TWI243072B - Substrates, preparation and use - Google Patents

Description

1243072 五、 發 -明說明 ( 1 ) 本 發 明 係 關 於反應基質之改良，其可用於形成具 有 探針 結 合 之 機 能 性 基質以用於多重反應系統，例 如與目 標 分子 交 互 作 用 0 本 發明之特點關於基質表面化學 改質之 方 法， 用 以 共 價 鍵 結 分子在其上（例如分子探針） ;經由 該 方法 獲 得 及 /或可獲得之基質；使用該基質製備 之多重 反 應系 統 進 -- 步 之 方 法；經由該方法獲得及/或可 獲得多 重 反應 系 統 > 於 分 析 及/或合成時該多重反應系統 之使用 使用 該 多 重 反 應 系 統直接及/或間接合成之產物 ;及/或 白 該多 重 反 應 系 統 之 訊息。 在此 之 多 重 反應系統具體例可爲微陣列（ micro- a r rays ) ( 例如 DNA 微陣列，亦即已知之生物晶片 (b i 〇 c hi ps ) ) ， 探 針 可 爲 DNA序列及/或寡核苷酸，且 所得之 訊 息可 爲 ( 生 物 ) 化 學及/或生物訊息。本發明之 多重反 應 系統 的 其 他 應 用 包括高產量篩檢。 微 陣 列 爲 多 重反應系統之一個實例，其爲 一種有 利 的工 具 ， 可 以 極 少 量之樣本及試劑同時進行成千 的偵測 及分析 實 驗 〇 此 種 大 量同時的技術受到科學家們的 注意， 例 如其 想 要 進 行 大 量 實驗例如用來篩檢目標物及/或分析及/或了 解 複 合 方 法 0 DNA 序 列鑑 定之領域爲此用途之一，直到 DNA生 物 晶片 成 爲 可 取 得 二一L·· 刖 ，根據聚合酶鏈式反應（PCR )的傳 統 技術 僅 能 經 常 偵 測 或硏究一種基因的表現，此項 技術描 述 於“ ΙΛ ^ v e n i e de 1 a PCR: Diversification de Technolog -3- i es e t 1243072 五、發明說明（2) d e s applications, " Le Technoscope cl u B i o f u t u r , l 7 1 p p · 3 - 9 ( 1 9 9 7 )，此項揭示在此倂作參考。相較下，dn A 生物晶片可同時分析多至數十萬個基因。應了解，在此所 使用如“微陣列”、“晶片”及/或“生物晶片” 一詞表 示具有相同或相似構造及/或基本原理的系統或裝置，並 於此替換使用。生物晶片表示用於生物的活性分子之晶片 ，DNA微陣列、DNA生物晶片及DNA晶片皆表示在探針上 以DNA序列或寡核苷酸爲基礎之晶片，在此之多數實例表 示DNA晶片並將字首DNA省略。 進行例如微陣列之多重反應系統的基本原理，係爲選擇 及持久地將各種化學種類（如探針分子）選擇性的形式結 合於一種或多種基質之表面上的能力，此基質在應用上可 使用於被結合之種類，其在堅固地結合至基質的同時可進 一步與其周圍環境反應，這些基質亦可使用於測量及/或 分析（具備適當的要件下）結合至基質（及/或一組基質 )之任何所欲特定的性質之完整的一組種類。 此以使用DNA生物晶片的雜交方法更詳細的說明，在此 方法中，在兩者相互存在下單股DNA片段優先的結合至其 互補的序列，實際的DNA生物晶片包含以多至數十萬的單 股DNA序列（亦稱爲捕獲探針（capture probe))之指 定陣列覆蓋的表面；其可爲寡核苷酸、cDNA或DNA片段， 之後將晶片曝露於未知但已標示DNA序列（亦稱爲目標） 之懸浮液中，已標示之目標將結合至其補獲探針上（如果 1243072 五、發明說明（3) 存在於晶片上）之互補序列，因此在謹慎的淸洗下，將可 僅在目標樣本所發現其互補之捕獲探針的位置上發現標示 ’因爲各捕獲探針（之後稱爲其互補目標）之序列可由其 位置被決定，而獲得目標樣本之基因內容的訊息是可能的 〇 根據上述原理的DNA晶片可被設計成多種不同的用途， 例如當個體暴露於特定基質以決定基因表現變化是可能的 ，這些受到醫藥工業注目的實驗是決定新藥的潛在副作用 。DNA晶片亦可作爲診斷工具，例如決定引起感染之細菌 的正確菌株，因而可將最適當的抗生素給予病患。作爲此 項用途的DNA晶片可比現今所使用之任何測試更快且更準 確地證實。DNA微陣列在遺傳性疾病之領域中亦有幫助， 其中有時僅以單一鹼基對區別基因之複合形式。在最主要 的硏究應用上，微陣列將持續的爲基因篩檢工作及其他生 物學領域所選擇之工具，以進一步的了解控制細胞生命的 過程。 雜交係爲在分子間發生相互作用之唯一形式，因此進行 上千類似實驗的槪念可被應用至其他領域。例如雖然DNA 晶片可提供暴露於確實基質中的細胞發生什麼表現的洞察 力，確實的訊息不能得自硏究基因的表現。例如發生在 mRNA或甚至蛋白質程度的因素是複雜難懂的問題。因此用 以鑑定之蛋白質晶片及蛋白質程度的劑量變化亦立刻引起 關注。 1243072 五、發明說明 ( 4； 使用 非生 物 分 子之其他形式之探針也受關注，例 如 用 於 高產率 篩檢 的 微 陣列可被覆能以各種性質及/或各 種 化 學 及物理 與樣 本交 互作用的選擇性活性化學物質可因 此 被 硏 究。 現今有二 種 不 同方法裝配微陣列，尤其用作DNA 生 物 晶 片，其 兩者 是 不 便的。 用以 製造 DNA 晶片的第一種方法是由Affymetri X 發 展 ，其根 據將 形成 陣列在原位一步一步合成所有分子 ( 例如 依一鹼 基一1 驗 基 合成寡核苷酸），所使用之技術是 藉 由 半 導體製 程工 業 及使用光刻法以選擇性地活化各個位 置 其 根據暴 露於 微 陣 列的下一個鹼基是否有或無結合於 適 當 位 置上。 此技 術 對 於寡核苷酸及/或比約20鹼基對 還 長 的 DNA僅 可使 用 微 小尺寸的探針，在製程的各步驟引 起 的結 合錯誤 使其 難 以 達到可靠的產品。再者，此技術是 難 以 處 理、耗 時、 在 有 規則的實驗室難以複製、昂貴及/ 或 不 能 改變的 〇 此外 ，對 於 微 陣列之非DNA應用，光刻法尤其不 適 合 因爲光 保護 性 基 團通常在一般所使用之化學試劑及/或 探 針（其 包括 單 體 )上需要保護光標示基團，在有機 化 學 製 程上 ，製 備 :保護性建構阻體（p h 〇 t 〇 - p r 〇 t e c t ed b U i 1 d i η g bio c k s)之多種設定將不能實行。 製備 微陣列的第二種方法亦稱爲遞送法（de 1 i v e ry method )， 最 近 受到歡迎。