TWI248445B - Gene transfer methods - Google Patents

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1248445 九、發明說明： 技術範疇 ^本發明係關於在醫學、細胞工程、遺傳工程及發生工程 等範#中，能使對標的細胞之基因導入效率提昇且以良好 效率進行標的細胞轉形之方法，以及與其相關之—連串技 術0 背景技術 多數疾病之機構已被了解，再者’藉著重組dna技術及 基因導人細胞之技術急速進步’近年正致力開發供治療嚴 重遺傳疾病之體細胞基因治療法方案。再者，最近正嘗試 不僅將基因冶療用於遺傳疾/病，而且用於aids等病毒感 染症及癌症之治療。 " 至目前為止，在已完成人類臨床應用研究之基因治療法 中，有多種係利用重組反錄病毒載體而將基因導入細胞。 反錄病毒載體由於可將目的外來基因有效率地導入細胞 内，以及安疋地組合入該細胞之染色體dna中，所以在期 望獲得長期基因表現之基因治療上為特佳之基因導入手 段。該載體以不會對導人基因之生物產生不良影響之方式 被施加。舉例言之’使基因導入所用之載體之複製機能缺 才貝，以使其本身不會在細胞内進行複製及反覆無限制感染 (基因導入）。 此等載體（複製機能缺損之反錄病毒載體）由於無法自已 複製，-般使用反錄病毒產生細胞（套裝細胞）來調製包含 在病毒粒子内之反錄病毒載體。將基因以高效率導二標： 59247-940930.doc 1248445 細胞之最簡單方法為將該反錄病毒產生細胞與標的細胞共 培養。但是在該方法中，被移植於身體内且被導入基因之 標的細胞中有混入反錄病毒產生細胞之危險。 最近報告利用反錄病毒將基因導入時，藉著屬細胞外基 質成分之纖維粘著素（fibronectin)之共存，可使對細胞之 基因導入效率提昇[J· Clin· Invest·，第93卷，第1451〜1457頁 (1994年）；Bl00d，第 88卷，第 855 〜862 頁（1996年）]。再者， 以这傳工耘之方法所生產之粘著纖維素片段也有同樣的性 質，利用其可以將外來基因以良好效率導入造血幹細胞亦 已被證明（WO 95/26200號）。曾暗示基因導入效率藉著纖 維枯著素之提昇，與纖維枯著素中之肝素結合領域=反錄 病毒結合有關。 又，在WO 97/183 18號公報中顯示纖維粘著素以外之機 能性物質如纖維母細胞增殖因子能使基因導入效率提昇。 再者，在同一公報中顯示，在具反錄病毒結合活性之機 月b性物質與具標的細胞結合活性之其他機能性物質混合使 用之場合，可以見到同樣的基因導入效率提昇。 口 利用此等機能性物質之基因導入方法無需將反錄病毒產 生細胞與標的細胞共培養，就能以高效率進行基因導入。 :因導入效率藉著該方法之提昇’被認為係由：機能二 質將反錄病毒與標的細胞共配置成接近之狀態，使“ 相互作用機會增加所致。 反錄病毒感染標的 利用反錄病毒之基 在該使用反錄病毒之基因導入法中 細胞之結果為造成基因之導入。但是 59247-940930.doc 1248445 因導入效率對實際臨床應用而言現在尚無法令人滿意，而 強烈期望感染效率之進一步提昇。 關於使感染效率（即基因導入效率）提昇之手段，雖曾考 慮提高所用病毒液（病毒上清液）中反錄病毒之濃度（效價 數），但有高效價數病毒產生能力之病毒產生細胞之構築 及確認需要花費許多勞力。雖然利用VSV病毒之外套蛋白 質之偽型病毒載體（Pr〇c· Natl_ Acad· Sci· USA，第90卷， 第8〇33〜8037頁（1993年））藉著離心可以達到濃縮，但此法 僅限用於該載體可被使用之方法，缺乏廣用性。 再者基因‘入之呀，若反錄病毒之感染係以對標的細 胞具特異性之方式完成，則在標的細胞純度低之場合亦可 以得到高基因導入效率，但尚不知在現在之技術水準中簡 便且效率良好之方法。 發明之目的 蓉於上述問題，本發明之主要目的為在藉反錄病毒將基 因導入標的細胞之場合，提供一種使基因導入效率提昇且 以良好效率進行標的細胞轉形之改良方法。 本發明之其他目的及本發明之優點，下文將參照隨附之 圖式闡明。 圖式之簡單說明 圖1顯示分子内含有9個甘露糖殘基之高甘露糖型糖鏈之 構造。 圖2係顯示在實例3中被化學修飾之ch_296與藉此所得之 基因導入效率（％)之圖。 59247-940930.doc 1248445 圖3係顯示在實例13之病毒感染抑制物質之除去效果試 驗中，相對基因導入效率（％)與接觸/結合時間之關係圖。 圖4係顯示在實例15中，利用離心法之反錄病毒與機能 f生物貝之結合效果之試驗中，相對基因導入效率（〇/〇)與各 病毒結合操作之關係圖；空白柱：上清法，網狀柱··連接 法’塗黑柱：離心法。 S 5係顯示在實例15中，藉離心法及離心感染法分別得 到之基因導入效率（〇/0)。 發明之概要 本發明者發現藉著在進行對標的細胞之感染之前，使被 口足於支持體上且具反錄病毒結合活性之機能性物質與反 錄病毒接觸以及實施該支持體之洗淨操作，能使基因導入 效率提昇。 又 ^現用反錄病毋感染標的細胞之時，藉著對標的細 胞具特異性之抗體、昆布胺酸（laminine)、來自昆布胺酸 之糖鏈或高甘露糖型糖鏈之共存，可以獲得對做為目標之 標的細胞之特異性及/或高效率之基因導入。 再者，藉著對在基因導入之前之標的細胞實施適當的處 理’可以使基因導入效率提昇。 再者又發現藉著將具病毒結合活性之機能性物質予以化 學修飾以提高其之鹼性，能夠改善該基因導入之效果。 本發明，基於本發明者之此等新穎發現而被完成。 亦即，本發明之第一態樣係關於一種藉反錄病毒將基因 導入標的細胞之方法，其特徵為包含下列步驟： 59247-940930.doc -10- 1248445 (1) 將含有反錄病毒之溶液與被固定於支持體上且具反 錄病毒結合活性之機能性物質接觸之步驟， (2) 將結合有反錄病毒之支持體洗淨之步驟，以及 (3) 使結合有反錄病毒之支持體與標的細胞接觸及培育 之步驟。 上述步驟⑴，沒有特殊限制，例如實施i小時以上，以 貝^ 3小4以上為較佳。又’可藉著將反錄病毒與具反錄 病毒結合活性之機能性物質接觸之頻率以物理方法提高而 實施。 不贫明所使 -、、汞病f結合活性心微祐性籾買沒 特殊限制，例如可以使_維黏著素（fib_ctin)、、纖 母、’田胞i日殖因子、V型膠原、聚離胺酸、deae_葡聚糖 此等之片段以及與這些同等之具反錄病毒結合活性之物 者。又，可以使用具標的細胞結合活性之物質做為上述 能性物質，或者將上述機能性物質與具標的細胞結合活 之其他機能性物質Μ。具標的細胞結合活性之機能性 質沒有特殊限制，例如可以使用細胞接著性蛋白質、： 素、細胞激素（cytokine)、妙驶 )杬體、糖鏈、碳水化合物或^ δ射物專。 在本發明中基因導入所使用之反錄病毒，例如可以使； 反錄病毒產生細胞之丨立表主 你、隹“… U養上-液。該培養上清液亦可為力 促進反錄病毒產生之物暂 生之物貝（例如酪酸鈉）共存下所得者。 细樣之特徵為在藉反錄病毒將基因導入標# 之方法中，於存在下述二種機能性物質下，使反錄, 59247-940930.doc 1248445 毒感染標的細胞： (1) 具反錄病毒結合活性之機能性物質，以及 (2) 標的細胞之特異性抗體。 在本發明中所用之標的細胞之特異性抗體沒有特殊限 制，例如存在於細胞表面能辨識身體物質者。 本發明第三態樣之特徵為在藉反錄病毒將基因導入標的 細胞之方法中，於存在下述二種機能性物質下，使反錄病 毒感染標的細胞： (1)有反錄病毒結合活性之機能性物質，以及 (2财胺酸(laminine)、昆布胺酸片段、來自昆布胺酸 之糖鏈或高甘露糖型糖鏈。 本發明之第二態樣及第三態樣所用之具反錄病毒結合活 性之機能性物質沒有特殊限制，例如為纖維黏著辛 (fibr〇nectin)、纖維母細胞增殖因子、V型膠原、聚離胺 酸、DEAE-葡聚糖、此等之片段以及與這些同等之具反錄 病毒結合活性之物質者。該機能性物f亦可為具標的細胞 結合活性者。再者，所用之機能性物質亦可以被固定於支 持體上之狀態使用。 ' 本發明之第四態樣之特徵為在使用反錄病毒將基因導入 心的、田胞之方法中，在與反錄病毒接觸之前，先將標的細 胞在鐵濃度被降低之培養基中培養。本發明所使用之培養 基沒有特殊限制’例如可以使用含去鐵胺（deferc>xamine) 之培養基，較佳於機能性物質存在下進行。 本發明之第五態樣之特徵係關於一種使胜肽或蛋白質之 59247-940930.doc -12- 1248445 反錄病毒結合活性提昇之方法，其特徵為將胜肽或蛋白質 以化學方法修飾。上述化學性修飾沒有特殊限制，例如將 胜肽或蛋白質之胺基酸殘基活性化或導入鹼性殘基。胺基 酸殘基之活性化所用之方法沒有特殊限制，例如藉水溶性 碳化二亞胺處理’以及以藉水溶性碳化二亞胺及二胺基化 合物處理為較佳。藉該方法所得之被化學性修飾之胜肽或 蛋白質適合用在藉反錄病毒將基因導入標的細胞之方法 中0 發明之詳細說明 在本發明之基因導人方法中，通常使用重組反錄病毒載 體尤其以複製機能缺損之反錄病毒載體為較佳。該載體 在感染細胞中欠缺自行複製那樣之複製能力，因此為非病 原性。Λ等載體侵入如脊椎動物細胞(尤丨是哺乳動物細 胞）之伯主細胞中，能夠安定地將被插入該載體之外來基 因組合入該宿主細胞之染色體DNa中。 在本發明中，被導入細胞之外來基因，在適當啟動子 (例如存在於反錄病毒載體中之LTR之啟動子以及外來之啟 動子）控制下，能插入重組反錄病毒載體内而使用。又， 為了達成良好效率之外來基因轉錄，啟動子及與轉錄開始 部位合作之其他調節要素（例如加強子序列及終結子序列） 亦可存在於載體内。被導入之外來基因可為天然者，亦可 為人工製造者，或者由起源不同之DNA分子藉粘接等公知 手段所結合者。 被插入反錄病毒中之外來基因係選擇期望導入細胞中之 59247-940930.d〇( -13- 1248445 任何基因。舉例言之，外來基因除可使用編碼與治療對象 之疾病有關之酵素及蛋白質之基因外，亦可使用編碼細胞 内抗體（參照W0 94/02610號）、增殖因子、反義核酸、核 糖酶〇比(^71^)、錯誤引子（例如參照\^〇 90/13 641號）等之 基因。 在本發明中所用之反錄病毒載體亦可以含有適用於選擇 導入基因之細胞之標記基因。