 핵산 서열)을 제외할 수 있다.
대안적으로, 상동성은 상동 영역 사이에 안정한 듀플렉스를 형성하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 이어 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)에 의한 분해, 및 분해된 단편의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다. 실질적으로 상동인 DNA 서열은, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의된 가혹한 조건 하에 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적당한 혼성화 조건을 정의하는 것은 당해 기술분야의 기술 범위 내에 있다.
핵산 분자를 기재하기 위해 본 명세서에서 사용된 "재조합"은 이의 기원 또는 조작에 의해 사실상 관련된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련되지 않는 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 관심 유전자는 클로닝된 다음, 하기에 더 기재된 바와 같이, 형질전환된 유기체에서 발현된다. 숙주 유기체는 외래 유전자를 발현하여 발현 조건 하에 단백질을 생성한다.
용어 "형질전환"은 삽입에 사용된 방법에 관계없이 숙주 세포로의 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 나타낸다. 예를 들어, 직접 흡수(direct uptake), 형질도입(transduction) 또는 f-교배(mating)가 포함된다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합(non-integrated) 벡터, 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 대안적으로, 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.
"재조합 숙주 세포", "숙주 세포", "세포", "세포주", "세포 배양물" 및 단세포 실체(entities)로서 배양된 미생물 또는 고등 진핵 세포주를 나타내는 기타 이러한 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전달된 DNA에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 또는 사용된 세포를 나타내며, 형질감염된 원래 세포의 원래 자손을 포함한다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "인코딩하는" 서열은 적당한 조절 서열 (또는 "제어 요소")의 제어 하에 있을 때 in vivo에서 폴리펩티드로 전사되며 (DNA의 경우) 번역되는 (mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 시작 코돈 및 3' (카복시) 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정될 수 있다. 코딩 서열은 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
일반적인 "제어 요소"는 전사 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열 (번역 정지 코돈에 대해 3'에 위치함), 번역 개시의 최적화를 위한 서열 (코딩 서열에 대해 5'에 위치함), 및 번역 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "핵산"은 DNA 및 RNA, 및 또한 변형된 백본 (예를 들어, 포스포로티오에이트 등)을 함유하는 것과 같은 이들의 유사체, 및 또한 펩티드 핵산 (PNA) 등을 포함한다. 본 발명은 (예를 들어, 안티센스 또는 탐침(probing) 목적을 위해) 상기 기재된 것들에 상보적인 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
"작동가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 이의 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 요소의 배열을 나타낸다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적당한 효소가 존재할 때 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 프로모터는 이의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들어, 중간에 번역되지는 않았지만 아직 전사된 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
"~에 의해 인코딩된"은 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타내며, 여기서 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부는 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드로부터의 적어도 3 내지 5 아미노산, 적어도 8 내지 10 아미노산, 및 적어도 15 내지 20 아미노산의 아미노산 서열을 함유한다.
"발현 카세트" 또는 "발현 구조체"는 관심 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 조립체(assembly)를 나타낸다. 발현 카세트는 일반적으로 관심 서열(들) 또는 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 (이의 전사를 지시하기 위해) 프로모터와 같은 상기 기재된 바와 같은 제어 요소를 포함하며, 종종 폴리아데닐화 서열도 포함한다. 실시예에서, 본 명세서에 기재된 발현 카세트는 플라스미드 구조체 내에 함유될 수 있다. 발현 카세트의 성분 이외에, 플라스미드 구조체는 또한 하나 이상의 선별가능한 마커, 플라스미드 구조체가 단일-가닥 DNA (예를 들어, M13 복제 기점)로 존재하도록 허용하는 신호, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및 "포유류" 복제 기점 (예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스 복제 기점)을 포함할 수 있다.
"정제된 폴리뉴클레오티드"는 본질적으로 없는, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 결합된 단백질의 약 50% 미만, 약 70% 미만, 및 약 적어도 90% 미만을 함유하는 관심 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 나타낸다. 관심 폴리뉴클레오티드를 정제하기 위한 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 카오트로픽제(chaotropic agent)로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포의 파괴 및 이온-교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강에 의한 폴리뉴클레오티드(들) 및 단백질의 분리를 포함한다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 나타내는데 사용된다. 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되었을 때, 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법은 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있다. 이러한 기법은 하나 이상의 외인성 DNA 부분을 적합한 숙주 세포에 도입하는데 사용될 수 있다. 용어는 유전 물질의 안정적 및 일시적 흡수를 둘 다 나타내며, 펩티드- 또는 항체-연결된 DNAs의 흡수를 포함한다.
"벡터"는 핵산 서열을 표적 세포 (예를 들어, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 미립자 담체, 및 리포좀)로 전달할 수 있다. 일반적으로, "벡터 구조체", "발현 벡터", 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 핵산의 발현을 지시할 수 있으며 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다. 따라서, 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 및 바이러스 벡터를 포함한다.
"단편"은 온전한 전장 서열 및 구조의 일부만으로 이루어진 분자를 의미한다. 폴리펩티드의 단편은 천연 폴리펩티드의 C-말단 결실, N-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단편은 일반적으로 전장 분자의 적어도 약 5-10의 연속 아미노산 잔기, 전장 분자의 적어도 약 15-25의 연속 아미노산 잔기, 및 전장 분자의 적어도 약 20-50 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 5 아미노산과 전장 서열의 아미노산 수 사이의 임의의 정수를 포함할 것이며, 단 당해(in question) 단편은 원하는 생물학적 반응을 유도하는 능력을 유지해야 한다. 핵산의 단편은 핵산의 5'-결실, 3'-결실, 및/또는 내부 결실을 포함할 수 있다. 핵산 단편은 일반적으로 전장 분자의 적어도 약 5-1000의 연속 뉴클레오티드 염기를 포함할 것이며, 전장 분자의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 또는 적어도 500의 연속 뉴클레오티드, 또는 5 뉴클레오티드와 전장 서열의 뉴클레오티드 수 사이의 임의의 정수를 포함할 수 있다. 이러한 단편은 혼성화, 증폭, 면역원성 단편의 생성, 또는 핵산 면역화에 유용할 수 있다.
"면역원성 단편"은 하나 이상의 에피토프를 포함하여 면역 반응을 조절할 수 있거나 또는 공동-투여된 항원에 대한 면역보조제로서 작용할 수 있는 면역원의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당해 기술분야에 잘 알려진 임의의 수의 에피토프 맵핑 기법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어, 단백질 분자의 일부에 해당하는 펩티드인 고체 지지체 상에 많은 수의 펩티드를 동시에 합성하며, 펩티드가 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 전체 참조로 본 명세서에 포함된 U.S. 특허 번호 제 4,708,871호에 기재되어 있다. 유사하게, 형태적(conformational) 에피토프는 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명과 같은 아미노산의 공간적 형태를 결정함으로써 쉽게 확인된다.
본 발명의 목적을 위한 면역원성 단편은 일반적으로 적어도 약 2 아미노산 길이, 적어도 약 5 아미노산 길이, 및 적어도 약 10 내지 약 15의 아미노산 길이일 것이다. 단백질 서열의 거의 전장, 또는 심지어 2 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있는 단편의 길이에 대한 임계 상한은 없다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 일반적으로 T-세포 수용체 및/또는 항체에 의해 인식되는 항원 상의 부위를 나타낸다. 실시예에서, 이는 단백질 항원으로부터 유래된 또는 단백질 항원의 일부로서 짧은 펩티드이다. 그러나, 용어는 또한 글리코펩티드 및 탄수화물 에피토프를 갖는 펩티드를 포함하도록 의도된다. 여러 상이한 에피토프는 단일 항원 분자에 의해 운반될 수 있다. 또한, 용어 "에피토프"는 전체 유기체를 인식하는 반응을 자극하는 아미노산 또는 탄수화물의 변형된 서열을 포함한다. 선택된 에피토프가 감염성 질환을 야기하는 감염제 (infectious agent)의 에피토프이면 유리하다.
에피토프는 과도한 실험 없이 특정 아미노산의 특성 (예를 들어, 크기, 전하 등) 및 코돈 사전으로부터 뿐만 아니라 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 및 상응하는 DNA 서열에 대한 지식으로부터 생성될 수 있다. 단백질이 반응을 자극할지 여부를 결정하는 몇 가지 지침은 펩티드 길이를 포함한다: 펩티드는 MHC 클래스 I 복합체에 맞도록 약 8 또는 9 아미노산 길이 및 클래스 II MHC 복합체에 맞도록 약 13-25 아미노산 길이이다. 이 길이는 펩티드가 MHC 복합체에 결합하기 위한 최소 길이이다. 하나의 측면에서, 세포가 펩티드를 절단할 수 있기 때문에 펩티드는 이러한 길이보다 더 길 수 있다. 펩티드는 면역 반응을 일으키기에 충분히 높은 특이도로 다양한 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있게 하는 적당한 앵커 모티프를 함유할 수 있다. 이는 MHC 분자와 관련된 펩티드의 공개된 구조와 관심 단백질의 서열을 비교함으로써 과도한 실험 없이 수행될 수 있다. 따라서, 숙련된 기술자는 단백질 서열을 단백질 데이터베이스에 열거된 서열과 비교함으로써 관심 에피토프를 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포 에피토프"는 일반적으로 T 세포 반응을 유도할 수 있는 펩티드 구조의 특징을 나타내며, "B 세포 에피토프"는 일반적으로 B 세포 반응을 유도할 수 있는 펩티드 구조의 특징을 나타낸다.
항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응"은 피험자에서 관심 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성(humoral) 및/또는 세포성(cellular) 면역 반응의 발생이다. 본 발명의 목적을 위해, "체액성 면역 반응"은 항체 분자에 의해 매개된 면역 반응을 나타내는 반면, "세포성 면역 반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개된 면역 반응이다. 세포성 면역의 한 가지 중요한 측면은 세포용해성 (cytolytic) T-세포 ("CTL"s)에 의한 항원-특이적 반응을 포함한다. CTLs은 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에 의해 인코딩되며 세포 표면에서 발현되는 단백질과 관련하여 제시되는 펩티드 항원에 대한 특이도를 가진다. CTLs은 세포내 미생물의 파괴 또는 이러한 미생물에 감염된 세포의 용해를 유도하고 촉진하는데 도움을 준다. 세포성 면역의 또 다른 측면은 헬퍼 T-세포에 의한 항원-특이적 반응을 포함한다. 헬퍼 T-세포는 이들의 표면에 MHC 분자와 관련하여 펩티드 항원을 표시하는 세포에 대해 비특이적 작동체 세포(effector cells)의 기능을 자극하며 활성에 집중하는데 도움을 주는 역할을 한다. 또한, "세포성 면역 반응"은 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 것을 포함하여, 활성화된 T-세포 및/또는 다른 백혈구에 의해 생성된 사이토카인, 케모카인 및 기타 이러한 분자의 생성을 나타낸다.
세포성 면역 반응을 유도하는 조성물 또는 백신은 세포 표면에서 MHC 분자와 관련하여 항원의 제시에 의해 척추동물 피험자를 감작시키는(sensitize) 역할을 할 수 있다. 세포-매개 면역 반응은 표면에 항원을 제시하는 세포를 향하거나, 또는 그 근처에서 이루어진다. 또한, 항원-특이적 T-림프구를 생성하여 면역화된 숙주의 향후 보호를 허용한다.
특정 항원의 세포-매개 면역학적 반응을 자극하는 능력은 림프증식 (림프구 활성화) 분석, CTL 세포독성 세포 분석, 또는 감작된 피험자에서 항원에 특이적인 T-림프구에 대한 분석과 같은 다수의 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 세포-매개 면역 반응을 측정하는 최근 방법은 T-세포 집단에 의한 또는 에피토프 특이적 T-세포의 측정에 의한 세포내 사이토카인 또는 사이토카인 분비의 측정을 포함한다.
따라서, 본 명세서에서 사용된 면역학적 반응은 항체 (예를 들어, 세포에 들어가는 바이러스와 같은 박테리아 독소 및 병원체를 차단하며 독소 및 병원체에 결합하여 복제하고, 일반적으로 세포를 감염 및 파괴로부터 보호하는 중화 항체)의 생성을 자극하는 것일 수 있다. 또한, 관심 항원은 CTLs의 생성을 유도할 수 있다. 따라서, 면역학적 반응은 하기의 효과 중 하나 이상을 포함할 수 있다: B-세포에 의한 항체의 생성; 및/또는 관심 조성물 또는 백신에 존재하는 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시되는 억제자 T-세포 및/또는 기억/작동체 T-세포의 활성화. 이러한 반응은 감염성을 중화하며, 및/또는 항체-보체 또는 항체 의존성 세포 독성 (antibody dependent cell cytotoxicity, ADCC)을 매개하여 면역화된 숙주를 보호하는 역할을 할 수 있다. 이러한 반응은 당해 기술분야에 잘 알려진 표준 면역분석 및 중화 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 포유류의 선천적 면역 체계는 면역 세포의 Toll-유사 수용체 및 유사한 수용체 분자의 활성화를 통해 병원성 유기체의 분자 특징을 인식하고 반응한다. 선천적 면역 체계의 활성화 시, 다양한 비-후천적(non-adaptive) 면역 반응 세포가 활성화되어, 예를 들어, 다양한 사이토카인, 림포카인 및 케모카인을 생성한다. 선천적 면역 반응에 의해 활성화된 세포는 단핵구 및 형질세포(plamsacytoid) 계통 (MDC, PDC)의 미성숙 및 성숙 수지상 세포뿐만 아니라 감마, 델타, 알파 및 베타 T 세포 및 B 세포 등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 면역 반응이 선천적 및 후천적 반응 둘 다를 수반하는 면역 반응을 고려한다.
"면역원성 조성물"은 피험자에게 조성물의 투여가 피험자에서 관심 항원 분자에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 야기하는 항원 분자를 포함하는 조성물이다.
용어 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 기재된 면역학적 반응을 유도하는 아미노산 서열을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드는 전구체 및 성숙 형태, 이의 유사체, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하여, 당해 단백질의 전장 서열을 포함한다.
"유전자 전달(Gene transfer)" 또는 "유전자 전달(gene delivery)"은 관심 DNA 또는 RNA를 숙주 세포에 확실하게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 나타낸다. 이러한 방법은 비-통합 전달된 DNA의 일시적인 발현, 전달된 레플리콘 (예를 들어, 에피좀)의 염색체외(extrachromosomal) 복제 및 발현, 또는 숙주 세포의 게놈 DNA로의 전달된 유전 물질의 통합을 야기할 수 있다. 유전자 전달 발현 벡터는 박테리아 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 알파바이러스, 폭스 바이러스 및 백시니아 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역화에 사용되는 경우, 이러한 유전자 전달 발현 벡터는 백신 또는 백신 벡터라고 할 수 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 본 명세서에서 분자의 원래 공급원을 확인하기 위해 사용되나, 예를 들어, 화학적 합성 또는 재조합 방법에 의한 것일 수 있는 분자가 제조되는 방법을 제한하는 것을 의미하지 않는다.
일반적으로, 바이러스 폴리펩티드는 (i) 그 바이러스의 폴리뉴클레오티드 (바이러스 폴리뉴클레오티드)의 개방 판독 프레임에 의해 인코딩되거나, 또는 (ii) 상기 기재된 그 바이러스의 폴리펩티드에 대한 서열 동일성을 나타내는 경우, 바이러스의 특정 폴리펩티드 (바이러스 폴리펩티드)"로부터 유래"된다.
지정된 서열"로부터 유래된" 폴리뉴클레오티드는 지정된 뉴클레오티드 서열의 영역에 상응하는, 즉, 동일한 또는 상보적인 대략 적어도 약 6 뉴클레오티드, 적어도 약 8 뉴클레오티드, 적어도 약 10-12 뉴클레오티드, 및 적어도 약 15-20 뉴클레오티드의 연속 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 유래된 폴리뉴클레오티드는 관심 뉴클레오티드 서열로부터 반드시 물리적으로 유래될 필요는 없으나, 폴리뉴클레오티드가 유래된 영역(들)의 염기의 서열에 의해 제공된 정보에 기초한 화학적 합성, 복제, 역전사 또는 전사를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 방법으로 생성될 수 있다. 따라서, 원래 폴리뉴클레오티드의 센스 또는 안티센스 배향(orientation)을 나타낼 수 있다.
상기 정의된 바와 같이, 사포바이러스 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드는 각각 사포바이러스의 다양한 분리주 중 어느 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는 사포바이러스로부터 유래된 분자이다. 분자는 당해 특정 분리주로부터 물리적으로 유래될 필요는 없으나, 합성적으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다.
사포바이러스 균주의 게놈은 2개 또는 3개의 개방 판독 프레임 (ORF)을 함유한다. 2개의 개방 판독 프레임을 갖는 사포바이러스의 균주에서, ORF1은 비구조적 단백질 및 구조적 단백질을 둘 다 포함하는 폴리단백질을 인코딩한다. 캡시드 단백질 VP1은 사포바이러스 폴리단백질의 성분으로서 ORF1에 의해 인코딩되며, 소수 (minor) 구조적 단백질 VP10은 ORF2에 의해 인코딩된다. 3개의 개방 판독 프레임을 갖는 사포바이러스 균주에서, 정지 코돈은 캡시드 단백질의 코딩 영역 앞에 있다. 캡시드 단백질을 포함하지 않는 폴리단백질은 ORF1에 의해 인코딩되며, 캡시드 단백질 VP1은 ORF2에 의해 인코딩되고, 소수 구조적 단백질 VP10은 ORF3에 의해 인코딩된다.
3C-유사 프로테아제에 의한 사포바이러스 균주 Mc10 폴리단백질 (GenBank Accession No. AY237420)의 절단은 적어도 10개의 별개의 생성물인 p11, p28, p35 (NTPase), p32, p14 (VPg), p70 (Pro-Pol), p60 (VP1)을 생성한다. 폴리단백질은 NH2--p11-p28-NTPase-p32-VPg-p70(Pro-Pol)-VP1-COOH의 순서로 폴리펩티드를 포함한다. 폴리단백질의 p70 (Pro-Pol) 영역은 잔기 1056-1720에 존재하며, 폴리단백질의 VP1 영역은 잔기 1721-2278에 존재한다. 전술한 번호매기기는 사포바이러스 균주 Mc10의 폴리단백질 아미노산 서열에 관한 것이지만, 사포바이러스의 다른 유전자형 및 분리주로부터 얻은 서열의 상응하는 아미노산 위치도 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. ORF1에 의해 인코딩된 폴리펩티드 중 어느 하나, 또는 전장 폴리단백질인 VP1 또는 VP10, 및 이의 변이체, 이의 면역원성 단편, 및 이러한 폴리펩티드, 변이체 또는 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산은 개시된 내용의 실시에 사용될 수 있다.