在遞送法中，探針或DNA -6- 片段 1243072 五、發明說明（5) 直接接到基質上，首先將其懸浮於適當的載體介質中，其 以藉由任何適當方法如微滴將其沉積於基質上所欲的位置 。典型小滴之量爲毫微公升（丨X1 9)或微微公升（1X10 ·12 )之量，沉積小低的適當方法包含直接接觸（例如微點散 佈；mi c ro-spot t 1 ng )及/或噴墨印刷。然而，雖然沉積 微滴是便利的，但達到功能性微陣列重要的是製備基質要 保證DNA探針將會在微滴蒸發時間內同時反應完（較佳的 產生共價鍵）。遞送方法更詳細的被描述於E a t ο η Publishing 發行（Natick，ΜΑ，USA) ，Marc Schena 所 著之微陣列生物晶片技術（M i c r o - a r r a y B i o c h i p Technology，2000 )，其內容在此作爲參考。 不論用作製備微陣列的方法爲何，爲了功能適當，重要 的是在微陣列上的探針十分牢固的接在微陣列基質，固定 的探針在不同製程步驟時（例如在使用DNA生物晶片之雜 交、淸洗及/或分析步驟）必須不被釋出。爲了滿足這些 需求，及基質與探針間的共價鍵是較佳的連接模式’探針 牢固連接的微陣列有利於之後進一步的製程步驟（例如 DNA雜交）更容易達到，因此改善了微陣列的敏感性。 針對這些原因，許多嘗試已經完成將探針共價地鍵結至 爲陣列之基質，例如，N，Zammateo等（Analytical Biochemistry, 280, PP. 143-15， 2000)已比較使用玻 璃基質的特別情形之現今技術，被硏究的系統包括磷酸化 DNA連接至胺化玻璃；胺化DNA連接至羧化玻璃；胺化 1243072 五、 發明說明 ( 6) DNA 連 接 至 醛 官能性玻璃。作者判斷將, 胺' 化 DNA 固 定於 醛 改 質 之 表 面 對 於建構DNA微陣列爲最佳 偶 程 序 如在 Μ ^\\\ 偶 合 劑 下 > 藉 由偶合產率及反應比率測 量 0 然 而 醛 官 能 性基質與胺化探針之反應 儘 管 有 效 率 5 但 具 有 需 要 額 外 還 原步驟至形成穩定碳-氮 鍵 的 缺 點 〇 雖 然 醛 基 與 胺 基 間 內 部反應形成使碳針牢固連 接 至 表 面 的 亞 胺 基 ( 包含 ON 雙 •鍵），但此反應在經使用 微 陣 列 實 驗 的許 多 條 件 下 是 可 逆 的，因此亞胺基在進一步 的 步 驟 中 被 7m 原 成 胺 基 ( 包含 較 具阻性的C - N單鍵），將 碳 針 共 價 的 及 較 不 可 逆 的 接 合 至 基質。進一步的問題是典 型 的 醛 官 能 基 在 碳 針 上 對 於延 長 儲存及使用並不充分安定 因 此 醛 官 能 化 基 質 需 要 多 重 步 驟且在需要接連碳針及提 供 阻 性 基 質 之 穩 定 性 及 反 應 性 並 不具理想的平衡。 現存 的 微 陣 列遺留許多問題，其難以 獲 得 具 有 提 昇 功 能 及 /或反應位置密度及/或接連密度之微 陣 列 仍 然 期 盼 微 陣 列 在 每 — 單 位中應具有盡可能多的探 針 1 以 改 善 微 陣 列 之 敏 感 性 〇 在 基質上的反應位置及/或 功 能 性 以 再 生 及 改 造 方 法 獲 得 亦 爲重要。 藉 由 任 何 機 制結合不加以淸洗被相信 爲 — 種 解 決 上 述 問 題 的 方 法 其 可提供在此呈現之官能化 基 質 與 碳 針 具 有 充 分 速 度 的 化 學 反應能力，因此在碳針所 運 用 之 載 體 介 質 具 有 之 乾 燥 時 一、/. 刖 ，在碳針及基質間充分快 速 的 形 成 鍵 ( 較 佳 的 微 共 價 鍵 ) ，此問題正是在乾燥非常 -8- 快 速 的 載 體 介 質 之 1243072 五、 發明說明 ( 微 滴 中 將 探 針 供 應 至 表 面的特殊關鍵所在 5 合 適 的 基 質 β //Uj、 在 使 用 基 質 所 歷 經 之 條 件下以實質上不可 逆 之 方 式 與 探 針 反 應 0 本 發 明 中 選擇 性 的 提 出一個進一步的問 題 爲 提 供 探 針 ( 現今所使 用 之 典 型 DNA 探針）之化學性質 與 其 基 質 間 之 正 確 結 合 > 將 其 兩 者 實 用 化是可能的。本發 明 中 CEB 擇 性 的 再 提 出 其 他 的 問 題 爲 提 供 一種官能化及/或 反 m hlli、 性 基 質 其 在 -- 般 保 存 條 件 預 製 程步驟及/或在上 述 探 針 結 合 之 境 下 可 m 疋存 留 〇 因 此 當在保存及使用時 並 不 容 易 找到 如 此 具 有 在 對 探 針 筒 反 應 性及穩定性間適當 平 衡 之 基 質 因 此 本 發 明 之 另 — 目 的 係 提供具有可使探針 以 共 價 鍵 牢 固 結 合 於 表 面 之 基 質 的 微 陣 列，且其在保存及使 用 在 探 針 之 吸 附 前 後 之 條 件 下 皆 爲 穩定。如果以已知 方 法 製 造 這 Itb 基 質 物 質 則 在 基 質 物 質 有嚴格的限制，其 並 非所有 被 使 用 的 方 法 都 能 配 合所有 的 基質，現今所使用 之 多 數 的 微 陣 列 是 以 玻 璃 基 質 製 雖 然玻璃具很多優良 性 質 但亦 具 有 缺 點 例 如 玻 璃 並 不 容 易製成所欲之形狀 〇 具 有 與 玻 璃 多 方 面 不 同 性 •質 •之 :基質則需要發展，如積彳 體 的 標 示 晶 片 ( i η • t e g Γ a t e d 1 a b _〇 η - S - c h i Ρ )及/或使用： 微 流 體 技 術 〇 聚 合 物 係 爲 了 這 用 途 而 可輕易被製成所需 形狀所 C巳巳 进 擇 之 基 質 例 如 經 由 鑄 造 〇 因 此任意地提供適當 的 方 法 以 使 用 於 非 玻 璃 基 質 而 可 導 致 改 良微陣列亦爲所欲 者 0 所 以 本 發 明 其 他 任 rxizi 的 a 的 提 供 具 有在此所述聚合物 -9- 基 質 此 或 所 有 1243072 五、發明說明（8) 之優點的微陣列。 本發明之另一任意的目的提供之微陣列，其所結合之探 針（隨意的DNA探針）密度（即接合密度）十分高，本發 明之其他任意的目的亦提供具有提高的接合密度之基質， 其以可再生之方法獲得，且可根據使用者所需而輕易的修 正。 官能化及/或反應性基質亦可被用於微流體系統，因此 本發明進一步任意的目的係提供適合於此系統之基質。 因此，解決一些或所有先前微陣列技術所確定之上述問 題係爲本發明最廣泛觀點之目的。 所以根據本發明，其提供一種方法以製備具有與分子探 針之反應基反應之位置的基質’此方法包含施用一種物質 於基質表面之步驟，其物質包含一種或多種如式1之具有 反應性乙烯化未飽和雙鍵：