做為標記基因者，例如為可 以使細胞對抗生物質產生财性之藥劑耐性基因，以及能藉 酵素活性使導入基因之細胞顯現之報信子（reporter)基因。 在本發明中可使用之載體例如有MFG載體（ATCC 68754 號）、α-SGC 載體（ATCC 68755 號）、LXSN 載體 [BioTechniques，第7卷，第980〜990頁（1989年）]等反錄病 毒載體。PM5neo載體[Exp· Hematol·，第 23卷，第 630〜638 頁（1995年）]以及在本案說明書實例中所用之反錄病毒載 體，含有做為標記基因之新黴素磷酸轉移酶基因。因此， 藉該載體導入基因之細胞能夠以其對G418之耐性做為指標 而被確認。 再者，此等載體，藉著使用公知之組裝細胞株[例如 PG13 (ATCC CRL-10686) > PG13/LNc8 (ATCC CRL-10685)、PA317 (ATCC CRL-9078)、GP+E-86 (ATCC CRL-9642)及 GP + envAml2 (ATCC CRL-9641)、Proc_ Natl· Acad. Sci. USA，第 85卷，第 6460 〜6464 頁（1988 年）記載之 p CRIP等細胞株，做成成組裝有該載體之病毒粒子而調 製。 59247-940930.doc -14- 1248445 將反錄病毒導人組裝細胞所製得之病毒產生細胞與標的 細胞之培養’彳以使用杜爾貝科氏（Dulbe⑽）改質之伊格 (Eagle)培養基及伊斯寇卜改質之杜爾貝科氏培養基等，此 等培養基例如可從吉伯可公司(Gibc〇)之市售商品得到。在 此等培養基中，為因應基因導入之標的細胞之種類及其他 目的可以添加各種成分。舉例言之，以促進或抑制標的 細胞之生月及分化為目的時，可以添加血清及各種細胞激 素（cytokines)。該血清例如可使用幼牛血清（cs)及牛胎血 清（FCS)等。又，可做為細胞激素者，有間白素（比_3、化_ 6等）、群落刺激因子（G_CSF、GM_CSF等）、幹細胞因子 (SCF)、促紅血球生成素及各種細胞增殖因子等，其中多 個來自人類之細胞激素在市面上有販售。適用此等細胞激 素之場合，應選擇具有符合使用目的之作用者，於需要 時’亦可以將彼等組合使用。 在本發明之基因導入方法中，可以使用含有反錄病毒之 試料，例如病毒產生細胞之培養上清液，其之調製方法沒 有特殊限制。舉例言之，已知在培養病毒產生細胞之時， 藉著添加酪酸鈉，上清液中之病毒粒子會增加[Hu则η

Gene Therapy，第 6卷，第 1195 〜1202 頁（1995 年）]，使用本 發明之基因導入方法時，被如此調製之高效價數病毒上清 液亦毫無問題可被使用。 本發明之特徵為在具有反錄病毒結合部位之機能性物質 存下使反錄病毒感染標的細胞。藉著在有效量之此等 機能性物質存在下，使反錄病毒感染細胞，可以高效率得 59247-940930.doc • 15 - 1248445 到基因導入細胞。再者，力由 、、存中；r力夕、广主戌-九& 生物f之病毒上清 存在病毋“抑制物質，亦可簡單地將之除去。 又，藉著具標的細胞結合活性 ^ ^ 之機忐性物質之共存，能以 更商之特異性及/或效率進行基因之導入。 導!=月Γ:所謂有效量係指在利用反錄病毒將基因 二仏的細胞而引起標的細胞轉形上有效之量，以及依據 機此性物質及標的細胞之 ..,_ _ T颁、擇適當ΐ。該量，例如藉 耆本呪明書記載之方法測定基 , 守八效率而決定。又，在 本忒明書中，所謂細胞結合活# ^ ^ ^ ^ ^ 之活性，而且包含在溶液"有II;3”結合於細胞 At 、 八有月b與軚的細胞維持接觸狀 # 。該活性亦可如上述，從其之基因導入效率來 測疋。再者’所謂基因導入效率意味轉形效率。 2機能性物質可轉解於溶液中之狀態或以於適當 特❹ί之狀態被使用。將機能性物質固^之支持體沒有 ，、卜通常使用細胞培養用容器及珠粒狀之支持體。 β _ 口疋於支持體上且具病毒結合活性之機能性物質之 ，合’藉著下文例示之步驟可以使基因導入之效率更為提 幵° I先’將含有反錄病毒之液體試料（例如病毒上清液）與 固疋有具反錄病毒結合活性之機能性物質之支持體接觸。 ^此支2體洗淨後，藉著將該支持體與標的細胞接觸，或 疋用適:彳法將⑹支持體溶離之病毒粒子添加至標的細胞 :二能以高效率進行基因導入。此處所使用之具反錄病 毋、σ 0 /舌性之機能性物質也可為具標的細胞結合活性者， 59247-940930.doc -16 - 1248445 亦可以將具反錄病毒結合活性之機能性物 細胞結合活性之機能性物質組合使用。 使含有反錄病毒之液體試料與固定有具反錄病毒結合活 =機能性物質之支持體接觸之步驟無特殊之限制，通常 ““小時以上’以實施3小時以上為較佳。在溫度等條件 二:沒有特殊限制，例如可在室溫或坑進行。依病毒之 ^ 等在4 C左右之低溫進行亦可。固定有機能性物 貝^支持體雖可依其目的而適當選擇，但若使用細胞培養 用容器，則一添加標的細胞就可開始基因導入步驟。又在 寺體之洗淨上，除可使用碟§曼緩衝生理食鹽水及漢克斯 生理食鹽水外，亦可以使用培養標的細胞所用之液體培養 基。 心再者，藉著物理性手段提高與具反錄病毒結合活性之機 能性物質之接觸頻率，能夠使該機能性物質以良好效率與 反錄病毒結合。此等物理性手段沒有特殊限制，例如可以 利用震盈、過遽或離心力。㈣離心力之方法，具體而 吕，例如為將含有反錄病毒之液體試料添加至底部固定有 具反錄病毒結合活性之機能性物質之離心 心管進行離心分離操作之方法。該離心之時，由於= 毒藉著離心力沉降至離心管之底部，以致反錄病毒與具反 錄病毒結合活性之機能性物質之接觸頻率增加，而使彼等 之結合效率提昇。上述方法’不像藉離心力使病毒沉降於 細胞上而感染之方法（WO 95A0619號公報）那樣會對細胞 施予物理性應力，因而可以得到更高之基因導入效率。 59247-940930.doc 1248445 藉著上述操作使含有反錄病毒之試料中所包含之對基因 導入不利之物質被除去後，再實施基因之導入。藉本發明 之方法所除去之物質，例如為病毒上清液所含之來自組裝 細胞之反錄病毒感染抑制物質[Human gene therapy，第8卷， 第 1459〜1467 頁（1997年）；J. Virol·，第 70卷，第 6468〜6473 頁 (1996年）]，及在培養反錄病毒細胞食為促進反錄病毒產生 所添加之物質，例如除佛波醇-12-肉莖蔻酸酯-13-乙酸酯 及地塞米松（dexamethasone)[Gene Therapy，第 2 卷，第 547〜551頁（1995年）]之外，尚可用酪酸鈉等。 本發明所使用之具反錄病毒結合活性之機能性物質沒有 特殊限制，例如為纖維黏著素（fibronectin)之肝素-II結合 領域、纖維母細胞增殖因子、V型膠原、聚離胺酸、 DEAE-葡聚糖或者與此等機能性物質具同等機能之物質， 例如也可以使用有肝素結合部位之機能性物質。又，可以 使用該機能性物質之混合物、含有該機能性物質之多胜 肽、該機能性物質之聚合體或該機能性物質之衍生物等。 藉著將此等機能性物質以化學方法修飾，可以增強其之 病毒結合活性。化學修飾之方法例如有將所用機能性物質 上之胺機酸殘基活性化之方法，以及將鹼性殘基導入該物 質之方法。舉例言之，藉著將胜肽或蛋白質所組成機能性 物質中之游離羧基用水溶性碳化二亞胺（例如1-乙基-3-二 曱胺丙基碳化二亞胺鹽酸鹽）修飾，可以將羧基活性化而 提高反錄病毒結合活性。再者，藉著利用如此活性化之魏 基，將鹼性殘基（例如胺基）導入機能性物質上，能夠提高 59247-940930.doc -18- 1248445 反錄病毒結合活性。 又，本發明所用之具標的細胞結合活性之機能性物質， 、有寺殊限制，例如為具有結合至標的細胞之配位體之物 貝，汶配位體例如為細胞接著性蛋白質、激素、細胞激素 (cytokine)、對抗細胞表面之抗原之抗體、多糖類、糖蛋 白質、糖脂質、來自糖蛋白質或糖脂質之糖鏈、或者標的 細胞之代谢物。再者亦可以使用含有該機能性物質之多胜 肽、該機能性物質之聚合體、該機能性物質之衍生物或與 該機能性物質之機能同等之物質等。 能特異性結合至標的細胞之抗體，在將基因以特異性及 同效率^入特疋細胞上特別有用。本發明可使用之抗體沒 有特殊限制，可以適當選用在欲“基因之細胞中所表現 之抗原之抗體。該抗體可藉公知方法製造，不過現在多種 抗體在市面上有販售，此等市售抗體亦可被使用。此等抗 體亦可為具有細胞特異性等期望性f之多株抗體及單株抗 體中之任-種。再者，可以使用藉公知技術修飾之抗體或 抗體之衍生物，例如人類化抗體、Fab片段及單鏈抗體 等。 關於已知做為CD抗原之白血球抗原，各抗原在種種細 胞中之表現正被詳細探究。因此藉著選擇會制在標的細 胞中表現之CD抗原之抗體並將其用於本發明之基因導入 方法中，可以將基因以高特異性導入標的細胞中。舉例言 之，在使用抗CD4抗體之場合，基因導入鎖定辅助丁細 胞；或在使用CD34抗體之場合，基因導入鎖定造血幹細 59247-940930.doc •19- 1248445 胞。 再者，藉著使用昆布胺酸（為一種糖蛋白質，其係做為 具標的細胞結合活性之機能性物質），能以良好效率將基 因導入種種標的細胞（例如血液系細胞）中。本發明所使用 之昆布胺酸，若為對標的細胞具結合活性者，可以使用來 自小鼠者，也可以使用來自人類者，再者，亦可以使用其 之片段。如下列實例所示，在使用昆布胺酸之基因導入之 中，其之糖鏈扮演重要角色。因此，藉公知方法從昆布胺 酸切出之糖鏈在本發明之方法中也可以被使用。再者與昆 布胺酸同樣具高甘露糖型之N—結合型糖鏈之糖蛋白質、從 其切出之糖鏈以及化學合成之該糖鏈在本發明之方法中亦 可以被使用。另外，可以使用使上述糖鏈結合於蛋白質等 物質上者，例域上述糖鏈結合至具反錄病毒結合活性之 機能性物質上者適於用來進行基因之導入。 上述高甘露糖型糖鏈，雖然只要為分子内具有丄〜職邊 之甘露糖者即沒有特殊限制，但在本發明之方法中，以= 其非還原終端具有甘露糖殘基者為較佳。該糖鏈亦可μ 以外之適當分子（例如單糖、募糖、多糖、 肽、蛋白質、脂質等身體分子，戋人 土酉文、泡 質)結合而使用。 分子等人工物 糖》)2之構造者[蛋白f、核酸及酵為扑 卷’第263B39頁（1998年）]。