TWI260986B

TWI260986B - Use of GLP-1 or analogs in reducing mortality and morbidity after stroke by controlling hyperglycemia

Info

Publication number: TWI260986B
Application number: TW088116396A
Authority: TW
Inventors: Suad Efendic
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2006-09-01
Also published as: EP1115421B1; JP2002526454A; MY155270A; WO2000016797A2; EP1115421A2; CN1163267C; BR9913932A; ATE433324T1; CA2344056A1; CN1322137A; AU6398599A; DE69940975D1; WO2000016797A3; ES2325777T3; AU766375B2

Description

1260986 A7 一, 川— B7 五、發明說明（1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係有關在中風後經由控制高糖血症以減低致死率與罹病率所用之方法與組合物。該方法與組合物特別可用於非-胰島素依賴型糖尿病，有新的中風危險者或有進行中的或複發性中風者。先前存在的高糖血症會獲得治廢而新開始的高糖血症可被遏止。發明背景源自心血管疾病的罹病率與致死率在顯現出糖尿病或受損的葡萄糖耐受性之患者而言皆較沒有這些疾病的患者更爲高。在接受冠狀動脈加護單元的患者總數中有24%有糖尿病，而在一般人群中糖尿病患者只佔約5 % (F—M， 1993 )。患有心肌梗塞的糖尿病患者之住院死亡率爲非糖尿病患者 I 兩倍（Hamsten，w94 ; Malmberg and Ryden, 1988 )。在後一急性恢復期中糖尿病患者經歷較高的死亡’ 率且更常死亡，大部份是由致死的再一梗塞與充血性心臟衰竭所致（Stone 1989 ; Karlson，1993 ; Barbash，1993 )。雖然在急性心肌梗塞後的罹病和死亡發生率上有減低之事實，但在中風後於糖尿病與非糖尿病之間的死亡率與罹病率差異仍存在著（Granger, 1993 ; Gdnes, 1993 )。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製中風危險性也已知會在糖尿病患者中明顯地升高。例如有非胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)的男性患者之中風危險性比對應的非糖尿病患者較高約3倍而於NIDDM婦女則車父咼約5倍（Lehto，I966 )。於芬蘭國内的另一研究中，患有基線糖尿病的男人有增高6倍的中風致死危險率而在追蹤期中發展出糖尿病的男人之相對危險率爲1 . 7。對於女 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1260986 A7 B7 五、發明說明（2 ) 人，個別相對危險率爲8.2和3·7 (Tuomilehto, 1996 )。再者，另一研究證實溫和與未確認的高糖血症也是急性中風的一項危險因素且於有高血糖値的患者中不論其册八丨爲何都有增高的累積死亡率，HbA丨爲反映長期血糖控制之値（Gray，1 987 )。高糖血症對於中風發生的劣化效應也在其它研究中獲得證貫（Cazzato, 1991 ; Kiers，1992 ; deFalco，1993 ; Moulin， 1997 ; Weir, 1997)。中風期間的壓力激素回應強度明顯地助成高糖血症之發展（O’Neill，1992 )不過也可能是高糖血症本身主要經由長期酸毒症而不利地影響絕血性腦新陳代謝（Levine，1988 ; Wass and Lanier，1996 )。動物研究強烈地支持下述概念：高糖血症有使中風期間的腦部傷害因下列原因而明顯更壞：區域性腦部血流的減少，顯著的水腫和腦幹壓縮，增加的梗塞尺寸，增加的收縮期Ca2+水平，乳酸蓄積，血腦障壁破裂及增高的出血 (Duckrow, 1985, 1987 ; de Courten-Myers, 1988 ; Slivka, 1991 ; Araki，1992 ; Wagner，1992 ; Dietrich, 1993 ;

Broderick, 1995 )。因此有需要舒減構施以使血糖正常化及用以控制會使糖尿病患者的中風傷害擴大之新陳代謝級聯。此點可以經由以皮下夕劑胰島素處理調整胰島素和葡萄糖的注入及後急性^岔血糖#]節而達到。後述服藥法在用於治療處於急性心肌梗塞中的糖尿病患者時可在心肌梗塞後的該年中，相對於除非視爲需要才接受胰島素處治的糖尿病患者對照組 -5- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ί--------Φ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) » 線%- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 A7 ______B7______ 五、發明說明（3 ) 而言，可使致死率降低30% ( Malmberg，1 995 )。不過’騰島素注入會k成低糖血症之潛發，該症係經定我爲血糖低於〇. j mM之情況。低糖血症會增加心肌梗塞之危險率’心室節律不齊且爲胰島素注入的一種危險性後果。因此發展出用於中風糖尿病患者的胰島素注入法以防止低糖血症（Hendra，1992 )。不過，在這種作法下仍有 2 1 %患者發展出低糖血症。出於心肌梗塞後的葡萄糖控制之另一研％中，於用胰島素和葡萄糖注入時有1 8 %的患者發展出低糖血症（Malmberg，1994) 〇胰島素注入也需要經常地監測血糖水平以使低糖血症的起始得以儘快地偵測到且治療。於所引述的研究中接受騰島素注入的患者内（Malmberg，1994)，至少每二小時測量血糖且據以調整注入速率。因此，胰島素_葡萄糖注入療法的菁全性和效能有賴於血糖數據的容易且快速取得。這種對於監測血糖的強烈需求給健康維護職業者加上一重荷，且增加治療的不便性與成本。其結果，加護單元常不分派使糖尿病患者的血糖水平最適化之計，如可經由靜脈内胰2素給用而得者。在慮及胰島素注入所潛在的危險性與負荷，有需要有一種在糖尿病患者急性中風中管制血糖之替代措施。腸降血糖激素，似胰增血糖素肽i，簡稱GLp_l，係在腸中從胰丨曰血糖素原處理而得且其可增強養分-謗發性胰島素釋出（Krcymann，。有多種經截短形式的GLp」係已知可剌激胰島素分泌（促胰島素作用）及Μ·形成者本紙張尺度適鮮（CNS)A4規格（210· -------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -6 - 1260986 A7 B7 五、發明說明（4 ) (參看;MG」1992)。已確立出在各種活體外（m vitro )貫驗罜實驗和哺乳動物，尤其是人類對於外源給用 GLIM、’ GL1M (7_36)醯胺，與GLP-1 (3-37)酸所得促胰島素回應之間的關係（參看，例如，N_k, 1993 &和匕； GUtmak，1992 ;和 Th〇rens, 1993)。GLP-i (Μ)酿胺經由刺激胰島素敏感性及增強在生理濃度下的葡萄糖謗發胰島素釋出而對胰島素_依賴型糖尿病患者發出明顯的抗糖尿形成效應（Gutniak，1992 )。在給非_胰島素依賴型糖^病患者服用時，GLP-1 (7_36)醯胺會刺激胰島素釋出，降低胰i曰血糖素的分泌，抑制胃的排空及增強葡萄糖利用 (Nauck，1993 a和 b ; Gutnick，1992)。 GLP-1型分子對於長期糖尿病療法之用途卻因爲彼等肽的血凊半生期十分短而受阻。例如，GLP-1 (7_37)的血清半主』有3至5分。GLP-1 (7-36 ) Bf胺在經皮下投服時具有約5 0分鐘的半生期。因此，彼等GLp分子必須以連續注入开y式^藥來達到長期效用（Gutniak，1刊4 )。發明概述經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明提出用以減低中風後的死亡率和罹病率之方法與組合物。該方法包括給有此需要的患者服用一可以將血择有效地正常化之選自GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物和彼等的醫藥可接受鹽所形成的組合中之化合物。本發明經由’例如促成較小的梗塞尺寸而提供糖尿病患者在中風後減低死亡率與罹病率之效益。本發明對非-胰島素依賴土的/口瘃相對於用胰島素和葡萄糖注入的組合治療可避尹本紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格（21Q χ 297公爱） 1260986 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（5 ) 掉不方便且π卩貴的頻繁血糖監測以及血糖結果的解釋與胰島素劑量率的調整。該處治也可避免掉先前存在的伴隨胰島素注入之低糖血症危險。於本發明中，某些種1具有t半生期但因爲患者典型地係臥病者，都在加護單位内接^連續地非經腸給用流體，所以連續投藥的需要性即不成爲缺點。這種處治包括有高糖血症的所有患者不論彼等是否經診斷爲糖尿病患者皆然。圖式之簡略説明圖1爲一圖形其顯示出對5個NIDDM患者在晚間連續注入GLP-1 (7-36)醯胺對平均血糖濃度（mM)的影響（―一）。叆圖形也繪示出對相同的5個NmDM患者，但在不同晚上連績胰島素注入對平均血糖濃度的影響。一圖2爲一圖形顯示出對5個NmDM患者於白天注入，從三餐的每餐開始進行三小時G L p _丨（7 _ 3 6 )醯胺注入對於平均血糖/辰度的影響。該圖形也緣示出對於相同的$ 個NIDDM患者，但於不同天，且係在每一餐之前不久注射時所彳f皮下注射胰島素對平均血糖濃度的影響（__〇-) D 發明之詳細説明曰本發明万法與組合物，特別是使用㈣降血糖素肽-1，其類似物或衍生物的醫藥物（醫藥組合物或調配物）可以有效地減低糖尿病患者，特別是非胰島素依賴性糖尿病患者在中風後的死亡率和罹病率。可用來實施本發明的⑽-】類似物和衍生物爲具有相對於GUM增加的半生期及在給患者服用時影響死亡率與罹病率的能力者。 -8 297公釐） ς --------訂---------線广請先閲讀背面之江意事項再填寫本頁) A7 1260986 五、發明說明（6 ) 中風中風或腦中風或腦血管意外（CVA)爲一種腦血管疾病其特徵爲非瘦攣和局竈性神經缺陷的突然發作。中風在美國引起每年約200,000的死亡例及神經病廢。於西方國家中絕血性梗塞在約85-90 %病例中引起中風，而在其它病人組中也發現有顱内出血情形。腦絕血係因持續數秒鐘的血流減低所激發。若血流中止持續數分鐘以上時，就會包括腦組織梗塞現象。腦絕血與梗塞的最常見肇因爲伴有血栓性插塞和心臟性插塞之動脈粥樣硬化。絕血性中風的臨床特徵在於其起始及隨後過程之方法。其表徵爲在動脈硬化年齡組中的個體之半身輕癱之急性起始。不過，也可能發生任何種腦障礙徵候^頸動脈系統徵候與跡象常會影響中腦動脈的分佈，且患者可能展現出對側半身輕癱，半身感覺缺陷（hemisensory def1C1t)及半盲。在涉及優性半球時， $會有某種程度的失語症。此外也可能包括前（頸動脈）或後（底椎）循環其可能導致或多或少的特殊臨床徵候。高糖血症係經定義爲約2 0 0毫克/公合〇11毫莫耳/升）或更大的血漿葡萄糖濃度，或約】2 5毫克/公合（7 〇毫莫經濟部智慧財產局員工消費合作社印製耳/升）或更大之禁食血漿葡萄糖水平。本發明的一部份即爲防止鬲糖血症或將其減低到正常値。化合物 GLPO類似物’衍生物’變體’前驅體和同系物皆適合用來實施本發明，只要其包括會促成減低中風後死亡率或罹病率的活性片段即可。 -9- 1260986 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) “GPL-1”意指GLP-1 (7-37)。以技藝中的慣例而言， GLP-1 (7-37)的胺基端係經指稱爲編號7而其羧基端爲编號37。GLP-1 (7-37)的胺基酸序列係技藝中熟知者，不過爲*讀者的方便，將其呈現於下： ' NH2~His7-Ala-Glij-Gly 1 〇- * Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15_Val-Ser-Ser-Tyr>Leu2〇-Glu-Gly-Gln-Ala-Aia25 丄 ys_Glu-Phe-lle-Ala3〇·