다수의 사포바이러스 분리주에 대한 핵산 및 단백질 서열도 알려져 있다. 대표적인 사포바이러스 서열은 서열번호: 1, 7, 14, 및 20에 제시되어 있다. ORF1 및 ORF2의 서열을 포함하여 추가의 대표적인 서열, 및 사포바이러스 분리주로부터 인코딩된 폴리펩티드는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 열거되어 있다. 참조, 예를 들어, GenBank 항목(entries): 사포바이러스 Mc10, GenBank Accession No. NC--010624; 삿포로 바이러스, GenBank Accession No. U65427; 사포바이러스 Mc10, GenBank Accession No. AY237420; 사포바이러스 SaKaeo-15/Thailand, GenBank Accession No. AY646855; 삿포로 바이러스, GenBank Accession No. NC--006269; 사포바이러스 C12, GenBank Accession No. NC 006554; 사포바이러스 C12, GenBank Accession No. AY603425; 사포바이러스 Hu/Dresden/pJG-Sap01/DE, GenBank Accession No. AY694184; 인간 칼리시바이러스 (Human calicivirus) SLV/cruise ship/2000/USA, GenBank Accession No. AY289804; 인간 칼리시바이러스 SLV/Arg39, GenBank Accession No. AY289803; 돼지 장 칼리시바이러스 균주(Porcine enteric calicivirus strain) LL14, GenBank Accession No. AY425671; 돼지 장 칼리시바이러스, GenBank Accession No. NC 000940; 인간 칼리시바이러스 균주 Mc37, GenBank Accession No. AY237415; 밍크 장 칼리시바이러스 균주 Canada 151A, GenBank Accession No. AY144337; 인간 칼리시바이러스 SLV/Hou7-1181, GenBank Accession No. AF435814; 인간 칼리시바이러스 SLV/Mex14917/2000, GenBank Accession No. AF435813; 인간 칼리시바이러스 SLV/Mex340/1990, GenBank Accession No. AF435812; 돼지 장 칼리시바이러스, GenBank Accession No. AF182760; 삿포로 바이러스-런던/29845, GenBank Accession No. U95645; 삿포로 바이러스-맨체스터, GenBank Accession No. X86560; 삿포로 바이러스-휴스턴/86, GenBank Accession No. U95643; 삿포로 바이러스-휴스턴/90, GenBank Accession No. U95644; 및 인간 칼리시바이러스 균주 HuCV/Potsdam/2000/DEU, GenBank Accession No. AF294739; 모든 서열 (본 출원의 출원일까지 입력된 것)은 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 사포바이러스에 관한 용어 "캡시드 단백질" 또는 "캡시드 폴리펩티드" 또는 "VP1"은 사포바이러스의 캡시드 폴리펩티드와 상동 또는 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타내며, 이와 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 동일성과 같은 이들 범위 내의 임의의 퍼센트 동일성을 포함하여, 이와 적어도 약 80-99.9% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 캡시드 폴리펩티드는 사포바이러스의 상이한 균주에서 ORF1 또는 ORF2에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 균주에서, 사포바이러스는 2개의 개방 판독 프레임을 가진다: 캡시드 단백질은 폴리단백질의 일부로서 ORF1에 의해 인코딩되며 소수 구조적 단백질 (VP10)은 ORF2에 의해 인코딩된다. 다른 균주에서, 사포바이러스는 3개의 개방 판독 프레임을 가진다: 정지 코돈은 ORF2에 의해 인코딩되는 캡시드 단백질의 코딩 영역 앞에 있으며, 소수 구조적 단백질 (VP10)은 ORF3에 의해 인코딩된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 사포바이러스에 관한 용어 "소수 구조적 단백질" 또는 "소수 구조적 폴리펩티드" 또는 "VP10"은 사포바이러스 게놈의 캡시드 단백질에 대한 코딩 영역에 따른 개방 판독 프레임 (균주에 따라 ORF2 또는 ORF3)에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 상동 또는 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타내며, 이와 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99.9% 서열 동일성과 같은 이들 범위 내의 임의의 퍼센트 동일성을 포함하여, 이와 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "사포바이러스 폴리단백질"은 사포바이러스의 ORF1-인코딩된 폴리단백질과 상동 또는 동일한 서열을 포함하는 폴리단백질을 나타내며, 이와 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9% 서열 동일성과 같은 이들 범위 내의 임의의 퍼센트 동일성을 포함하여, 이와 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
"항원"은 숙주의 면역 체계를 자극하여 체액성 및/또는 세포성 항원-특이적 반응을 일으키는 하나 이상의 에피토프 (선형, 형태적 또는 둘 다)를 함유하는 분자를 나타낸다. 이 용어는 용어 "면역원"과 통용된다. 일반적으로, B-세포 에피토프는 적어도 약 5 아미노산을 포함할 것이나, 3-4 아미노산만큼 작을 수 있다. CTL 에피토프와 같은 T-세포 에피토프는 적어도 약 7-9 아미노산을 포함할 것이며, 헬퍼 T-세포 에피토프는 적어도 약 12-20 아미노산을 포함할 것이다. 일반적으로, 에피토프는 약 7 내지 15 아미노산, 예를 들어, 9, 10, 12 또는 15 아미노산을 포함할 것이다. 용어 "항원"은 아단위 항원 (즉, 사실상 항원이 결합된 전체 유기체로부터 분리되고 이산된 항원), 및 사멸, 약독화 또는 비활성화 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 또는 기타 미생물을 모두 나타낸다. 항-유전자형 항체(anti-idiotype antibodies)와 같은 항체, 또는 이의 단편, 및 항원 또는 항원결정인자를 모방할 수 있는 합성 펩티드 미모토프(mimotopes)도 본 명세서에서 사용된 항원의 정의 하에 포획된다. 유사하게, 유전자 요법 및 DNA 면역화 적용에서와 같이 in vivo에서 항원 또는 항원결정인자를 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드도 본 명세서에서 항원의 정의에 포함된다.
용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제제, 및 하이브리드 항체, 변경된 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하는 제제, 및 하이브리드 (키메라) 항체 분자 및 이러한 분자로부터 얻은 임의의 기능적 단편을 포함하며, 여기서 이러한 단편은 부모 항체 분자의 특이적-결합 특성을 유지한다.
용어 "혼성화하다(hybridize)" 및 "혼성화(hybridization)"는 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 복합체를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열 사이의 복합체 형성을 나타낸다. 프라이머가 표적 (주형)과 "혼성화하는" 경우, 이러한 복합체 (또는 하이브리드)는 예를 들어, DNA 합성을 개시하기 위해 DNA 폴리머라제에 필요한 프라이밍 기능을 제공하기에 충분히 안정적이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생물학적 시료"는 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 대변(fecal matter), 소변, 골수, 담즙, 척수액(spinal fluid), 림프액, 피부의 시료, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관의 외부 분비물, 눈물, 타액, 우유, 혈액 세포, 장기, 생검을 포함하나 이에 한정되지 않는 피험자로부터 분리된 조직 또는 체액의 시료, 및 또한 배양 배지에서 세포 및 조직의 성장으로 인한 조건 배지를 포함하나 이에 한정되지 않는 in vitro 세포 배양 성분, 예를 들어, 재조합 세포 및 세포 성분의 시료를 나타낸다. 특히, 사포바이러스는 바이러스에 감염된 개체의 구토물 또는 설사와 같은 생물학적 시료로부터 얻을 수 있다.
"피험자"는 인간, 및 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종과 같은 비-인간 영장류를 포함하는 기타 영장류; 소, 양, 돼지, 염소, 사슴 및 말과 같은 농장 동물; 개 및 고양이와 같은 가축 포유류(domestic mammals); 마우스, 랫트 및 기니아 피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물; 닭, 칠면조 및 기타 가금류 조류 (gallinaceous birds), 오리, 거위와 같은 가축 조류, 야생 조류 및 수렵 조류를 포함하는 조류; 야생 동물 및 수렵 동물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 척삭동물 아문(subphylum chordata)의 모든 구성원을 의미한다. 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 성체 및 신생아 개체 둘 다를 대상으로 한다.
용어 "변이체", "유사체" 및 "뮤테인(mutein)"은 사포바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 항원 활성과 같은 원하는 활성을 유지하는 기준 분자의 생물학적 활성 유도체를 나타낸다. 일반적으로, 용어 "변이체" 및 "유사체"는 변형이 생물학적 활성을 파괴하지 않으며 하기에 정의된 기준 분자와 "실질적으로 상동"인 한, 천연 분자에 비해 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환 (일반적으로 사실상 보존적) 및/또는 결실을 갖는 천연 폴리펩티드 서열 및 구조를 갖는 화합물을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 유사체의 아미노산 서열은 두 서열이 정렬될 때, 기준 서열에 대해 고도의 서열 상동성, 예를 들어, 50% 이상, 일반적으로 60%-70% 이상, 더욱 더 특히 80%-85% 이상, 예를 들어 적어도 90%-95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 것이다. 종종, 유사체는 동일한 수의 아미노산을 포함할 것이지만, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 치환을 포함할 것이다. 용어 "뮤테인"은 아미노 및/또는 이미노 분자만을 포함하는 화합물, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 결합을 갖는 폴리펩티드, 및 당해 기술분야에 알려진 다른 변형인, 자연적으로 발생하는 및 비-자연적으로 발생하는 (예를 들어, 합성), 고리형, 분지형 분자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 아미노산-유사 분자를 갖는 폴리펩티드를 더 포함한다. 또한, 이 용어는 하나 이상의 N-치환된 글리신 잔기 ("펩토이드") 및 다른 합성 아미노산 또는 펩티드를 포함하는 분자를 포함한다. (참조, 예를 들어, U.S. 특허 번호 제 5,831,005호; 제 5,877,278호; 및 제 5,977,301호). 실시예에서, 유사체 또는 뮤테인은 적어도 천연 분자와 동일한 항원 활성을 가진다. 폴리펩티드 유사체 및 뮤테인의 제조 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 하기에 더 기재된다.
상기 설명된 바와 같이, 유사체는 일반적으로 사실상 보존적인 치환, 즉, 측쇄에서 관련된 아미노산의 계열 내에서 발생하는 치환을 포함한다. 구체적으로, 아미노산은 일반적으로 4개의 계열로 나뉜다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전(uncharged) 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 분리된 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 보존적 대체가 생물학적 활성에 큰 영향을 미치지 않을 것이라고 합리적으로 예측할 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 분자의 원하는 기능이 그대로 유지되는 한, 최대 약 5-10 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 또는 심지어 최대 약 15-25 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 또는 5-25 사이의 임의의 정수를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 당해 기술분야에 잘 알려진 Hopp/Woods 및 Kyte-Doolittle 플롯을 참조하여 변화를 허용할 수 있는 관심 분자의 영역을 쉽게 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "다중 에피토프 융합 항원" 또는 "다중 에피토프 융합 단백질"은 다중 사포바이러스 항원이 단일 연속 아미노산 사슬의 일부인 폴리펩티드를 의미하며, 이 사슬은 자연에서 발생하지 않는다. 사포바이러스 항원은 펩티드 결합에 의해 서로 직접 연결될 수 있거나 또는 아미노산 서열을 개입시켜 분리될 수 있다. 융합 항원은 예를 들어, N-말단 단백질, p11, p28, NTPase, p32, VPg, 프로테아제, 폴리머라제, VP1, 및 VP10과 같은 사포바이러스 폴리펩티드의 서열을 포함하는, ORF1-인코딩된, ORF2-인코딩된, 및/또는 ORF3-인코딩된 폴리펩티드 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 또한, 융합 항원은 사포바이러스에 대해 외인성 서열을 함유할 수 있다. 또한, 존재하는 서열은 사포바이러스의 다중 유전자형 및/또는 분리주로부터 유래될 수 있다.
면역원성 조성물의 문맥에서 "치료적 유효량"은 항체 생성을 위해 또는 사포바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위해 면역학적 반응을 유도할 면역원 (예를 들어, 면역원성 폴리펩티드, 융합 단백질, 폴리단백질, 또는 항원을 인코딩하는 핵산)의 양을 의미한다. 이러한 반응은 일반적으로 피험자에서 조성물에 대한 항체-매개 및/또는 분비성 또는 세포성 면역 반응의 발생을 야기할 것이다. 일반적으로, 이러한 반응은 하기의 효과 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M과 같은 면역학적 부류 중 어느 하나로부터의 항체의 생성; B 및 T 림프구의 증식; 면역학적 세포에 대한 활성화, 성장 및 분화 신호의 제공; 헬퍼 T 세포, 억제자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 γ,δ-T 세포 집단의 확장.
본 발명의 목적을 위해, 면역보조제의 "유효량"은 공동-투여된 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산에 대한 면역학적 반응을 향상시키는 양일 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"는 (i) 종래의 백신에서와 같이, 감염 또는 재감염의 예방, (ii) 증상의 감소 또는 제거, 및 (iii) 당해 병원체의 상당한 또는 완전한 제거 중 어느 하나를 나타낸다. 치료는 예방적으로 (감염 전) 또는 치료적으로 (감염 후) 수행될 수 있다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기법 및 면역학의 통상적인 방법을 사용할 것임을 이해해야 하며, 이들 모두는 당해 기술분야의 통상의 기술 내에 있다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 다수의 방법 및 물질이 청구된 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 물질 및 방법은 본 명세서에 기재된다.
본 발명은 사포바이러스 감염에 대해 피험자를 면역화하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 사포바이러스 균주로부터의 캡시드 단백질 및/또는 다른 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물, 하나 이상의 사포바이러스 균주로부터 유래된 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시에 사용되는 면역원성 폴리펩티드는 ORF1-인코딩된 폴리펩티드, ORF2-인코딩된 폴리펩티드, ORF3-인코딩된 폴리펩티드, 다중 에피토프 융합 항원, 및/또는 ORF1-인코딩된 폴리단백질을 포함하는, 사포바이러스-유래 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 면역원성 조성물은 하나 이상의 면역보조제 또는 면역보조제를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 면역원성 폴리펩티드는 면역보조제와 혼합되거나 또는 공동-발현된다. 또한, 면역원성 조성물은 설사병을 야기하는 병원체에 대한 면역화에 사용될 수 있는 항원과 같은 사포바이러스 항원 이외의 추가 항원을 포함할 수 있다.
개시된 발명에 대한 이해를 더 돕기 위하여, 면역원성 조성물에 사용하기 위한 핵산 및 폴리펩티드의 생성 및 사포바이러스 감염의 치료 또는 예방에 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 더 상세한 논의가 하기에 제공된다.
구조적 폴리펩티드, 비구조적 폴리펩티드, 및 폴리단백질
본 명세서에 기재된 면역원성 조성물은 사포바이러스의 하나 이상의 유전자형 및/또는 분리주로부터 유래된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 발명의 실시에 사용될 수 있는 폴리펩티드는 구조적 단백질, 비구조적 단백질, 및 폴리단백질을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 사포바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 전장 단백질 또는 이의 변이체 또는 면역원성 단편일 수 있다.
3C-유사 프로테아제에 의한 사포바이러스 균주 Mc10 폴리단백질 (GenBank Accession No. AY237420)의 절단은 적어도 10개의 별개의 생성물인 p11, p28, p35 (NTPase), p32, p14 (VPg), p70 (Pro-Pol), p60 (VP1)을 생성한다. 초기 단백질분해 과정은 p66 (p28-p35), p46 (p32-p14), 및 p120 (p32-p14-p70) 단편을 생성한다. 폴리단백질은 NH2--p11-p28-NTPase-p32-VPg-p70(Pro-Pol)-VP1-COOH의 순서로 폴리펩티드를 포함한다. 폴리단백질의 p70 (Pro-Pol) 영역은 잔기 1056-1720에 존재하며, 폴리단백질의 VP1 영역은 잔기 1721-2278에 존재한다 (GenBank Accession No. AY237420에 따라 번호가 매겨짐).
p11, p28, NTPase, p32, VPg, p70(Pro-Pol), VP1 유전자 및 폴리펩티드를 포함하는, VP1 및 VP10 구조적 단백질 및 사포바이러스 폴리단백질의 다양한 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는, 다수의 사포바이러스 균주 및 분리주의 핵산 및 아미노산 서열도 결정되었다.
면역원성 조성물 내 폴리펩티드는 사포바이러스 게놈의 임의의 영역에 의해 인코딩될 수 있다. 다중 폴리펩티드는 면역원성 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 광범위한 사포바이러스 유전자형에 대한 증가된 보호를 제공하기 위해, 다양한 사포바이러스 유전자형 중 어느 하나를 갖는 분리주를 포함하여, 동일한 사포바이러스 분리주 또는 상이한 균주 및 분리주로부터의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 사포바이러스의 다중 바이러스 균주는 알려져 있으며, 이들 균주 중 어느 하나로부터 유래된 에피토프를 포함하는 다중 폴리펩티드는 면역원성 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 사용된 항원은 개개의 별도의 폴리펩티드로서 조성물에 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 재조합 단백질은 GST-융합 단백질 및/또는 His-태깅된 융합 단백질로 표시된다.
다중에피토프 융합 단백질
또한, 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물은 다중 에피토프 융합 단백질을 포함할 수 있다. 참조, 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 97/44469, U.S. 특허 번호 제 6,632,601호, U.S. 특허 번호 제 6,630,298호, U.S. 특허 번호 제 6,514,731호, 및 U.S. 특허 번호 제 6,797,809호; 전체 참조로 본 명세서에 포함됨. 이러한 융합 단백질은 사포바이러스의 하나 이상의 유전자형 및/또는 분리주의 2 이상의 바이러스 폴리펩티드로부터 유래된 다중 에피토프를 포함한다. 다중 에피토프 융합 단백질은 2가지 주요 이점을 제공한다: 첫째, 불안정하거나 또는 그 자체로는 좋지 못하게(poorly) 발현될 수 있는 폴리펩티드는 문제를 극복하는 적당한 하이브리드 파트너를 추가함으로써 도움을 받을 수 있다; 둘째, 둘 다 항원적으로 유용한 2개의 폴리펩티드를 생성하기 위하여 단 하나의 발현 및 정제가 사용될 필요가 있기 때문에 상업적 제조가 단순화된다.