Sm 2

Ri X3 —(χ2)ήρ4 R/ R3 Λ 式ϊ S c|：i > 若n = 〇，m =丨，χ3爲碳且X 1爲氮’则具之間爲二鍵’且 L不存在； 萨n=l χ3爲碳且X1爲氧或硫’則其之間爲雙鍵 -10- 1243072 五、發明說明（9 ) 且X爲經有機取代基取代之氧或硫或氮； 若，m=l或2, X3爲硫且X1爲氧，則其之間爲雙鍵 ’且X2爲經有機取代基取代之氮；

Ri、L各獨立代表氫、羥基或有機基，r3及r4各獨立代 表氫或有機基，R,、R2並不連接於R4。 且在另一步驟中’分子探針共價地鍵結至具有式I之反 應位置的反應性乙烯化未飽和雙鍵。 根據本發明，在位於基質上之反應位置與分子探針之間 的連結反應具有至少一種下列特徵： (i ) 在所使用之製程條件下，連結反應夠快，因此反 應是充分完成； (i i )在單一步驟中，反應在物種及基質間形成堅固的 連接；及/或 (i i i )在基質之使用的條件下，物種及基質間之連結 實質上式可逆的。 在此所使用之“反應基質”表示具有在其表面除去之式 I自由反應位置的有效濃度。 任意的基質爲適用於多重反應系統，如微陣列。 在此使用之分子探針表示一種如有機分子之探針、一種 生物分子如DNA、RNA、蛋白質、生物素、毒素、除草劑、 農藥、碳水化合物、藥物標的、抗生素、細胞有毒物質' 類固醇、胜肽、核苷酸、胜肽核酸、共結合物、附著素等 。在本發明之具體例中’使用於多重反應系統之最終丨罙針 -11- 1243072 五、發明說明（1〇) 可包含一或多種不同的其他種類，其以連續方法（如鏈狀 )結合至連接於基質反應位置上之第一探針，在此方法中 ，具有任何所欲性質之探針可被使用，即使其並不適合（ 及/或並不能被改質）於直接連結至基質的反應位置上。 載體可任意地爲一種流體，例如分子探針可分散於其中 之液體。 較佳的液體及/或種類是以滴定方式供應，較佳的藉由 直接的方式，如具有例如小於一毫微公升之平均小滴體積 的微點散佈及/或噴墨印刷（例如熱及/或壓力噴墨印刷， 例如壓力）。 連結反應可任意地發生於充分快速之方法中，其反應在 載體液體蒸發前充分的完成（例如載體液體亦小滴方式供 應）。 在此使用之“堅固地結合”及/或“堅固地結合”一詞 表示在將被使用之微陣列及/或基質的條件（及其他試劑 )下，對移除具有充分之抗性。較佳地，其表示分子探針 以共價鍵連結至反應位置；更佳地，對於探針連結，以每 一反應位置平均至少一共價鏈連結至探針。更佳地，所形 成之鏈在微陣列之使用條件下實質上是可逆地，及/或經 由實質上可逆的反應而形成。共價鍵較佳爲碳-碳鍵及/或 碳-氮鍵，且更佳地爲飽和鍵，如C - N單鍵。 反應位置可原本位於基質本身表面，其中無預處理之情 況需要本發明方法中所使用之基質。或者，同樣好地，可 -12- 1243072 五、發明說明（11) 以含有反應位置之其他物質的方式加成反應位置’並添加 於基質上，如塗層。使用具有反應位置之物質的優點爲其 對於下列支持基質之選擇可予較寬廣的變化。 因此，方法較佳地進一步包含供應及固定物質於基質之 步驟，該物質包含反應位置。更佳地’物質爲一種塗層組 成物及/或膠體。較佳的物質爲可聚合的’且在基質原位 上聚合物質之步驟以在其上形成塗層。較佳的爲該塗層包 含之反應位置經由聚合作用製程而殘留’最佳的爲對於充 分的使用如微陣列之多重反應系統’在足夠的濃度中以牢 固的連結分子探針。 本發明亦包含這些適合在本發明方法中處理之基質’這 些基質包含具有原本即含反應位置在其上者’及/或包含 含反應位置之物質在其上者。 亦可了解的爲在此使用之基質表示任何適合於支持物’ 及可包含任何合適之物質，其如在此所述能夠支持結合於 其上之種類，及可爲任何適當之形狀，例如平坦的、粗糙 的及/或彎曲的。這些支持物可爲如膜、微孔、離心管、 薄膜、載玻片。 本發明之基質可爲二度空間，如十分平坦的同支持薄片 之表面。然而，其他合適的非平面基質亦可被使用，如包 含2 - D外表面及/或其部分在其上之任何適當物質Z物品 〇 基質亦可爲三度空間，其表面必須考慮到任何暴露出之 -13- 1243072 五、發明說明（12) 表面，無論是物體的外在及/或內在空間及/或部分，例如 多孔性物質之物體及/或其上之多孔性塗層（如燒結玻璃 )。多孔性應爲物體可輕易被在此所述之適當的載體組成 物浸漬，以官能化其所暴露出之表面（包括在空間及/或 縫隙者）。其他可使用之3 - D基質包含在物質形式上爲高 開放及/或高表面積之物質（以s e之任何基質及/或其上 之塗層），例如如水凝膠及/或氣凝膠之具有氣體作爲分 散項之分散作用。關於3 - D基質，其較佳以外在面積單元 取代，接合密度應該以每單位體積或每單位表面積計算（ 如以任何適當技術計算，如脫附作用）。 在此所述之所欲的類似物可以許多方法達成，在此所使 用的多重反應系統一詞廣泛的表示任何系統，其可提供一 連串多可同時處理之反應位置或例如可被使用以同時實行 大量的一般化學相似反應（如大量的平行系統）。因此廣 泛而言，多重反應系統包含至少兩個不同形式的下述系統 。依據在此所使用者，應了解在本發明最寬廣的觀點中， “微陣列”一詞可被任何替用之“多重反應系統”所取代 。廣泛而言，一些相同製備技術及化學作用（如在此所述 者，以作爲本發明微陣列之參考）可以熟習此項技術者所 知之任何必要修正而被用於本發明之任何多重反應性統中 〇 本發明多重反應系統之第一形式包含關於單一設計部分 之官能化物質，例如以微陣列爲實例，其包含大量之分離 -14- 1243072 五、發明說明（13) 但共接合的及/或鄰接的位置在其上（其可爲多功能的及/ _不均相官能化的及/或形式的）。訊息可由其在例如陣 列之模式中的位置導引出大約之特性。此形式之系統的一 個特殊實例爲平坦薄片（如玻璃或聚合物載玻片），其包 含在其表面上相異位置之柵格具有探針以預定之模式固定 在其上，之後目標物種可被接觸到整個柵格。 本發明之多重反應系統亦可包含第二形式，其中系統包 含及/或爲由一連串多數（較佳的爲小或爲小尺寸的）官 能話機質所形成（視情況地爲非平坦表面官能化種類）， 由於其反應位置及/或探針及或特定組合物及/或混合物之 性質，其各可不同地反應至周圍。例如儘管各（或各組） 基質不相同，各基質可僅包含一種位置之形式及固定於其 上之探針（均相反應）。訊息可由統計學分析及/或分離 具有選擇特性（如具有確定特性之種類的數目及/或分佈 可被測量，及/或確定者可被收集）的種類導出。這些基 質混合物可以元位製備一起形成，及/或可包含大多數個 別地製備基質，其在使用前以所欲之比例連續的混合在一 起。 