Trp-Leu-Va卜Lys-Gly35_Arg-Gly37_c〇〇H “ GLP-1類似物”係經定義爲在相對於GLP-1而言具有包括一或多個胺基酸取代，缺失，倒置或添加的改質之分子。技藝中已知的GLP-1類似物包括，例如GLP-1 (7-34)和 GLP-1 (7-35)，GLP-1 (7-36)，Val8-GLP-1 (7_37)，Gln9_GUM (7-37)，D-Gln9-GLP-1 (7-37)，Thr16-Lys18-GLP-l(7-37)，及 Lys18-GLP-1 (7·37) 0 較佳的 GLP-1 類似物爲 GLP-1 (7-34) 和GLP-1 (7_35)，彼等都經揭示於美國專利第5，118,666號之中，以及GLP-1 (7-36)。這些化合物都是經生物處理的有促胰島素性質之GLP-1形式。其它GLP-1類似物皆揭示 •淤美國專利第5,545,618號之中。 “ GLP-1衍生物”係經定義爲具有GLP-1或GLP-1類似物所具之胺基酸序列，但另外具有至少一種在一或多個其胺基酸側基，a -碳原子，末端胺基，或末端羧酸基上的化學改質之分子。化學改質包括添加化學部份體，創造新的鍵，及脱除化學部份體。在胺基酸側基上的改質包括離胺酸e- -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） IL-----------------訂 c請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1260986 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8 ) 胺基的I 土化，精胺酸，組胺酸或離胺酸的N _烷基化，穀胺酸或天冬胺酸的羧酸基之烷基化，及穀胺醯胺或天冬胺酸的脱醯胺化。末端胺基的改質包括去-胺基，N-低碳數烷基，N -二-低碳數烷基，和N _醯基諸改質。末端羧基的改質包括醯胺，低碳數烷基醯胺，二烷基醯胺，和低碳數烷基酯諸項改質。低碳數烷基爲CrC：4烷基。再者，一或多個側基，或末端基，可經由用熟練蛋白質化學家所知的保羞基了以保護。胺基酸的α _碳可經一 ·或二-貌芙化。儿土於本發明中，可用的較佳GLP-1類似物和衍生物之組合包括在美國專利第5,545,618號中揭示的各種GLP]分子。活性GLP-1肽，7-34，7_35，7_36和7-37諸有效類似物係在位置7-1 0有胺基酸取代及/或在c -端經截短及/或含有在鹼性肽中的各種其它胺基酸取代者。在7和8位置有d -胺基酸取代及/或在7位置有Ν -燒基化或Ν -醯基化胺基酸之類似物特別可抗拒活體内（in vi v〇 )降解。頭示出增強的胰島素刺激性質之類似物具有天然〇!^-1 ’ 7〇4 ’ 7-3 5，7-36，或7-37，或彼等的C -端醯胺的序列’加上至少一種選自下列所成組合中之改質： (a)用中性胺基酸，精胺酸，或d形式的離胺酸取代位置2 b及/或3 4處的離胺酸及/或用中性胺基酸，離胺酸，或D形式的精胺酸取代位置3 6的精胺酸； (b )抗氧化性胺基酸對位置3 1的色胺酸之取代： (c )根據至少一種下列之取代： -11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 126〇986 五、發明說明（9 ) γ取代位置1 6的V : K取代位置1 8的S : D取代位置2 1的Ε : S取^位置2 2的G : R取代位置2 3的Q ; R取代位置2 4的A :及 Q取代位置2 6的K ; (採用對胺基酸的單字母密碼） (d)包括至少一種下列之取代：另一小的中性胺基酸取代位置8的A ; 另一酸性胺基酸或中性胺基酸取代位置9的E : 另一中4胺基酸取代位置1 〇的g ;及另一酸性胺基酸取代位置1 5的D ;及 (Ο另一中性胺基酸或D*N_.基化或烷基化形式的胺酸取代位置7的組胺酸。