다중에피토프 융합 단백질은 하나 이상의 사포바이러스 분리주로부터 유래된, 사포바이러스 폴리단백질, 전장 폴리단백질, VP1 (본 명세서에서 캡시드 단백질이라고도 함) 및/또는 VP10 (본 명세서에서 사포바이러스 소수 구조적 단백질이라고도 함)의 다양한 도메인 중 하나 이상; 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩티드는 광범위한 사포바이러스 유전자형에 대한 증가된 보호를 제공하기 위해, 다양한 사포바이러스 유전자형 중 어느 하나를 갖는 분리주를 포함하여, 동일한 사포바이러스 분리주 또는 상이한 균주 및 분리주로부터 유래될 수 있다. 사포바이러스의 다중 바이러스 균주는 알려져 있으며, 이들 균주 중 어느 하나로부터 유래된 에피토프는 융합 단백질에 사용될 수 있다.
임의의 주어진 유기체의 종은 개개의 유기체마다 다르며, 또한 바이러스와 같은 주어진 유기체는 다수의 상이한 균주를 가질 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기 설명한 바와 같이, 사포바이러스는 적어도 5개의 유전자군 (G1-GV)을 포함한다. 각 균주는 사포바이러스의 모든 균주에 존재하는 상동 영역에 있으나 바이러스 균주마다 약간 상이한 다수의 항원결정인자를 포함한다. 따라서, 다중 에피토프 융합 항원은 사포바이러스의 다양한 바이러스 균주로부터의 다중 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 각각은 특정 상동 영역을 포함하나 각각은 상이한 형태의 항원결정인자를 가진다. 일반적으로, 항원결정인자는 아미노산 서열 측면에서 고도의 상동성을 가질 수 있으며, 이러한 상동성 정도는 일반적으로 정렬될 때 30% 이상, 40% 이상이다. 또한, 융합 단백질은 에피토프의 다중 복제를 포함할 수 있으며, 여기서 융합 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 동일한 에피토프의 정확한 복제를 포함하는 서열을 포함한다. 또한, 폴리펩티드는 융합체를 함유하는 백신 조성물이 사용될 특정 지리적 영역에서 특정 바이러스 계통군(clades) 풍토병(endemic)에 기초하여 선택될 수 있다. 대상 융합체가 매우 다양한 상황에서 사포바이러스 감염을 치료하는 효과적인 방법을 제공한다는 것은 쉽게 명백하다.
다중 에피토프 융합 항원은 식 NH2-A-{-X-L-}n-B--COOH로 표시될 수 있으며, 여기서 X는 사포바이러스 항원 또는 이의 단편의 아미노산 서열이고; L은 임의의 링커 아미노산 서열이며; A는 임의의 N-말단 아미노산 서열이고; B는 임의의 C-말단 아미노산 서열이며; n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
--X-- 부분이 이의 야생형 형태의 리더 펩티드 서열을 갖는 경우, 이는 다중 에피토프 융합 항원에 포함되거나 또는 생략될 수 있다. 일 실시예에서, 리더 펩티드는 하이브리드 단백질의 N-말단에 위치한 --X-- 부분의 것을 제외하고 삭제될 것이다, 즉, X1의 리더 펩티드는 유지될 것이나, X2 . . . Xn의 리더 펩티드는 생략될 것이다. 이는 모든 리더 펩티드를 삭제하고 X1의 리더 펩티드를 -A- 부분으로 이용하는 것과 동등하다.
(--X-L-)의 각 n의 경우, 링커 아미노산 서열 -L-이 존재하거나 또는 부재할 수 있다. 예를 들어, n=2인 경우, 하이브리드는 NH2--X1-L1-X2-L2-COOH, NH2--X1--X2--COOH, NH2--X1-L1-X2--COOH, NH2--X1--X2-L2-COOH 등일 수 있다. 링커 아미노산 서열(들)-L-은 일반적으로 짧은, 예를 들어, 20 이하 (즉, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1)의 아미노산일 것이다. 예로는 클로닝을 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열, 폴리-글리신 링커 (Gly, 여기서 n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상), 및 히스티딘 태그 (Hisn, 여기서 n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)를 포함한다. 다른 적당한 링커 아미노산 서열은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 유용한 링커는 클로닝 및 조작을 돕는 BamHI 제한 부위로부터 형성되는 Gly-Ser 디펩티드 및 일반적인 폴리-글리신 링커인 (Gly)4 테트라펩티드가 있는 GSGGGG이다. 또한, 프로테아제 기질 서열도 추가될 수 있다 (예를 들어, TEV 프로테아제: ENLYFQG).
-A-는 임의의 N-말단 아미노산 서열이다. 이것은 일반적으로 짧은, 예를 들어, 40 이하 (즉, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1)의 아미노산일 것이다. 예로는 단백질 트래피킹을 지시하는 리더 서열 또는 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어, 히스티딘 태그 Hisn, 여기서 n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상)을 포함한다. 다른 적당한 N-말단 아미노산 서열은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. X1에 자체 N-말단 메티오닌이 없는 경우, -A-는 N-말단 메티오닌을 제공하는 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 아미노산을 갖는) 올리고펩티드이다.
--B--는 임의의 C-말단 아미노산 서열이다. 이것은 일반적으로 짧은, 예를 들어, 40 이하 (즉, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1)의 아미노산일 것이다. 예로는 단백질 트래피킹을 지시하는 서열, 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어, Hisn, 여기서 n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상), 또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열을 포함한다. 다른 적당한 C-말단 아미노산 서열은 TEV 프로테아제 기질 서열이 선행하는 경우 (예를 들어, ENLYFQGHisn), 이러한 Hisn 서열이 제거될 수 있음을 포함하여, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
다중 에피토프 융합 항원 내의 면역원성 조성물의 개개의 항원 (개개의 --X-- 부분)은 하나 이상의 균주 또는 하나 이상의 M 유형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, n=2인 경우, X2는 X1과 동일한 균주 또는 유형으로부터이거나 또는 상이한 균주 또는 유형으로부터일 수 있다. n=3인 경우, 균주는 (i) X1=X2=X3, (ii) X1=X2가 X3와 같지 않음, (iii) X1가 X2=X3와 같지 않음, (iv) X1이 X2와 같지 않음, X3과 같지 않음, 또는 (v) X1=X3가 X2와 같지 않음, 등일 수 있다.
다중 에피토프 융합 항원이 사용되는 경우, 융합 단백질 내의 개개의 항원 (즉, 개개의 --X-- 부분)은 하나 이상의 균주로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, n=2인 경우, X2는 X1과 동일한 균주로부터 또는 상이한 균주로부터일 수 있다. n=3인 경우, 균주는 (i) X1=X2=X3, (ii) X1=X2가 X3와 같지 않음, (iii) X1이 X2=X3와 같지 않음, (iv) X1이 X2와 같지 않음, X3과 같지 않음, 또는 (v) X1=X3가 X2와 같지 않음, 등일 수 있다.
따라서, 실시예에서, 상이한 사포바이러스 균주로부터의 항원결정인자가 존재할 수 있다. 사포바이러스 분리주로부터 유래된 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명에서 사용하기 위한 대표적인 다중에피토프 융합 단백질은 하기에서 논의된다. 그러나, 사포바이러스 게놈으로부터 유래된 다른 에피토프를 포함하는 다중에피토프 융합 단백질 또는 상이한 배열의 에피토프를 포함하는 다중에피토프 융합 단백질도 개시된 면역원성 조성물에서 사용될 것임을 이해해야 한다.
특정 실시예에서, 융합 단백질은 사포바이러스의 하나 이상의 분리주로부터의 하나 이상의 캡시드 및/또는 소수 구조적 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시예에서, 융합 단백질은 하나 이상의 사포바이러스 균주로부터의 VP1 폴리펩티드를 포함한다 (예를 들어, VP1Sapporo-VP1London/29845, VP1London/29845-VP1Manchester-VP1Sapporo, VP1Manchester-VP1Parkville-VP1Sapporo-VP1London/29845, VP1Parkville-VP1Houston/90-VP1Houston/86-VP1Manchester-VP1Sapporo).
본 명세서에 기재된 모든 융합체에서, 바이러스 영역은 자연적으로 발생하는 순서일 필요는 없다. 또한, 각각의 영역은 동일한 또는 상이한 사포바이러스 분리주로부터 유래될 수 있다. 상기 기재된 다양한 융합체에 존재하는 다양한 사포바이러스 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 또는 이의 일부일 수 있다.
원한다면, 융합 단백질 또는 이들 단백질의 개개의 성분은 또한 아미노산 링커 또는 신호 서열과 같은 다른 아미노산 서열, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 및 스타필로코컬(staphylococcal) 단백질 A와 같은 단백질 정제에 유용한 리간드를 함유할 수 있다.
핵산
예를 들어, 폴리펩티드 생성에서 본 명세서에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 핵산은 ORF1, ORF2, 또는 ORF3 영역 중 어느 하나를 포함하여, 사포바이러스 게놈의 다양한 영역 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 사포바이러스 분리주로부터의 대표적인 서열은 본 명세서에 열거되어 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 핵산은 임의의 병원성 사포바이러스 유전자형 또는 분리주로부터의 하나 이상의 서열로부터 유래된 것을 포함한다.
서열번호: 1, 7, 14, 및 20을 포함하여, 사포바이러스로부터의 대표적인 서열은 알려져 있다. 대표적인 사포바이러스 서열은 삿포로 바이러스-런던/29845, GenBank Accession No. U95645, 파크빌 바이러스, GenBank Accession No. AF294739; 및 삿포로 바이러스-휴스턴/86, GenBank Accession No. U95643 이다.
사포바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 핵산 면역화에 사용될 수 있는 이들 서열 중 어느 하나, 및 이의 단편 및 변이체는 본 방법에서 사용될 것이다. 따라서, 본 발명은 이와 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9% 서열 동일성과 같은 이들 범위 내의 임의의 퍼센트 동일성을 포함하여, 이와 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 나타내는 상기 서열의 변이체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 서열 중 어느 하나로부터 유래된 사포바이러스 폴리펩티드의 면역원성 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 변이체를 제공한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나 또는 자연에서 발생하지 않는 인공 서열일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 전체 사포바이러스 게놈보다 적게 함유할 수 있거나, 또는 대안적으로 전체 바이러스 게놈 RNA의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스 게놈의 ORF1, ORF2, 및 ORF3 영역으로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 다중 유전자형 및/또는 분리주로부터의 전체 바이러스 게놈 RNA 또는 전체 바이러스 게놈 RNA보다 적게 포함할 수 있다.
실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 전장 폴리단백질을 코딩하는 ORF1 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 ORF1 서열의 하나 이상의 부분을 포함한다.
또 다른 예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스 폴리단백질의 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 하나 이상의 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 구조적 단백질 (예를 들어, VP1, VP2, VP10)을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 다중 유전자형 및/또는 분리주로부터의 적어도 2개의 캡시드 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 하나 이상의 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하는 하나 이상의 사포바이러스 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 사포바이러스의 하나 이상의 분리주의 캡시드 단백질을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다.
실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 다중에피토프 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다중에피토프 융합 단백질은 사포바이러스의 하나 이상의 유전자형 및/또는 분리주로부터의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 다양한 방식으로 (예를 들어, 화학적 합성에 의해, 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터, 유기체 자체로부터 등) 제조될 수 있으며, 다양한 형태 (예를 들어, 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터, 프로브 등)를 취할 수 있다. 실시예에서, 핵산은 실질적으로 순수한 형태 (즉, 다른 숙주 세포 또는 비-숙주 세포 핵산이 실질적으로 없음)로 제조된다.
예를 들어, 바이러스에 감염된 세포로부터 cDNA 및/또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도함으로써 핵산을 얻을 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 감염된 개체의 대변 또는 구토물 시료에 존재하는 바이러스 RNA로부터 유래된 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 사포바이러스 핵산은 감염된 인간 또는 다른 포유류로부터 또는 감염된 개체로부터 수집된 대변 또는 구토물 시료로부터 분리될 수 있다. 바이러스는 담즙산을 함유한 장액(intestinal fluid)의 존재 하에 LLC-PK 세포에서 성장할 수 있다. PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 이를 인코딩하는 사포바이러스 게놈 RNA 또는 cDNA로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 합성기를 이용하여 실험실에서 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 원하는 특정 아미노산 서열에 대한 적당한 코돈으로 설계될 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현될 의도된 숙주에 대해 바람직한 코돈을 선택할 것이다. 관심 폴리뉴클레오티드의 완전한 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립되며 완전한 코딩 서열로 조립될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 단일- 또는 이중-가닥 DNA일 수 있다. 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 단백질 및 지질과 같은 다른 성분 없이 분리된다.
따라서, 특정 뉴클레오티드 서열은 원하는 서열을 보유하는 벡터로부터 얻어지거나, 또는 적절한 경우 부위-지정 돌연변이생성 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기법과 같은 당해 기술분야에 알려진 다양한 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 특히, 원하는 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 얻는 한 가지 방법은 통상적인 자동화 폴리뉴클레오티드 합성기에서 생성된 중첩 합성 올리고뉴클레오티드의 상보적 세트를 어닐링한 다음, 적당한 DNA 리가제로 결찰시키고, PCR을 통해 결찰된 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 것이다.
면역원성 폴리펩티드의 생성
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 임의의 적당한 방법 (예를 들어, 재조합 발현, 세포 배양믈로부터의 정제, 화학적 합성 등) 및 다양한 형태 (예를 들어, 천연, 융합, 비-글리코실화(non-glycosylated), 지질화(lipidated) 등)로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 자연적으로-발생하는 폴리펩티드, 재조합적으로 생성된 폴리펩티드, 합성적으로 생성된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드의 제조 방법은 당해 기술분야에 잘 이해되어 있다. 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태 (즉, 다른 숙주 세포 또는 비-숙주 세포 단백질이 실질적으로 없음)로 제조된다.
폴리펩티드는 펩티드 분야의 통상의 기술자에게 알려진 여러 기법 중 어느 하나에 의해 화학적으로 편리하게 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 성장하는 펩티드 사슬에 하나 이상의 아미노산의 순차적 첨가를 사용한다. 일반적으로, 제 1 아미노산의 아미노기 또는 카복실기는 적당한 보호기로 보호된다. 그 다음, 보호된 또는 유도체화된 아미노산은 아미드 결합의 형성을 허용하는 조건 하에, 불활성 고체 지지체에 부착되거나 또는 적당하게 보호된 상보적 (아미노 또는 카복실) 기를 갖는 서열에 다음 아미노산을 첨가함으로써 용액에서 이용될 수 있다. 그 다음, 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 보호기를 제거하고, 다음 아미노산 (적당하게 보호됨)을 첨가하는 등의 작업을 수행한다. 원하는 아미노산을 적당한 서열로 연결한 후, 임의의 남아있는 보호기 (및 고체상 합성 기법이 사용되는 경우, 모든 고체 지지체)가 순차적으로 또는 동시에 제거되어 최종 폴리펩티드가 된다. 이 일반적인 방법의 간단한 변형에 의해, 예를 들어, (키랄 중심을 라세미화하지 않는 조건 하에) 보호된 트리펩티드를 적당하게 보호된 디펩티드와 결합시켜 탈보호 후 펜타펩티드를 형성함으로써, 성장하는 사슬에 한 번에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 것이 가능하다.
일반적인 보호기는 t-부틸옥시카보닐 (Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 벤질옥시카보닐 (Cbz); p-톨루엔설포닐 (Tx); 2,4-디니트로페닐; 벤질 (Bzl); 비페닐이소프로필옥시카복시-카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보닐옥시카보닐, o-브로모벤질옥시카보닐, 시클로헥실, 이소프로필, 아세틸, o-니트로페닐설포닐 등을 포함한다. 일반적인 고체 지지체는 가교결합된 고분자 지지체이다. 이들은 디비닐벤젠 가교결합된-스티렌-기반 고분자, 예를 들어, 디비닐벤젠-히드록시메틸스티렌 공중합체, 디비닐벤젠-클로로메틸스티렌 공중합체 및 디비닐벤젠-벤즈히드릴아미노폴리스티렌 공중합체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 동시 다중 펩티드 합성 방법과 같은 다른 방법에 의해 화학적으로 제조될 수 있다.
대안적으로, 상기 기재된 면역원성 폴리펩티드, 폴리단백질, 및 다중에피토프 융합 단백질은 재조합적으로 생성될 수 있다. 원하는 단백질에 대한 코딩 서열이 분리되거나 또는 합성되면, 이들은 발현을 위해 임의의 적당한 벡터 또는 레플리콘(replicon)으로 클로닝될 수 있다. 다수의 클로닝 벡터는 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 적당한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 다양한 박테리아, 효모, 식물, 포유류 및 곤충 발현 시스템은 당해 기술분야에서 이용가능하며, 임의의 이러한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 임의로, 이들 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 무세포(cell-free) 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
클로닝을 위한 재조합 DNA 벡터 및 이들이 형질전환할 수 있는 숙주 세포의 예는 박테리오파지 λ (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (그람-음성 박테리아), pGV1106 (그람-음성 박테리아), pLAFR1 (그람-음성 박테리아), pME290 (비-E. coli 그람-음성 박테리아), pHV14 (E. coli 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), pBD9 (바실러스), pIJ61 (스트렙토마이세스 (Streptomyces)), pUC6 (스트렙토마이세스), YIp5 (사카로마이세스 (Saccharomyces)), YCp19 (사카로마이세스) 및 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus) (포유류 세포)를 포함한다.
또한, 곤충 세포 발현 시스템, 예를 들어 바큘로바이러스 시스템이 사용될 수 있으며, 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)에 기재되어 있다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 물질 및 방법은 특히 Invitrogen, San Diego, CA로부터 키트 형태 ("MaxBac" 키트)로 시판된다.
또한, 식물 발현 시스템을 사용하여 면역원성 단백질을 생성할 수 있다. 일반적으로, 이러한 시스템은 바이러스-기반 벡터를 사용하여 이종 유전자로 식물 세포를 형질감염시킨다.
백시니아 기반 감염/형질감염 시스템과 같은 바이러스 시스템도 본 명세서에 개시된 발명과 함께 사용될 것이다. 이 시스템에서, 세포는 먼저 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 백시니아 바이러스 재조합체로 in vitro에서 형질감염된다. 이 폴리머라제는 T7 프로모터를 함유하는 주형만 전사한다는 점에서 정교한 특이도를 나타낸다. 감염 후, 세포는 T7 프로모터에 의해 구동되는 관심 DNA로 형질감염된다. 백시니아 바이러스 재조합체로부터 세포질에서 발현된 폴리머라제는 형질감염된 DNA를 RNA로 전사한 다음, 숙주 번역 기계에 의해 단백질로 번역된다. 이 방법은 다량의 RNA 및 이의 번역 산물(들)의 높은 수준의 일시적인 세포질 생성을 제공한다.