雖然沒有素’； 具上述構造且其分子内含有9個甘露糖殘基之糖:，’彳 59247-940930.doc -20- 1248445 露糖）9_(G1ucNAc)2(該糖鏈之構造示於圖1中），更適合用在 本發明之基因導入方法中。 上述機能性物質可為得自 八Μ、、’貝 方法製造（例如藉重組DNA技術及化學合成技術製造），另 外可將天然來源之物質與人工製造之物質加以組合而製 造。再者，如W0 97/1 83 18號公報所記載者，在使用此等 機能性物質而實施基因導入之場合，可以將具反錄病毒結 合部位之機能性物質與具標的細胞結合部位之其他機能性 物貝此a使用，或者使用在同一分子中具有具反錄病毒結 合部位及標的細胞結合部位二者之機能性物質。又，做為 此等機能性物質者，係使用實質上不含在天然情況下與其 子之…他蛋白貝者。更且，此等機能性物質或機能性物 貝之組合，可與培養標的細胞所用之培養基及細胞增殖因 子等組合而做成供基因導入之套組。 •本發明方法所使用之纖維粘著素及其片段，例如可藉厂 Bi〇l· Chem·，第 256卷，第 7277頁（1981年）；了 ⑽咖曰 1〇2 卷，第 449 頁（1986年）；j Cell Bin1 $ 心尘 ·’ 卞 J J· leli B1〇l·，弟 l〇5 卷第 489 頁 (=7年）記載之方法，從天然來源之材料以實質上& U &。又’藉著美國專利第5，198,423號記載之方法， 可以利用重組職技術製造。含有為反㈣4結合部位之 肝素-II領域之纖堆社I喜μ机 , 纖、准拈者素片段，例如下述實例所用之ΓΜ 290，以及 Η_271、Η_296、 之 CH- ^ Η 271#重組多胜肽， 付此等片段之方法被詳 取 左饭卉、、、田5己載在該專利中。此 上述公報所記載，葬菩 美 、 又如 戰稭者培養被寄存於茨城縣付場市東1丁 59247-940930.doc -21 - 1248445 目1番3號之大腸菌可以獲得[此等大腸菌之寄存㈣為 FERM P.1G721 (H_296)(原寄託日：平成 月 12日）、 FERM BP-2799 (CH_271)(原寄託日：平成⑷月㈣）、 FERM BP-2800 (CH_296)(原寄託日：平成⑷心日）以 及BP-2264 (H-271)(原寄存日：平成⑷月则）]。又，能 從此等片段定型衍生之片段’可以藉著公知之重組基因技 術，將保存於上述大腸菌之質體改變而製造。再者，上述 纖維粘著素片段之中，h_296具有對於vla_4之結合領 域，（^^了丨具有對於VLA_5之結合領域，CH_296具有對於 上述二者之結合領域[Nature Medicine，第2卷，第876_882頁 (1996年）]〇 藉著在上述機能性物質存在下，使反錄病毒感染標的細 胞，可以良好效率得到導入基因之細胞。反錄病毒之感染 藉通常之方法’例如於37。(：及5%二氧化碳之條件下培育 而進行。該條件及培育之時間可隨著標的細胞及目的而適 宜變更。 由於在標的細胞為G〇期細胞之場合反錄病毒不會感染， 所以較佳藉預備刺激誘導細胞週期。為達此目的，在以反 錄病毒感染之前，先將標的細胞在適當的標的細胞增瘦因 子存在下培養。例如，在將基因導入骨髓細胞及造血幹細 胞之場合’預備刺激可以使用各種之細胞激素例如間白 素-3、間白素_6及幹細胞因子等而進行。 已知反錄病毒對細胞之感染與該細胞表面上存在之受器 有關。已知驗性胺基酸傳送子（transporter)及鱗酸傳送子 59247-940930.doc -22- 1248445 刀別有做為親腸道病毒（echotroPic virus)及親兩性病毒 (amPh〇tropic virus)之受器之機能[pr〇c Nau n USA，第93卷l14G7〜11413f (1996年）]，為了使此等傳送子 之表現及代謝循環活潑化，藉著將標的細胞在鹼性胺基酸 或磷酸或者其鹽或前軀體被降低之培養基中進行前處理， 可以使病毒成為易感染該細胞之狀態。 令人驚異地本發明者發現，在將運鐵蛋白受器（以前不 知與病毒感染有關）活性化之場合，反錄病毒之感染效率 (即基因導入效率）亦上升。運鐵蛋白受器之活性化沒有特 殊限制’可以在鐵濃度被限制之培養基中處理標的細胞， 例如可以使用添加去鐵胺以螯合培養基中之鐵而得之培養 基。 藉運鐵蛋白活性化之基因導入，較佳於亦存在上述機能 性物質下進行。 為藉本發明之方法導入基因之標的之細胞沒有特殊限 制，例如可以使用幹細胞、造血細胞、非接著性低密度單 核細胞、接著性細胞、骨聽細胞、造血幹細胞、末梢血幹 細胞、臍帶血液細胞、胎兒性造血幹細胞、胚形成幹細 胞、胚細胞、原生殖細胞、卵母細胞、卵原細胞、印子、 精母細胞、精子、CD34+細胞、C-kit+細胞、多功能性造 血前驅細胞、單功能性造血前驅細胞、紅血球系前驅細 胞' 淋巴球母細胞、成熟血球、淋巴球、B細胞、T細胞、 纖維母細胞、神經母細胞、神經細胞、内皮細胞、血管内 皮細胞、肝細胞、肌肉母細胞、骨骼母細胞、平滑肌細 59247-940930.doc -23- 1248445 胞、癌細胞、骨鰱腫瘤細胞及白血病細胞等。由 :骨髓所得之“系細胞比較容易得到，且其之料及: 持技術已經確立，所以適合用於利用本發明之場合。尤复 疋在以導人基因長期表現為目的之場合，u造血幹^ 胞、CD34陽性細胞、c_kit陽性細胞、多功能性造灰㈣ 細胞等血液系之前驅細胞做為標的細胞。 例如’以造血幹細胞做為標的細胞之基因治療可 述之操作進行。 曰^ *首先採取含有來自給予者之造血幹細胞之材料，例如骨 鈿組織、末梢血液、臍帶血液等。此等材料雖可以 於基因導入操作，但通常藉密度梯度離心等方法調製含有 造金幹細胞之單核細胞部分，然後利用所謂咖4及,或c u之細胞表面之標記分子進行造灰幹細胞之精製。含有此 等造血幹細胞之材料，如需要，可用適當的細胞增殖因子 專先進行預備刺激，然後以藉本發明方法插入目的基因而 付之纽反錄病毒將其感染。如此所得之基因導入細胞， ❹❹脈内投與可移植至接受者中。接受者雖然較佳為 給予者本身’但亦可以進行同種異系移植，例如在使用臍 帶血液做為材料之場合可進㈣種異系移植。 以造血幹細胞為標的之基因治療係修補患者中缺損或發 現有異常之基因’例如ADA缺損症及韵豆病之基因治療適 匕外為緩和癌症及白血病治療所用之化學治療劑 對造血細胞之障害，可將藥劑耐性基因導人造血幹細胞 中〇 59247-940930.doc -24- 1248445 再者’關於癌症之基因治療法，將細胞激素類之基因導 入癌細胞後’剝奪其之增殖能力並將其送回患者體内，以 增強腫瘤免疫之腫瘤疫苗療法正在被研究中[Human gene therapy，第5卷，第153〜164頁（1994年）]。另外亦嘗試藉基 因治療法治療AIDS。於該場合，在為AIDS之原因之 HIV(人類免疫不全病毒）所感染之τ細胞中，考慮將編碼會 妨害HIV之複製及基因表現之核酸分子（反義核酸及核糖酶 專）之基因導入[例如Journal of virology，第69卷，第 4045〜4052 頁（1995 年）]。 如上所詳細說明者，藉著使用本發明，可以高效率且對 標的細胞具高特異性之方式實施基因之導入。再者，本發 明之方法無需特別之設備及裝置，以及多種的反錄病毒載 體在標的細胞中有效。 實例 下文列舉之實例將更詳細說明本發明，但本發明非僅限 於下述實例之範圍。 實例1 來自纖維粘著素之多胜肽之調製 來自人類纖維粘著素之多胜肽H-271，藉美國專利第 5，198,423號公報記載之方法，從含重組質體pHD1〇1之大 腸菌HBlOl/pHDIOl (FERM BP-2264)調製，其中該重組 質體pHDIOl含有編碼該多胜肽h_271之DNA。 來自人類纖維粘著素之多胜肽H_296，藉上述專利公報 記載之方法’從含重組質體pHD1〇2之大腸菌HB102/ 59247-940930.doc -25 - 1248445 pHD102 (FERM P-10721)調製，其中該重組質體pHD102含 有編碼該多胜肽H-296之DNA。 多胜肽H-271藉下述方法調製。 亦即使用大腸桿菌HBlOl/pCHlOl (FERM BP-2799)，並 用上述公報記載之方法培養，從該培養物得到CH-271。 多胜肽CH-296藉下述方法調製。 亦即使用大腸桿菌HB101/pCH102 (FERM BP-2800)，並 用上述公報記載之方法培養，從該培養物得到CH-296。 多胜肽C-274藉下述方法調製。 亦即使用大腸桿菌 JM109/pTF 7221 (FERM BP-1915)， 並用美國專利第5,102,988號公報記載之方法培養，從該培 養物得到C-274。

Col V(來自V型膠原之具反錄病毒結合活性之多胜肽）依 照國際公開公報WO 97/1 83 18號記載之方法調製。 實例2 反錄病毒載體之構築以及反錄病毒上清液之調製 導入含新黴素磷酸轉移酶基因之反錄病毒質體，即 PM 5 neo 載體[Experimental Hematology，第 23 卷，第 630 〜638 頁，1995 年]之 GP+E-86 細胞（ATCC CRL-9642)，在含 10% 牛 胎血清（FCS，吉伯可公司製）、50單位/ml之青黴素及50 pg/ml鏈黴素（皆為吉伯可公司製）之杜爾貝科氏（Dulbecco) 改質之伊格（Eagle)培養基（DMEM，生物威塔克公司製）中 培養。又，在以下之操作中，所用之DMEM全為含有上述 抗生物質者。含有PM5neo病毒之上清液，係在使上述產 59247-940930.doc -26- 1248445 生細胞生長至半會合程度之平皿（10釐米直徑之明膠塗佈 之細胞培養用皿，岩城硝子公司製）中，添加含10〇/〇FCS之 4 ml DMEM並培育一夜後，將其採取而調製得。將採集得 之培養上清液用0.45微米之濾器（微孔公司製）過濾以做為 病毒上清液貯存液，並保存於_8。〇直至使用為止。 再者，從導入反錄病毒質體pLEIN[克隆技術公司製，該 質體含有新黴素磷酸移轉酶基因及增感綠色螢光蛋白質 (EGFP)基因]之親腸道組裝細胞B〇SC23[Proc· Natl· Acad· Sci· USA，第90卷，第8392〜8396頁（1993年）]以及親兩性組裝 細胞 p CRIP [proc· Natl· Acad· Sci· USA，第 85 卷，第 6460〜6464頁（1988年）]之各個，用與上述者同樣之操作調 製病毒上清液。