、有關改質（a)，（b)，（d)和（e)，經取代的胺基酸可爲D 式者。在位置7取代的胺基酸也可呈N-醯基化或N—烷化形式。在血聚中呈現相對於GLP_] (7_37)較增進的抗降解性肽皆適合用來實施本發明。於這些類似物中，任何種上 =形式的GLIM (7_34)至GLIM (7_37)或其。端醯胺形式係經由下列予以改質： U )用D _中性或D _酸性胺基酸取代位置7的H，或 (b )用D _胺基酸取代位置8的a，或 -12 尺度適FT關家鮮⑽X297¥f -------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線% 1260986 A7 B7 五、發明說明（10 ) (c )上述兩者同時，或 (d)用N -醯基化或N -烷基化形式的任何天然發生型胺基酸取代位置7的Η。依此可抗拒降解的類似物包括（Ν -醯基（1-6C)AA)7GLP_1 (7-3 7)和（n -烷基（1-6C AA)7GLP-1 (7-3 7)其中當 a A 爲離胺醯基殘基時，其一或兩個氮可經烷基化或醯基化，A A表與保持胰島素刺激活性一致之任何胺基酸。對於在7和8位置中的D -胺基酸取代，可以在位置7使用任何酸性或中性胺基酸的D -殘基及在位置8用任何胺基酸的D殘基，再度地要保持住胰島素刺激活性。位置7和8中任一者或兩者皆可經D -胺基酸取代；在位置7的d _胺基酸也可經醯基化或燒基化。彼等經改質形式不僅可應用於 GLP-1 (7-3 7)而且也可以用於較短的經截端類似物。因此，於較佳類似物中包括其中G L P - 1的（7 _ 3 4 )，（ 7 _ 3 5 )或（7 - 3 7 )諸形式只經由用中性胺基酸，精胺酸，或D 形式的離胺酸取代位置2 6及/或3 4的離胺酸及/或用中性胺基’離胺fe或D形式的精胺酸取代位置3 6的精胺酸予以改質者。特別較佳者爲其中用來取代位置2 6和3 4的離胺酸之胺基酸係選自下列所成組合之中者· K+，G，s，A， ’且取代位置3ό的精胺酸所用的胺基酸係選自下列所成組合之中者：K，K+，r C Λ Τ τ υ ，A，L，I， Q，M和R+。（此處的+表D形式）。此外，較佳的類似物爲其中的該唯—改質爲用抗氧化性胺基酸取代位置3 1的色胺酸者。特別有利的取代係選自 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） •ί--------% (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 線%- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（11 ) f，v，l，i，a*y所成組合之中者。特々]車又佳的類似物爲有下列组合取代者：s取代位置2 2 的G尺取代位置2 3的Q和位置2 4的A，及q取代位置2 6 的K或Υ取代位置1 6的V和Κ取代位置1 8的S ;或這些取代再加上D取代位置2〗的Ε者。於其中特別較佳者爲其中取代位置8的丙胺酸所用的小中性胺基酸係選自s，s' Gc，c+，Sar，Α+，卜—和⑽所成組合之中者：及/或取代位置9的穀胺酸所用之酸性或中性胺基酸係選自下列所成組合之中者：E+，D，d+，丁， T+，N’N+，Q，Q+，Clt，MS〇，和乙醆基_〖；及/或取代位置1 0的甘胺酸所用另一中性胺基酸係選自下列所成組合之中者：S，S+，Y，Y+，丁，τ+，N，N+，Q，Q+，Clt， MSO,乙醯基-K，F，和F+;及/或其中用〇取代位置。的 E者。另外較佳的類似物爲其中只有位置7經變動者。較佳的取代爲其中取代位置7的組胺酸所用之胺基酸係選自下列所成組合之中者：H+，Y，Y+，F，F+，R，R+，⑽，_+， Μ’Μ+，Ν·甲醯基-Η，Ν -甲醯基_Η+，Ν -乙醯基_Η，乙醯基-Η+，Ν_異丙基- Η，Ν -異丙基_Η+，N-乙醯基· Κ : Ν -乙醯基-κ +，Ρ和Ρ +。另外較佳的實施例爲除了下列指定實施例（類似物）之外’只有兩種上述類別的改質形式之組合者. (H+)7-GLP-l (7-37); (Y)7-GLP-1 (7-37)： 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ---------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1260986 Α7 Β7 五、發明說明（12 ) (N-acetyl-H)7-GLP-l (7-37); (N-isopropyl-H )7-GLP-l (7-37)： (A+)8-GLP-l (7-37): (E+)9-GLP-l (7-37)； (D)9-GLP-1 (7-37)； (D+)9-GLP-l (7-37)； (F+)10-GLP-l (7-37)： (S)22(R)23(R)24(q)26-GLIM (7-37); (S)8(Q)9(Y)i6(K)i8(D)2i_GLP-i(7-37)。具有增強的安定性之較佳類似物形式也只具有一或最多兩處胺基酸改質者。對於位置7的組胺酸之較佳取代包括D _形式的酸性或中性胺基酸或D -形式的組胺酸。較佳爲p+，D+，E+，N+， Q+，L+，v+，1+和 H +。在位置7的組胺，或一置換（或l )，也可以經n _跪基化（1-6C )或N _醯基化。烷基爲具有所示c數的直鏈或支鏈型（包括環狀）烴基殘基。醯基爲式RC〇-基其中R爲烷基。較佳的烷基爲t -丙基，α _丙基和乙基；較佳的醯基爲乙fe：基和丙醯基。可經:)¾基化或醯基化的較佳殘基包括卩，〇，£，：^，（5，\^，1^，1，尺和11可爲仍或乙形式。對於位置8的丙胺酸之較佳取代基爲D _形式的P，V， L ’ I和八；此外也爲較佳者爲〇-形式的〇，：£，]^，（5，1^， T，S 和 Η 〇某些特殊類似物同時顯示出增進的胰島素釋放刺激能力 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 線%_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（13) 和增進的安定性。供本發明所用的一較佳GLP-1類似物和衍生物組合係由具有下式的分子及其醫藥可接受鹽所構成：

Rl-X-Giu-Gly10-

Thr-Phe-Thr-Ser-Asp^5_\/al-Ser-Ser-Tyr-Leu2〇-Y -Gly-Gln-Ala-Afa25_LyS. z -Phe-lle-Ala3〇-T rp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2 其中：R i係選自下列所成組合之中者：L -組胺酸，D 組胺酸，去胺基-組胺酸，2 -胺基-組胺酸’ b -經基-組胺酸’ 同組胺酸’ α 氣甲基-組胺酸’和α -甲基-組胺敗；X係選自下列所成組合之中者：Ala ’ Gly ’ Val ’ Thr，lie和α -甲基-A1 a，Υ係選自下列所成組合之中者：Glu，Gin，Ala， Thr，Ser與Gly ; Z係選自下列所成組合之中者：Glu，Gin， Ala，Thr，Ser和Gly ;且R2係選自下列所成組合之中者：NH2，與Gly-OH ;但其限制條件爲該化合物具有在約 6 . 0至約9 . 0範圍内之等電點且更有一限制條件爲當R丨爲 His，X 爲 Ala，Y 爲 Glu，且 Z 爲 Glu 時，R 2必須爲 nh2。乂有許多具有在約6 . 0至約9 . 0範圍内的等電點之glP - 1類似物和衍生物皆經揭示出且包括，例如： GLP-1 (7-36)NH2 Gly8-GLP-1 (7-36)NH2 Gln9-GLP-1 (7-37) D-Gln9-GLP-1 (7-37) -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------^ ---------

1260986 A7 B7 五、發明說明（14 ) acetyl-Lys9-GLP-l (7-37)

Thr9-GLP-1 (7-37) D-Thr9-GLP-1 (7-37)