원하는 면역원성 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열이 이 발현 구조물을 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포에서 RNA로 전사되도록, 유전자는 프로모터, 리보좀 결합 부위 (박테리아 발현용) 및 임의로, 작동자 (본 명세서에서 전체적으로 "제어" 요소라고 함)의 제어 하에 놓일 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩티드 또는 리더 서열을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명과 함께, 자연적으로 발생하는 신호 펩티드 또는 이종 서열을 둘 다 사용할 수 있다. 리더 서열은 번역-후 처리에서 숙주에 의해 제거될 수 있다. 참조, 예를 들어, U.S. 특허 번호 제 4,431,739호; 제 4,425,437호; 제 4,338,397호, 각각은 전체 참조로 본 명세서에 포함된다. 이러한 서열은 tpa 리더 및 꿀벌 멜리틴 신호 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
숙주 세포의 성장에 대한 단백질 서열의 발현 조절을 허용하는 다른 조절 서열도 바람직할 수 있다. 이러한 조절 서열은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예로는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현을 켜거나 또는 끄는 것을 포함한다. 다른 유형의 조절 요소, 예를 들어, 인핸서 서열도 벡터에 존재할 수 있다.
제어 서열 및 기타 조절 서열은 벡터에 삽입되기 전에 코딩 서열에 결찰될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 이미 제어 서열 및 적당한 제한 부위를 함유하는 발현 벡터로 직접 클로닝될 수 있다.
실시예에서, 적당한 배향으로 제어 서열에 부착될 수 있도록 코딩 서열을 변형하는 것, 즉, 적당한 판독 프레임을 유지하는 것이 필요할 수 있다. 또한, 면역원성 폴리펩티드의 돌연변이체 또는 유사체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 돌연변이체 또는 유사체는 단백질을 인코딩하는 서열의 일부의 결실, 서열의 삽입, 및/또는 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해 제조될 수 있다. 부위-지정 돌연변이생성과 같은 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 기법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
그 다음, 발현 벡터를 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질전환한다. 다수의 포유류 세포주는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2) 등과 같으나 이에 한정되지 않는, ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입가능한 불멸화 세포주를 포함한다. 유사하게, E. coli, 바실러스 서브틸리스, 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) spp.와 같은 박테리아 숙주는 본 발현 구조체와 함께 사용될 것이다. 개시된 발명에 유용한 효모 숙주는, 특히, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 길리에르몬디이(Pichia guilliermondii), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다. 바큘로바이러스 발현 벡터와 함께 사용하기 위한 곤충 세포는, 특히, 애데스 애집티(Aedes aegypti), 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)를 포함한다.
선택된 발현 시스템 및 숙주에 따라, 본 명세서에 개시된 단백질은 관심 단백질이 발현되는 조건 하에 상기 기재된 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 성장시킴으로써 생성된다. 적당한 성장 조건의 선택은 당해 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 그 다음, 세포를 용해하지만 사포바이러스 면역원성 폴리펩티드를 실질적으로 온전하게 유지하는 화학적, 물리적 또는 기계적 방법을 이용하여, 세포를 파괴한다. 또한, 세포내 단백질은 면역원성 폴리펩티드의 누출이 발생하도록, 예를 들어, 세제 또는 유기 용매를 사용하여 세포벽 또는 막으로부터 성분을 제거함으로써 얻어질 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 개시된 발명과 함께 사용하기 위한 세포를 파괴하는 방법은 음파처리(sonication) 또는 초음파처리(ultrasonication); 교반 (agitation); 액체 또는 고체 압출; 열처리; 동결-융해(freeze-thaw); 건조 (desiccation); 폭발성 감압(explosive decompression); 삼투압 충격(osmotic shock); 트립신, 뉴라미니다제 및 리소자임과 같은 프로테아제를 포함하는 용해 효소로의 처리; 알칼리 처리; 및 담즙산염(bile salts), 나트륨 도데실설페이트 (sodium dodecylsulphate), 트리톤(Triton), NP40 및 CHAPS와 같은 세제 및 용매의 사용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포를 파괴하는데 사용되는 특정 기법은 대체로 선택의 문제이며, 폴리펩티드가 발현되는 세포 유형, 배양 조건 및 사용되는 모든 전-처리에 따라 달라질 것이다.
세포의 파괴 후, 일반적으로 원심분리에 의해 세포 잔해(cellular debris)가 제거되며, 세포내 생성된 사포바이러스 면역원성 폴리펩티드는 컬럼 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 전기영동, HPLC, 면역흡수 기법, 친화도 크로마토그래피, 면역침전 등과 같으나 이에 한정되지 않는 표준 정제 기법을 이용하여 더 정제된다.
예를 들어, 본 명세서에 개시된 세포내 사포바이러스 면역원성 폴리펩티드를 얻기 위한 한 가지 방법은 특정 항체를 이용한 면역친화도 크로마토그래피와 같은 친화도 정제를 포함한다. 적당한 친화도 수지의 선택은 당해 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 친화도 정제 후, 면역원성 폴리펩티드는 당해 기술분야에 잘 알려진 통상적인 기법을 이용하여, 예를 들어 상기 기재된 기법 중 어느 하나에 의해 더 정제될 수 있다.
다중 폴리펩티드를 동시에 생성하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 바이러스 균주로부터의 구조적 및/또는 비구조적 단백질 또는 폴리펩티드 면역보조제와 조합된 바이러스 폴리펩티드). 2 이상의 상이한 폴리펩티드의 생성은 예를 들어, 상이한 폴리펩티드를 인코딩하는 구조체와 숙주 세포를 공동-형질감염시킴으로써 쉽게 달성될 수 있다. 공동-형질감염은 트랜스 또는 시스로, 즉, 별도의 벡터를 이용하거나 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 벡터를 이용하여 달성될 수 있다. 단일 벡터가 사용되는 경우, 폴리펩티드의 발현은 제어 요소의 단일 세트에 의해 구동될 수 있거나, 또는 대안적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 개개의 제어 요소에 의해 조절되는 개개의 발현 카세트의 벡터 상에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 본 명세서에 개시된 발명과 함께 실시에 사용될 수 있는 고체 지지체는 니트로셀룰로오스 (예를 들어, 막 또는 마이크로타이터 웰 형태); 폴리염화비닐 (예를 들어, 시트 또는 마이크로타이터 웰); 폴리스티렌 라텍스 (예를 들어, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트); 불화 폴리비닐리덴(polyvinylidene fluoride); 디아조화 종이 (diazotized paper); 나일론 막; 활성화된 비드, 자기 반응성 비드 등과 같은 기질을 포함한다.
일반적으로, 고체 지지체는 먼저 성분이 지지체에 충분히 고정되도록, 적당한 결합 조건 하에 고체상 성분 (예를 들어, 하나 이상의 사포바이러스 항원)과 반응한다. 때때로, 지지체에 대한 항원의 고정화는 더 나은 결합 특성을 가진 단백질에 먼저 항원을 결합함으로써 향상될 수 있다. 적당한 결합 단백질은 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 면역글로불린 분자, 티로글로불린(thyroglobulin), 오브알부민, 및 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 단백질과 같은 거대분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 지지체에 항원을 결합시키기 위해 사용될 수 있는 다른 분자는 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체 등을 포함한다. 이러한 분자 및 항원에 이들 분자를 결합시키는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
원하는 경우, 폴리펩티드는 통상적인 기법을 이용하여 표지될 수 있다. 적당한 표지는 형광단(fluorophores), 발색단(chromophores), 방사성 원자 (특히, 32P 및 125I, 고전자밀도 시약(electron-dense reagents), 효소, 및 특이적 결합 파트너를 갖는 리간드)를 포함한다. 효소는 일반적으로 이들의 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)는 일반적으로 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 분광광도계로 정량화할 수 있는 청색 안료로 전환하는 능력으로 검출된다. "특이적 결합 파트너"는 예를 들어 항원 및 이에 특이적인 단일클론 항체의 경우와 같이, 높은 특이도로 리간드 분자에 결합할 수 있는 단백질을 나타낸다. 다른 특이적 결합 파트너는 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, IgG 및 단백질 A, 및 당해 기술분야에 알려진 수많은 수용체-리간드 커플을 포함한다. 단일 표지 또는 표지들의 조합은 본 명세서에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
일단 제형화되면, 본 명세서에 개시된 조성물은 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같이) 피험자에게 직접 투여될 수 있거나, 또는 대안적으로, 상기 기재된 것과 같은 방법을 이용하여 피험자로부터 유래된 세포에 ex vivo로 전달될 수 있다.
면역원성 조성물
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 면역원성 폴리펩티드 및/또는 폴리단백질 다중에피토프 융합 단백질 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 상이한 폴리펩티드, 폴리단백질, 및 다중 에피토프 융합 단백질은 단일 제형으로 함께 혼합될 수 있다. 이러한 조합 내에서, 면역원성 조성물의 항원은 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 다중 에피토프 폴리펩티드, 또는 폴리단백질에 존재할 수 있다. 하나의 측면에서, 면역원성 조성물을 포함하는 사포바이러스 VP1은 바큘로바이러스 발현된 곤충 숙주 세포로부터의 용해물을 포함한다. 관련 측면에서, 상기 용해물은 다양한 수준의 분별(fractionation)을 거치거나 또는 비분별되며(unfractionated), 여기서 발현된 단백질은 발현된 상태로부터 변형되거나 또는 비변형된다 (예를 들어, 온전한 Hisn 태그).
면역원성 조성물은 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있으며, 이는 동일한 또는 상이한 비히클을 이용하여 차례로 전달될 수 있다. 항원은 예를 들어, 예방적 (즉, 감염을 예방하기 위해) 또는 치료적 (감염을 치료하기 위해) 면역원성 조성물로 개별적으로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 면역원성 조성물은 원하는 효과를 달성하기 위해 1회 이상 제공될 수 있다 (예를 들어, "프라임(prime)" 투여 후 하나 이상의 "부스트(boosts)"). 동일한 조성물은 하나 이상의 프라이밍 단계 및 하나 이상의 부스팅 단계로 투여될 수 있다. 대안적으로, 상이한 조성물은 프라이밍 및 부스팅에 사용될 수 있다.
면역원성 조성물은 일반적으로 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 하나 이상의 "약학적으로 허용가능한 부형제 또는 비히클"을 포함할 것이다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질은 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
면역원성 조성물은 일반적으로 상기 언급된 성분 이외에, 하나 이상의 "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 것이다. 이들은 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적당한 담체는 일반적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체 (예를 들어, 오일 액적 또는 리포좀)와 같은 크고 천천히 대사되는 거대분자이다. 이러한 담체는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 또한, 조성물은 물, 식염수, 글리세롤 등과 같은 희석제를 함유할 수 있다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 존재할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 성분에 대한 자세한 논의는 Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed., ISBN: 0683306472에서 이용가능하다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 또는 설페이트와 같은 무기염, 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 또는 벤조에이트와 같은 유기산의 염도 본 명세서에 개시된 조성물에 사용될 수 있다. 특히 유용한 단백질 기질은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 면역글로불린 분자, 티로글로불린, 오브알부민, 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 및 통상의 기술자에게 잘 알려진 기타 단백질이다. 또한, 개시된 조성물은 단독으로 또는 조합하여, 물, 식염수, 글리세롤, 덱스트로오스, 에탄올 등과 같은 액체 또는 부형제, 및 습윤제, 유화제 또는 pH 완충제와 같은 물질을 함유할 수 있다. 또한, 항원은 PLG와 같은 미립자 담체 및 리포좀에 흡착되거나, 내부에 포획되거나 또는 결합될 수 있다.
항원은 면역원성을 향상시키기 위하여 담체 단백질에 접합될 수 있다. 이것은 당류 또는 탄수화물 항원이 사용되는 조성물에서 특히 유용하다.
담체 단백질은 디프테리아 또는 파상풍 톡소이드와 같은 박테리아 독소 또는 톡소이드를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. CRM197 디프테리아 톡소이드를 사용할 수 있다. 다른 담체 폴리펩티드는 N. 메닌지티디스(meningitidis) 외막 단백질 (EP-A-0372501), 합성 펩티드 (EP-A-0378881 및 EP-A-0427347), 열 충격 단백질 (WO 93/17712 및 WO 94/03208), 백일해(pertussis) 단백질 (WO 98/58668 및 EP-A-0471177), H. 인플루엔자로부터의 단백질 D (WO 00/56360), 사이토카인 (WO 91/01146), 림포카인, 호르몬, 성장 인자, C. 디피실레(difficile)로부터의 독소 A 또는 B (WO 00 /61761), 전달(transferring)과 같은 철-흡수 단백질 (WO 01/72337) 등을 포함한다. 혼합물이 세리그래프(serigraphs) A 및 C 둘 다로부터의 캡슐 당류 (capsular saccharide)를 포함하는 경우, MenA 당류:MenC 당류의 비 (w/w)는 1 이상일 수 있다 (예를 들어, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 또는 그 이상). 상이한 당류는 동일한 또는 상이한 유형의 담체 단백질에 접합될 수 있다. 필요한 경우, 임의의 적당한 링커와 함께, 임의의 적당한 접합 반응이 사용될 수 있다.
개시된 백신을 포함하는 면역원성 조성물은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 백신은 면역보조제를 포함할 수 있다. 면역보조제는 하기에 기재된 하기 유형의 면역보조제 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
무기질 함유 조성물
본 명세서에 개시된 면역보조제로 사용하기에 적합한 무기질 함유 조성물은 알루미늄염 및 칼슘염과 같은 무기염을 포함한다. 본 명세서에 개시된 염은 수산화물 (예를 들어, 옥시수산화물), 포스페이트 (예를 들어, 히드록시포스페이트, 오르토포스페이트), 설페이트 등과 같은 무기염, 또는 임의의 적당한 형태 (예를 들어, 겔, 결정질, 무정형 등)를 취하는 화합물과 상이한 무기질 화합물의 혼합물 (예를 들어, 임의로 과량의 포스페이트와 함께, 포스페이트 및 수산화물 면역보조제의 혼합물)을 포함한다. 또한, 무기질 함유 조성물은 금속 염의 입자로서 제형화될 수 있다 (WO00/23105).
알루미늄염은 Al3+의 용량이 용량당 0.2 내지 1.0 mg이 되도록 백신에 포함될 수 있다.
실시예에서, 개시된 바와 같이 사용하기 위한 알루미늄 기반 면역보조제는 명반(alum) (황산 알루미늄 칼륨(aluminum potassium sulfate) (AlK(SO4)2)), 또는 인산염 완충제 내 항원을 명반과 혼합한 후 수산화 암모늄 또는 수산화 나트륨과 같은 염기로 적정 및 침전시켜 제자리(in-situ)에서 형성된 것과 같은 명반 유도체이다.
본 발명의 백신 제형에 사용하기 위한 또 다른 알루미늄-기반 면역보조제는 수산화알루미늄 면역보조제 (Al(OH)3) 또는 대략 500 m2/g의 표면적을 갖는 우수한 흡착제인 결정질 알루미늄 옥시수산화물 (AlOOH)이다. 대안적으로, 알루미늄 포스페이트 면역보조제 (AlPO4) 또는 수산화알루미늄 면역보조제의 히드록실 기의 일부 또는 전부 대신에 포스페이트 기를 함유하는 알루미늄 히드록시포스페이트가 제공된다. 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 알루미늄 포스페이트 면역보조제는 무정형이며, 산성, 염기성 및 중성 매질에 가용성이다.
실시예에서, 본 명세서 개시된 면역보조제는 알루미늄 포스페이트 및 수산화알루미늄을 둘 다 포함한다. 하나의 측면에서, 면역보조제는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 9:1 이상의 알루미늄 포스페이트 대 수산화알루미늄 중량비와 같이, 수산화알루미늄보다 더 많은 양의 알루미늄 포스페이트를 가진다. 더욱 더 특히, 백신 내 알루미늄 염은 백신 용량당 0.4 내지 1.0 mg, 또는 백신 용량당 0.4 내지 0.8 mg, 또는 백신 용량당 0.5 내지 0.7 mg, 또는 백신 용량당 약 0.6 mg으로 존재한다.
일반적으로, 알루미늄-기반 면역보조제(들), 또는 알루미늄 포스페이트 대 수산화알루미늄과 같은 다중 알루미늄-기반 면역보조제의 비는 항원이 원하는 pH에서 면역보조제와 반대 전하를 갖도록 분자 사이의 정전기 인력의 최적화에 의해 선택된다. 예를 들어, 알루미늄 포스페이트 면역보조제 (iep=4)는 리소자임을 흡착하나, pH 7.4에서 알부민을 흡착하지 않는다. 알부민이 표적인 경우, 수산화알루미늄 면역보조제가 선택될 것이다 (즉, 11.4). 대안적으로, 포스페이트로 수산화알루미늄의 전처리는 이의 등전점을 낮추어, 보다 염기성 항원에 대해 선호되는 면역보조제가 된다.
오일-에멀젼
면역보조제로 사용하기에 적합한 오일-에멀젼 조성물은 스쿠알렌-물 에멀젼, 예를 들어 MF59 (미세유동화기를 이용하여 서브미크론 입자로 제형화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% TWEEN 80™, 및 0.5% SPAN 85™)를 포함할 수 있다. 참조, WO90/14837. MF59는 FLUAD™ 인플루엔자 바이러스 3가 아단위 백신에서 면역보조제로 사용된다.