因此，多重反應系統之益處在於其包含多重成分，其特 異的作用於各自的環境，因此能夠將多重實驗充分同時地 (並行地）實行。如上所述，其可經由二種形式之系統達 成，可以在限定位置上具有不同性質的微陣列，及/或以 在其上相同官能化但各具有不同性質之官能化種類之總數 1243072 五、發明說明（14) 加以例示。 微陣列可由含有及/或應用於基質表面之材料（如塗層 或凝膠），該材料包含反應位置。含有化學基之有機探針 與該反應位置反應，之後經由適當的反應可與該材料可牢 固地接合（較佳地共價接合），較佳地，材料於基質上之 原位被聚合至其所連接者（或其所形成者），在聚合作用 充分的反應位置之後仍需要牢固地接合有機探針。材料亦 可能包含含有該反應位置之分子。材料亦可接合至基質上 及/或可形成基質表面的一部份（即基質原本就包含反應 位置，而不需進一步地塗布）。 亦可能具有反應位置於能與多官能（較佳地爲二官能的 )接合種類反應之基質上，以形成其他反應位置於相同位 置。其可相同或相異於前者。例如，基質上一羥基官能位 置可與（甲基）丙烯酸胺甲酸酯上的異 酸鹽基團反應， 以獲得在其上具有自由（甲基）丙烯酸部分的新反應位置 ，經由連接（甲基）丙烯酸胺甲酸酯而連接於基質表面。 以此方法官能化之基質亦包含於本發明，且亦如此所述而 使用。 有益地，基質首先以含一活性未飽和部分之可聚合組成 物塗布，塗層於第二步驟被聚合，在此方法中，活性未飽 和部分仍存留於塗層上。在第三步驟中，產生塗布之基質 ，以便與含有以活性乙烯化雙鍵反應之基團的有機探針在 加成反應中反應。 1 1243072 五、發明說明（15) 本發明另一個觀點爲提供一種多重反應系統，其包含一 或多種如所此述具有分子探針置於其上之官能化基質。 本發明另一觀點爲提供使用多重反應系統之方法，其包 含供應如此所述之本發明一或多種官能化基質、目標分子 、視情況的分散於一或多種載體介質中的步驟。 目標可被用以提供訊息爲關於目標及/或介質來源、及/ 或多重反應系統的環境、及/或已呈現者。 較佳地，多重反應系統包含單一基質（如微陣列），活 性未飽和部分及/或其補充物以預先選擇模式（如2 - D栅 格）而被置於其上。 以此所述而獲得及/或可獲得之多重反應系統（如微陣 列）可備用以決定訊息（如基質、濃度及/或任何其他有 用之化學、生化及/或生物訊息），其係關於有機分子互 補地牢固地連接至在此所述之基質。微陣列亦可使用於微 陣列所呈現的液體中較佳地結合至一或多個經選擇的種類 ，此有益於例如所欲之去活化或目標生物的活性種類（如 若探針包含生物活性抗體）。 本發明其他非限制的具體例包含以下任何及/或所有使 用領域之基質的使用及/或本發明之多重反應系統，包含 任何其可能組合‘· 本發明之基質在應用上之用途如cDNA及寡核苷酸晶片 、生化免疫分析、蛋白動力學、基因表現、藥物標的確認 、藥力學、藥劑/毒物活性預測、治療標地之發現及改善 -17- 1243072 五、發明說明（16) 藥物治療、生物樣本分析、蛋白質-蛋白質相互作用、對 於蛋白質藥物標的之化學實體篩選。 其他的應用爲偵測及/或分析（對於現存及/或濃縮的） :雜質、污染物、反應副產物、微小植物、微小動物、病 原及/或非所欲之成分。例如在糧食中其可被期待偵測物 質，例如在如乳或肉類中的遺傳的改質物質、抗生素及/ 或賀爾蒙。因此本發明可用以提供改善品質管制及/或產 物中成分的標示。 另外其他的應用爲有助於偵測及/或測試生物、藥學及/ 或獸醫在動物及/或人類之疾病及/或障礙的狀況；及/或 提供診斷工具、治療、療法及/或其預防方法；及/或任何 其他藥學及/或獸醫學之用途，如DNA-RNA及/或RNA胜肽 相互作用之硏究。 本發明其他觀點係可提供一種製備基質的方法，其中基 質可以含一或多種活性未飽和部分之可聚合組成物塗布； 之後塗層已活性未飽和部份可存留於塗層上之方法加以聚 合；在進一步的步驟中，因此在加成反應中經塗布的基質 與含有可與活性未飽和部份反應之基團的有機探針反應。 本發明另一個觀點係可提供製備微陣列的方法，其中塗 層組成物可被置於基質表面；之後，在聚合作用之後可在 原位聚合以形成一含活性未飽和部份之塗層於其上；其後 ’含可與活性未飽和部份反應之化學基的有機探針可以加 成反應的方式共價地結合。 -18- 1243072 五、發明說明（17) 本發明另一個觀點係可提供一種_質，其包含經由活性 未_和加成反應而牢固的接合於其上之有機探針，有機探 針以一種模式及/或微陣列被排列及/或設置於其上。 在此說明書中，所使用之“活性未飽和部份”一詞表示 含有至少一位飽和之碳-碳雙鏈在化學上鄰近於至少一個 活性部份的種類，此種類以式I表示。活性部分較佳地包 含可活化乙烯化未飽和雙鍵之任何基團，其經由適當，親電 子基團而加成於其上。活性部份以包含氧、硫、（視情況 的經有機基取代）胺基、硫羰基/或羰基（後兩個基團視 情況的經硫、氧或（視情況的經有機基取代）胺基）較爲 合適，其亦包含磺醯胺、楓及亞楓基，更合適的“活性未 飽和部份”包括一個“未飽和醋邰分，其表示有機種類 包含一或多個“亞烴基（硫基）羰基（硫基）氧”及/或 一或多個“亞烴基（硫基）-羰基（有機基）胺基”基團 及/或類似物，衍生部分如含有（甲基）丙烯酸酯官能性 及/或其衍生物之部分。“未飽和酯部分”可視情況的包 含經取代之一般α，Θ -未飽和酸類、酯類及/或其衍生物 ，包括硫衍生物及其類似物。 活性未飽和部份以式I表示’

x3——(x\r4 -19- 1243072 五、發明說明（18) 其中， 若η二0，m=l，X3爲碳且χΐ爲氮，則其之間爲三鍵，且 R 4不存在； 若11 = 1，m = i，X3爲碳且χι爲氧或硫，則其之間爲雙 鍵，且X2爲經有機取代基取代之氧或硫或氮； 义 若n=l，m = l或2，X3爲硫且χι爲氧，則其之間爲雙 鍵，且X2爲經有機取代基取代之氮； 、I各獨II代表氫、羥基或有機基，h及&各獨 立代表氫或有機基，R!、R2並不連接於。