Asn9-GLP-1 (7-37) D_Asn9_GLP-l (7-37) S e r 22- Ar g23- Ar g24- G1 n 26- G L P -1 (7 - 3 7)

Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37)

Lys18-GLP-1 (7-37)

Arg23-GLP-1 (7-37)

Arg24-GLP-1 (7-37) 另一較佳的可用於本發明中之活性化合物組合係揭示於 WO 91/11457，（美國專利第5,545,618號相關者）中且包括具有至少一種下面所示改質之GLP-1 (7-34)，GLP_1 ，GLP_1 (7_36)，或 GLP-1 (7-37): (a) 用甘胺酸，絲胺酸，半胱胺酸，蘇胺酸，天冬胺醯胺，穀胺醯胺，酪胺酸，丙胺酸，顯胺酸，異白胺酸，白胺酸，甲硫胺酸，苯丙胺酸，精胺酸，或D -離胺酸取代位置2 6及/或位置3 4的離胺酸；或用甘胺酸，絲胺酸，半胱胺酸，蘇胺酸，天冬胺醯胺，穀胺醯胺，酪胺酸，丙胺酸，纈胺酸，異白胺酸，白胺酸，甲硫胺酸，苯丙胺酸’ 離胺酸，或D -精胺酸取代位置3 6的精胺酸； (b) 用抗氧化性胺基酸取代位置3 1的色胺酸； (c) 至少一種下列取代：酪胺酸取代位置1 6的顯胺酸’ 離胺酸取代位置1 8的絲胺酸：天冬胺酸取代位置2 1的設 ------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 線% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 a? B7 五、發明說明（15) 胺酸：絲胺酸取代位置2 2的甘胺酸：精胺酸取代位置2 3 的穀胺醯胺；精胺酸取代位置2 4的丙胺酸；及殺胺驢胺取代位置2 6的離胺酸；及 (d)至少一種下列取代：用甘胺酸，絲胺阪’或半胱胺酸取代位置8的丙胺酸；天冬胺酸，甘胺酸’絲胺酸’半胱胺酸，蘇胺酸，天冬胺醯胺，穀胺醯胺’赂胺酸’丙胺酸，纈胺酸，異白胺酸，白胺酸，甲硫胺酸，或苯丙胺酸取代位置9的穀胺酸；用絲胺酸，半胱胺酸，蘇胺酸，天冬胺醯胺，穀胺醯胺，酪胺酸，丙胺酸，纈胺酸，異白胺酸，白胺酸，甲硫胺酸，或苯丙胺酸取代位置1 〇的甘胺酸；及用穀胺酸取代位置1 5的天冬胺酸；及 (e )用甘胺酸，絲胺酸，半胱胺酸，蘇胺酸，天冬胺醯胺，穀胺醯胺，酪胺酸，丙胺酸，纈胺酸，異白胺酸，白胺酸，甲硫胺酸，或苯丙胺酸，或D _或N -醯基化或烷基化形式的組胺酸取代位置7的組胺酸；其中，在（a)， (b )，（ d)，和（e )諸取代中，經取代的胺基酸可視情況爲 D -形式且經取代在位置7的胺基酸可視情況呈N ·醯基化或N -烷基化形式。因爲酵素，二肽基·肽酶IV (DPP IV)可能爲促成所觀察到的給服GLP-1之快速活體内抑活化（Mentlein et吐， 1 993 )，所以較佳者爲服用經保護可對抗dpp IV活性的 GLP-1類似物和衍生物，且更佳者爲給用GlyLGL]M (7_36) NH2，Val8-GLP-1 (7-37)OH，a-甲基-Ala8-GLP-1 (7-36)NH2，與 Gly8-Gln21-GLP-1 (7-37)〇H，GLY8-GLP-1 (7-37)〇H 或彼 -18- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） " ---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 % 1260986 A7 ____ B7 五、發明說明（16 ) 等的醫藥可接受鹽。 ---.--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外較佳者爲在本發明中使用美國專利第5，188,666 (’ 666)號中所揭示的分子。彼等分子包括具有下列諸胺基酸序列中之一者的肽： NH2-His7-Ala-Glu-GIy1〇-, Thr-Phe-Thr-Ser-Asp 15-Va!-Ser-Ser-Tyr-Leu2〇-Glu>Gly-Gln-Ala-Ala25.Lys.G|u_phe |(e A|a3〇_

丁「P-Leu-Val-X 其中X可爲Lys和Lys-Gly ; 或該肽的衍生物，且其中該肽可爲該肽的醫藥可接受之酸加成鹽；該肽的醫藥可接受之羧酸鹽；該肽的醫藥可接受之低碳數烷基酯；或選自下列所成組合中的該肽之醫藥可接受醯胺：醯胺，低碳數燒g蠢胺，和二-低碳數烷基醯胺。 ’666中的發明係有關一肽片段其具有促胰島素性且可從天然發生的胺基酸序列衍生物而得。彼等序列皆適合用來實施本發明。本發明包括選自下列所成組合之中的化合物 (A)包括下面的序列之肽：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu

^Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中X係選自下列所成組合之中者： (a) Lys ， (b ) Lys-Gly， (c ) Lys-Gly-Arg ; 及（B )該肽的衍生物：其中該化合物實質地不含天然雜 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

126〇986 五、發明說明（17) 質’且具有超越GLP-1 0-36)或GLP-1 (1-37)所具促胰島素活性之促胰島素活性。本發明也包括選自下列所成組合中之化合物： (A ) —肽其包括下面的序列：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu

-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys«Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X 其中X係選自下列所成組合之中者： (a) Lys ， (b) Lys-Gly， (c) Lys-Gly-Arg ; 及（B )該肽的衍生物；其中該化合物實質地不含天然雜質，且具有在至少1〇-ι〇Μ濃度之下的促胰島素活性。特別有用者的具有下式之肽： (1 )H2N-X-CO-R1 其中 R 1爲 OH，OM，或-NR2R3 ; Μ爲醫藥可接受的陽離子或低碳數分枝型或未分枝型烷基； R2與R 3可相同或相異且係選自氫與低碳數分枝或未分枝型烷基之中者； X爲一包括下面的序列之肽：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-

Gly-Arg NH2爲X的胺基末端之胺基；且c〇爲X的羧基末端之羧 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---I I ! I 訂-----I---· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 A7 ---- B7 五、發明說明（18 ) 基； (2 )其酸加成鹽：及 (3 )其經保護或經部份保護的衍生物；其中該化合物所具促胰島素活性超越GLP-1 (1_36)或 GLP-1 (1-37)所具促胰島素活性。 ▲ 另一較佳的、可用於本發明中之分子組合包括美國專利第 5，5 12,549號中所揭示且具有下示通式之化合物： R1-Ala-Glu-Gly1〇«

• Thr-Phe-Thr-Ser-Asp^-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu^O-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-!le-Ala30-Trp-Leu-VaM_ys-Gly35-Arg-R3 I R2 及其醫藥可接受鹽，其中R1可爲4 -咪唑基丙醯基，4-咪峻基乙基，或4 -咪吐基-a，a-二甲基-乙驗基；R2可爲 C6-C10未分枝醯基，或不存在；R3可爲Gly-OH或NH2 ; 且，Xaa 爲 Lys 或 Arg。可用於本發明中的更佳化合物爲其中X a a爲A1* g且R2爲 Wcίο未分枝醯基者。可用於本發明中的高度較佳化合物爲其中X a a爲A r g， R2爲C6-C10未分枝醯基，且R3爲Gly-OH者。可用於本發明中的更高度較佳化合物爲其中X a a爲 Arg，R2爲C6-C10未分枝醯基，R3爲Gly-〇H，且R1爲4-咪峻基丙酿基者。 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 4 訂---------線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（19 ) 可用於本發明中的最佳化合物爲其中X a a爲A r g，R2爲 C 8未分枝醯基，R3爲Gly-OH，且R1爲4 -咪唑基丙醯基者。於本發明中，高度較佳者爲使用美國專利第5,120,712號中所揭示的分子。彼等分子包括具有下面胺基酸序列之肽:

NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp^ ^-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu^O-GIu-Gly-Gln-A!a-Ala25-Lys-Glu-Phe-lle~AIa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-GIy37-〇H 和該肽的衍生物，其中該肽可爲該肽的醫藥可接受酸加成鹽；該肽的醫藥可接受性羧酸鹽；該肽的醫藥可接受性低碳數貌基醋；或該肽的醫藥可接受酸胺其中該醯胺可爲醯胺，低破數烷基醯胺，或二-低破數烷基醯胺。於本發明中最高度較佳者爲使用GLP-1 (7-36)醯胺，或其醫藥可接受鹽。GLP-1 (7-36)醯胺的胺基酸序列爲： NH2-His7-Ala-Glu-Gly1 °-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15_val-Ser-Ser-Tyr-Leu2〇-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25_Lys-Glu-Phe-lle-Ala3〇_ Trp-Leu-Val-Lys-Gly^^-Arg-NH2 於本發明中最高度較佳者爲使用Val8-GLP-1 (7-37)OH，或其醫藥可接受鹽。Val8-GLP-1 (7-37)OH的胺基酸序列爲： -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 A7 B7 五、發明說明（2Q)

NH2-His7-Val-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala^S-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala^O-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH 化合物之製備 , 本發明所用的活性化合物，亦即，GLP-1，GLP-1類似物，或GLP-1衍生物，或任何相關化合物包括在經周圍給用時可以有效地減低中風後死亡率與罹病率之活性片段的製備方法係熟知者，且載於美國專利第5，118,666 ; 5,120,712 ；和 5,523,549 號之中 ° 本發明所用活性化合物或其前驅體的胺基酸部份係經由下述方法製得：1 )固相合成化學；2)從天然來源純化出 G L P分子；3 )重組D N A技術；或4 )這些方法的組合。多肽的固相化學合成係技藝中熟知者且可參看此領域的一般敎科書例如 Dugas and Penney (1981) ； Merrifield (1 962) ; Stewart and Young (1 969，1 984 ) 0 舉例而言，可利用PE-Applied Biosystems所供應的430A 月太合成器（PE_Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City, CA 94404 )和合成循環經由固相方法合成胺基酸部份。BOC-胺基酸和其它藥劑可在市面上從PE-Applied Biosystems 與其它化學品供應商取得。採用雙重偶合方案的次序性BOC化學可應用於用對-甲基二苯甲基胺樹脂起始以製造C -端羧醯胺之情況中。要製造C -端酸時，係使用對應的P AM樹脂。Asn，Gin和A r g係使用預形 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1260986 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（21) 成的羥基苯幷三唑酯予以偶合。下列側鏈保護基都可以用·· A r g，甲苯磺醯基 A s p，環己基 G 1 u，環己基 S e r，爷基

Thr，苄基

Tyr，4-溴芊氧羰基 B 0 C.保護可用三氟乙酸/二氯甲烷予以完成。在合成完畢後可用含1 0 %間-甲酚的無水氟化氫（Η f )將肽脱保護基及從樹脂切下來。側鏈保護基的切斷及肽從樹脂切斷係在 -5 C至5 °C，較佳者在冰上進行6 〇分鐘。於脱除掉H F之後，用醚洗肽/樹脂，並用冰醋酸萃取出肽及予以冷康乾燥。請於重組D N A技術者所熟知的技術都可用來製備本發明所用的活性化合物。事實上，因爲有較高的產率，所以重組D N A法可能爲較佳者。重組製造中的基本步驟爲. a) 分離出編碼本發明GLP-1分子的天然DNA序列或構成一合成型或半合成型GLP-1分子的DNA密碼序列， b) 將該密碼序列放置於一表現載體内其方式的適合於表現出蛋白質其可呈單獨形式或呈融合蛋白質形式， c) 用該表現載體轉形一恰當的眞核生物或原核生物宿主細胞， d) 在可促成GLP-1分子的表現之情況下培養該經轉形的宿主細胞，及 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐1 ---- in----------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1260986 A7 ---— _B7_ 五、發明說明（22 ) e )收取及純化該經重組製成的GLP-〗分子。如前文所述者，該密碼序列可爲完整合成者或爲對較大的天然胰增血糖素_編碼DN A的改質結果。編碼胰增血糖素原的DN A序列載於Lund et al (1982)中且可用於本發明化合物的半合成製造中作爲起始物經由變更天然序列以達到所欲結果。、、'工由。式ί内（in vitro )或活體内（in ν|ν〇 )轉錄與轉譯以導致GLP-1分子的製造所用之合成基因可經由技藝中熟知的技術丁以構成。由於基因金碼的天然簡併性，熟練技術員都了解可構成一頗大但確定數目的D N A序列，彼等全都編碼本發明GLP-1分子。合成型基因構成方法係技藝中熟知者（Br〇^以虬 1979)。DNA彳列係使用基因密碼從合意的胺基酸序列設計出，其可由熟練的生物學家容易地確定。在設計之後，可二習用的DNA合成裝置何如M〇del 38〇八或38仙〇^^合成器（PE-A_ed Blosystems，Inc , 85〇 Unc〇ln 以命 d· Foster City，CA 944〇4 )產生該序列本身。，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製要表現本發明所用化合物的胺基酸部份時，係將處理過的合成DN A序列經由使用恰當的核酸内切限制酶而插置於許多恰當的重組DNA表現載體中（M_atis et d， 1989 )。諸核酸内切限制酶切斷部位係經設計成分子-編碼DNA的任一端以幫助分離出，及整合到技蓺中孰知的擴增與表現載體之内。所採用的特殊核酸内切酶係決定於所用的母表現載體所具核酸内切限制酶之切斷型能。 >25- 1260986

五、發明說明（23) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製限制邵位皆經選擇得使密碼序列與對 f此達到恰當的架構内讀碼一貝（表現。沧碼序列必須經配置到與啓動子核糖體結合部位都處於正確赛载姐的、 1趣万、止唯項碼區内，兩者都是在要表银蛋白質的宿主細胞内作用。要達到合成基因的有效轉錄時，其必須與一啓動子-操縱子區（pr〇m〇ter_operat〇r reg_)呈可操縱地缔合著所以口成基因的啓動子-操縱子區係配置成相對於合成笑因的ATG起始密碼子呈相同的序列取向。土有夕。種可用來轉形原核生物和眞核生物細胞之表現載體係技藝中熟知者（Pr〇mega Catal〇gue，1992 ;⑽ Catalogue，1992)。此外，美國專利第4,7i〇,473號述及用來在大腸埃希氏菌（E C〇li)内以高水平表現外來基因圓形DNA質體轉形载體。彼等質體可在重組dna程序用爲轉形載體且 (a)在該質體上載有在宿主細胞内自主複製之能力； (b )相對於維持宿主細胞培養物的溫度而控制自主質複製； (c )將質體在宿主細胞群内的維持予以穩定化； (d)頌π質體在宿主細胞群中的維持之蛋白質產物的接合成； (e )供供對質體爲獨特性的順序性核酸内切限制酶辨邵位；及 (f)終止mRNA轉綠。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）可之中體直識 1260986 A7 B7 五、發明說明（24 ) 這些圓形D N A質體可作爲載體用於重組D n A程序中以確保外源基因之高表現水平。在針對本發明所用化合物的胺基酸部份構成表現載體之後’下一步驟爲將該載體置於適當的細胞内及藉此構成可用來表現多肽的重組宿主細胞。用重組D N A載體轉形細胞所用的技術皆爲技藝中熟知者且可在如Maniatls，et al，上引資料等一般參考文獻中找到。宿主細胞可從眞核生物或原核生物細胞構成。原核生物宿主細胞通常以較高的速率產生蛋白質且較容易培養。在高水平細菌表現系統中表現出的蛋白質含特性地來集成顆粒或包藏體，其含有高水平的過度表現蛋白質。彼等蛋白質聚集體典型地必須使用技藝中熟知的技術予以回收，溶解，變性及再摺疊（Kreuger et al，199〇 ;美國專利第4,923,967號）。 QLP -1類似物和衍生物之製備經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對前驅體GLP· I或GLP· 1胺基酸序列予以變更以製得合思的GLP-1類似物或GLP-1衍生物，或其活性片段之舉係用熟知方法予以完成的：化學改質，酵素改質，或化學和酵素改質之組合。傳統液相方法和半合成方法的技術也可以用來製備本發明所用的GLP]分子。製備本發明分子所用的方法係熟練肽化學家所熟知者。在Lys34所含e_胺基加上醯基之舉可經由使用技藝中已知的多種方法中之任一者予以完成（Bi〇c〇njugate 1990 ; Hashimoto et al·，1989 )。 -27-