특히 조성물에 사용하기 위한 면역보조제는 서브미크론 수중유 에멀젼이다. 본 명세서에서 사용하기 위한 서브미크론 수중유 에멀젼은 4-5% w/v 스쿠알렌, 0.25-1.0% w/v TWEEN 80™ (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트), 및/또는 0.25-1.0% SPAN 85™ (소르비탄 트리올레에이트), 및 임의로, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(베타-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE)을 함유하는 서브미크론 수중유 에멀젼과 같은, 임의로 다양한 양의 MTP-PE를 함유하는 스쿠알렌/물 에멀젼, 예를 들어, "MF59"로 알려진 서브미크론 수중유 에멀젼 (국제 공개 번호 WO90/14837; U.S. 특허 번호 제 6,299,884호 및 제 6,451,325호)일 수 있다. MF59는 4-5% w/v 스쿠알렌 (예를 들어, 4.3%), 0.25-0.5% w/v TWEEN 80™, 및 0.5% w/v SPAN 85™을 함유하며, 임의로 Model 110Y 미세유동화기 (Microfluidics, Newton, Mass.)와 같은 미세유동화기를 이용하여 서브미크론 입자로 제형화된 다양한 양의 MTP-PE를 함유한다. 예를 들어, MTP-PE는 약 0-500 μg/용량, 0-250 μg/용량 및 0-100 μg/용량의 양으로 존재할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "MF59-0"은 MTP-PE가 결여된 상기 서브미크론 수중유 에멀젼을 나타내는 반면, 용어 MF59-MTP는 MTP-PE를 함유하는 제형을 나타낸다. 예를 들어, "MF59-100"은 용량당 100 μg MTP-PE 등을 함유한다. 본 명세서에서 사용하기 위한 또 다른 서브미크론 수중유 에멀젼인 MF69는 4.3% w/v 스쿠알렌, 0.25% w/v TWEEN 80™, 및 0.75% w/v SPAN 85™ 및 임의로 MTP-PE를 함유한다. 또 다른 서브미크론 수중유 에멀젼은 10% 스쿠알렌, 0.4% TWEEN 80™, 5% 플루로닉-블록 고분자 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF로도 알려진 MF75이며, 역시 서브미크론 에멀젼으로 미세유동화된다. MF75-MTP는 용량당 100-400 μg MTP-PE와 같은 MTP를 포함하는 MF75 제형을 나타낸다.
서브미크론 수중유 에멀젼, 이의 제조 방법 및 조성물에 사용하기 위한 무라밀 펩티드와 같은 면역자극제는 국제 공개 번호 WO90/14837 및 U.S. 특허 번호 제 6,299,884호 및 제 6,451,325호에 상세히 기재되어 있다.
완전 프로인트 면역보조제 (Complete Freund's adjuvant, CFA) 및 불완전 프로인트 면역보조제 (incomplete Freund's adjuvant, IFA)도 면역보조제로 사용될 수 있다.
사포닌 제형
사포닌 제형은 면역보조제로도 사용될 수 있다. 사포닌은 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코시드 및 트리테르페노이드 글리코시드의 이종 군(heterologous group)이다. 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaia saponaria Molina) 나무의 나무껍질로부터 분리된 사포닌은 면역보조제로서 널리 연구되어 왔다. 또한, 사포닌은 스밀락스 오르나타(Smilax ornata) (사사파릴라(sarsaparilla)), 집소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata) (신부 베일(brides veil)), 및 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) (비누 뿌리(soap root))로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 사포닌 면역보조제 제형은 QS21과 같은 정제된 제형, 및 ISCOMs과 같은 지질 제형을 포함한다.
고성능 박층 크로마토그래피 (High Performance Thin Layer Chromatography, HP-TLC) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)를 이용하여 사포닌 조성물을 정제하였다. QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함하는 이러한 기법을 이용하여 특정 정제 분획을 확인하였다. 실시예에서, 사포닌은 QS21이다. QS21의 제조 방법은 U.S. 특허 번호 제 5,057,540호에 개시되어 있다. 또한, 사포닌 제형은 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함할 수 있다 (참조 WO96/33739).
사포닌 및 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(Immunostimulating Complexes, ISCOMs)라고 하는 독특한 입자를 형성하는데 사용될 수 있다. ISCOMs은 일반적으로 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 인지질도 포함한다. 알려진 모든 사포닌을 ISCOMs에 사용할 수 있다. 실시예에서, ISCOM은 Quil A, QHA 및 QHC 중 하나 이상을 포함한다. ISCOMs은 EP0109942, WO96/11711 및 WO96/33739에 더 기재되어 있다. 임의로, ISCOMs는 추가 세제(들)이 없을 수 있다. 참조 WO00/07621.
박테리아 또는 미생물 유도체
본 명세서에 개시된 바와 같이 사용하기에 적합한 면역보조제는 하기와 같은 박테리아 또는 미생물 유도체를 포함한다:
(1) 엔테로박테리아 지질다당류 (Lipopolysaccharide, LPs)의 비-독성 유도체
이러한 유도체는 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 3-O-탈아실화 MPL (3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 3 탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 하나의 "작은 입자" 형태는 EP 0 689 454에 개시되어 있다. 3dMPL의 이러한 "작은 입자"는 0.22 미크론 막을 통해 멸균 여과될 만큼 충분히 작다 (참조 EP 0 689 454). 다른 비-독성 LPS 유도체는 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예를 들어 RC-529와 같은 모노포스포릴 지질 A 모방체를 포함한다.
(2) 지질 A 유도체
지질 A 유도체는 OM-174와 같은 대장균으로부터의 지질 A의 유도체를 포함한다.
(3) 면역자극성 올리고뉴클레오티드
면역보조제로 사용하기에 적합한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프 (비메틸화(unmethylated) 시토신 다음에 구아노신을 함유하며 포스페이트 결합에 의해 연결된 서열)를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 재발성(palindromic) 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 박테리아 이중 가닥 RNA 또는 올리고뉴클레오티드는 면역자극성인 것으로 나타났다.
CpG's는 포스포로티오에이트 변형과 같은 뉴클레오티드 변형/유사체를 포함할 수 있으며, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 임의로, 구아노신은 2'-데옥시-7-데아자구아노신과 같은 유사체로 대체될 수 있다.
CpG 서열은 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT와 같은 TLR9에 관한 것일 수 있다. CpG 서열은 CpG-A ODN과 같은 Th1 면역 반응 유도에 특이적일 수 있거나, 또는 CpG-B ODN과 같은 B 세포 반응 유도에 더 특이적일 수 있다. 실시예에서, CpG는 CpG-A ODN이다.
실시예에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 5' 말단이 수용체 인식을 위해 접근 가능하도록 구성될 수 있다. 임의로, 2개의 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 이들의 3' 말단에 부착되어 "면역체(immunomers)"를 형성할 수 있다.
(4) ADP-리보실화 독소 및 이의 해독화된(Detoxified) 유도체.
박테리아 ADP-리보실화 독소 및 이의 해독화된 유도체는 면역보조제로 사용될 수 있다. 실시예에서, 단백질은 E. coli (즉, E. coli 열 불안정성 엔테로독소 "LT"), 콜레라 ("CT"), 또는 백일해 ("PT")로부터 유래될 수 있다. 해독화된 ADP-리보실화 독소의 점막 면역보조제로서의 용도는 WO95/17211에 기재되어 있으며, 비경구 면역보조제로서는 WO98/42375에 기재되어 있다. 실시예에서, 면역보조제는 LT-K63, LT-R72, 및 LTR192G와 같은 해독화된 LT 돌연변이체이다.
생체접착제 및 점막접착제(Bioadhesives and Mucoadhesives)
생체접착제 및 점막접착제는 면역보조제로도 사용될 수 있다. 적당한 생체접착제는 에스터화 히알루론산 미소구체 또는 폴리아크릴산, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 다당류 및 카복시메틸셀룰로오스의 가교결합된 유도체와 같은 점막접착제를 포함한다. 키토산 및 이의 유도체도 면역보조제로 사용될 수 있다. 예를 들어, WO99/27960.
무라밀 펩티드(Muramyl Peptides)
면역보조제로 사용하기에 적합한 무라밀 펩티드의 예는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-1-알라닐-d-이소글루타민 (nor-MDP), 및 N-아세틸무라밀-1-알라닐-d-이소글루타미닐-1-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-s-n-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE)을 포함한다.
이미다조퀴놀린 화합물.
면역보조제로 사용하기에 적합한 이미다조퀴놀린 화합물의 예는 이미퀴모드 (Imiquimod) 및 이의 유사체를 포함한다 (참조, 예를 들어, U.S. 특허 번호 4,689,338, 5,389,640, 5,268,376, 4,929,624, 5,266,575, 5,352,784, 5,494,916, 5,482,936, 5,346,905, 5,395,937, 5,238,944, 및 5,525,612).
티오세미카바존(Thiosemicarbazone) 화합물.
티오세미카바존 화합물의 예, 및 면역보조제로 사용하기에 적합한 모든 화합물의 제형화 방법, 제조 방법, 및 스크리닝 방법은 WO04/60308에 기재된 것을 포함한다. 티오세미카바존은 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.
트립탄트린(Tryptanthrin) 화합물.
트립탄트린 화합물의 예, 및 본 명세서에 개시된 면역보조제로 사용하기에 적합한 모든 화합물의 제형화 방법, 제조 방법, 및 스크리닝 방법은 WO04/64759에 기재된 것을 포함한다. 트립탄트린 화합물은 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.
상기 확인된 면역보조제 중 하나 이상의 측면의 조합은 본 명세서에 개시된 조성물에 적용될 수 있다. 예를 들어, 하기의 면역보조제 조성물이 사용될 수 있다:
(1) 사포닌 및 수중유 에멀젼 (WO99/11241); (2) 사포닌 (예를 들어, QS21)+비-독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL) (참조 WO94/00153); (3) 사포닌 (예를 들어, QS21)+비-독성 LPS 유도체 (예를 들어, 3dMPL)+콜레스테롤; (4) 사포닌 (예를 들어, QS21)+3dMPL+IL-12 (임의로+스테롤) (WO98/57659); (5) 예를 들어, QS21 및/또는 수중유 에멀젼과 3dMPL의 조합 (참조, 유럽 특허 출원 0835318, 0735898 및 0761231); (6) 서브미크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 또는 더 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 볼텍싱된, 10% 스쿠알렌, 0.4% TWEEN 80™, 5% 플루로닉-블록 고분자 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, (7) 2% 스쿠알렌, 0.2% TWEEN 80™, 및 모노포스포릴지질 A (MPL), 트레할로오스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분인 MPL+CWS (DETOX™)을 함유하는 RIBI™ 면역보조제 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem); 및 (8) 하나 이상의 무기염 (예를 들어, 알루미늄 염)+ LPS의 비-독성 유도체 (예를 들어, 3dPML), (9) 하나 이상의 무기염 (예를 들어, 알루미늄 염) 및 하나 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CpG 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열) 및 하나 이상의 해독화된 ADP-리보실화 독소 (예를 들어, LT-K63 및 LT-R72).
추가 항원
본 명세서에 개시된 조성물은 임의로 사포바이러스 단백질로부터 유래되지 않은 하나 이상의 추가 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 이러한 항원은 박테리아, 바이러스, 또는 기생충 항원을 포함한다.
일 실시예에서, 사포바이러스 항원은 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus) (인플루엔자), 뉴모바이러스(Pneumovirus) (RSV), 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus) (PIV 및 볼거리(Mumps)), 모르빌리바이러스(Morbillivirus) (홍역 (measles)), 토가바이러스(Togavirus) (풍진(Rubella)), 엔테로바이러스 (Enterovirus) (소아마비(polio)), HBV, 코로나바이러스 (SARS), 및 수두-대상포진 바이러스(Varicella-zoster virus) (VZV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus) (EBV), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 나이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (A군 스트렙토코쿠스), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani) (파상풍), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae) (디프테리아), 헤모필루스(Haemophilus) 인플루엔자 B (Hib), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) (B군 스트렙토코쿠스), 및 E. coli와 같은 박테리아 또는 바이러스로부터 유래된 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 항원과 조합된다.
다른 실시예에서, 사포바이러스 항원은 나이세리아 메닌지티데스, 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (A군 스트렙토코쿠스), 모락셀라 카타랄리스, 보르데텔라 페르투시스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermis), 클로스트리디움 테타니 (파상풍), 코리네박테리움 디프테리아 (디프테리아), 헤모필루스 인플루엔자 B (Hib), 슈도모나스 애루지노사, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스트렙토코쿠스 아갈락티애 (B군 스트렙토코쿠스), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 오르토믹소바이러스 (인플루엔자), 뉴모바이러스 (RSV), 파라믹소바이러스 (PIV 및 볼거리), 모르빌리바이러스 (홍역), 토가바이러스 (풍진), 엔테로바이러스 (소아마비), HBV, 코로나바이러스 (SARS), 수두-대상포진 바이러스 (VZV), 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) (CMV)를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 항원과 조합된다.
다른 실시예에서, 사포바이러스 항원은 설사병을 야기하는 병원체로부터 개체를 보호하도록 설계된 백신에 유용한 하나 이상의 항원과 조합된다. 이러한 항원은 로타바이러스(rotavirus), 시겔라(Shigella) spp., 장관독소원성 대장균 (enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 실시예에서, 하나 이상의 노로바이러스 항원은 노르워크(Norwalk) 바이러스, 스노우 마운틴(Snow Mountain) 바이러스, 및/또는 하와이 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 면역원성 조성물에서 로타바이러스 항원과 조합된다.
본 조성물과 함께 사용할 수 있는 항원은 하기에 제시된 하기 항원 중 하나 이상, 또는 하기에 제시된 병원체 중 하나 이상으로부터 유래된 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
박테리아 항원
본 명세서에 개시된 적당한 박테리아 항원은 단백질, 다당류, 지질다당류, 및 박테리아로부터 분리, 정제 또는 유래될 수 있는 외막 소포체(vesicles)를 포함한다. 또한, 박테리아 항원은 박테리아 용해물 및 비활성화 박테리아 제형을 포함할 수 있다. 박테리아 항원은 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 박테리아 항원은 이의 수명 주기(life cycle)의 적어도 한 단계 동안 박테리아의 표면에 노출될 수 있는 에피토프를 포함한다. 박테리아 항원은 여러 혈청형(serotypes)에 걸쳐 보존될 수 있다. 박테리아 항원은 하기에 제시된 박테리아 중 하나 이상으로부터 유래된 항원 및 하기에 확인된 특정 항원 예를 포함한다.
나이세리아 메닌지티데스: 메닌지티데스 항원은 (예를 들어, 참고문헌 1-7에서 확인된 것과 같은) 단백질, 당류 (다당류, 올리고당류 또는 지질다당류 포함), 또는 A, C, W135, Y, 및/또는 B와 같은 N. 메닌지티데스 혈청군(serogroup)으로부터 정제되거나 또는 유래된 외막 소포체를 포함할 수 있다. 메닌지티데스 단백질 항원은 유착(adhesions), 자가수송체(autotransporters), 독소, Fe 획득 단백질, 및 막 관련 단백질 (예를 들어, 일체형 외막 단백질(integral outer membrane protein))로부터 선택될 수 있다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애: 스트렙토코쿠스 뉴모니애 항원은 당류 (다당류 또는 올리고당류 포함) 및/또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 당류 항원은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F로부터 선택될 수 있다. 단백질 항원은 WO 98/18931, WO 98/18930, U.S. 특허 번호 제 6,699,703호, U.S. 특허 번호 제 6,800,744호, WO 97/43303, 및 WO 97/37026에서 확인된 단백질로부터 선택될 수 있다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질은 폴리 히스티딘 트리어드 계열(Poly Histidine Triad family) (PhtX), 콜린 결합 단백질 계열 (CbpX), CbpX 절단체 (truncates), LytX 계열, LytX 절단체, CbpX 절단체-LytX 절단체 키메라 단백질, 뉴몰리신(pneumolysin) (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 또는 Sp133으로부터 선택될 수 있다.
스트렙토코쿠스 피오게네스 (A군 스트렙토코쿠스): A군 스트렙토코쿠스 항원은 WO 02/34771 또는 WO 2005/032582에서 확인된 단백질 (GAS 40 포함), GAS M 단백질의 단편의 융합체 (WO 02/094851에 기재된 것을 포함), 피브로넥틴 결합 단백질 (Sfb1), 스트렙토코컬 헴(Streptococcal heme)-관련 단백질 (Shp), 및 스트렙토리신(Streptolysin) S (SagA)를 포함할 수 있다.
모락셀라 카타랄리스: 모락셀라 항원은 WO 02/18595 및 WO 99/58562에서 확인된 항원, 외막 단백질 항원 (HMW-OMP), C-항원, 및/또는 LPS를 포함한다.
보르데텔라 페르투시스: 페르투시스 항원은 B. 페르투시스로부터의 페르투시스 홀로톡신 (PT) 및 사상체 혈구응집소 (filamentous haemagglutinin, FHA)를 포함하며, 임의로 퍼탁틴(pertactin) 및/또는 응집원(agglutinogens) 2 및 3 항원과의 조합도 포함한다.
스타필로코쿠스 아우레우스: 스타프 아우레우스(Staph aureus) 항원은 비독성 재조합 슈도모나스 애루지노사 외독소 A, 예를 들어 STAPHVAX™에 임의로 접합된 S. 아우레우스 유형 5 및 8 캡슐 다당류, 또는 표면 단백질로부터 유래된 항원, 인바신(invasins) (류코시딘(leukocidin), 키나제, 히알루로니다제), 식세포 포식 (phagocytic engulfment)을 저해하는 표면 인자 (캡슐, 단백질 A), 카로티노이드 (carotenoids), 카탈라제(catalase) 생성, 단백질 A, 응고효소(coagulase), 응고 인자(clotting factor), 및/또는 진핵 세포막을 용해시키는 (임의로 해독화된) 막-손상 독소 (용혈소(hemolysins), 류코톡신(leukotoxin), 류코시딘)을 포함한다.
스타필로코쿠스 에피더미스: S. 에피더미스 항원은 점액(slime)-관련 항원 (SAA)을 포함한다.
클로스트리디움 테타니 (파상풍): 파상풍 항원은 파상풍 톡소이드 (TT)를 포함하며, 본 발명의 조성물과 함께/접합된 담체 단백질로 사용될 수 있다.
코리네박테리움 디프테리아 (디프테리아): 디프테리아 항원은 해독화된 CRM197를 포함하는 디프테리아 독소를 포함한다. 또한, ADP 리보실화를 조절, 저해 또는 관련시킬 수 있는 항원은 본 발명의 조성물과의 조합/공동-투여/접합을 위해 고려된다. 디프테리아 톡소이드는 담체 단백질로 사용될 수 있다.
헤모필루스 인플루엔자 B (Hib): Hib 항원은 Hib 당류 항원을 포함한다.
슈도모나스 애루지노사: 슈도모나스 항원은 내독소(endotoxin) A, Wzz 단백질, P. 애루지노사 LPS, 더 특히 PAO1 (O5 혈청형)로부터 분리된 LPS, 및/또는 외막 단백질 F (OprF)를 포함하는 외막 단백질을 포함한다.
레지오넬라 뉴모필라: 박테리아 항원은 레지오넬라 뉴모필라로부터 유래될 수 있다.