了解的爲式I可代表個別的化學種類（例如化合物、離 子、自由基、寡聚物及/或聚合物）及/或其任何部分。因 此式I亦可代表多價基（較佳地爲二價）。故Ri、R2、L 、R4及Rs在此所給予之選擇亦可包含組合的二或多價基較 爲適當。 式Ϊ之更佳部分（包括異購物及其混何物）係η爲1 ; X1 爲 〇; X2爲 〇、S 或 NR5; X3 爲碳。 L ' R2 ' L及R4係各選自Η、視情況的取代基及視情況 的經取代之C!. 1()烴基，且其r5係選自η及視情況的經取 代之c !.! 〇烴基。 較^的11爲丨，X1爲0 ; X2爲0或S，X3爲碳，且R,、R 2 、L及L係各自爲η、羥基及/或視情況的經取代之C!_6 烴基’ L亦可代表視情況的經取代之Cl 6烴基鹵化矽烷。 例如η爲丨’ 及χ2皆爲〇 ;且Ri、R2、r3及係各自 -20- 1243072 五、發明說明（19) 爲Η、0H及/或C!.4烷基’或r4爲Cj 4烷基氯化矽烷。 關於式I之一部分’ n爲1，X!及X2皆爲〇且X3爲碳， 因此當R!及R2之一爲Η且R3亦爲Η時，式I代表丙烯酸 酯一部分，其包括丙烯酸酯（當Rj及r2皆爲Η時）及其 衍主初（每R!及R 2爲皆不爲Η時）。相似地，當R j及R 2 之一爲Η且R3爲CH3時，式I代表甲基丙烯酸酯一部分， 其包括甲基丙烯酸酯（當R!及R2皆爲Η時）及其衍生物 (當R,及R2爲皆不爲Η時），式I之丙烯酸酯及/或甲基 丙烯酸酯部份尤其適宜。 式I之一部份合適地爲η爲1 ; X1及X2皆爲〇 ; X3爲碳 ;1^及1^各自爲Η、甲基或0Η，且1?3爲1^或CH3。 式I之一部份更合適地爲η爲1; X1及X2皆爲0; X3爲 碳；R!爲OH，R2爲CH3，且R3爲Η，及/或其互變異購物 (例如乙醯乙醯氧基官能官能性種類）。 最合適的未飽和酯部份係選自-0C0-CH = CH2 ; -0C0C(CH3) = CH2 ;乙醯乙醯氧基、-0C0CH = C(CH3) (OH)及其所有適當之 互變異購物。應了解以式I代表的任何適當部份可被用於 本發明方面，例如其他反應部分。 在此所使用之“視情況的取代基”或“視情況的經取代 的”一詞（除非例出示出其他取代基於其後）表示一或多 種下述基團（或經這些基取代）：羧基、磺酸基、甲醯基 、羥基、胺基、亞胺基、氮基、锍基、氰基、硝基、甲基 、甲氧基及/或其組合。這些選擇的基團在上述基團（例 -21 - 1243072 五、發明說明（2〇) 如胺基及磺醯基如果直接相互連接則代表胺磺醯基）的大 部分相同部分中，包括所有化學上可能的結合，較佳地選 擇性取代基包含羧基、磺酸基、羥基、胺基、锍基、氰基 甲基及/或甲氧基。 在此所使用之“有機取代基”或“有機基”一詞表示任 何單價或多價部份（視情況的連接至一或多個其他之部份 )，其包含一或多個碳原子及視情況的一或多個其他雜原 子。有機基可包含有機基雜基（亦爲所知之有機元素基） ，其包含含碳單價基，因此其爲有機的但在除了碳外之原 子上具有其自由價（如有機硫基）。有機基可選擇地或加 成地包含含任何有機取代基、官能形式不拘、在碳原子上 具有一自由價之有機基。有機基亦可包含雜環基，其包含 經由在雜環化合物之任何環原子上移除一個氫原子而形成 之單價基：（環狀化合物具有至少二個相異元素之環狀成 員）。在此之有機基上非碳原子較佳地可被選自：氫、磷 、氮、氧、矽及/或硫，更佳地選自氫、氮、氧、磷及/或 石夕。 最佳的有機基包含一或多個下列含碳部分：烷基、烷氧 基、烷醯基、甲醯基及/或其組合；視情況的組合一或多 個下列含雜原子部分：氧基、硫基、亞磺醯基、磺醯基、 胺基、亞胺基、硝基及/或其組合，有機基包括在上述含 碳及/或雜原子部分（例如烷基及羰基如果直接相互連接 則代表烷羰基）的大部分相同部分中，包括所有化學上可 -22- 1243072 五、發明說明（21) 能的結合。在此所使用之“烴基”一詞係有機基之次集合 ’表示任何由一或多個氫原子及一或多個碳原子組成之單 價或多價部分（視情況的接合一或多個其他部分），可包 括飽和、未飽和及/或芳族部分。烴基可包含一或多個下 列基團，烴基包含經由自烴基上移除一個氫原子所形成之 單價基。伸烴基包含經由自烴基上移除二個氫原子所形成 之二價基，其自由價並不接合於雙鍵上。烴烯基包含經由 自烴基之同一碳上移除二個氫原子所形成之二價基（以“ r2c=”表示），其自由價並接合於雙鍵上。烴炔基包含經 由自烴基之同一碳上移除三個氫原子所形成之三價基（以 “ RC Ξ ”表示），其自由價接合於三鍵上。烴基亦包含飽 和碳-碳單鍵；未飽和雙及/或三碳-碳鍵（如各爲烯基及/ 或炔基）及/或芳族基（芳族烴），且表示可以其他官能 基取代。 在此所使用之“烷基”或其相當者（如“a 1 k”）一詞爲 適當的且除了內容其他方面有明確指示外，可被輕易地經 由包括任何其他在此所述之烴基取代，例如包含雙鍵、三 鍵、芳族部分（如各爲烯基、炔基及/或芳族烴）及/或其 組合（如芳烷基），且任何多價烴基種類連接二或多個部 分（如二價伸烴基，如伸烷基）。 在此所述之任何殘基或部分（如取代基）除了另有陳述 或內容其他方面有明確指示外可爲多價或單價基（如連接 二個其他部分之二價伸烴基部分）。然而，在此所指之單 -23- 1243072 五、發明說明（22 ) 價或多價基仍可包含選擇性取代基，包含三或多個原子之 基可表示此基之長鏈全部或部分爲線形、分支及/或形成 環狀（包括螺及/或稠合環）。確定原子之總數以明確表 示確定之取代基，如C!_N有機基，其明確地表示有機基不 分包含1至N個碳原子。在此任合式中，若一或多個取代 基並無指出連接部份中任何特定的原子（如沿著鏈及/或 環上特定的位置），則取代基可替換任何Η，及/或可設置 於化學上適當的或有效的部分上任何可獲得的位置。 例示於此任何之有機基較佳地包含1至3 6個碳原子， 更佳地爲1至1 8個。在有機基上之碳原子特別適宜地爲1 至10個，尤其式1至4個。 在此所使用之化學名詞（不同於I UPAC名稱而特別定義 之化合物），其包含括號內所給予之特點，如（烷基）丙 烯酸酯、（甲基）丙烯酸酯及/或（共）聚合物，其表示 部分括號中所指示者爲選擇的，因此例如名詞（甲基）丙 烯酸酯表示甲基丙烯酸酯及丙烯酸酯。 除另有明確指出者之外，在此所使用之複數形式之名詞 由包括單數形式構成，反之亦然。 在此所使用之“包含”一詞應可被了解表示其後面所例 示者並不完全，可包括或不包括其他另外適當的項目，例 如一或多種進一步的特點、成分、要素及或取代基爲合適 的。 “有效的”（例如所言及本發明之方法、用途、產物、 -24- 1243072 五、發明說明（23) 物質、化合物、單體、寡聚物、聚合物先驅物及/或聚合 物）一詞應可被了解表示是在任何一或多種下述用途及/ 或應用中的效用：微陣列之裝置及/或其成分之製備及/或 用途’例如官能化基質（較佳地爲了化學分析及/或合成 之目的），及/或直接及/或間接由其獲得之產物及/或結 果；及/或在此所述其他用途。 此效用可直接的爲具有必要性質的物質以供前述用途， 及/或間接地爲如合成的中間產物之具有用途之物質，及/ 或在製備直接效用之物質中的診斷工具。如在此所使用之 “適當的”一詞表示官能基與製造有效產物一致。在重複 單元上的取代基可被選擇，以改良原料與聚合物及/或樹 脂的互適性，其中其可位前述用途而被公式化及/或結合 。因此選擇取代基之尺寸和長度以充分利用與樹脂之物理 扭結或插入，或其可包含或未包含其他能夠與其他樹脂化 學反應及/或交連的反應實體。 在此所述之一些或所有包含及/或使用之確定的部分、 種類、基團、重複單元、化合物、寡聚物、聚合物、材料 、混何物、組成物及/或配方可以一或多種不同型式存在 ，例如下列非完整之例示中的任一者：立體異構物（例如 鏡像異構物（如E及/或Z形式）、非立體異構物及/或幾 何異構物）；互變異構物（如酮及/或烯醇）、構像異構 物、鹽類、兩性離子、複合物（如螯何物、晶籠化合物、 階間化合物、配位體複合物、有機金屬複合物、非化學劑 -25- 1243072