1260986 A7 B7 五、發明說明（25 ) 例如’可以使用5 0 %乙腈/硼酸鹽緩衝液將辛酸N -羥基 -丁二廳亞胺酯加到離胺醯基-e -胺基。可在咪峻基加入之别或之後將肽予以酸基化。再者，若肽係經由重組方式製備時’可在酵素切斷之前醯基化。此外，GLP-1衍生物中的離胺酸可依W0 96/29342中所述予以醯基化。多種經保護，未保護，和經部份保護，天然和非天然的 &月匕性GLP-1 (7-3 6)醯胺和GLP-1 (7-37)分子之類似物和衍生物的存在和製備皆經説明過（美國專利第5,12〇,712 ; 5,545,618 和 5，1 18,666 號；Orskov et al.9 1989 ; WO 91/11457)。視情況，GLP-1衍生物的胺基端和羧基端胺基酸殘基皆可經保護，或，視情況，只將其中一端保護住。彼等保護基的形成和脱除所用的反應皆在諳於此技者所知的著作中述及’例如 ’ Protective Groups in Organic Chemistry 1973 ; Green，1981 ;和 Schr5der and Liibke，1965。代表性胺基保護基包括，例如，甲醯基，乙醯基，異丙基，丁氧羰基，苐甲氧羰基，芊氧羰基，等。代表性幾基保護基包括，例如，苄基酯，甲酯，乙酯，第三丁酯，對-硝基苯醋，等。本發明使用的羧基端低碳數烷基酯GLP-1衍生物係經由用合意的（CrC4 )烷基醇與合意的多肽於催化性酸例如鹽酸存在中反應而製成。彼等烷基酯形成的恰當條件包括約 5 0 C的反應溫度及約1小時至約3小時的反應時間。類似地，可以形成A s p及/或G 1 u殘基的烷基酯衍生物。 --------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -28-

1260986 A7 B7 五、發明說明（26 ) 本發明所用化合物的羧醯胺衍生物之製備係依，例如， Stewart et al. (1984)中所述形成的。 GLP-1，GLP-1類似物或GLP-1衍生物之醫藥可接受鹽形式都可用於本發明中。常用來形成酸加成鹽的酸爲無機酸例如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸，等；及有機酸例如對-甲苯磺酸，甲烷磺酸，草酸，對_溴苯基_磺酸，碳酸，丁二酸，檸檬酸，苯甲酸，乙酸，等。彼等鹽的例子包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，磷酸鹽，磷酸一氫鹽，噂酸二氫鹽^偏磷酸鹽，焦彻Μ ’ 化物，乙❹，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，丙晞酸鹽，甲酸鹽，異丁酸祿，己酸鹽，庚酸鹽，丙決酸鹽，草酸鹽，汚二酸鹽，丁二酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，反丁烯二酸職 %鹽，順丁晞二酸鹽，丁块- 1，4 -二酸鹽，己炔-16 -二酸職，# γ ^ 1^1，冬甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基笨甲妒癒 ^ Τ鉍鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯曱酸鹽，g太酸鹽，橫酸喷㉚’二甲苯磺酸鹽鹽，苯丙酸鹽，苯丁酸鹽，檸樣酸酸鹽，乙醇酸鹽，酒石酸鹽奈-1_績酸鹽，審-2-續酸鹽，苯乙酸鹽，乳酸鹽，γ -輕基丁，甲烷磺酸鹽，丙烷磺酸鹽，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製局桃酸鹽，等。較佳的酸加成鹽爲用礦酸例如鹽酸和負、;自所形成者。飞_，且，特別者，鹽酸，驗加成鹽包括衍生自無機鹼， 1如錢或驗金屬+ 屬的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氣嗥，等可乂鹼土至明鹽類的彼等鹼因而包括氫氧化制用來製備本發 ’氫氧化鉀，氫氧化一 29、本紙張尺㈣财酬家鮮（CNS)A4祕⑽x (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986

歲、1石炭酸鉀，¥。彼等鹽形式皆爲特別較佳者。在用於本發明中+ 乂 π A 4 1何生於太鉻日日+ Μ〜^ 、一或多種賦形劑調配。例如，用於本發明中的活性化合物用子钭人。IΡ 」、、、二由熱知万法與二價金屬陽離 c Γ +皮寺金屬陽離子包括，例如，Zn+.，Mn'Fe++， C〇++，Cd++，Νι++，等。明的組合物 :需二用於本發明中的活性化合物可與醫 ::劑組合，並將叩調節到可提供可接受的安定性，：馬非經腸給藥可接受的p Η値。視需要’可加入一或多種醫藥可接受的抗微生物劑。間 -甲酚和酚皆爲較佳的醫藥可接受性抗微生物劑。可加入或多種醫藥可接受性鹽以調整離子強度或張性。可加入一j多種賦形劑以進一步調整調配物的張性。甘油即爲一種等張性調整用賦形劑之一例。 GLP-1受體及經由結合到GLpq受體所起始的信號轉導、及駟皆載於 WO 96/25487 ; Thorens et al·，1993 ;和 Widmann et al·，1994 (中。GLP-1受體爲具有七個透膜功能部位的膜蛋白質，其經偶合到異三體型G -蛋白質上其將經由配體結合的受體活化連接到細胞内第二信使的產生，特別是環狀腺苷一麟酸（CAMP )。cAMP轉而活化一特殊的蛋白質激酶，cAMP-依賴性蛋白質激酶（蛋白質激酶a，P κ A )。這種酵素可將某些基因所含啓動子區内的許多關键性效應元素予以嶙酸化。於胰b -細胞和其它神經内分泌細胞 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1260986 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（28 ) 中，調節分泌途徑所含某些特殊蛋白質的磷酸化會經由刺激分泌粒的外釋作用而剌激肽分泌。有多種化合物皆爲已知可刺激内源性GLP-1的分泌者。例如，將STC-1細胞暴露於某些促分泌物如腺苷酸環化酶活化劑，forskolin，或蛋白質激酶_ c -剌激劑，12_〇_十四烷醯基phobol-13-乙酸酯（TP A)，會促成GLP-1釋放之明顯增加（Abella et al·，I"4)。STC-1細胞素係源自載有胰島素-促進性致癌基因的轉殖小鼠體内的腸腫瘤，且細胞係已知含有可產生GLP-1的胰增血糖素原之mRNA轉錄本者。別的化合物，例如，抑體素，胃抑制多肽，葡萄糖依賴性促胰島素肽，鈐蟾素，抑鈣素基因-關聯性肽，円/必素-釋放性肽’膽驗能激動劑，b -腎上腺素能激動劑，異丙腎上腺素，及毒蕈鹼型膽鹼能激動劑，胺甲醯甲膽鹼，皆同樣地已知可促成内源GLP-1的釋出者 (Plarsancxe et al.? 1994 ； Orskov et al., 1996 ; Brubaker, 1991 ; Buchon，et al·，1987)。組合物之投服投服可經由熟練醫師已知爲有效的任何途徑進行，例外者爲直接進入中樞神經系統的非經腸投服不是本發明所敎授或揭示之途徑。較佳者爲經周圍的非經腸投服：非妙腸投服係-般醫學文獻中所知者，其爲經由無菌注射筒戍某些其它機械裝置例如注入栗將—劑形注射到”。爲本恭明目的而言，非經腸途徑包括靜脈内，肌肉内，：下，和腹膜内給藥徑途。更佳者爲唾靜巧、、、工静脈内，肌肉内和皮 ^-----------------訂---------線· (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -31 - 1260986 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（29) 下的投服本發明所用化合物之途經。甚至更高度較佳者爲經靜脈内和皮下投服本發明所用化合物之途徑。用於非經膠給藥時，較佳者係將本發明所用活性化合物與恰當p Η 的蒸餘水組合。本發明用以促成死亡率和罹病率減低所用的某些化合物也可適合經口，直腸，鼻，或下呼吸道等非_非經腸途徑丁以投服。於孩等非-非經腸途徑中，對於投服本發明所用肽而Τ較佳者爲下呼吸道途徑。供經由下呼吸道投服所用的各種肽化合物調配物皆揭示於美國專利第5,284,656和 5,364,838號之中。文獻wo96/!”97揭示出適合用來增本發明所用化合物的下呼吸道吸收之各種肽的氣霧劑。口給藥途徑對本發明所用化合物係較佳者。附加的醫藥方法可用來控制作用的持續期。控釋製劑經由使用聚合物來複合或吸收本發明所用化合物而達到。經由選擇恰當的巨分子，例如聚酷，聚胺基酸，聚乙缔基吨略酮，乙稀/乙酸乙晞醋共聚物，甲基纖維辛，幾甲纖維素，或繞酸魚精蛋白，及經由選擇恰當的巨分子度’以及掺入方法，以期征石趨： … 月延長釋放而得到延長的持婧期、、莖由控釋製劑延長作用持續期的另— : 明所用活性化合物摻加到聚合馬鼾木 . 何枓例如聚酯，聚胺 ^水凝膠，聚(乳酸)或乙缔/乙酸乙缔酿共聚物：之子内。另外，取代將化合物摻加到彼等聚二：可將本發所用化合物捕捉到經由子中者合所製的微膠囊，例如分別爲声极水術或界面〗局匕甲基纖維素-或明膠-微進經可基濃發基粒聚膠 --------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂---------線』 -32-