스트렙토코쿠스 아갈락티애 (B군 스트렙토코쿠스): B군 스트렙토코쿠스 항원은 WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157, 또는 WO 2005/002619에서 확인된 단백질 또는 당류 항원을 포함한다 (단백질 GBS 80, GBS 104, GBS 276 및 GBS 322 포함, 및 혈청형 Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII으로부터 유래된 당류 항원 포함).
나이세리아 고노뢰애(Neiserria gonorrhoeae): 고노뢰애 항원은 Por (또는 포린(porin)) 단백질 (예를 들어, PorB), 전달 결합 단백질 (예를 들어, TbpA 및 TbpB), 불투명 단백질 (예를 들어, Opa), 감소-변형 단백질(reduction-modifiable protein) (Rmp), 및 외막 소포체 (OMV) 제제를 포함한다 (참조, 예를 들어, WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO02/079243).
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis): 클라미디아 트라코마티스 항원은 혈청형 A, B, Ba 및 C (실명(blindness)의 원인인 트라코마의 제제), 혈청형 L1, L2 & L3 (성병성 림프육아종(Lymphogranuloma venereum)과 관련됨), 및 혈청형 D-K로부터 유래된 항원을 포함한다. 또한, 클라미디아 트라코마티스 항원은 PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-like (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823), 및 MurG (CT761)을 포함하여, WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811, 또는 WO 05/002619에서 확인된 항원을 포함할 수 있다.
트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum) (매독(Syphilis)): 매독 항원은 TmpA 항원을 포함한다.
헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi) (연성하감(chancroid)을 야기함): 듀크레이 항원은 외막 단백질 (DsrA)을 포함한다.
엔테로코쿠스 패칼리스 또는 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium): 항원은 삼당류 반복 또는 U.S. 특허 번호 제 6,756,361호에 제공된 다른 엔테로코쿠스 유래 항원을 포함한다.
헬리코박터 파일로리: H. 파일로리 항원은 Cag, Vac, Nap, HopX, HopY 및/또는 우레아제 항원을 포함한다.
스타필로코쿠스 사프로피티커스(Staphylococcus saprophyticus): 항원은 S. 사프로피티커스 항원의 160 kDa 헤마글루티닌을 포함한다.
예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 항원은 LPS를 포함한다.
E. coli: E. coli 항원은 장관독소원성 E. coli (ETEC), 장관집적성 (enteroaggregative) E. coli (EAggEC), 분산 부착(diffusely adhering) E. coli (DAEC), 장관병원성(enteropathogenic) E. coli (EPEC), 및/또는 장관출혈성 (enterohemorrhagic) E. coli (EHEC)로부터 유래될 수 있다.
바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) (탄저병(anthrax)): B. 안트라시스 항원은 임의로 해독화되며, A-성분 (치사 인자 (LF) 및 부종 인자 (EF))로부터 선택될 수 있고, 둘 다 보호 항원 (PA)으로 알려진 공통 B-성분을 공유할 수 있다.
예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) (전염병(plague)): 전염병 항원은 F1 캡슐 항원을 포함한다.
미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis): 투베르쿨로시스 항원은 지질단백질, LPS, BCG 항원, 항원 85B (Ag85B)의 융합 단백질 및/또는 양이온성 지질 소포체에서 임의로 제형화된 ESAT-6, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mtb) 이소시트레이트 탈수소효소 관련 항원, 및/또는 MPT51 항원을 포함한다.
리케차(Rickettsia): 항원은 외막 단백질 A 및/또는 B (OmpB)를 포함하는 외막 단백질을 포함한다.
리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes): 박테리아 항원은 리스테리아 모노시토게네스로부터 유래될 수 있다.
클라미디아 뉴모니애: 항원은 WO 02/02606에서 확인된 것을 포함한다.
비브리오 콜레라: 항원은 프로테이나제 항원, LPS, 특히 비브리오 콜레라 II의 지질다당류, O1 이나바(Inaba) O-특이적 다당류, V. 콜레라 O139, IEM108 백신의 항원, 및/또는 조눌라 옥클루덴스 독소(Zonula occludens toxin) (Zot)를 포함한다.
살모넬라 타이피(Salmonella typhi) (장티푸스(typhoid fever)): 항원은 접합체 (Vi, 즉, vax-TyVi)를 포함하는 캡슐 다당류를 포함한다.
보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi) (라임병(Lyme disease)): 항원은 지질단백질 (예를 들어, OspA, OspB, Osp C 및 Osp D), OspE-관련 단백질 (Erps)과 같은 기타 표면 단백질, 데코린-결합 단백질 (예를 들어, DbpA), 및 P39 및 P13 VlsE 항원 변이 단백질과 관련된 항원과 같은 항원적으로 가변성 VI 단백질을 포함한다.
포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis): 항원은 P. 진지발리스 외막 단백질 (OMP)을 포함한다.
클렙시엘라(Klebsiella): 항원은 OMP A를 포함하는 OMP, 또는 파상풍 톡소이드에 임의로 접합된 다당류를 포함한다.
본 발명의 추가 박테리아 항원은 상기 중 어느 하나의 캡슐 항원, 다당류 항원 또는 단백질 항원일 수 있다. 또한, 추가 박테리아 항원은 외막 소포체 (OMV) 제제를 포함할 수 있다. 또한, 항원은 상기한 박테리아 중 어느 하나의 생(live), 약독화, 및/또는 정제된 버전을 포함한다. 본 발명의 항원은 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항원은 호기성 또는 혐기성 박테리아로부터 유래될 수 있다.
또한, 상기 박테리아-유래 당류 (다당류, LPS, LOS 또는 올리고당류) 중 어느 하나는 담체 단백질 (예를 들어, CRM197)과 같은 다른 제제 또는 항원에 접합될 수 있다. 이러한 접합은 U.S. 특허 번호 제 5,360,897호에 제공된 바와 같이, 당류 상의 카보닐 부분의 단백질 상의 아미노기로의 환원적 아미노화(reductive amination)에 의해 영향을 받는 직접 접합일 수 있다. 대안적으로, 당류는 석신아미드 또는 다른 결합과 같은 링커를 통해 접합될 수 있다.
바이러스 항원
개시된 조성물에서 사용하기에 적합한 바이러스 항원은 정제된 아단위 제형, 바이러스로부터 분리, 정제 또는 유래될 수 있는 바이러스 단백질, 및 바이러스 유사 입자 (VLPs)를 포함한다. 바이러스 항원은 세포 배양물 또는 기타 기질에서 증식된 바이러스로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 항원은 재조합적으로 발현될 수 있다. 바이러스 항원은 이의 수명 주기의 적어도 한 단계 동안 바이러스의 표면에 노출되는 에피토프를 포함한다. 바이러스 항원은 여러 혈청형 또는 분리주에 걸쳐 보존될 수 있다. 바이러스 항원은 하기에 제시된 바이러스 중 하나 이상으로부터 유래된 항원 및 하기에 확인된 특정 항원 예를 포함한다.
오르토믹소바이러스: 바이러스 항원은 인플루엔자 A, B 및 C와 같은 오르토믹소바이러스로부터 유래될 수 있다. 오르토믹소바이러스 항원은 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 핵단백질 (NP), 매트릭스 단백질 (M1), 막 단백질 (M2), 전사효소(transcriptase) 성분 (PB1, PB2 및 PA) 중 하나 이상을 포함하는 바이러스 단백질 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 실시예에서, 항원은 HA 및 NA를 포함한다.
인플루엔자 항원은 대유행간기(interpandemic) (연간(annual)) 독감 균주로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 항원은 유행병의 발병을 야기할 가능성이 있는 균주 (즉, 현재 순환 균주의 헤마글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌을 가진 인플루엔자 균주, 또는 조류 피험자에서 병원성이 있으며 인간 집단에서 수평으로 전파될 가능성이 있는 인플루엔자 균주, 또는 인간에게 병원성인 인플루엔자 균주)로부터 유래될 수 있다.
파라믹소비리대 바이러스(Paramyxoviridae viruses): 바이러스 항원은 뉴모바이러스 (RSV), 파라믹소바이러스 (PIV) 및 모르빌리바이러스 (홍역)와 같은 파라믹소비리대 바이러스로부터 유래될 수 있다.
뉴모바이러스: 바이러스 항원은 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스, 마우스의 뉴모니아 바이러스, 및 칠면조 비기관염 바이러스(Turkey rhinotracheitis virus)와 같은 뉴모바이러스로부터 유래될 수 있다. 실시예에서, 뉴모바이러스는 RSV이다. 뉴모바이러스 항원은 표면 단백질 융합체 (F), 당단백질(Glycoprotein) (G) 및 작은 소수성 단백질 (SH), 매트릭스 단백질 M 및 M2, 뉴클레오캡시드 단백질 N, P 및 L 및 비구조적 단백질 NS1 및 NS2를 포함하는, 하기의 단백질 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 뉴모바이러스 항원은 F, G 및 M을 포함할 수 있다. 또한, 뉴모바이러스 항원은 키메라 바이러스에서 제형화되거나 또는 유래될 수 있다. 예를 들어, 키메라 RSV/PIV 바이러스는 RSV 및 PIV 둘 다의 성분을 포함할 수 있다.
파라믹소바이러스: 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 유형 1-4 (PIV), 볼거리, 센다이(Sendai) 바이러스, 유인원(Simian) 바이러스 5, 소 파라인플루엔자 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스와 같은 파라믹소바이러스로부터 유래될 수 있다. 실시예에서, 파라믹소바이러스는 PIV 또는 볼거리이다. 파라믹소바이러스 항원은 하기 단백질 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN), 융합 단백질 F1 및 F2, 핵단백질 (NP), 인단백질 (P), 큰 단백질(Large protein) (L), 및 매트릭스 단백질 (M). 파라믹소바이러스 단백질은 HN, F1 및 F2를 포함할 수 있다. 또한, 파라믹소바이러스 항원은 키메라 바이러스에서 제형화되거나 또는 유래될 수 있다. 예를 들어, 키메라 RSV/PIV 바이러스는 RSV 및 PIV 둘 다의 성분을 포함할 수 있다. 시판되는 볼거리 백신은 1가 형태로 또는 홍역 및 풍진 백신 (MMR)과 조합된, 생 약독화 볼거리 바이러스를 포함한다.
모르빌리바이러스: 바이러스 항원은 홍역과 같은 모르빌리바이러스로부터 유래될 수 있다. 모르빌리바이러스 항원은 하기 단백질 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: 헤마글루티닌 (H), 당단백질 (G), 융합 인자 (F), 큰 단백질 (L), 핵단백질 (NP), 폴리머라제 인단백질 (P) 및 매트릭스 (M). 시판되는 홍역 백신은 일반적으로 볼거리 및 풍진 (MMR)과 조합된, 생 약독화 홍역 바이러스를 포함한다.
피코르나바이러스(Picornavirus): 바이러스 항원은 엔테로바이러스, 리노바이러스, 헤파르나바이러스(Heparnavirus), 카디오바이러스(Cardioviruses) 및 아프토바이러스(Aphthoviruses)와 같은 피코르나바이러스로부터 유래될 수 있다. 소아마비바이러스와 같은 엔테로바이러스로부터 유래된 항원이 사용될 수 있다.
엔테로바이러스: 바이러스 항원은 소아마비바이러스 유형 1, 2 또는 3, 콕사키(Coxsackie) A 바이러스 유형 1 내지 22 및 24, 콕사키 B 바이러스 유형 1 내지 6, 에코바이러스(Echovirus) (ECHO 바이러스) 유형 1 내지 9, 11 내지 27 및 29 내지 34 및 엔테로바이러스 68 내지 71과 같은 엔테로바이러스로부터 유래될 수 있다. 실시예에서, 엔테로바이러스는 소아마비바이러스일 수 있다. 엔테로바이러스 항원은 하기 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 시판되는 소아마비 백신은 비활성화 소아마비 백신 (IPV) 및 경구용 소아마비바이러스 백신 (OPV)을 포함한다.
헤파르나바이러스: 바이러스 항원은 A형 간염 바이러스 (HAV)와 같은 헤파르나바이러스로부터 유래될 수 있다. 시판되는 HAV 백신은 비활성화 HAV 백신을 포함한다.
토가바이러스: 바이러스 항원은 루비바이러스(Rubivirus), 알파바이러스, 또는 아르테리바이러스(Arterivirus)와 같은 토가바이러스로부터 유래될 수 있다. 풍진 바이러스와 같은 루비바이러스로부터 유래된 항원이 사용될 수 있다. 토가바이러스 항원은 E1, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 또는 NSP-4로부터 선택될 수 있다. 토가바이러스 항원은 E1, E2 또는 E3를 포함한다. 시판되는 풍진 백신은 일반적으로 볼거리 및 홍역 백신 (MMR)과 조합된, 생 감기-적응 바이러스를 포함한다.
플라비바이러스(Flavivirus): 바이러스 항원은 진드기-매개 뇌염(Tick-borne encephalitis) (TBE), 뎅기열(Dengue) (유형 1, 2, 3 또는 4), 황열병(Yellow Fever), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 웨스트 나일 뇌염(West Nile encephalitis), 세인트 루이스 뇌염(St. Louis encephalitis), 러시아 봄-여름 뇌염(Russian spring-summer encephalitis), 포와산 뇌염(Powassan encephalitis)과 같은 플라비바이러스로부터 유래될 수 있다. 플라비바이러스 항원은 PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, 및 NS5로부터 선택될 수 있다. 플라비바이러스 항원은 PrM, M 및 E를 포함할 수 있다. 시판되는 TBE 백신은 비활성화 바이러스 백신을 포함한다.
페스티바이러스(Pestivirus): 바이러스 항원은 소 바이러스 설사 (BVDV), 고전적 돼지 열병 (CSFV) 또는 보더병(Border disease) (BDV)과 같은 페스티바이러스로부터 유래될 수 있다.
헤파드나바이러스(Hepadnavirus): 바이러스 항원은 B형 간염 바이러스와 같은 헤파드나바이러스로부터 유래될 수 있다. 헤파드나바이러스 항원은 표면 항원 (L, M 및 S), 코어 항원 (HBc, HBe)으로부터 선택될 수 있다. 시판되는 HBV 백신은 표면 항원 S 단백질을 포함하는 아단위 백신을 포함한다.
C형 간염 바이러스: 바이러스 항원은 C형 간염 바이러스 (HCV)로부터 유래될 수 있다. HCV 항원은 E1, E2, E1/E2, NS345 폴리단백질, NS 345-코어 폴리단백질, 코어, 및/또는 비구조적 영역으로부터의 펩티드 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
랍도바이러스(Rhabdovirus): 바이러스 항원은 리사바이러스(Lyssavirus) (광견병 바이러스(Rabies virus)) 및 수포성바이러스(Vesiculovirus) (VSV)와 같은 랍도바이러스로부터 유래될 수 있다. 랍도바이러스 항원은 당단백질 (G), 핵단백질 (N), 큰 단백질 (L), 비구조적 단백질 (NS)로부터 선택될 수 있다. 시판되는 광견병 바이러스 백신은 인간 이배체(diploid) 세포 또는 태아 레서스(fetal rhesus) 폐 세포에서 성장한 사멸 바이러스를 포함한다.
칼리시비리대(Caliciviridae); 바이러스 항원은 노르워크 바이러스와 같은 칼리시비리대 및 하와이 바이러스 및 스노우 마운틴 바이러스와 같은 노르워크-유사 바이러스로부터 유래될 수 있다.
코로나바이러스: 바이러스 항원은 코로나바이러스, SARS, 인간 호흡기 코로나바이러스, 조류 감염성 기관지염(Avian infectious bronchitis) (IBV), 마우스 간염 바이러스 (MHV), 및 돼지 전염성 위장염 바이러스(Porcine transmissible gastroenteritis virus) (TGEV)로부터 유래될 수 있다. 코로나바이러스 항원은 스파이크 (S), 외피 (E), 매트릭스 (M), 뉴클레오캡시드 (N), 및 헤마글루티닌-에스터라제 당단백질 (HE)로부터 선택될 수 있다. 실시예에서, 코로나바이러스 항원은 SARS 바이러스로부터 유래된다. SARS 바이러스 항원은 WO 04/92360에 기재되어 있다.
레트로바이러스(Retrovirus): 바이러스 항원은 종양바이러스(Oncovirus), 렌티바이러스(Lentivirus) 또는 스푸마바이러스(Spumavirus)와 같은 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다. 종양바이러스 항원은 HTLV-1, HTLV-2 또는 HTLV-5로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 항원은 HIV-1 또는 HIV-2로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 항원은 gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu, 및 vpr로부터 선택될 수 있다. HIV 항원은 gag (p24gag 및 p55gag), env (gp160 및 gp41), pol, tat, nef, rev vpu, 미니단백질(miniproteins) (예를 들어, p55 gag 및 gp140v 결실)로부터 선택될 수 있다. HIV 항원은 하기 균주 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다: HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, HIV-1CM235, HIV-1US4.
레오바이러스(Reovirus): 바이러스 항원은 오르토레오바이러스 (Orthoreovirus), 로타바이러스, 오르비바이러스(Orbivirus), 또는 콜티바이러스 (Coltivirus)와 같은 레오바이러스로부터 유래될 수 있다. 레오바이러스 항원은 구조적 단백질 λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, σ1, σ2, 또는 σ3, 또는 비구조적 단백질 σNS, μNS, 또는 σ1s로부터 선택될 수 있다. 레오바이러스 항원은 로타바이러스로부터 유래될 수 있다. 로타바이러스 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4 (또는 절단된 산물 VP5 및 VP8), NSP 1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4, 또는 NSP5로부터 선택될 수 있다. 로타바이러스 항원은 VP4 (또는 절단된 산물 VP5 및 VP8), 및 VP7을 포함할 수 있다. 참조, 예를 들어, WO 2005/021033, WO 2003/072716, WO 2002/11540, WO 2001/12797, WO 01/08495, WO 00/26380, WO 02/036172; 전체 참조로 본 명세서에 포함됨.
파르보바이러스(Parvovirus): 바이러스 항원은 파르보바이러스 B19와 같은 파르보바이러스로부터 유래될 수 있다. 파르보바이러스 항원은 VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 및 NS-2로부터 선택될 수 있다. 실시예에서, 파르보바이러스 항원은 캡시드 단백질 VP-2이다.
델타 간염 바이러스 (HDV): 바이러스 항원은 HDV로부터 유래될 수 있으며, 특히 HDV로부터의 델타-항원일 수 있다 (참조, 예를 들어, U.S. 특허 번호 제 5,378,814호).
E형 간염 바이러스 (HEV): 바이러스 항원은 HEV로부터 유래될 수 있다.