以下將從BOSC23細胞調製之病毒稱為 Eco-EGFP，以及將從p CRIP細胞調製之病毒稱為Ampho-EGFP。 再者，從含有具新黴素磷酸移轉酶基因之反錄病毒質 體，即TKNeo 載體[J· Exp. Med·，第 178 卷，第 529 〜536 頁 (1993 年）]之 GP+EnvAml2 細胞（ATCC CRL-964 1)，以與上 述同樣之方法調製成病毒上清液。又，DMEM係使用含有 10%幼牛血清（CS，吉伯可公司製）以替代FCS者。 上述病毒上清液之力價係依照以NIH/3T3細胞（ATCC CRL-1658)中導入新黴素磷酸移轉酶基因為指標之標準方 法[Journal of virology，第 62 卷，第 1120 〜1124 頁（1988 年）]測 定。計算出每ml上清液所含之感染性粒子數（cfu/ml)，將 其做為上清液之力價，以決定在以下之實驗中上清液之添 59247-940930.doc -27- 1248445 加量。 實例3 反錄病毒結合性機能性物質之製造及其活性之測定 在表面未經處理之細胞培養用96穴顯微平皿（法爾孔公 司製）中於每-穴添加5G微升含濃度各為⑼叫㈤之仏 271、H-296、C-274 W、—6、ColV、人類驗 性纖維母細胞增殖因子（bFGF，普羅京公司製）、田納新 (Tenascin ’纟伯可公司製）、表皮細胞增殖因子（pop，寶 酒製造公司製）或2%牛血清白蛋白（BSA，西格瑪公司製）之 溶液，於靜置-夜後，將平皿用填酸緩衝生理食睡水 ㈣S ’羅馬工業公司製）進行二次洗淨操作。再者，:上 述同樣處理後，在每一穴中分別注入用滅菌純水調整至4 mg/mkh乙基_3·二甲胺丙基碳化：亞胺鹽酸鹽（西格瑪公 司製）溶液0.1 ml，並於3rc使其反應2小時後，將平皿用 純水充分洗淨而製成經碳化二亞胺處理之平皿。將此等平 皿保存在4°C，直至進行病毒感染實驗為止。 將在添加有10%FCS、50單位/ml青黴素及5〇 pg/mi鏈黴 素之RPMI 1640培養基（生物威塔克公司製）中培育之小鼠 白血病細胞U2U) (ATCC CCL_219)104個，與pM5ne〇病毒 上清液（104cfU/ml)50 μ卜添加至上述顯微平皿之每一穴 中。將其培養24小時之後，將培養基與含有最終濃度為 〇.75mg/ml之G418(吉伯可公司製）者交換，然後再進行48 小時培養。G418耐性細胞之檢定，係藉著改變s. Kim等人 方法之一部份，並測定Premix WST]試藥（寳酒製造公司 59247-940930.doc -28 - 1248445 製）之顯色以做為在450 nm之吸光度而進行。培養後，在 每100 μΐ培養液中添加10 μΐ之WST-1試藥，於37°C培養4小 時後，以顯微平jui讀數器測定在450 nm及650 nm之吸光度 並計算出其之差（450 nm - 650 nm)。再者，將用2% BSA塗 佈且未經碳化二亞胺處理之群所得之值做為背景值。將3 次試驗之結果示於表1中。 表1 機能性物質 未處理群 碳化二亞胺處理群 實驗1 BSA 0.000±0.011 未實施 -CH-271 2.099土 0.010 2.814±0.079 實驗2 BSA 0·000±0·007 0.224±0.031 H-271 0·777±0·016 0.994土0.029 H-296 0.474±0.014 0.666±0.021 C-274 -0·068±0·017 0.100 土 0.033 CH-271 0.382±0.017 0.425±0.019 CH-296 0.363+0.023 0.460土 0.007 ColV 0.644±0.006 0.847±0.033 bFGF 0·425±0·014 0.580±0.046 Tenascin 0.060±0.021 0·323±0·037 EGF 0.030±0.021 0·077±0·038 (平均值±標準偏差值） 如表1所示，藉著使用公知之具病毒結合活性之機能性 物質：H-271、H-296、CH-271、CH-296、ColV及 bFGF， 可以見到基因導入效率上升。再者，就不具病毒結合活性 之C-274、田納新（Tenascin)、EGF及BSA吕之，在施予碳^ 化二亞胺處理之場合，G4 1 8耐性細胞之出現率增加。 接下來使用CH-296做為機能性物質，進行以下之實驗。 59247-940930.doc -29- 1248445 在表面未經處理之細胞培養用之24穴顯微平皿（法爾孔 公司）中，每穴各添加40 pg/ml之CH-296並於4°C培育一 夜。該平iϊII用PBS(pH5.8)洗淨後，將含有各種濃度之乙二 胺[NH2(CH2)2NH2，納卡來公司製]或三亞甲基二胺 [NH2(CH2)3NH2，納卡來公司製]或腐胺[NH2(CH2)4NH2， 納卡來公司製]之1-乙基-3-二甲胺丙基碳化二亞胺鹽酸鹽 (10mg/ml)之PBS(pH 5.8)溶液，在每六中各添加625 μΐ，並 於37°C培育2小時。藉著該操作，經由碳化二亞胺而將胺 基導入CH-296分子上之羧基中。將該平皿用PBS洗淨3次 後，用2%甘胺酸/PBS及2%BSA/PBS依次封阻。 將導入有反錄病毒載體質體pLEIN之GP+E86細胞在含有 10%CS之DMEM中培養，然後採取上清液。將該上清液稀 釋成lxl 05cfu/ml而得之病毒液以每孤0.5ml之量添加至上 述平孤中並培育4小時，繼而再加入1x104個NIH/3T3細胞 並進行2日培養。培養終了後，將細胞回收至細胞剝離用 緩衝液（生物威塔克公司製）並洗淨後，藉著使用 FACSVantage(貝克同狄肯森公司製）之流式細胞光度測定 法（激起波長：488 nm ;螢光波長：515〜545 nm、 5 62〜5 8 8nm)，進行EGFP表現細胞之解析，以細胞之基因 導入效率表示病毒對平孤之結合能力。將結果示於圖2 中〇 如圖2所示，胺基導入反應所用之二胺基化合物之濃度 提高，則病毒結合能力上升。若將腐胺、三亞甲基二胺及 乙二胺一起以2 mM之濃度用於該反應，則與未經處理之 59247-940930.doc -30- 1248445 CH-296相較’顯示2倍程度之病毒結合能力。 實例4 昆布胺酸對基因導入效率之增強效果 將小鼠昆布胺酸（吉伯可公司製）或人類昆布胺酸（寶酒掣 造公司製）與具病毒結合活性之機能性物質組合而實施某 因之導入。本實驗所用之表面未經處理之細胞培養用 顯微平皿（法爾孔公司製）藉下述二種方法塗佈此等機能性 物質。 混合塗佈法（cocktail method):將二種機能性物質之混 合液添加至平皿中並於4°C靜置一夜後，藉2%BSA進行封 阻（37°C，20分鐘），繼而用pbS洗淨平皿。 預塗法··將具病毒結合活性之機能性物質溶液添加至平 皿中，於4°C靜置一夜後，將該溶液除去。接下來添加昆 布胺酸溶液並於37 °C培育2小時，繼而藉2%BSA進行封 阻，然後用PBS洗淨平皿。 又，塗佈操作所用之機能性物質溶液，係在每一穴中添 加 0.5ml 〇 添加105個L1210細胞及〇_5ml之Eco-EGFP病毒上清液 (105 cfu/ml)並繼續培養24小時。培養終了後，將細胞回收 於細胞剝離用緩衝液（生物威塔克公司）中並洗淨後，藉著 使用FACSvantage(貝克同狄肯森公司製）之流式細胞光度 測定法（激起波長·· 488 nm ;螢光波長：515〜545 nm)，進 行EGFP表現細胞之解析，並算出基因導入效率（EGFP細胞 對全部細胞之比率）。實驗結果被示於表2〜5中。 59247-940930.doc •31 - 1248445 表2 機能性 昆布胺酸添加濃度及塗佈法 (80 pg/ml) 未添加 5 pg/ml 20 pg/ml 20 pg/ml - 預塗法 預塗法 混合塗佈法 BSA (2%) 1.12 5.20 6.55 6.22 H-271 5.41 11.19 17.52 9.67 H-296 4.83 5.96 5.51 6.95 CH-271 4.00 6.72 13.73 17.34 CH-296 6.48 7.08 6.02 16.77 基因導入效率以％表示。 表3 機能性物質 _ 昆布胺酸添加濃度 (80 pg/ml) 未添加 20 pg/ml 40 pg/ml 60 pg/ml BSA (2%) 1.36 5.14 4.74 3.82 CH-271 16.89 32.05 24.45 23.46 CH-296 17.80 18.79 20.44 19.31 平JBI之塗佈用混合塗佈法進行。又，基 因導入效率以°/〇表示。 表4 CH-296 添加濃度 無添加 昆布胺酸添加濃度 未添加 5 pg/ml 10 pg/ml 20 pg/ml 0.69 4.09 6.76 6.89 10 pg/ml 4.67 11.81 9.36 7.01 20 μ^/τη! 5.16 11.64 10.57 8.49 40 pg/ml 4.41 10.49 11.52 9.11 80 pg/ml 5.11 10.87 11.48 11.10 1 60 pg/ml 5.19 9.04 11.84 10.88 320 pg/ml 未實施 未實施 10.27 10.54 平JHI之塗佈用混合塗佈法進行。又，基 因導入效率以％表示。 59247-940930.doc -32- 1248445 表5