1260986 發明說明（30 ) 囊；或在膠體藥物輸送系統，例如，微脂粒，白蛋白微球粒，微乳液，奈微子（nanoparddes)，和奈膠囊 (apsules) ’或到巨乳液等之内。彼等敘述皆爲諳於此技者所知且經揭*於，例如R⑽ngton，s Ph職⑽utlcal

Sciences，1 980 之中。齊j量 1 GLP-1頒似物或GLp]衍生物，或其活性片段對特殊患者減低因中風所致死亡率和罹病率之有效劑量決定杰"午夕口素，其中包括患者的特性，重量和年齡，中風嚴重度’中風副51!，給藥途徑和生物利用率，投服化合物在體内的持續存在，配方，及力價。在間斷給藥時，每次給藥的劑量也必須考慮到投藥之間隔，及所給化合物之生物利用率。在連績給藥時，適當的劑量率爲〇至6微微莫耳/公斤體重/分，較佳者爲約0 5至約12微微莫耳/公斤/ 分。熟練醫師都可定出含GLP-1，GLP]類似物或GLp]衍生物，或其活性片段的投服劑量與速率以達到合意的臨床結果，即經由葡萄糖控制減低中風後的死亡率與罹病率。於一實施例中，將血漿葡萄糖濃度減低到約7毫莫耳/升以下係急性中風後的目標。醤藥可接受’’意指適合給人類服用，亦即，不含毒性元素，不良雜質等，且不會干擾其中所含活性化合物的活性。 / 具有在4 . 8至7 . 5範圍内的等電點之眾多GLP-1類似物和衍生物皆經揭示出且包括，例如： -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線j (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 %

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1260986 五、發明說明（31 )

CjLP-1 (7-36) NH2

Gly8-GLP-1 (7-3 6)ΝΗ2

Gln9-GLP-1 (7-37) 中風之診斷

“中風”之診斷係涉及罄A 丄 W孥判斷者。本發明主題的户恭Η 常係給急性中風期中的人所用。令心 n功需要本發明所用化人你ΑΑ + 口的者爲處於急性中風期者，j 其亦不能自我調節血液葡洛地履葡句糖。若患者有下列情況時即肩

不能自我調節者：（n、人M )先則、左衫斤出患有根據the Nationa Diabetes Data Group ^ 身 P Wlabetes，1979)的定義之胰島素依孝· 型糖尿病（ID DM )或非-腺ι本7、+ 、 ’ μ胰島素依賴型糖尿病（NIDDM); (2)即使沒有事先的糖尿病診斷，也具有大於u毫莫耳升的血液葡萄糖水平者；或（3 )具有不正常的葡萄糖耐担者。可以將患者的血糖水平有效地正常化所用GW]，GUM 類似物，或GLP-1衍生物之劑量決定於許多因素，其中包括，但不限於，患者的性別，體重與年齡，不能調節血糖足嚴重度，不能調節血糖的基底肇因，是否有同時給用葡萄糖或另一種醣類源，給藥途徑與生物利用率，在體内的持續性，配方，與力價。於連續投服之情況中，適當的投藥率爲0.25至6微微莫耳/公斤體重/分，較佳者爲約〇 . 5至約1 . 2微微莫耳/分之間。在斷續給藥之情況中，對每次給藥的劑量必須慮及投藥間隔，GLP]，GLP-1類似物或 GLP-1衍生物的生物利用率，及促成正常血糖所需的水 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1260986 A7 -------BT^_五、發明說明（32 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製平。熟練醫師都可定出GLP]，GLIM類似物，或GUM衍生物的投服劑量和速率以達到合意的臨床結果。實施例本發明可經由爹照特殊實施例而獲得更順利地了解，彼等係經提出以示範説明本發明具體實施例者。貝她例1 : 對NIDDM患者血糖之影^ 對5個有非_胰島素依賴型糖尿病（NIDDM)的患者於晚期以1 . 2微微莫耳/公斤/時的投藥率經由皮下注入給用 GLP-1 (7-36)醯胺1 〇小時。其對照組爲對相同的5個患者連續注入胰島素，但與GLpq (7_36)醯胺注入爲不相同的天進行。每二小時調整胰島素注入速率以達到最適控制，及避免低血糖症。如表丨中的數據，及圖丨所示者，皮下注入GLP_1 (7_36)醯胺可將血糖近乎正常化而不會在任何患者體内謗發低血糖症。用GLpq (7_36)醯胺所得新陳代謝控制優於胰島素所達到者，且用GLp_l (7-36)醯胺處理所得平均血糖水平比對照組在23:〇〇，〇:〇〇，和1:〇〇較低具統計意義之量。表1 .對5個NIDDM患者用GLP」（7_36)醯胺在晚間連續注入1 0小時所得平均血糖水平。於不同天對相同的患者所作對照研究中，係經由連續注入而給用胰島素。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1260986 --- Α7 Β7 、發明說明（ 33 ) GLP- 1注入胰島素注. 平均血糖標準誤差平均血糖小時 (mM) (mM) (mM) 21:00 7.5 0.45 6.9 22:00 5.4 0.76 6.6 23:00 4.1 0.16 5.9 0:00 4.4 0.23 5.6 1:00 4.4 0.29 5.1 2:00 4.8 0.34 5.2 3:00 5.2 0.41 5.4 4:00 5.4 0.41 5.7 5:00 5.8 0.41 6.0 6:00 6.0 0.45 6.1 7:00 6.2 0.45 6.1 實施例2 :於用餐中皮下注射GLP-1 (7. -36)對 NIE 水平之影響標準誤差 XmM) 0.68 0.55 0.98 0.90 0.58 0.58 0.30 0.25 0.30 0.38 0.33 --------% (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在一天中，對5個NIDDM患者在早餐，午餐，和晚餐中注入GLP-1 (7-36)醯胺3小時。注入時間爲7:3〇_1〇 3〇 (早餐），10:30-1:30 (午餐），和 4:30-7:30 (晚餐），如圖 2 中指出者。在對相同的5個NIDDM患者於不同天、隹^ 尸斤、 I行的對昭實驗中，係在開始用餐之前刻經皮下注射入〜一艰島素，如同 2中所示者。於注入GLP-1時，可消除掉對认昧a 吗 \胰島素注私所觀察到的餐後葡萄糖逸出現象，且可維杜^ ’ 符4王正常的i 水平。緊接在每一次GLP-1 (7_36)醯胺注Α μ 糖八終止之後， -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）血 1260986 A7 五、發明說明（34 糖水平有明顯地增加。未觀察到(7_岣醯胺的不當田II作用。這些數據顯示GLPq (7_36)醯胺注入比胰島素注入可以更有效地控制餐後葡萄糖水平，且只要GLP-i (7_36) 8监胺主入繼續進行該控制即保持有效。表2.對5個NIDDM患者在每一餐起始時開始注入^^卜】 (7-36)醯胺三小時所得平均血糖水平。於對相同患者在不同天進行的對照研究中，係在每一餐之前刻皮下注射投服胰島素。用餐係在7:30, 10:30和 _L6:3〇開始。 GLP-1注入經濟部智慧財產局員工消費合作社印製平均血糖 (mM) 5.4 4.9 5.7 5.8 8.1 9.4 7.2 5.3 7 10 9.2 5.7 6.6 8.3 9.3 標準誤差 :mM) 0.35 0.38 0.59 1.06 0.94 0.59 1.18 1.21 0.71 0.26 1.06 1.59 0.94 0.71 0.71 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）小時 7:00 8:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 18:00 19:00 20:00 21:00 胰島素皮下注射平均血糖標準誤i