G형 간염 바이러스 (HGV): 바이러스 항원은 HGV로부터 유래될 수 있다.
인간 헤르페스바이러스(Human Herpesvirus): 바이러스 항원은 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex Viruses, HSV), 수두-대상포진 바이러스 (VZV), 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 시토메갈로바이러스 (CMV), 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV6), 인간 헤르페스바이러스 7 (HHV7), 및 인간 헤르페스바이러스 8 (HHV8)과 같은 인간 헤르페스바이러스로부터 유래될 수 있다. 인간 헤르페스바이러스 항원은 즉시-초기 단백질 (α), 초기 단백질 (β), 및 후기 단백질 (γ)로부터 선택될 수 있다. HSV 항원은 HSV-1 또는 HSV-2 균주로부터 유래될 수 있다. HSV 항원은 당단백질 gB, gC, gD 및 gH, 융합 단백질 (gB), 또는 면역 탈출(immune escape) 단백질 (gC, gE, 또는 gI)로부터 선택될 수 있다. VZV 항원은 코어, 뉴클레오캡시드, 피막 (tegument), 또는 외피 단백질로부터 선택될 수 있다. 생 약독화 VZV 백신은 시판된다. EBV 항원은 초기 항원 (EA) 단백질, 바이러스 캡시드 항원 (VCA), 및 막 항원 (MA)의 당단백질로부터 선택될 수 있다. CMV 항원은 캡시드 단백질, 외피 당단백질 (예를 들어, gB 및 gH), 및 피막 단백질로부터 선택될 수 있다.
파포바바이러스(Papovaviruses): 항원은 유두종바이러스 및 폴리오마바이러스(Polyomaviruses)와 같은 파포바바이러스로부터 유래될 수 있다. 유두종바이러스는 HPV 혈청형 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 및 65를 포함한다. 실시예에서, HPV 항원은 혈청형 6, 11, 16 또는 18로부터 유래된다. HPV 항원은 캡시드 단백질 (L1) 및 (L2), 또는 E1-E7, 또는 이들의 융합체를 포함할 수 있다. 폴리오마바이러스는 BK 바이러스 및 JK 바이러스를 포함한다. 폴리오마바이러스 항원은 VP1, VP2 또는 VP3로부터 선택될 수 있다.
써코바이러스(Circovirus): 항원은 돼지 써코바이러스 (PCV) 1, PCV 2, PCV 3, 및 PCV 4와 같은 써코바이러스로부터 유래될 수 있다.
진균 항원
적당한 진균 항원은 하기에 제시된 진균 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다.
진균 항원은 에피더모피톤 플록코섬(Epidermophyton floccosum), 마이크로스포럼 아우도우이니(Microsporum audouini), 마이크로스포럼 카니스(Microsporum canis), 마이크로스포럼 디스토르툼(Microsporum distortum), 마이크로스포럼 에퀴눔(Microsporum equinum), 마이크로스포럼 깁세움(Microsporum gypseum), 마이크로스포럼 나눔(Microsporum nanum), 트리코피톤 콘센트리쿰(Trichophyton concentricum), 트리코피톤 에퀴눔(Trichophyton equinum), 트리코피톤 갈리내 (Trichophyton gallinae), 트리코피톤 깁세움(Trichophyton gypseum), 트리코피톤 메그니니(Trichophyton megnini), 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes), 트리코피톤 퀸케아눔(Trichophyton quinckeanum), 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum), 트리코피톤 쉔레이니(Trichophyton schoenleini), 트리코피톤 톤슈란스(Trichophyton tonsurans), 트리코피톤 베루코섬(Trichophyton verrucosum), T. 베루코섬 var. 알붐(album), var. 디스코이데스(discoides), var. 오크라세움(ochraceum), 트리코피톤 비올라세움(Trichophyton violaceum), 및/또는 트리코피톤 파비포르메(Trichophyton faviforme)를 포함하는, 피부사상균 (Dermatophytres)으로부터 유래될 수 있다.
진균 병원체는 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 플라바투스(Aspergillus flavatus), 아스페르길루스 글라우쿠스 (Aspergillus glaucus), 블라스토쉬조마이세스 카피타투스(Blastoschizomyces capitatus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 에놀라세(Candida enolase), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 칸디다 쿠세이 (Candida kusei), 칸디다 파라크우세이(Candida parakwsei), 칸디다 루시타니애 (Candida lusitaniae), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondi), 클라도스포리움 카르리오니이 (Cladosporium carrionii), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티디스(Blastomyces dermatidis), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 게오트리쿰 클라바툼(Geotrichum clavatum), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파라콕시디오이데스 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 피티움 인시디오숨 (Pythiumn insidiosum), 피티로스포룸 오발레(Pityrosporum ovale), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisae), 사카로마이세스 보울라르디이 (Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 세도스포리움 아피오스페룸(Scedosporium apiosperum), 스포로트릭스 쉔크키이(Sporothrix schenckii), 트리코스포론 베이겔리이(Trichosporon beigelii), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei), 말라세지아(Malassezia) spp., 폰세카에아(Fonsecaea) spp., 왕기엘라(Wangiella) spp., 스포로트릭스(Sporothrix) spp., 바시디오볼루스(Basidiobolus) spp., 코니디오볼루스(Conidiobolus) spp., 리조푸스(Rhizopus) spp., 무코르(Mucor) spp., 압시디아 (Absidia) spp., 모르티에렐라(Mortierella) spp., 쿤닝하멜라(Cunninghamella) spp., 삭세나에아(Saksenaea) spp., 알테르나리아(Alternaria) spp., 쿠르불라리아 (Curvularia) spp., 헬민토스포리움(Helminthosporium) spp., 푸사리움(Fusarium) spp., 아스페르길루스(Aspergillus) spp., 페니실리움(Penicillium) spp., 모놀리니아(Monolinia) spp., 리조크토니아(Rhizoctonia) spp., 패실로마이세스 (Paecilomyces) spp., 피토마이세스(Pithomyces) spp., 및 클라도스포리움 (Cladosporium) spp.로부터 유래될 수 있다.
진균 항원의 제조 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (참조, U.S. 특허 번호 제 6,333,164호). 하나의 방법에서, 세포벽이 실질적으로 제거되거나 또는 적어도 부분적으로 제거된 진균 세포로부터 얻을 수 있는 불용성 분획으로부터 추출 및 분리된 가용화 분획은, 방법이 살아있는 진균 세포를 얻는 단계; 세포벽이 실질적으로 제거되거나 또는 적어도 부분적으로 제거된 진균 세포를 얻는 단계; 세포벽이 실질적으로 제거되거나 또는 적어도 부분적으로 제거된 진균 세포를 파열시키는 단계; 불용성 분획을 얻는 단계; 및 불용성 분획으로부터 가용화 분획을 추출 및 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
호흡기 항원
본 명세서에 개시된 조성물은 호흡기 질환을 야기하는 병원체로부터 유래된 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 호흡기 항원은 오르토소믹소바이러스 (인플루엔자), 뉴모바이러스 (RSV), 파라믹소바이러스 (PIV), 모르빌리바이러스 (홍역), 토가바이러스 (풍진), VZV, 및 코로나바이러스 (SARS)와 같은 호흡기 바이러스로부터 유래될 수 있다. 호흡기 항원은 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 슈도모나스 애루지노사, 보르데텔라 페르투시스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 클라미디아 뉴모니애, 바실러스 안트라시스, 및 모락셀라 카타랄리스와 같은, 호흡기 질환을 야기하는 박테리아로부터 유래될 수 있다. 이들 병원체로부터 유래된 특정 항원의 예는 상기에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 면역원성 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사제로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 내 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다 (예를 들어, 동결건조된 조성물 또는 분무-동결 건조된 조성물). 조성물은 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서, 국소 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 정제 또는 캡슐 또는 스프레이로서, 경구 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 이용하여, 예를 들어, 흡입기로서 폐 투여용으로 제조될 수 있다. 조성물은 좌제(suppository) 또는 페서리(pessary)로 제조될 수 있다. 조성물은 예를 들어, 점적제(drops)로서 비강, 귀(aural) 또는 안구 투여용으로 제조될 수 있다. 이러한 약학 조성물의 제제는 당해 기술분야의 일반적인 기술 범위 내에 있다. 참조, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition, 1990.
조성물은 조합된 조성물이 환자에게 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태일 수 있다. 이러한 키트는 액체 형태의 하나 이상의 사포바이러스 항원 또는 이러한 항원을 인코딩하는 핵산, 및 본 명세서에 기재된 추가 항원 및 면역보조제 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
개시된 폴리펩티드 항원을 포함하는 면역원성 조성물은 백신 조성물이다. 이러한 조성물의 pH는 6 내지 8이며, 약 7이다. pH는 완충제의 사용으로 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 무-발열원(pyrogen-free)일 수 있다. 조성물은 피험자에 대해 등장성일 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있으나, 일반적으로 예방적일 것이며, 동물 (농장, 사냥감, 반려동물 및 실험실 포유류 포함)을 치료하는데 사용될 수 있다.
백신으로 사용되는 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 항원(들) 및/또는 항원(들)을 인코딩하는 핵산, 및 필요에 따라 임의의 다른 성분을 포함한다. "면역학적 유효량"은 단일 용량으로 또는 일련의 일부로서, 개체에게 그 양의 투여가 치료 또는 예방에 효과적이라는 것을 의미한다. 이 양은 치료받을 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료받을 개체의 분류군(taxonomic group) (예를 들어, 돼지, 소 등), 항체를 합성하는 개체의 면역 체계의 능력, 원하는 보호 정도, 백신의 제형, 의학적 상황에 대한 치료하는 수의사의 평가, 및 기타 관련 요인에 따라 달라진다. 이 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
투여
본 명세서에 개시된 조성물은 일반적으로 피험자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사 (예를 들어, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간)에 의해, 또는 점막, 예를 들어 직장, 경구 (예를 들어, 정제, 스프레이), 질, 국소, 경피(transdermal) (참조, 예를 들어, WO99/27961) 또는 경피(transcutaneous) (참조, 예를 들어, WO02/074244 및 WO02/064162), 비강내 (참조, 예를 들어, WO03/028760), 안구, 귀, 폐 또는 기타 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 또한, 면역원성 조성물은 피부의 표면에 직접 전달함으로써 국소적으로 투여될 수 있다. 국소 투여는 임의의 장치를 사용하지 않고, 또는 붕대 (bandage) 또는 붕대-유사 장치를 사용하여 맨살(naked skin)을 면역원성 조성물과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다 (참조, 예를 들어, U.S. 특허 번호 제 6,348,450호).
실시예에서, 투여 방식은 비경구, 점막, 또는 점막 및 비경구 조합의 면역화일 수 있다. 하나의 측면에서, 투여 방식은 1-3주 간격으로 총 1-2회의 백신접종으로 비경구, 점막, 또는 점막 및 비경구 조합의 면역화이다. 하나의 측면에서, 투여 경로는 경구 전달, 근육내 전달, 및 경구 및 근육내 전달의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
헬리코박터 파일로리 항원과 같은 항원에 대한 점막 및 전신 면역 반응은 점막 프라이밍 후 전신 부스팅 면역화를 통해 향상될 수 있음이 이미 입증되었다. 실시예에서, 사포바이러스에 의한 감염의 치료 방법은 하나 이상의 사포바이러스 항원을 포함하는 제 1 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 점막 투여한 후, 치료적 유효량의 하나 이상의 사포바이러스 항원을 포함하는 제 2 면역원성 조성물을 비경구 투여하는 단계를 포함한다.
면역원성 조성물은 향상된 전신 및/또는 점막 면역을 유도하기 위해, 전신 및/또는 점막 면역을 유도하는데 사용될 수 있다.
실시예에서, 면역 반응은 혈청 IgG 및/또는 장 IgA 면역 반응의 유도를 특징으로 한다.
상기 언급된 바와 같이, 프라임-부스트 방법은 하나 이상의 유전자 전달 벡터 및/또는 폴리펩티드 항원이 "프라이밍" 단계에서 전달되며, 이어서, 하나 이상의 제 2 유전자 전달 벡터 및/또는 폴리펩티드 항원이 "부스팅" 단계에서 전달되는 경우에 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 유전자 전달 벡터 또는 폴리펩티드 항원을 이용한 프라이밍 및 부스팅에 이어 하나 이상의 폴리펩티드-함유 조성물 (예를 들어, 사포바이러스 항원을 포함하는 폴리펩티드)을 이용한 추가 부스팅이 뒤따른다.
공동-투여를 포함하는 임의의 방법에서, 다양한 조성물은 임의의 순서로 전달될 수 있다. 따라서, 다수의 상이한 조성물 또는 분자의 전달을 포함하는 실시예에서, 핵산은 모두 폴리펩티드 전에 전달될 필요는 없다. 예를 들어, 프라이밍 단계는 하나 이상의 폴리펩티드의 전달을 포함할 수 있으며, 부스팅 단계는 하나 이상의 핵산 및/또는 하나 이상의 폴리펩티드의 전달을 포함한다. 다중 폴리펩티드 투여 후 다중 핵산 투여가 이어질 수 있거나 또는 폴리펩티드 및 핵산 투여가 임의의 순서로 수행될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 유전자 전달 벡터 중 하나 이상 및 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 중 하나 이상은 임의의 투여 경로를 통해 임의의 순서로 공동-투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 임의의 조합을 사용하여 면역 반응을 유도할 수 있다.
용량 용법
투여량 치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정에 따를 수 있다. 다중 용량은 1차 면역화 일정 및/또는 부스터(booster) 면역화 일정에서 사용될 수 있다. 다중 용량 일정에서, 다양한 용량은 동일한 또는 상이한 경로, 예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 제공될 수 있다.
실시예예에서, 용량 용법은 중화 특성을 가진 항체로 이어지는 항체 반응의 결합력을 향상시킨다. in-vitro 중화 분석은 중화 항체를 검사하는데 사용될 수 있다.
혈청 항체 수준 및 사포바이러스에 의해 야기된 질환으로부터의 보호 사이의 상관관계에 대한 강력한 사례가 있다.
면역 반응의 효능을 결정하기 위한 검사
치료적 치료의 효능을 평가하는 한 가지 방법은 개시된 조성물의 투여 후 감염을 모니터링하는 것을 포함한다. 예방적 치료의 효능을 평가하는 한 가지 방법은 조성물의 투여 후 개시된 조성물에서 항원에 대한 면역 반응을 모니터링하는 것을 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물의 성분 단백질의 면역원성을 평가하는 또 다른 방법은 단백질을 재조합적으로 발현시키며 면역블롯에 의해 환자 혈청 또는 점막 분비물을 스크리닝하는 것이다. 단백질 및 환자 혈청 사이의 양성 반응은 환자가 당해 단백질에 대해 이전에 면역 반응을 일으켰음을 나타낸다. 즉, 단백질은 면역원이다. 또한, 이 방법은 면역우성(immunodominant) 단백질 및/또는 에피토프를 확인하는데 사용될 수 있다.
치료적 치료의 효능을 확인하는 또 다른 방법은 본 발명의 조성물의 투여 후 감염을 모니터링하는 것을 포함한다. 예방적 치료의 효능을 확인하는 한 가지 방법은 조성물의 투여 후 본 발명의 조성물 내 항원에 대한 전신 면역 반응 (예를 들어, IgG1 및 IgG2a 생성 수준 모니터링) 및 점막 면역 반응 (예를 들어, IgA 생성 수준 모니터링)을 둘 다 모니터링하는 것을 포함한다. 일반적으로, 혈청 특이적 항체 반응은 면역화-후 그러나 공격-전(pre-challenge)에 결정되는 반면, 점막 특이적 항체 반응은 면역화-후 및 공격-후에 결정된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 숙주 이전에 in vitro 및 in vivo 동물 모델에서 평가될 수 있다. 특히 유용한 마우스 모델은 복강내 면역화 후 복강내 공격 또는 비강내 공격을 수행하는 마우스 모델을 포함한다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물의 효능은 면역원성 조성물로 감염 동물 모델, 예를 들어, 기니아 피그 또는 마우스 또는 붉은털원숭이(rhesus macaques)에 공격함으로써 in vivo에서 결정될 수 있다. 면역원성 조성물은 공격 균주와 동일한 균주로부터 유래되거나 또는 유래되지 않을 수 있다. 실시예에서, 면역원성 조성물은 공격 균주와 동일한 균주로부터 유래될 수 있다.
In vivo 효능 모델은 (i) 인간 균주를 이용한 쥣과(murine) 감염 모델; (ii) 마우스에서 특히 악성인(virulent) 균주와 같은 마우스-적응 균주를 이용한 쥣과 모델인 쥣과 질환 모델 및 (iii) 인간 분리주를 이용한 영장류 모델을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. NIH 및 질병통제센터 (Center for Disease Control, CDC)에서 지원하는 인간 공격 모델도 사용할 수 있다.
면역 반응은 TH1 면역 반응 및 TH2 면역 반응 중 하나 또는 둘 다일 수 있다. 면역 반응은 개선되거나 또는 향상되거나 또는 변경된 면역 반응일 수 있다. 면역 반응은 전신 및 점막 면역 반응 중 하나 또는 둘 다일 수 있다. 실시예에서, 면역 반응은 향상된 전신 및/또는 점막 면역 반응이다.
향상된 전신 및/또는 점막 면역은 향상된 TH1 및/또는 TH2 면역 반응에 나타난다. 실시예에서, 향상된 면역 반응은 IgG1 및/또는 IgG2a 및/또는 IgA의 생성의 증가를 포함한다. 실시예에서, 점막 면역 반응은 TH2 면역 반응이다. 하나의 측면에서, 점막 면역 반응은 IgA의 생성의 증가를 포함한다.
활성화된 TH2 세포는 항체 생성을 향상시키므로, 세포외 감염에 대응하는데 가치가 있다. 활성화된 TH2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-10 중 하나 이상을 분비할 수 있다. TH2 면역 반응은 향후 보호를 위해 IgG1, IgE, IgA 및 기억 B 세포의 생성을 야기할 수 있다.
TH2 면역 반응은 TH2 면역 반응과 관련된 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10) 중 하나 이상의 증가, 또는 IgG1, IgE, IgA 및 기억 B 세포의 생성의 증가 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 실시예에서, 향상된 TH2 면역 반응은 IgG1 생성의 증가를 포함할 것이다.