導入效率以％表示。 如表2及表3所不，在將小鼠及人類之昆布胺酸與具病毒 …口活〖生之機忐性物質組合而用於藉反錄病毒進行基因導 入之場合’不管其之固定化方法為何，對標的細胞之基因 ‘入』；、、、：白以非常兩的效率進行。如表4及表5所示，檢討 在藉混合塗佈法塗佈有CH_296及CH_27l以及昆布胺酸之 平皿中基因之導入效率’此等物質之最適濃度比如下： CH_296/小鼠昆布胺酸為 8 : 1(例如 80 pg/ml : 10 μ§/ιηυ， CH-271/小鼠昆布胺酸為16 :【（例如8〇 ^/mi : $叫⑽。 此時之基因導人效率’肖昆布胺酸未添加時相比，在 296為上升2·6倍，以及在CH-271為上升5」倍。 實例5 在使用昆布胺酸下對小鼠c_kit陽性骨趙細胞之基因導 小鼠C-kit陽性骨髓細胞之調製如下述進行。從^〜^週 之C3H/He雌鼠（日本艾史艾爾西公司製）之大腿骨採取骨丨 細胞，將如此得到之細胞以使用菲可海克（ι 〇875 “π/ 59247-940930.doc -33- 1248445 法瑪西亞公司製）之密度梯度離心分離，而調製低密度單 核細胞部分。所付到之細胞用PBS洗淨後，用Ery-Lysis緩 衝液（155 mM NH4C1，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA，pH 7.4)溶解紅血球，然後用PBS洗淨。對於所得細胞每i〇7 個，添加1 pg之對抗該骨髓細胞之抗小鼠CD 11 7抗體（法明 津公司製），並使其在冰上反應30分鐘。將細胞用含5 mM EDTA及0.5%BSA之PBS洗淨後，懸浮於相同之緩衝液中。 接下來對於每107個細胞，添加20 pg之與微珠粒結合之2 次抗體（米爾―亭生物科技公司製），於4。(：反應30分鐘後，用 上述緩衝液洗淨及再懸濁。藉著MACS系統（米爾亭生物科 技公司製）回收結合至珠粒之細胞，而得到C-kit陽性細 胞。 在病毒感染之前，先將小鼠C-kit陽性骨髓細胞，依照 Luskey等人之方法[Blood，第80卷，第396〜4〇2頁〇992年）]進 行預備刺激。亦即，在含有2〇%FCS、20 ng/ml重組小鼠間 白素-3(基因酶公司製）、5〇 ng/ml重組人類間白素(基因 酶公司製）、100 ng/ml重組小鼠幹細胞因子（基因酶公司 製）50單位/ml之青黴素及5〇 gg/mi鏈黴素之α (生 物威塔克公司）中，於5%(：〇2存在下，於37。〇培養2曰。 將表面未經處理之細胞培養用24穴顯微平皿，用各種濃 度之小鼠昆布胺酸及80 pg/ml之CH-271之混合液以混合塗 佈法塗佈後，用2%BSA封阻30分鐘，然後用PBS進行洗 淨。再者，使用2°/〇BSA代替CH-271製作平皿以做為對照 組。在該顯微平皿之每一穴中添加1〇5個c_kit陽性骨髓細 59247-940930.doc -34- 1248445 胞及 0.5ml Eco-EGFP病毒上清液（105cfu/ml)並進行病毒 感染。將其培養48小時後，添加0.5ml新鮮的培養基並再 繼續培養24小時。培養終了後，將細胞回收於細胞剝離用 緩衝液中並洗淨後，從實例4記載之方法算出基因導入效 率。將進行2次實驗之結果示於表6及表7中。 表6 昆布胺酸添加濃度 未添加 10 pg/ml 20 pg/ml BSA 0.18 0.25 0.16 CH-271 0.69 3.93 2.64 基因導入效率以％表示。 表7 昆布胺酸添加濃度 未添加 2.5 pg/ml 5 pg/ml 10 pg/ml BSA 1.37 1.80 2.63 5.38 CH-271 9.95 16.12 15.28 17.00 基因導入效率以％表示。 如表6及7所示，在小鼠昆布胺酸及具病毒結合活性之機 能性物質CH-271以混合塗佈法塗佈之平皿上使反錄病毒感 染C-kit陽性骨髓細胞之場合，顯然可以見到非常高的基因 導入效率增強效果。併用昆布胺酸之基因導入效率，與 CH-271單獨使用時相較最大上升5.7倍。 再者，使用效價數為107 cfu/ml者並進行與上述同樣的 操作，以做為Eco-EGFP病毒上清液。將3次實驗所得之基 因導入效率之平均值示於表8中。在該場合，利用具反錄 病毒結合活性之機能性物質之基因導入效率，藉著併用昆 59247-940930.doc -35- 1248445 布胺酸而上升。 表8 昆布胺酸添加濃度 ............ 未添加 2 pg/ml 4 pg/ml 6 μ^/ιηΤ^ BSA 5.88 11.77 19.33 27.09 H-271 25.12 53.39 55.65 56.4T^J CH-271 43.06 , 66.87 73.67 77.76^^ CH-296 76.84 81.57 83.3£_ 「85.48—、^ 基因導入效率以％表示。 實例6 使用昆布胺酸對來自脾臟細胞之CD3陽性T細胞之基 因導入 來自小鼠脾臟細胞之CD3陽性T細胞之調製如下述進 行。從6〜8週齡之C3H/He雌小鼠之脾臟採取細胞，並通過 100 μιη篩（法爾孔公司製）以除去殘渣。將所得細胞用含有 10%FCS之漢克斯平衡溶液（HBSS ,生物威塔克公司製）洗 淨後，用Ery-Lysis緩衝液溶解紅血球，繼而用HBSS洗 淨。將所付細胞通過3 0 μιη篩（米爾亭生物科技公司製）及 除去殘渣後，在CD3陽性Τ細胞濃縮管柱（研發系統公司製） 中精製。病毋感染實驗所用之小鼠CD3陽性Τ細胞，在固 定有抗小鼠CD3及CD28抗體（各為1 gg/mi，法明津公司製） 之木炭上’於含有10%FCS、50單位/ml青黴素及50 pg/ml 鏈黴素之RPMI 1640培養基（生物威塔克公司製）中及於5% 二氧化碳存在下，於37°C培養2日並進行預備刺激。 使用20 pg/ml小鼠昆布胺酸及go gg/mi之ch-269之混合 液，以與實例5同樣之方式塗佈24穴顯微平皿。在該顯微 59247-940930.doc -36 - 1248445 平皿之每一穴中添加105個CD3陽性T細胞及0.5 ml Eco-EGFP病毒上清液（l〇5cfu/ml)並進行3小時之病毒感染。其 後，添加含有10%?〇8、5 00單位/1111重組小鼠間白素_1« (雙酶公司製）、10 ng/ml重組小鼠間白素-2(雙酶公司製）、 50單位/ml青黴素及50 gg/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基， 然後繼續培養48小時。培養終了後，將細胞回收於細胞剝 離用緩衝液中並洗淨後，從實例4記載之方法算出基因導 入效率。將結果示於表9中。 表9 機能性物質 BSA(對照） 導入效率(％) || 0.83 I &-296 8.78 [5H-296/小鼠昆布胺酸 __13.20 基因導入效率以％表示。 如表9所示，對小鼠CD3陽性T細胞之基因導入效率顯然 可藉著昆布胺酸之共存而上升。 實例7 基因導入與昆布胺酸分子中之糖鏈之關係 每穴使用50 μΐ之5 pg/ml小鼠昆布胺酸及8〇 pg/ml cH-271之混合液，並以與實例5同樣之方法將96穴顯微平皿塗 佈後，用具有各種糖鏈切斷活性之酵素處理平孤，然後檢 討對基因導入效率之影響。 平皿在以下所示之條件下以酵素處理：内向-α_Ν_乙醯 基半乳糖胺酶（O-glycanase，生化學工業公司製）、内葡萄 糖胺酶H(endoglycosidase Η，生化學工業公司製）、E-万_ 59247-940930.doc -37- 1248445 半乳糖芬酶（Endo-P-galactosidase，生化學工業公司製）及 α-甘露糖嘗酶（α-Mannosidase，生化學工業公司製）用 50mM檸檬酸-磷酸緩衝液（ρΗ5·0)分別調製成500mU/ml、 500mU/ml、250mU/ml以及2mU/ml之酵素液。糖胜肽酶 F(胜肽：N-糖甞酶F，寶酒製造公司製）用100 mM Tris-鹽 酸緩衝液（pH8.6)調製成250 mU/ml之酵素液。分注各酵素 液，每穴各50 μΐ，然後使其於37°C反應20小時。之後，以 PBS進行3次之洗淨，然後用於小鼠感染實驗。 將在添加有10%FCS、50U/ml青黴素及50 pg/ml鏈黴素 之RPMI 1640培養基中生育之小鼠白血病細胞L1210 104 個，與PM5neo病毒上清液（104cfu/ml)50 μΐ，添加至上述 顯微平狐之每一穴中。將其培養24小時之後，將培養基與 含有最終濃度為0.75 mg/ml之G4 18者（吉伯可公司製）交 換，然後再進行48小時培養。G418耐性細胞藉實例3記載 之方法測定，其結果示於表10中。又，表10為綜合3次實 驗之結果所得者。 表10 機能性物質 酵素處理 吸光度 BSA(2%，對照） 無 0.000±0.030 CH-271 (80 pg/ml) 無 1.376±0.012 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml: 5pg/ml) 無 1.781±0.062 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml· 5pg/ml) 0-聚糖酶 1.886±0.071 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml: 5pg/ml) 内葡萄糖胺酶Η 1.214±0.017 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml· 5pg/ml) Ε-/3-半乳糖苷酶 1.939土 0.083 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml: 5pg/ml) α-甘露糖苷酶 1.657土0.033 CH-271/昆布胺酸(80 pg/ml: 5pg/ml) 糖肽酶F 1.610±0.036 59247-940930.doc -38- 1248445 如表10所示，併用昆布胺酸之場合，與單獨使用CM” 相比，G418耐性細胞出現率增加。該用昆布胺酸塗佈之平 皿以酵素處理之場合’以内葡萄糖胺酶只處理之昆布胺酸 完全失去基因導入促進效果。又，以α_甘露糖菩酶或糖肽 酶F處理者，被觀察到基因導入效率多少有些降低。若依 照昆布胺酸分子上之糖鏈之報告[Bi〇chim Bi〇p时A eta第883卷，第112〜126頁（1986年）]，昆布胺酸分子上 之大4刀糖鏈為結合至天冬醯胺之N _結合型糖鏈，每一昆 布胺酸分子有43分子之N-結合型糖鏈結合。在此等糖鏈之 中用内葡萄糖胺酶Η處理所切出之糖鏈，為高甘露糖型之 天冬胺-Ν_結合型糖鏈。再者，從觀察到以α•甘露糖甞 酶處理時基因導入效率降低，可以想到具有如同昆布胺酸 为子中之（甘露糖）9_(GlucNAc)2-Asn及/或（甘露糖）6-(giuc N A c )2_Asn那樣之以al-2及/或al-6鍵結（可被α-甘露糖甘酶 切斷）之甘露糖構造之糖鏈為關鍵之點。由此可明白昆布 胺酸之基因導入促進效果係基於昆布胺酸分子中之糖鏈， 尤其是南甘露糖型糖鍵。 上述（甘露糖）9-(GlucNAc)2-Asn與基因導入之關係藉下 述實驗確認。 使用固定有乳糖之瓊脂糖CL-2B(法瑪西亞公司製）並將 從脫脂大豆粉（西格瑪公司製）調製之大豆凝集素1 g加熱變 性後，在含有10 mM氣化鈣之20ml之50 mM Tris-鹽酸緩衝 液（pH7.2)中，使用20mg之凝集素酶E(科研製藥公司製）於 3 7 °C消化2晝夜。將酵素加熱使失去活性後，使用 59247-940930.doc -39- 1248445