_0 • 2 • 4 9 9 8 6 9.1 8.1 7.0 7.2 6.5 7.3 6.1 6.0 6 9 .2 5 0.41 0.51 0.74 0.78 0.76 0.74 0.90 0.91 0.87 0.57 0.59 0.65 0.59 0.41 0.44 1260986 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（35) 引用文件：

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 1260986 A7 ____B7五、發明說明（38 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 U.S. PATENT NOS. 4,710,473 4,923,967 5.118.666 5.188.666 5,120,712 FOREIGN PA丁ENT N〇S. WO 91/11457 WO 96/29342 WO 96/25487 WO 96/19197 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 5,284,656 5,364,838 5,545,618 5.512.549 5.523.549 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

A BCD I26__ 號申請專利案中文申請專利範圍替換本(95年4月）申請專利範圍 ’一種用於中風後經由控制高血糖症以減低致死率虚羅病率之醫藥組合物’包括有效量之發揮親胰島素活性之化合物，其藉與GLIM、GLIM類似物及GLp_a生物之相同受體或受體們交互作用而發揮它們的親胰島素活性。 2.根據申請專利範圍第丨項之醫藥組合物，其中該化合物係選自GLP-1、GLiM類似物、GLp]衍生物及其醫藥可接受鹽。 3 .根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該類似物包括胺基酸序列： Ri-X-Glu-Gly10.Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu20-Y.Gly.Gln-Ala-Ala25-Lys-Z-Phe.Ile-Ala30-Trp.Leu- Val-Lys-Gly35-Arg-R2 其中R】為His或去胺基-組胺酸，χ為Ala、Gly或 Val，Y 為 Glu 或 Gin，Z 為 Glu 或 Gin 及 R2 為 Gly-〇H，及另包括一附加的胺基酸取代。 4 ·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中r 1為L_ 組胺酸，X為Val，Y為Glu，Z為Glu及R2為Gly-〇H 〇 5 .根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該GLP-1 類似物包括胺基酸序列： Ri-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu20.Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Z-Phe-Ile«Ala30-Trp-Leu- Val-Lys-Glyj5-Arg-R2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1260986 A8 B8

其中R〗為His或去胺基-組胺酸，χ為Ala、Giy或為 Glu 或 Gin，Z 為 Glu 或 Gin 及 R 為 Gly- OH。 6，根據申請專利範圍第5項之醫藥組合物，組胺酸，X為Va丨，丨u，uGlu及中〜為為_ OH。根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該GLp_ j 衍生物包括選自由 GLP-1 (7-34)、GLP-1 (135)、GLP] (7 36) GLP-1 (7-37)或其醯胺型式所組成之群組之glp_ 1類似物之胺基酸序列，及另包括至少一種選自下列所組成之群之修飾·· (a)用甘胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、天冬胺醯胺、穀胺醯胺、酪胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、精胺酸或D 離胺酸取代位置2 6及/或位置3 4的離胺酸；或用甘胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、天冬胺醯胺、穀胺醯胺、酪胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、曱硫胺酸、苯丙.胺酸、離胺酸或D _精胺酸取代位置3 6的精胺酸； (b )用抗氧化性胺基酸取代位置3 1的色胺酸； (c )至少一種下列取代：用酪胺酸取代位置1 6的纈胺 8义’用離私酸取代位置1 8的絲胺酸；用天冬胺酸取代位置21的榖胺酸；用絲胺酸取代位置2 2的甘胺酸；精胺酸取代位置2 3的榖胺醯胺；用精胺酸取代 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1260986 A B c D r—~·-- 六、申請專利範園位置2 4的丙胺酸；及用穀胺醯胺取代位置胺酸；及 (d )包括下列至少一種之取代：用甘胺酸、絲胺酸或半胱胺酸取代位置8的丙胺酸；天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、天冬胺醯胺、榖胺醯胺、酪胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、曱硫胺酸或苯丙胺酸取代位置9的榖胺酸；用絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、&冬胺醯胺、榖胺醯胺、酪胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸‘、白胺酸、曱硫胺酸或苯丙胺酸取代位置i 〇用穀胺酸取代位置15的天冬胺酸。及 8·根據中請專利範圍第7項之醫藥組合物，立中該GUM 類似物係選自由 GLP-；! (7_34)、GUM (7_35)、GLp」& ’GLIM (7_37)或其醯胺型式所組成之群組，及另包括用丙胺酸取代位置3 4的精胺酸。 9 .根據申請專利範圍第8項醫華酉条，、且σ物，其中該GLP-1類似物包括經胺酸醯化ε -胺基。 1〇=據中請專利範圍第1至9射任Him物，其係以0.25至6微微莫耳/公斤/分之間之量投服。 1 1 ·根據申請專利範圍第1 〇項貝（酉条組合物，其中該量為 •至2 · 4微微莫耳/公斤/分之間。 12.根據申請專利範圍第u π ς r 貝之錯条組合物，其中該量為約〇.5至約1.2微微莫耳/公斤/分之間。】3.根據申請專利範圍第i至9項中杯一項中任項之醫藥組合物，其 -3 A B c D 1260986 六、申請專利範圍係用於經由非經腸途徑投服。 14. 根據申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其係用於經靜脈内投服。 15. 根據申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其係用於經皮下投服。 16. 根據申請專利範圍第1 4項之醫藥姐合物，其係用於連續投服。 17. 根據申請專利範圍第1 4項之醫藥組合物，其係用於斷續投服。 18. 根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其係用於連續投服。 19. 根據申請專利範圍第1 5項之醫藥組合物，其係用於斷續投服。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）