TH1 면역 반응은 CTLs의 증가, TH1 면역 반응과 관련된 사이토카인 (예를 들어, IL-2, IFNγ, 및 TNFβ) 중 하나 이상의 증가, 활성화된 대식세포의 증가, NK 활성의 증가, 또는 IgG2a의 생성의 증가 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 실시예에서, 향상된 TH1 면역 반응은 IgG2a 생성의 증가를 포함할 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물, 특히, 본 발명의 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물은 단독으로 또는 임의로 Th1 및/또는 Th2 반응을 유도할 수 있는 면역조절제와 함께 다른 항원과 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 알루미늄 염과 같은 무기염, 및 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 실시예에서, 면역원성 조성물은 알루미늄 염 및 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 대안적으로, 면역원성 조성물은 해독화된 ADP 리보실화 독소와 같은 ADP 리보실화 독소 및 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 측면에서, 하나 이상의 면역조절제는 면역보조제를 포함한다. 면역보조제는 상기에서 추가로 논의된 TH1 면역보조제 및 TH2 면역보조제로 이루어진 군 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
본 조성물의 면역원성 조성물은 감염을 효과적으로 처리하기 위하여 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응을 둘 다 유도할 수 있다. 이 면역 반응은 장기 지속(long lasting) (예를 들어, 중화) 항체 및 하나 이상의 감염성 항원에 노출 시 빠르게 반응할 수 있는 세포 매개 면역을 유도할 수 있다. 예를 들어, 피험자의 혈액 시료에서 중화 항체의 증거는 이들의 형성이 TBE 감염에서 바이러스 제거에 결정적으로 중요하기 때문에 보호를 위한 대리 매개변수로 간주된다.
약제로서 면역원성 조성물의 용도
또한, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 약제는 포유류에서 면역 반응을 일으킬 수 있으며 (즉, 면역원성 조성물임), 백신일 수 있다. 또한, 본 발명은 포유류에서 면역 반응을 일으키기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다. 약제는 백신일 수 있다. 실시예에서, 백신을 사용하여 급성 위장염을 포함하는 위장염과 같은 장 감염을 예방 및/또는 치료한다. 위장염은 이온 및/또는 수분 전달의 불균형으로 인해 물설사(watery diarrhea) 및/또는 장 연동운동(intestinal peristalisis) 및/또는 운동성(motility) (구토)을 야기할 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 조성물을 이용하여 면역 반응을 유도하거나 또는 증가시키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 보호적일 수 있으며, 항체 및/또는 세포-매개 면역 (전신 및 점막 면역 포함)을 유도할 수 있다. 면역 반응은 부스터 반응을 포함한다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다. 면역 반응은 보호적일 수 있으며, 항체 및/또는 세포-매개 면역을 포함할 수 있다. 실시예에서, 면역 반응은 TH1 면역 반응 및 TH2 면역 반응 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 방법은 부스터 반응을 일으킬 수 있다.
키트
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 조성물은 개개의 항원과 같이 액체 형태이거나 또는 동결건조될 수 있다. 조성물에 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관(test tubes)을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함한 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하(hypodermic) 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다).
키트는 인산염-완충 식염수, 링거액, 또는 덱스트로오스 용액과 같은 약학적으로-허용가능한 완충제를 포함하는 제 2 용기를 더 포함할 수 있다. 또한, 완충제와 같은 기타 약학적으로 허용가능한 제형화 용액, 희석제, 여과기, 바늘, 및 주사기 또는 기타 전달 장치를 포함하여 최종-사용자에게 유용한 기타 물질을 함유할 수 있다. 키트는 면역보조제를 포함하는 제 3 성분을 더 포함할 수 있다.
또한, 키트는 면역 유도 방법 또는 감염 치료 방법에 대한 서면 설명서를 함유하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 패키지 삽입물은 미승인 초안 패키지 삽입물일 수 있거나 또는 FDA (Food and Drug Administration) 또는 기타 규제 기관에 의해 승인된 패키지 삽입물일 수 있다.
실시예에서, 전달 장치는 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물로 미리-충전된다.
사포바이러스-특이적 항체의 제조 방법
본 명세서에 기재된 사포바이러스 폴리펩티드를 사용하여 각각 사포바이러스 항원에 특이적으로 결합하는/선택적인 사포바이러스-특이적 다클론 및 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 다클론 항체는 마우스, 토끼, 염소, 또는 말과 같은 포유류에게 사포바이러스 폴리펩티드를 투여하여 생성될 수 있다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수집하고, 항체를 예를 들어, 암모늄 설페이트로 침전시킨 후 친화도 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피에 의해 혈장으로부터 정제한다. 다클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기법은 당해 기술분야에 알려져 있다.
폴리펩티드에 존재하는 사포바이러스-특이적 에피토프에 대한 단일클론 항체도 쉽게 생성될 수 있다. 사포바이러스 폴리펩티드로 면역화된 마우스와 같은 포유류의 정상 B 세포는 예를 들어, HAT-민감성 마우스 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다. 사포바이러스-특이적 항체를 생성하는 하이브리도마는 RIA 또는 ELISA를 이용하여 확인될 수 있으며, 반-고체 한천에서 클로닝하거나 또는 희석을 제한하여 분리될 수 있다. 사포바이러스-특이적 항체를 생성하는 클론은 또 다른 스크리닝에 의해 분리된다.
사포바이러스 에피토프에 대한 항체, 즉, 단일클론 및 다클론 혈청으로부터의 항체 (다클론)는 사포바이러스-감염된 인간으로부터의 혈청 시료와 같은 시료에서 사포바이러스 항원의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. 사포바이러스 항원에 대한 면역분석은 하나의 항체 또는 여러 항체를 이용할 수 있다. 사포바이러스 항원에 대한 면역분석은 예를 들어, 사포바이러스 에피토프에 대한 단일클론 항체, 하나의 사포바이러스 폴리펩티드의 에피토프에 대한 단일클론 항체의 조합, 상이한 사포바이러스 폴리펩티드의 에피토프에 대한 단일클론 항체, 동일한 사포바이러스 항원에 대한 다클론 항체, 상이한 사포바이러스 항원에 대한 다클론 항체, 또는 단일클론 항체와 다클론 항체의 조합을 사용할 수 있다. 면역분석 프로토콜은 예를 들어, 경쟁, 직접 반응, 또는 예를 들어, 표지된 항체를 이용하는 샌드위치 유형 분석에 기초할 수 있다. 표지는 예를 들어, 형광성, 화학발광성, 또는 방사성일 수 있다.
다클론 또는 단일클론 항체는 면역친화도 컬럼에 의해 사포바이러스 입자 또는 항원을 분리하는데 더 사용될 수 있다. 항체는 항체가 이들의 면역선택적 활성을 유지하도록, 예를 들어, 흡착 또는 공유 결합에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 임의로, 항체의 항원 결합 부위가 접근가능한 상태로 유지되도록 스페이서 기가 포함될 수 있다. 그 다음, 고정된 항체를 사용하여 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 시료로부터의 사포바이러스 입자 또는 항원을 결합할 수 있다. 결합된 사포바이러스 입자 또는 항원은 예를 들어, pH의 변화에 의해 컬럼 매트릭스로부터 회수된다.
회수된 항원은 시퀀싱될 수 있으며, 서열을 사용하여 분자 생물학적 방법에 의해 회수된 항원의 재조합 발현을 위한 구조체를 만든다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "구조체"는 유전 물질을 표적 조직 또는 세포에 포함시키는데 사용될 수 있는 벡터에 존재하는 인공적으로 설계된 핵산 (DNA 또는 RNA)의 절편을 의미한다.
도 1은 상동 코팅 항원 vs 이종 코팅 항원의 비교를 나타내는 그래프이며, x 액세스 = 혈청 희석, Y 액세스 = 광학 밀도. (-●- V19030-060920 사포바이러스 풀 평균(Sapovirus Pool Avg) OD; -■- IAV-S H3 백신접종(Vaccinate) 풀 평균 OD; -＊- V19030-060920 사포바이러스 비-백신접종(Non-Vaccinated) 대조군 풀 평균 OD V19045-120321A; -▼- IAV-S H3 비-백신접종 대조군 풀 평균 OD).
도 2는 ELISA를 통해 백신접종 vs 비-백신접종에 대한 혈청학적 평가를 나타내는 그래프이다 (도 1에 언급된 것과 동일한 축) (-●- 860 백신접종; -■- 861 백신접종; -＊- 862 백신접종; -▼- 863 백신접종; -▲- 864 백신접종; -◀- 865 백신접종; -○- 866 백신접종; -◆- 867 비-백신접종; -▶- 868 비-백신접종; -×- 869 비-백신접종).
하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 제한하려는 것은 아니다.
실시예
물질 및 방법:
40마리의 암컷 Balb/c 마우스를 각각 4마리의 마우스로 10개의 케이지에 무작위로 배치하였다. 마우스를 적응시켰다. 7개의 케이지의 마우스 (총 28마리의 마우스)에 Emulsigen 일련 PV0080621과 혼합한 후 VRx 19030 (재조합 사포바이러스 단백질; 서열번호: 2), 일련 번호 PV1070820으로 제형화된 것을 0.2 ml 용량으로 피하로 백신접종하였다. 나머지 3개의 케이지의 마우스 (총 12마리의 마우스)는 비-백신접종 대조군으로 두었다. 백신접종 마우스는 21일에 동일한 일련의 백신으로 추가접종을 받았으며, 35일에 채혈하였다. 전혈을 혈청으로 분리하였다. 혈청은 개개의 시료 및 특정 케이지에 함유된 4마리의 마우스 각각으로부터의 시료에 대해 비례적으로 생성된 풀로 보관되었다. 이 풀은 1개의 개개의 시료로 처리되었다.
간접 ELISA를 통해 혈청을 2회 검사하였으며, 여기서 플레이트는 탄산염 코팅 완충제에 희석된 0.1 μg V19030 (재조합 사포바이러스 단백질) 또는 V19045 (재조합 IAV-S H3 단백질)로 코팅되었다. 플레이트를 1x PBS-T로 3회 세척하였다. 그 다음, 항원 플레이트를 PBS에 희석한 1% 폴리비닐 알콜로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 블록을 제거하였다. 1:1000에서 시작하는 5배 연속 희석(serial dilutions)을 혈청에 대해 2회 수행하였다. 혈청을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1x PBS-T로 3회 세척하였다. 염소-항-마우스 IgG (H+L) 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 접합체를 1:10000 (표 1) 또는 1:17.5000 (표 2)으로 희석한 다음, 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1x PBS-T로 3회 세척하였다. TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질을 플레이트에 첨가하고, RT (실온)에서 3분 (표 1) 또는 6.5분 (표 2) 동안 배양하였다. 플레이트를 1N H2SO4 (황산)로 정지시키고, 450 nm에서 OD를 판독하였다. 대조군은 비-백신접종 마우스, 및 1° 항체만, 2° 항체만, 및 코팅 항원만 사용하여 수행되었다. 2회 웰의 평균을 구하였다.
[표 1]
(상동 코팅 항원 vs. 이종 코팅 항원에 대한 백신접종 반응 vs. 비-백신접종 반응의 비교).
[표 2]
(재조합 사포바이러스 단백질에 대한 면역 반응).
결과:
표 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상동 항원에 대한 백신접종 마우스 반응은 비-백신접종 마우스에 비해 더 높은 면역학적 반응을 나타내었다. 바큘로바이러스 플랫폼에서 생성된 이종 단백질과 비교할 때, 백신접종 마우스는 바큘로바이러스 자체로 인해 제한된 반응을 나타내었다.
도 1은 사포바이러스 단백질에 대한 특이적 면역 반응을 나타낸다. 도 2는 상동 단백질에 대한 백신접종 vs 비-백신접종 반응을 나타낸다.
본 발명에 인용된 모든 특허 문헌은 본 명세서에 전체 참조로 포함된다.
<110> VST LLC dba Medgene Labs Young, Alan <120> SAPOVIRUS VACCINES <130> MEDG-A-SAPOVIRUS-PCT <140> TBD <141> 2022-06-28 <150> 63/215,571 <151> 2021-06-28 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1714 <212> DNA <213> SAPOVIRUS <400> 1 aagcgttact gaattcatgg aggcgcctgc cccaacccgt tcggtggcga gcaacccaga 60 gggtactcaa accagcaatg aatccaggcc agtccagcca gccgggccca tgcccgtggc 120 cgcagcccag gcccttgaga tggctgttgc cactggacaa gtcaatgaca ccatccccag 180 tgtagttaga gaaactttca gcacctacac caatgtcact tggactacac gtcagccagc 240 aggaaccctg ctcgcccgga tgaccctagg gccaggcctg aatccctaca cactccacct 300 gtccgccatg tgggccggct ggggagggtc atttgaaatt aaggtggtga tatcggggtc 360 tggcttgtat gcaggcaaat tgctgtgcgc actcatacca cctggggtag accccagtgc 420 tgtggaccag cccggggctt ttccccatgc acttgtggat gcgcgcatca ctgagggcgt 480 caccttcacc cttggggatg tcagggcagt ggattaccac gaaacaggag ctggtgggac 540 catcgcttgc ttggcactct atgtgtacca accactcatc aacccctttg aaactgcttt 600 gtcagccgcc atggtgacaa tcgagacccg ccctggccca gactttgggt 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Thr Ile 165 170 175 Ala Cys Leu Ala Leu Tyr Val Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Pro Phe Glu 180 185 190 Thr Thr Leu Ser Ala Ala Met Val Thr Ile Glu Thr Arg Pro Gly Pro 195 200 205 Asp Phe Gly Phe Thr Leu Leu Lys Pro Pro Asn Gln Thr Met Glu Ala 210 215 220 Gly Leu Asp Pro Arg Ser Leu Leu Pro Arg Thr Ala Arg Thr Leu Arg 225 230 235 240 Gly Asn Arg Phe Gly Arg Pro Ile Thr Ala Val Val Ile Val Gly Met 245 250 255 Ala His Gln Ile Asn Arg His Phe Ser Ala Glu Gly Thr Thr Leu Gly 260 265 270 Trp Ser Thr Ala Pro Ile Gly Pro Cys Val Gly Arg Ile Asn Ser Arg 275 280 285 Tyr Thr Asn Asn Gly Gly Leu Ala Val Leu Ser Met Gln Pro Leu Ser 290 295 300 Asn Gly Pro Leu Tyr Pro Asn Ile Ile Asn His Tyr Pro Asp Val Ala 305 310 315 320 Ala Ser Arg Ala Phe Asn Thr Ser Thr Ser Leu Thr Asn Asp Thr Thr 325 330 335 Cys Gly Gly Gly Pro Met Val Ile Phe Asn Asp Val Gly Asp Val Val 340 345 350 Glu Thr Val Ser Tyr Gln Met Arg Phe Ile Ala Ser Gln Ala Thr Ser 355 360 365 Gln Thr Pro Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn Ala Thr Ser Met Gly Leu 370 375 380 Ala Ser Phe Gly Asn Ser Arg Gly Asp Phe Gly Ser Gly Gln Leu Asn 385 390 395 400 Val Gly Val Glu Leu Thr Tyr Thr Cys Gly Asn Thr Ala Ile Asn Glu 405 410 415 Lys Val Thr Thr Phe Met Asp Arg Gln Tyr Thr Phe Gly Ala Gln Gly 420 425 430 Pro Asn Asn Ile Met Leu Trp Val Glu Thr Val Leu Gly Thr His Thr 435 440 445 Gly Asn Asn Thr Val Tyr Ser Ser Gln Pro Asp Thr Val Ser Ala Ala 450 455 460 Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Asn Ile Pro Asp Gly Tyr Met Ala Val Trp 465 470 475 480 Asn Val Asn Ala Asp Ser Ala Asp Phe Gln Ile Gly Leu Arg Arg Asp 485 490 495 Gly Phe Phe Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly Thr Arg Met Val Ile Ser 500 505 510 Glu Asp Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Leu Thr Thr Pro 515 520 525 Leu Ile Gly Pro Ser Gly Met Thr Gly Arg Ser Leu His Ser Ser Arg 530 535 540 Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His 545 550 555 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 22 ggctccagtc tcatggtaat c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 23 tcattccacc gggagtagat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 24 cacaatggtt ggcgtttgag 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 25 ggaggtccga tggtcatatt c 21

Claims (20)

  1. 사포바이러스-유래 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 제조 방법으로서,
    임의로, 상기 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 하나 이상의 면역보조제(adjuvants)와 혼합되거나 또는 공동-발현되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 재조합 아단위 백신을 포함하며, 이러한 발현된 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 바큘로바이러스 (baculovirus)/곤충 세포 방법론을 이용하여 생성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 서열번호: 2, 서열번호: 8, 서열번호: 15, 서열번호: 21 또는 이들의 조합에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 사포바이러스 유래 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산은 화학적 합성에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 사포바이러스 유래 면역원성 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 인코딩하는 핵산은 프라이머-기반 증폭 방법을 이용하여 생성되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 프라이머-기반 증폭 방법은 PCR인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. i) 서열번호: 2, 서열번호: 8, 서열번호: 15, 서열번호: 21 및 이들의 조합에 제시된 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된, 또는
    ii) 서열번호: 2, 서열번호: 8, 서열번호: 15, 서열번호: 21 또는 이들의 조합에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는
    폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제 8항에 제시된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 면역학적 반응을 유도하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 면역보조제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 피험자에게 상기 면역원성 조성물을 투여하는 단계는 국소, 비경구 또는 점막 투여를 통한 것임을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 투여는 다중 투여에 의한 것임을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 제 1 면역원성 조성물 및 제 2 면역원성 조성물은 동일한 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 제 1 면역원성 조성물 및 제 2 면역원성 조성물은 상이한 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 치료적 유효량의 제 8항의 면역원성 조성물을 포함하는, 사포바이러스에 의한 감염의 치료를 필요로 하는 피험자에서 사포바이러스에 의한 감염의 치료에 사용하기 위한 약제.
  16. 사포바이러스 VP1 단백질을 인코딩하는 분리된 재조합 핵산으로서,
    인코딩 핵산은 i) 서열번호: 1, 서열번호: 7, 서열번호: 14, 서열번호: 20, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 ii) 서열번호: 1, 서열번호: 7, 서열번호: 14, 서열번호: 20 또는 이들의 조합에 제시된 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 재조합 핵산.
  17. 제 16항에 있어서, 인코딩 핵산은 벡터와 재조합되는 것을 특징으로 하는, 분리된 재조합 핵산.
  18. 제 17항에 있어서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 분리된 재조합 핵산.
  19. 제 18항에 있어서, 벡터는 숙주 세포에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 분리된 재조합 핵산.
  20. 제 19항에 있어서, 숙주 세포는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는, 분리된 재조합 핵산.
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