Sephadex G-15(50 ml)及 Sephadex G-25(150 ml)管柱進行層 析’然後精製（甘露糖）9-(GlucNAc)2-Asn。圖1顯示（甘露 糖）9_(GlucNAc)2-Asn之天冬醯胺殘基除去後之構造。製作 藉共價鍵結而固定有CH-271及（甘露糖）9-(Gluc NAc)2-Asn 之顯微平皿。亦即，將96穴碳製平皿（住友酚醛樹脂公司 製）以4 mg/ml之水溶性碳化二亞胺溶液於37°c活性化2小 後’用滅囷水洗淨3次。調製含有2%BSA或80 pg/ml之CH-271以及各種濃度之（甘露糖）9-(giuc NAc)2-Asn之溶液，將 其以50 μΐ之量加至被活性化之96穴碳製平皿之穴中，並於 37 C進行2小時之固定化反應。接下來藉〇·2%甘胺酸溶液 於4C進行15小時之封阻，而用於下述之基因導入實驗。 在上述顯微平皿之每一穴中，添加1〇3個[121〇細胞及 〇·1 ml之Eco-EGFP病毒上清液（106 cfu/mi)及培養48小時 後，添加0.1 ml之新鮮RPMI 1640培養基（含有Fcs、青黴 素及鏈黴素）’然後培養24小時。回收及洗淨細胞後，藉 實例4之方法异出基因導入效率。將二次實驗之結果示於 表11中。 表11 機能性物質 糖類添加濃度 (80 pg/ml) 未添加 2.8 pg/ml 5·5 Mg/ml 11.1 pg/ml 22·1 lag/ml 44.2 Li^/ml S Lip/ml BSA (2%) 1.68 未實施 未實施 未實施 1.24 1 65 Ο O · 1111 未實施 CH-271 26.9 27.1 29.9 34.7 39.2 52.0 58.7 如表11所示，在同時固定有（甘露糖）9_(Gluc NAe)2_Asn 及CH-271之穴中，基因導入效率隨所用糖鏈之濃度增加而 上升。亦即，確認與存在於昆布胺酸分子上者同樣構造之 59247-940930.doc -40- 1248445 糖鏈可使基因導入效率上升。 實例8 使用抗CD4單株抗體下，對CD4陽性細胞之特異性 基因導入 將抗小鼠CD4單株抗體及抗小鼠CD44單株抗體（任一者 皆係法明津公司製）各1 pg/ml與H-271、CH-271及CH-296 各80 pg/ml組合，然後依照實例4記載之方法塗佈表面未經 處理之細胞培養用24穴顯微平孤。再者，對於H-271採用 預塗佈法，對於CH-271及CH-296採用混合塗佈法。 在該顯微平皿之每一皿中添加〇·5 ml Eco_EGFP病毒上清 液（107 cfu/ml)，於32°C培育3小時後，用含10%FCS、50單 位/ml青黴素及50 pg/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基洗淨平 皿。繼而依照實例6記載之方法調製，每穴添加來自經預 備刺激之小鼠脾臟細胞之CD3陽性T細胞105個並進行3小 時之病毒感染。之後，添加含有10%FCS、500單位之重組 小鼠間白素-1 a、1 0 ng/ml之重組人類間白素-2、5 0單位 /ml之青黴素及50 pg/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基，然後 繼續培養48小時。培養終了後，將細胞回收於細胞剝離用 緩衝液中並洗淨，然後將細胞用經藻紅素（PE，法明津公 司製）標記之抗小鼠CD4單株抗體（法明津公司製）及丙炔碘 (PI \西格瑪公司製）染色。對於此等細胞，進行使用 FACS Vantage之流式細胞光度測定（激起波長·· 488 nm ;螢 光波長：515〜545 nm、562〜58 8 mm)，以進行活細胞中 CD4抗原之表現及EGFP之表現之二次元解析，並分別算出 59247-940930.doc -41 - 1248445 對CD4陽性細胞及CD4陰性細胞之基因導入效率。將該結 果示於表12中。再者，表12為總合4次之實驗結果所得 者0 表12 機能性物質 對CD4陽性細胞之導入效率 對CD4陰性細胞之導入效率 (%) (%) BSA(對照） 0.16土0.07 0.11±0.07 抗CD4抗體 0·24±0·19 0.12±0.04 抗CD44抗體 1.92±0.82 1.95±1.00 Η-271 31·02±7·34 16.54土4.30 抗 CD4 抗體 58·91±8·11 20.32土4.46 抗 CD44 抗體/Η-271 56.08±7.53 _40·96±7·04_ CH-271 44.63±6.40 26.21 土 5·73 抗 CD4 抗體/CH-271 64.81±9.74 25·97±1·25 抗 CD44 抗體/CD-271 60.2918.71 44.10±3.56 CH-296 48.8118.77 29.45土4.70 抗 CD4 抗體/CH-296 62.93土 6.45 30.84+3.27 抗 CD44 抗體/CH-296 56.79±9.87 41·37±1·14_ (平均值±標準偏差） 如表12所示，若在塗佈有單株抗體及纖維粘著素片段二 者之平ϋϋ上進行反錄病毒感染，則在來自小鼠脾臟細胞之 CD3陽性Τ細胞中可以觀察到基因導入效率增強之效果。 格外值得特別一提之點為在將抗CD4單株抗體與具反錄 病毒結合活性之機能性物質加以組合而進行病毒感染之場 合，對CD4陽性細胞之基因導入效率，與對CD4陰性細胞 之效率相較，顯示非常高。例如在與Η-271組合之場合， 對CD4陽性細胞之基因導入效率約高達60%，相對於此， 對CD4陰性細胞之基因導入效率不超過20%之程度。使用 59247-940930.doc -42- 1248445 CH-271及CH-296做為纖維粘著素片段之場合亦得到同樣 的結果。 另一方面，CD44抗原，不論在CD4陽性細胞或在CD4陰 性細胞，98%以上會表現；在使用抗CD44單株抗體且與上 述同樣進行反錄病毒感染之場合，可以推想基因導入效率 上升與細胞之CD4抗原之表現無關，表12之結果證明此推想。 實例9 使用抗CD8a單株抗體下，對CD8陽性細胞之特異性 基因導入 除了使用H-271做為具反錄病毒結合性之機能性物質， 以及使用抗小鼠CD8a(法明津公司製）及抗小鼠CD44單株 抗體做為抗體之外，以與實例8同樣之方法進行。再者， 在CD8陽性、陰性細胞之檢出上，使用藻紅素（PE，法明 津公司製）標記之抗小鼠CD8a單株抗體（法明津公司製）。 將所得結果示於表13中。表13為綜合二次實驗結果所得者。 表13 機能性物質 對CD8陽性細胞之導入效率 對CD8陰性細胞之導入效率 (%) (%) BSA(對照） 0.22±0.08 0.28土0.00 抗CD8a抗體 0.36±0.20 0.28±0.02 抗CD44抗體 0.98±0.34 0.92±0.20 H-271 20.08±4.71 26.43±6.07 抗 CD8a 抗體/H-271 36.07±1.57 24.42土 0.55 抗 CD44 抗體/H-271 46·93±0·88 47.16 土0.75 (平均值±標準偏差） 如表13所示，藉著併用抗CD8a單株抗體及纖維粘著素 片段，可以觀察到對來自小鼠脾臟細胞之CD3陽性T細胞 59247-940930.doc -43- 1248445 之基因導入效率有增強之效果。 在抗CD8a單株抗體之場合，與實例8之結果一樣，對於 表現該抗體能識別之CD8抗原之細胞，顯示高基因導入效 率。又，在使用抗CD44單株抗體（該抗體在98%以上之 CD8陽性及陰性兩種細胞中均可被表現）之場合，未見到 CD8陽性與陰性細胞間之基因導入效率有差異。 上述實例8及9之實驗結果所顯示之意義非常大，其證明 若用標的細胞特異性抗體及病毒結合性機能性物質之混合 物質塗佈培養器，並用組合有目的基因之反錄病毒感染該 培養器上含標的細胞之細胞群，則可以標的細胞特異性之 方式導入目的基因。 實例10 使用抗體之細胞選擇性基因導入 使用80 pg/ml之CH-271以及對抗各種細胞表面抗原之單 株抗體（抗-CD4、抗-CD8、抗 CD-44、抗-CD49c、抗-CD49c、抗-CD49d及抗-CD49e抗體；各由法明津公司製 造）各1 pg/ml，依照實例4記載之方法，藉混合塗佈法塗佈 表面未經處理之細胞培養用2 4穴顯微平jiii。 標的細胞係使用K562(人類慢性骨髓性白血病細胞， ATCC CCL-243)，HSB-2(人類急性淋巴球性白血病細胞， CCRF-HSB-2，ATCC CCL-120.1)，MOLT-3(人類急性淋巴 球性白血病細胞，ATCC CRL-1552)，TF-1(人類紅白血病 細胞，ATCC CRL-2003)。對於此等細胞，使用被標記之 上述各種單株抗體進行FACS解析，然後測定對應於該抗 59247-940930.doc -44- 1248445 體之抗原之表現。 在上述顯微平皿之每一穴中添加0.5 ml之Ampho-EGFP 病毒上清液（1乂106〇!\1/1111)，於32°(：培育3小時後，用含有 10%FCS、50單位/ml青黴素及50 pg/ml鏈黴素之RPMI 1640 培養基洗淨。上述各種細胞各以1X1 〇5個之量懸浮於1 ml 之上述培養基中並添加至穴中，以進行病毒感染。再進行 3曰培養後，將細胞回收於細胞剝離用緩衝液中及洗淨， 並用實例4記載之流式細胞光度測定法算出EGFP基因之導 入效率。 將以上之結果示於表14中。又，其結果以3次實驗結果 之平均值表示。 