五、發明說明（24) 量複合物溶劑合物及/或水合物） 同位素取代形式、聚

物）];多形物（如階間形、晶形及/或非晶形）、異相、 固體溶液；其組合物及/或其混合物，本發明包含及/或使 用有效之所有型式。 本發明之一個/彳寸色爲基質帶有活性未飽和部分之塗層以 接合一 DNA及/或生物分子。由實際觀之，其存有很多方 法已引發增加在塗層上的活性不飽和部分之量。根據本發 明’藉由在塗層表面上製造可獲得之功能的製程及方法是 適當的。 現描述在及/或以本發明中適宜使用的二種方法，以獲 得包含自由活性未飽和部分之塗層。 在及/或以本發明中使用之塗層中之一係爲獲自及/或可 獲自包含一或多種聚合物前驅物之組成物者，其前驅物含 有如單獨可聚合基之活性未飽和部分。聚合物前驅物可含 有任何單獨及/或混合之單體、寡聚物及/或預聚物。這些 組成物可以給予含其之足夠數目的聚合物自由（即反應的 )活性未飽和部分以使用作爲官能化塗層之任何適當方法 加以硬化。 於及/或以本發明中使用之一種可用於製備塗層之可替 -26- 1243072 五、發明說明（25) 換方法，其包含具有可與化合物之其他官能基反應的官能 基之聚合物前驅物，其化合物含有活性未飽和部分（例如 (甲基）丙烯酸酯）。例如，含有羥基之聚合物前驅物可 與氯化丙烯醯反應，或含羧基之聚合物前驅物可與（甲基 )丙烯酸縮水甘油酯。含有如單獨化學上可聚合部分之（ 甲基）丙烯酸酯部分的聚合物前驅物，亦可以在聚合作用 後給予含自由（甲基）丙烯酸酯部分的聚合物之方法加以 硬化。 許多不同聚合物在及/或以本發明中適於作爲聚合物前 驅物及/或聚合物塗層，例如下列相同種類中之任一者及/ 或其混合物及/或其組合：（甲基）丙烯酸聚胺甲酸酯、 (甲基）丙烯酸（甲基）丙烯酸酯、（甲基）丙烯酸聚酯 、（甲基）丙烯酸環氧酯、樹枝狀及/或高分枝狀（甲基 )丙烯酸聚酯及/或丙烯酸聚胺甲酸酯、（甲基）丙烯酸 聚矽氧酯及/或（甲基）丙烯酸胺。 可製造適當聚合物之組成物係爲任何已熟知之技術者， 且較佳的屬於已知的輻射可硬化（輻射硬化）技術範圍。 有效之組成物可成現任合適當物理性質及/或形式，例如 以如水及/或有機溶劑作爲連續相之分散液、溶液及/或乳 液：及/或不具任何水或有機溶劑（如聚合物前驅物之混 合物及/或固體溶液）。乳液可含有任何適當之連續相（ 例如油包水（W / 〇 )、水包油（〇 / W )乳液），且視情況地 分散相亦可包含乳液（例如水包油包水（W / 〇 / w )及/或油 -27- 1243072 五、發明說明（26) 包水包油（0 / W / Q )乳液）。 更適當之聚合物及/或組成物含有例示於“表面塗層技 術”第二冊-預聚物即反應稀釋劑—塗層用UV及EB配方之 化學及技術（I n k a n d P a i n t，e d i t e d b y G . w e b s t e r and published by Wiley, 1997) 〇 藉由可用以獲得在及/或以本發明中所使用之聚合物塗 層的任何適當方法可以聚起始合作用，例如這些塗層含有 自由活性未飽和部分。有二種較佳之聚合作用起始方法， 其爲經熱及/或經輻射作用（例如UV或電子束輻射）。適 合於熱聚合作之組成物可含有熱引發劑。聚合作用亦可在 UV輻射下發生，因此光引發劑通常存在於組成物中以促進 聚合作用，亦可使用電子束輻射。 I 存留之未反應自由活、懊来飽和部分（如自由（甲基）丙 烯酸酯）的數量以聚合條件調整，例如溫度、輻射劑量、 引發劑之形式及數量等，例如“極快光聚合反應之動力硏 究“中之敘述（C· Decker, B. Elzaouk，D. Decker， J.M.S.-Pure Appl, Chem., A(33) , 173-1790(1996))° 用於製備本發明基質之其他路徑使用單獨或混合物中含 有任何聚合物前驅物（如單體、寡聚物及/或預聚物）之 塗層組成物，其至少一者含有至少一種可聚加成於其上之 化學反應基。活性未飽和部分亦可存在於這些聚合物前驅 物中之至少一種。或者，含可聚加成於其上之化學反應基 -28- 1243072 五、發明說明（27) 之聚合物前驅物可被反應形成實質上含無（甲基）丙烯酸 酯部分之聚合物前驅物，但仍然含可與其他活性未飽和部 分反應之反應基。 例如聚胺甲酸酯聚合物（如其於溶劑及/或水分散液中 )可以多元醇與聚異氰酸酯反應製得，自由（甲基）丙烯 酸酯部分可因此以（甲基）丙烯酸化醇及/或（甲基）丙 烯酸酯化多元醇被插入聚合物中。例如經由異 酸酯之終 端戴帽形式終止聚合物前驅物（其視情況地可全部或一部 份鏈延長），及/或作爲聚合物前驅物本身之成分（其視 情況地可全部或一部份鏈延長）。 在此所描述相同及/或相似的方法可被用於製備包含大 多數（甲基）丙烯酸酯部分的樹枝狀及/或高度分支的羥 基化合物（例如醇及/或多元醇），此種羥基化合物之倂 入聚胺甲酸酯可製造具有高濃度自由（甲基）丙烯酸酯部 分的塗層。 在本發明之具體例中，如果R4表示鹵化矽，則式I之 未飽和活性部分可直接被接至支架，未達此目的，必須選 擇具有羥基之支架，例如玻璃或矽晶圓。鹵化矽基與羥基 在支架表面反應，直接接合活性未飽和部分至支架上。 如此所述本發明任何適當的基質可被用以製作關於本發 明之微陣列，較佳之基質包含玻璃或塑膠，例如聚碳酸酯 (PC )、聚酯（PE )、聚烯烴（如聚丙烯（PP ))、聚對 酞酸乙烯酯（PET )、奈倫、聚苯乙烯及/或活性纖維素。 -29- 1243072 五、發明說明（28) 視情況地，爲了促進附著此基質可被預處理（例如以高電 壓環形放電處理）’然後再以如此所述處理。 較佳的分子探針包括一或多個不同之羥基及/或胺基； 更佳的爲胺基。 並不希望以任何機制接合，相信探針包含可共價鍵結合 至活性未飽和部分之化學基’較佳藉由加成反應。其活性 未飽和部分包含未飽和酯類，適當的加成反應可包含已廣 爲人知的麥克加成反應。較佳地當在微陣列製造過程中， 於室溫中進行此反應。更佳地，反應發生於例如含有設置 於基直上之種類的胺基與未飽和酯類部分（如包含（甲基 )丙烯酸酯部分者）之未飽和（烴基二烯）基團之間，其 可獲自於官能化基質之表面。 