表14 使用細胞 HS] B-2 MOLT-3 TF-1 K562 使用 抗體 未添加 導入 效率(％) 100 CD抗原 表現率 導入 效率(％) 100 CD抗原 表現率 導入 效率(％) CD抗原 表現率 導入 效率(％) CD抗原 表現率 100 100 CD4 106.7 — 100.7 + /- 108.8 +/- 104.9 一 CD8 130.4 + + 130.4 + + 107.0 一 116.9 — CD44 173.7 + + 172.5 + + 188.9 + + + 135.1 — CD49c 153.9 + + + 102.7 一 115.6 — 106.3 — CD49d 159.2 + + 165.3 + + + 150.3 + + + 97.5 — CD49e 185.5 + + + 127.5 + 128.9 + + 172.6 + + + 基因導入效率，係以各細胞中未添加抗體之基因 導入效率設為100%時之相對值（％)表示。 CD抗原表現率，將在FACS測定中之陽性率（％)各 如下表示： 59247-940930.doc -45 - 1248445 —:10%以下；+/— ： 10-30% ; + : 30-60% ++ : 60-90% ;+++·· 90%以上 如表14所示，關於在用CH-271做為病毒結合物質以及用 對抗各種細胞上抗原之抗體做為細胞結合物質之混合塗佈 法中之基因導入，確認抗原之表現率與基因導入效率有 關。 再者，使用在CH-271中加入有80 pg/ml聚離胺酸者做為 具反錄病毒結合能力之機能性分子，進行基因導入實驗。 所用之單株抗體、細胞及其他實驗條件與上述同樣進行。 將所得結果示於表15中。再者，結果以3次實驗結果之平 均值表示。 表15 使用細胞 ~ ~1 HS] 3-2 MOLT-3 TF-1 K562 使用 導入 CD抗原 導入 CD抗原 導入 CD抗原 導入 CD抗原 抗體 效率(％) 表現率 效率(％) 表現率 效率(％) 表現率 效率(％) 表現率 未添加 100 100 100 100 CD4 103.3 — 104.1 + /- 98.6 + /— 99.4 — CD8 116.3 + + 136.7 + + 100.8 — 92.4 — CD44 155.5 + + 144.9 + + 253.1 + + + 102.6 — CD49c 160.1 + + + 104.7 一 116.1 一 100.6 — CD49d 138.2 + + 156.3 + + + 187.7 + + + 103.1 一 CD49e 142.5 + + + 140.0 + 166.1 + + 129.2 + + + 基因導入效率，係以各細胞中未添加抗體之基因 導入效率設為100%時之相對值（％)表示。 CD抗原表現率，將在FACS測定中之陽性率（％)各 如下表示： 59247-940930.doc -46- 1248445 一 ：10%以下；+/— ： 10-30% ; + : 30-60% ++ ： 60-90% ;+++·· 90%以上 如表15所示，關於在用聚離胺酸做為病毒結合物質及用 對抗各種細胞上抗原之抗體做為細胞結合物質之混合塗佈 法中之基因導入，確認抗原之表現率與基因導入效率有 關。 以上二實驗之結果顯示，以能特異性識別標的細胞上表 現之抗原之抗體做為細胞結合物質之混合塗佈法被用於基 因導入時，可以將基因特異性地導入所期望之標的細胞 中0 實例11 對於在含有去鐵胺之培養基中前培養之標的細胞之基因 導入 將在含有10%FCS、50單位/ml青黴素及50 pg/ml鏈黴素 之RPMI 1640培養基中培養之人類骨髓性白血病細胞HL-60(ATCC CCL-240)，自感染實驗前日移至含有各種濃度 去鐵胺（deferoxamin，西格瑪公司製）之上述培養基中，於 5%二氧化碳存在下，於37 °C進行20小時之前培養。使用 時，將細胞用未含去鐵胺之新鮮培養基洗淨後，調製成 2x105個細胞/ml而用於以下之感染實驗。 在表面未經處理之細胞培養用24穴顯微平皿中，於每一 六添加80 pg/ml之CH-271 0.5ml，於4°C靜置一夜後，用 2%BSA封阻30分鐘，再用PBS洗淨。在上述顯微平皿之每 一穴中，添加0.5 ml之Ampho-EGFP病毒上清液（106 59247-940930.doc -47- 1248445 cfu/ml)，於32°C培育3小時後，用含有10%FCS、50單位 /ml青黴素及50 pg/ml鏈黴素之RPMI 1640培養基洗淨，接 著添加經前培養之HL-60細胞（每穴105個）並培養48小時 後，添加含有10%FCS、50單位/ml青黴素及50 pg/ml鏈黴 素之RPMI 1640培養基5 ml並繼續培養24小時。之後，藉 著與實例4同樣之操作調查基因導入效率。將結果示於表 16及17中。 表16 去鐵胺處理濃度 機能性物質 導入效率 (μΜ) 一 (%) 未添加 BSA(對照） 0.01 未添加 CH-271 0.14 6.25 CH-271 0.22 12.5 CH-271 0.27 25 CH-271 0.35 50 CH-271 0.71 表17 去鐵胺處理濃度 (μΜ) 機能性物質 導入效~ (%) 1 未添加 BSA(對照） 0.02 1 未添加 CH-271 0.25 40 CH-271 11.14 如表16及17所示，可以確認縱使對於單獨使用CH-271而 基因導入效率非常低之HL-60細胞，藉著事先用去鐵胺處 理20小時，基因導入效率會上升。 實例12 培養上清液中感染抑制物質之存在之檢出 將在實例2調製之TKNeo病毒上清液，分別用DMEM、 59247-940930.doc -48- 1248445 NIH/3T3細胞（ATCC CRL-165 8)之培養上清液及0 CRIP細 胞之培養上清液稀釋成312.5 cfu/ml，並用於下述之操作 中〇 在表面未經處理之培養用24穴顯微平孤之每一穴中添加 2 pg/ml之CH-296 0.5 ml及放置於室溫2小時後，用2%BSA 封阻30分鐘，再用PBS洗淨。在該顯微平皿之每一穴中， 加入上述病毒液1 ml及2x104個NIH/3T3細胞，然後於37°C 培育一夜。其後，在含有0.75 mg/mlG418之選擇培養基中 培養10日，然後計算出現之純系數目。將G41 8耐性純系數 目與在不含G4 1 8之培養基中所得之純系數目之比做為基因 導入效率，並將其結果示於表18中。 表18 稀釋液 基因導入效率(％) | DMEM(對照） 100 NIH/3T3細胞培養上清液 20.6 0 CRIP細胞培養上清液 15.7 基因導入效率用相對於對照群之相對效率（％)表示。 如表18所示，與病毒用DMEM稀釋之場合相較，用 NIH/3T3細胞之培養上清液或0 CRIP細胞之培養上清液稀 釋之場合，導入效率低至5分之一以下。NIH/3T3細胞，為 0 CRIP細胞及用於調製本實驗所用TKNeo病毒載體產生細 胞之等多數組裝細胞之親株。此暗示在該細胞之培養上清 液中若發現抑制病毒感染之活性，則用同樣組裝細胞調製 之病毒上清液亦將含有抑制物質。 實例13 59247-940930.doc -49- 1248445 病毒液中存在之病毒感染抑制物質之去除 為除去實例12所示之病毒感染抑制物質，使用以下之方 法。將實例2調製之TKNeo病毒上清液用0 CRIP細胞之培 養上清液稀釋成5000 cfu/ml後，再用DMEM稀釋二倍，以 做為含有反錄病毒之試料。 將上述病毒液用實例11記載之方法添加至以CH-296塗佈 之平孤之穴中，培育1-5小時並在CH-296上與病毒粒子保 持接觸後，用PBS洗淨平皿3次，然後添加含有2x104個 NIH/3T3細胞之DMEM 1 ml。做為對照者，係將2x104個 NIH/3T3細胞懸浮於上述病毒液1 ml中者立刻移至用CH-296塗佈之平皿中。將此等平皿於37°C培育一夜並使病毒 感染細胞。感染後之細胞在含0.75 mg/mlG4 1 8之選擇性培 養基中培養10日，然後計算出現之純系數目。將G418耐性 純系數目與在不含G418之培養基中所得之純系數目之比做 為基因導入效率，並將其結果示於圖3中。 如圖3所示，在將病毒粒子與塗佈有CH-296之平孤保持 接觸之場合，3小時後與對照之實驗區相比，導入效率較 高。亦即顯示存在於病毒液中之病毒感染抑制活性可用上 述之操作移除。 實例14 病毒液中存在之絡酸納之除去 將反錄病毒載體質體pLEIN導入0 CRIP細胞所得之重組 反錄病毒產生細胞，在含有10%CS之DMEM中培養。在10 cm直徑之平孤中生育至半會合（semiconfluent)程度之時， 59247-940930.doc •50- 1248445 將培養基用含有10%FCS之7 ml RPMI 1640交換，再用含 有5 mM酪酸鈉（拿卡來泰斯克公司製）及10%FCS之RPMI 1640交換，培養24小時後，將上清液用0.45微米之濾器過 遽而做為病毒上清液。病毒上清液之力價用實例2記載之 方法測定。不含酪酸鈉之病毒液之力價為3.3x104 cfu/ml，而含5 mM酿酸納之病毒液之力價為2x106 cfu/ml 〇 絡酸納一方面會停止細胞週期而抑制細胞之增殖，另一 方面有誘導分化之作用，因此亦被認為對於感染細胞可能 有不良影響。為了除去溶液中所含之酪酸鈉，使用下述之 方法評價。 用HL-60細胞做為標的細胞。在藉實例12記載之方法塗 佈CH-296之平孤中，添加上述病毒液，每穴0.5ml，於37 °C培育3小時並在CH-296上與病毒粒子保持接觸。培育終 了後，用PBS洗淨平孤3次，然後添加含有5x104個HL-60 細胞之PRMI 1640培養基（含10%FCS) 0.5 md。做為對照 者，係將5x104個HL-60細胞懸浮於上述病毒液0.5 ml中者 立刻移至用CH-296塗佈之平孤中。將此等平皿於37°C培育 一夜以使病毒感染細胞後，添加含10%FCS之PRMI 1640培 養基1 ml，再培養48小時後，計算細胞數目，又用實例4 記載之流式細胞光度測定法檢出EGFP表現細胞並解析基 因導入效率。將其結果示於表19中。 59247-940930.doc -51 - 1248445 表19 實驗區/病毒上清液 細胞數(個/平皿） 基因導入效率(％) CH-296 酪酸鈉：一 2.0xl05 2.21 酪酸鈉：+ 1.8xl05 52.98 對照 酪酸鈉：一 1·7χ105 2.74 酿酸鈉：+ 4·0χ104 35.46 如表19所示，在對照實驗區中之基因導入效率，以使用 添加酪酸鈉而調製成之病毒液者為較高，此確認酪酸鈉在 病毒調製方面之效果。但是在使用酪酸鈉之上清液中之生 育細胞數為未使用者之1/4以下，此確認細胞之生育會被 酪酸鈉抑制。另一方面，在預先以CH-296塗佈之平孤中使 病毒粒子保持接觸之場合，沒有見到在對照實驗區、使用 酪酸鈉之上清液中所見到之細胞生育抑制。再者，未見到 基因導入效率降低，而反是上升。此顯示在CH-296上使病 毒接觸後，藉著實施洗淨操作，將不受酪酸鈉之影響，且 能得到高基因導入效率。 接下來，使用DEAE-葡聚糖進行同樣之實驗。 將DEAE-葡聚糖溶解於PBS並使濃度為10 mg/ml後，用 0.22微米之濾器滅菌過濾，以供塗佈平孤。在經表面處理 之細胞培養用6穴平皿（岩城硝子公司製）之每一穴中，各添 加PBS 10體積與上述DEAE-葡聚糖溶液1體積之混合物1.1 ml，並於4 °C培育一夜。從平孤中除去DEAE-葡聚糖溶 液，然後每穴添加2% BSA 2 ml，並處理30分鐘後，將平 孤每穴用2 ml之PBS洗淨3次。再者，以用PBS替代DEAE- 59247-940930.doc -52- 1248445 葡聚糖並進行同樣操作所製成之平孤做為對照組。 使用將反錄病毒載體質體pLEIN導入GP+E86細胞 [Journal of virology ^ 第 62卷，第 1120〜1124 頁（1988)]所得 之重組反錄病毒產生細胞，並按照添加酿酸納之上述方法 調製病毒上清液。將該病毒上清液1體積用含10%CS之 01^^1^20體積稀釋所得之病毒稀釋液（1.6乂106〇;^/1111)添加 至平孤中，每穴各1 ml，並於37°C培育2小時。將平孤每 穴用2 ml之PBS洗淨3次後，加入5xl04個NIH/3T3細胞並於 5%C02存在下，於37°C培養3日。培養終了後，將細胞用 胰蛋白酶處理並回收，用實例4記載之流式細胞光度測定 法進行EGFP表現細胞之解析並調查基因導入效率。其結 果示於表20中。 表20 塗佈 基因導入效率(％) DEAE-葡聚糖 26.7 對照 0.7 基因導入效率用EGFP陽性細胞與全部細胞之比（％)表 0示 如表20所示，DEAE-葡聚糖亦具有反錄病毒結合活性， 因此在本發明之基因導入方法中可以使用。 實例1 5 利用離心法之反錄病毒與機能性物質之結合 將導入含新黴素耐性基因之反錄病毒質體，即DOL載體 [Proc. Natl. Acad· Sci. USA，第 84卷，第 2150〜2154 頁（1987 年）]之CRIP細胞，在含有10%CS、50單位/ml青黴素及50 59247-940930.doc -53- 1248445 gg/ml鏈黴素之DMEM培養基中培養。DOL病毒上清液，藉 著在上述產生細胞生長至半會合之10 cm直徑之平孤中， 將培養基以含有10%CS之5 ml DMEM交換，24小時後將採 取之上清液用0.45微米之濾器（微孔公司製）過濾而調製。 該病毒上清液之力價為8.7 X 105 cfu/ml。 對反錄病毒細胞感染所用之離心管（5 0 ml容積之聚丙稀 製錐形管，法爾孔公司製），依照下示之操作用CH-296包 覆。亦即，將含有40 pg/ml之CH-296之3 ml PBS置入離心 管之底部、將該管於直立狀態在4 °C培育16小時。接下 來，將CH-296溶液用含2% BSA之3.5 ml PBS交換，於室 溫再培育30分鐘後，用5 ml之漢克斯平衡鹽溶液（HBSS， 吉伯可公司製）洗淨離心管。 以下述方法將DOL反錄病毒結合至以CH-296塗佈之離心 管底部。亦即將上述DOL病毒上清液、10倍稀釋液或100 倍稀釋液各5毫升加到離心管中，藉著於2900 X g及25°C下 離心3小時，強制性地使反錄病毒結合至CH-296上。為了 比較，使用含有40 pg/ml CH-296之PBS，在塗佈有該CH-296(8 pg/cm2)之表面未經處理之細胞培養用6穴平皿上， 添加與上述同樣之病毒上清液，於37 °C及靜置狀態培育4 小時以使病毒結合，如此所得者亦被用於以下之操作。 使用實施離心以使反錄病毒強制結合之CH-296塗佈管， 進行對NIH/3T3細胞之基因導入。亦即，在將各段稀釋病 毒液離心而得之上述CH-296塗佈管中，加入1x105個 NIH/3T3細胞，並於37°C培育3小時（以下稱為離心法）。 59247-940930.doc -54- 1248445 又，上述顯微平孤亦在同樣條件下進行培育（以下稱做結 合法）。再者，以在塗佈CH-296之顯微平皿中添加病毒液 與NIH/3T3細胞之混合液並於37°C培育3小時者係做為相當 於先前感染法之對照組，以供比較（以下稱做上清液法）。 培育終了後，對回收細胞之基因導入效率用實例13記載之 方法調查。將其結果示於圖4中。在圖中，橫軸表示病毒 上清液之稀釋率，以及縱軸表示基因導入效率。再者，白 柱表示上清液法，網點柱表示結合法以及黑柱表示離心法 所得之結果。 如圖4所示，使用離心法之場合，不論與以前之上清法 相比，或與感染前先使病毒自然吸著於CH-296上之場合 (結合法）相比，皆可得到較高之基因導入效率。亦即藉著 利用離心力使病毒強制沉降，較多之病毒粒子將結合於容 器底面之CH-296上。尤其是在稀薄病毒液之場合，可見到 利用離心力之效果顯著。 再者，對於在離心下及在靜置狀態進行病毒結合操作後 所回收之上清液，進行力價測定並將結果示於表21中。 表21 Π 試料 病毒力價(cfli/ml) 結合操作後之回收率(％) 病上清液(未使用） 8.7xl05 100 h結合法回收之上清液 7·8χ105 89.4 從離心法回收之上清液 7.6x1 Ο4 8.8 如表2 1所示，相對於在靜置狀態之場合回收之上清液之 力價為操作前之約8至9成（80-90%)，在離心下使病毒強制 結合之場合，上清液之力價為操作前之1成。此顯示藉著 59247-940930.doc -55- 1248445 離心力’較多之病毒粒子結合於⑶^外上。再者，由於離 心後洗淨離心管之PBS所含之病毒量為原液之約2%，該洗 淨操作之有無對於基因導入效率大體無影響，所以可暗示 在利用離心之場合，病毒粒子被強固地保持在CH-296上。 另外，利用離心法之基因導入效率，與在離心下使病毒 感染細胞之方法比較。 比較離心法[其中以實例14記載之GP+]E86細胞所調製之 病毒上清液用NIH-3T3細胞之培養上清液稀釋成ιχ1〇5 cfu/ml，使用如此所得之病毒液5 ml]以及藉離心力使病毒 /儿降於細胞上而感染之方法（離心感染法，參照W〇 95/10619號公報）對NIH/3T3細胞之基因導入效率。亦即， 將上述病毒液添加至塗佈有CH-296i離心管内並於3(Γ(：及 2900 X g離心4小時後，用PBS洗淨離心管，繼而添加細胞 並使其於37 C感染4小時之方法（離心法），以及將細胞添加 至塗佈有CH-296之離心管中並培養2小時後，加入病毒 液，然後於30 C及2900 x g進行4小時之離心而實施感染之 方法（離心感染法）之各個被用於實施基因導入。又，以 CH-296塗佈離心管係依照上述方法進行，再者，於各個之 基因導入操作中使用lxl05個NIH/3T3細胞。將感染後之細 胞直接接種於60 mm之平皿中，培養2日後，用實例4記載 之流式細胞光度測定法調查EGFP基因之導入效率。將其 結果示於圖5中。 如圖5所示，利用離心法之基因導入效率比利用離心感 染法之效率高。此被認為係由於病毒液中存在之感染抑制 物質藉著洗淨操作被除去。 59247-940930.doc -56-

Claims (1)

1248445 十、申請專利範圍： 1 · 一種藉反錄病毒將基因導入標的細胞之方法，其特徵為 包含下列步驟： (1) 將含有反錄病毒之溶液與被固定於支持體上且具反 錄病毒結合活性之機能性物質進行接觸3小時以上之步 驟， (2) 將結合有反錄病毒之支持體洗淨之步驟，以及 (3) 使結合有反錄病毒之支持體與標的細胞接觸及培育 之步驟。 2·根據申請專利範圍第2項之方法，其在步驟（1)中，反錄 病毋與具反錄病毒結合活性之機能性物質接觸之頻率藉 物理方法提高。 3 ·根據申睛專利範圍第2項之方法，其中步驟（丨）藉離心力 使反錄病毒沉降於被固定在支持體上之反錄病毒結合物 質上而貫施。 4·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中具反錄病毒結合 活性之機能性物質為選自纖維黏著素、纖維 母細胞增殖因子、V型膠原、聚離胺酸、DEaE-葡聚 糖、此等之片段以及具有與這些同等之反錄病毒結合活 性之物質者。 5·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中具反錄病毒結合 活性之機能性物質為具標的細胞結合活性者。 6·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中使用固定有具反 錄病毒結合活性之機能性物質以及具標的細胞結合活性 59247-940930.doc 1248445 之其他機能性物質之支持體。 ::申請專利範圍第6項之方法，其中具標的細胞結合 2之機能性物質為選自細胞接著性蛋白質、激素、細 ^素（Cyt〇kinee)、抗體、糖鏈、碳水化合物及代謝物 f。 8 9 ::康申請專利範圍第1項之方法，其中使用細胞培養用 奋益或粒子狀支持體做為支持體。 =申請專利範圍第1項之方法，其中含有反錄病毒之 :次為在译進反錄病毒產生之物質共存下，所得到之反 錄病毒產生細胞之培養上清液。 1〇.:據申請專利範圍第9項之方法，其中含有反錄病毒之 洛液為於路酸鈉共存下所得之培養上清液。 11·=、中請專利範圍第7項之方法，其中該具有標的細胞 所a : !·生之機能性物質為可辨識標的細胞表面之活體物 質的抗體。 12· ^中請專㈣圍第7項之方法，其中該具有標的細胞 了活性之機能性物質為昆布胺酸（laminine)、具有高甘 露糖型糖鏈的見布胺酸片段、來自昆布胺酸之糖鏈：高 甘露糖型糖鏈。 59247-940930.doc