較佳的有機探針爲生物分子，更佳的爲DNA，最佳的爲 含胺基者，胺基爲一搬在生物分子上所發現之廣泛的反應 基。在本發明方法之一實例中，胺基終端DNA可精適當方 法（如微點散佈及/或噴墨印刷）被至於基質之上，以在 預先決定的模式中（如微陣列）與安置在基質上的未飽和 (甲基）丙烯酸酯部分反應。 本發明主要的優點包括下列任一及/或全部： 任何基質可經適當配方的塗層處理，以用作DNA生物晶 片及/或類似的應用。 高的丙烯酸酯密度可能達到每單位面積產生相當高密度 的探針。 -30- 1243072 五、發明說明（29) 丙儲酸邰分之反應性提供在基質表面之探針的快速固定 之競爭要素與官能化基質之良好保存特性之間的良好平衡 〇 經由使用低成本之之前並不適合微陣列使用的塗層及/ 或基質（如聚合物），可減低本發明微陣列之製造成本。 與酸官能化基質相比較（被相信是之前可獲得最好的官 能化基質），使用通常的輸出技術減了所需製造適當官能 化基質的製程步驟之數量，當具有比較不好之反應性時， 本發明之丙烯酸酯官能化基質去除還原步驟。 在此所使用之方法適合於任何材料，減少了先前所設計 之微陣列的限制及促進積體的標示晶片系統。本發明之官 能化基質具有良好的化學及/或機械抗性，尤其是當使用 輻射可硬化材料時。特別是當使用輻射可硬化材料於金屬 表面（例如基於CD - ROM之銀質表面）時，塗層給予金屬 十分良好的抗蝕性。 本發明其他方面及/或較佳之特點在此沒有描述者，在 申請專利範圍中舉出。 . 本發明可以下列圖示說明，其中： 弟1圖之曲線圖爲威不本發明基質對於自由丙煉酸酯官 能性的DNA連接效能；及 第2圖爲以在此所述之各固定及雜交實驗來測試本發明 之微陣列。 本發明現將以下列非限定的實例及測試來說明，其僅爲 -31 - 1243072 五、發明說明（3〇 ) 說明。實例包含二種形式之配方（熱硬化或輻射硬化）， 其說明及評估用於微陣列（如生物晶片）中確定的丙烯酸 化基質。在這些實例中，製備基質之程序個別的描述使用 的結果以評估基質。在此實例中：NC0値或濃度（於此亦 以 Leo表示）可以任何適當的標準方法（如在ASTM D2 572 - 87中所述）測量；羥基値或濃度（於此亦以1。„表 示）可以任何適當的標準方法（如在E222 - 7 3中所述）測 量；酸値或濃度（於此亦以IH +表示）可以任何適當的標 準方法（如在ASTM D974 - 64中所述）測量；及/或自由丙 烯酸酯値或濃度（於此亦以IACR表示）可以熟悉此項技術 者所知之任何適當的標準方法測量。 基質之製備 塗層用聚合物前驅物之合成 實例1 羥基官能化丙烯酸胺甲酸酯之合成 將數量444 g之經預熱的5-異氰氧基-1 -異氰氧基甲基-1 , 3，3 -三甲基環己烷（亦爲已知之I PD I，商業上可獲自 於D e g u s s a - H u e 1 s，德國）導入配有攪拌器、溫度計、水 冷凝管及滴液漏斗之2公升4頸圓底燒瓶，混合物於4 5 °C 加熱’之後添加0 . 3 7 g之二丁基月桂酸錫（亦爲已知之 DBTL，商業上可獲自於Akcros )做爲觸媒，由滴液漏斗緩 慢添加232 g羥乙基丙烯酸酯及〇 . 9 2 5 g氫醌一甲醚，同 時反應混合物之溫度保持在最高爲6 5 °C，混合物保持在此 -32- 1243072 五、發明說明（31) 溫度1小時直到IN e 〇達2 . 9 6 m e q / g。然後添加2 5 0 g二二 羥甲基丙烷（ 89 8 mg KOH/g之IQH)，同時反應進一步於 65°C加熱直到INCC)低於0.05 meq/g，將寡聚物冷卻至40 °C，且以927 g乙酸丁酯稀釋而獲得50%產物丙烯酸胺甲 酸酯之有機溶液，其在251具有Π5 mPas之黏度；60 mg K〇H/g之Uh及1.07 8 meq/g之自由丙烯酸酯（固體產物 之IQH爲121 mg KOH/g )。此丙烯酸胺甲酸酯之分散液直 接的使用於下述配方中。 實例2 多元醇之合成 1，6 己二醇（1144.2 g)及己二酸（1135.6 g)(商業 上皆可獲自於BASF ) —起與DBTL觸媒（〇 · 〇2 g )於三公 升反應槽中混合，其配有攪拌器、包裝管住、冷凝器、溫 度計及惰性氣體入口。反應槽以惰性氣體充滿’且將反應 物加熱至溫度1 95至20CTC，同時移除由酯化作用所產生 之水，連續進行反應5小時直至IH +爲5 mg KOH/g且I〇H 爲121 mg KOH/g，而獲得具有100 0之Μη及最終IQH爲 112 mg KOH/g之多元醇產物。此多元醇直接的使用於下述 配方中。 基質之配方及塗層 基質 本發明之官能化基質由商業化CD (未塗覆之裸聚碳酸醋 CD，可獲自I SP，比利時）製備，其以棒狀塗層器用在此 -33- 1243072 五、發明說明（32) 所述之一種配方塗覆一層表層，其將厚度1 〇 /i m之未硬 化配方的薄膜置於基質上。其他亦可使用之適當基質爲： 商用塗覆聚碳酸酯CD (商業上可獲自丨SP，比利時）及/ 或Α4尺寸之1 mm厚的聚碳酸酯薄片（商業上可獲自通用 電子，美國）。本發明之官能化基質隨後根據廣爲人知的 標準方法及儀式測試，以說明本發明微陣列之性質（如丙 烯酸酯濃度在接合能力之影響，參考第1圖）。 塗層配方 測試三種型態之配方，兩種根據聚合骨幹（輻射硬化及 熱硬化）與一種矽烷化學。 輻射硬化配方 本發明UV硬化配方（實例3及4 )敘述於下列表1中， 硬化塗層之自由丙烯酸含量來自於UV輻射之後所存在之 未反應基，下表1中配方以20公尺/分鐘之速度經過 8 0W /公分之中及壓力水銀燈4次。表1中除光抑制劑外的 所有成分皆可由UBC化學獲得，若在括弧內則爲商標名。 -34- 1243072 五、發明說明（33) 表1 成分 重: 1; % 實例3 實例4 丙烯酸胺甲酸酯（Ebecryl 284 ) 40 25 丙烯酸環氧酯（Ebecryl 284) 40 25 丙烯酸己二酯 15 45 二苯基酮 2.5 2.5 光抑制劑（Darocure 1173, CIBA) 2.5 2.5 熱硬化配方 本發明富於變化之熱硬化配方可以此處方式調配自由丙 烯酸酯濃度，其在最終基質中可經由增加或減少配方中羥 官能化丙烯酸胺甲酸酯（如實例1 )支濃度來調整。例如 實例1之兩個丙烯酸酯基團於丙烯酸胺甲酸酯上，其並不 參與熱引起之聚合作用（交連），且在交連之後仍可殘留 。下表2之配方（實例5至8 )係在6(TC熱硬化超過3小 時。表2中之配方包含9重量％之脂族聚異氰酸酯，其可 獲自拜耳公司且商標名爲D e s m 〇 d u r N 3 3 0 0 ; ( 9 1 - X ) %實 例2之多元醇及χ%實例1之丙烯酸胺甲酸酯；x之値於表 2中所示。 -35- 1243072 五、發明說明（w) 表2 實例 X 自由丙j#酸酯meq/g 5 91 0.98 6 45 0.49 7 23 0.24 8 9 0.10 矽烷系系統 具有活性未飽和部分之表面的活化作用可經矽烷化作用 進行。首先以將玻璃載玻片於室溫中置於甲醇：鹽酸之比 爲1 : 1之溶液30分鐘加以淸潔，然後以蒸餾水淸洗載玻 片直到看不到暗線爲止。淸潔之後，活化載玻片，此經由 將載玻片浸入1(Τ3莫耳（3-丙烯氧基丙基）三氯矽烷之無 水甲苯溶液中1小時加以達成，然後在強烈的攪動下經浸 於新鮮甲苯中而淸潔樣本以除去多餘的物理吸附分子，之 後於烘箱中以120t乾燥10分鐘。 生物晶片之製備 DNA捕獲探針之製備 測試中在此所述用於製備核苷酸（做爲捕獲探針）之模 板DNA序列係爲巨細胞病毒（Cytomegalovirus)者，其 根據分析生物化學（Z a m m a t e 〇 e t a 1 . I η A n a 1 y t i c Biochem 253，pp 1 80 - 1 89 )所述之方法及方式合成。所 使用之MIE4啓動子爲一個包含一胺基於5’端的長2 57個 鹼基對擴大區，DNA序列以PCR —般方法增幅，然後藉由 -36- 1243072 五、發明說明（35) 在高純度PCR產物純化套組（商品化可獲自Mannheim， 德國）中的色層分析法，由未合倂之核苷酸及啓動子中分 離。DNA濃度以其在260 nm之吸光度測量，因此所獲得之 胺化DNA捕獲探針添加入緩衝溶液，亦在其未質子化階段 (即NH2 )時在探針上保持胺基牢固之性質。含DNA探針 之緩衝溶液（在此爲印染緩衝液）被置入微陣列，如下所 述。在此所使用之各相異印染緩衝液中，DNA探針之濃度 爲 100 nM 0 經標記目標之DNA之製備 巨式細胞病毒DNA序列（如前述參考所描述製備）亦做 爲目標DNA製造之模板，目標DNA具有43 7個鹼基對長， 且在DNA增幅時使用生物素-16-Dutp標示在DNA上使標示 莫耳率爲1 : 1，DNA濃度以其在260 nm之吸光度測量。 製備生物晶片 將印染緩衝液之DNA捕獲探針以微陣列機（商業上可獲 自WOW，比利時）分配至本發明之官能化樹脂基質上。將 此印染緩衝液之小滴以適當之方法（例如噴墨列印）分配 在晶片上，以產生直徑約400 // m之小點，其相互間之距 離約爲800 // m，生物晶片（即帶有DNA捕獲探針之基質） 在23 t培養1小時，且連續以0 . 2重量％硫酸十二酯鈉（ 在此亦引用爲SDS，商業上可獲自默克（Merck))淸洗一 次，之後以水淸洗二次，然後再將生物晶片於廢水中培養 3分鐘以確定核苷酸之單鍵牢固的連接於表面。 -37- 1243072 五、發明說明（36) 雜交 製備的雜交溶液爲含濃度1 0 nM經標記目標之DNA (如 上述製備）之含4% SDS、pH 7、0.35 Μ磷酸鹽緩衝溶液 (該緩衝溶液商業上可獲自ΑΑΤ，比利時），將雜交溶液 (70 μ 1 )添加至雜交室（商業上可獲自 MJ Research’ 美國），將架設於微陣列之上並以覆蓋片封蓋，以使溶液 被帶至與生物晶片接觸，然後將其加熱至50°C、2小時， 之後生物晶片以淸洗溶液（含0.1% Tween之10 mM順丁 烯二酸鹽緩衝液，pH 7 . 5 )淸洗4次，然後與抗生蛋白鏈 菌素-金共軛物（商業上可獲自Signia，MO，美國）培養 45分鐘，然後生物晶片以相同淸洗溶液再淸洗5次，最後 與另一個培養溶液（商業上可獲自ATT，比利時，商標名 稱爲銀藍溶液（S i 1 v e r B 1 u e S ο 1 u t i ο η ))培養1 〇分鐘 ο 結果 本發明一上述製備之微陣列的評定根據已知標準方法及 設計進行，如下顯示之第1及2圖所述。 第1圖 測試本發明由實例5至8所製之官能化基質以說明丙_ 酸濃度對於接合能力之影響。這些結果呈現於第丨圖，Μ 說明自由丙烯酸酯含量如何影響DNA接合效率。 第1圖之橫座標表示各以實例5至8所製之樹脂測試塗 層配方中自由丙烯酸酯官能度之濃度單位，meq/g。 -38- 1243072 五、發明說明（37) 第1圖之縱座標表示相對於DNA表面濃度測試之相關接 合效率，其經由比較在每一件測量之單一強度，以測量具 有較高自由丙烯酸酯含量（0 . 98 m e q / g )的高濃縮DNA分 散液（200 Nm，實例8 )，因此縱座標値被標準化且爲無 因次的。 第1圖中的3個小圖符合以不同濃度NH2-DNA探針表現 之測試：2 5 nM (底線，以▲表示之資料）、5 0 nM (中線 ’以◊表示之資料）及200 nM (頂線，以表示之資料） 〇 這些結果淸楚的顯示本發明之基質增加自由丙烯酸濃度 之效果爲引起增加相對應的基質接合效用。 弟2圖 一連串實驗進行於A4尺寸的1 mni厚聚碳酸酯薄片（如 商業上可獲自通用電子’美國），其以實例4之配方塗覆 其上並置於各種不同印染緩衝液中，第二圖顯示由比色微 陣列讀取器（商業上可獲自W0W，比利時）所獲致之圖片 ’其依照在此所述改變探針組成物用之印染緩衝液的組成 及pH値，各實驗根據在此所述之標準程序進行，第2圖 中之結果根據各實驗做不同的解釋。 在第2圖中，數字所代表之舟狀墨點係指不同的印染緩 衝液： ‘‘ Γ表示pH 8之0. 1 μ硼酸緩衝液； “2”表示ΡΗ 8之含i M NaC1及1% SDS的〇」Μ硼酸鹽 -39- 1243072 五、發明說明（38) 緩衝液； “ 3 ”表示pH 9之含0 . 1 % SDS的0 . 1 Μ碳酸鹽緩衝液； “ 4”表示pH 8之含0 . 1% SDS的0 . 1 Μ硼酸鹽緩衝液；及 “ 5”表示pH 7之含0 . 1 % SDS的0 . 1 Μ磷酸鹽緩衝液。 第2圖中，以字母表示之欄係指本發明之功能，其： “ A” （ χ2 )表示固定控制組；“ B” （ χ2 )表示負雜交 控制組；“ C” （ χ2 )表示正雜交控制組。下列更詳細的 說明這些實驗。 以源自HI V之DNA序列做爲測試，所使用之啓動子使得 源自 HIV 的捕獲探針相對應至序列 NH2-GAGGAAGCTGCAGAATGGG ；及 GGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTG 。這些擴大區可藉由傳統PCR方法，自HIV的“GAG”基 因增幅247個鹼基之DNA而獲得，然後將擴大區在“高純 度PCR”純化套組上純化並在瓊脂糖凝膠上定量，之後將 所述之在不同印染緩衝液的濃度300 Nm之捕獲探針以小 點置於本發明基質之上。 固定控制組（A ) 此實驗計劃分離固定步驟且確定捕獲探針以固定於基質 上。製備有生物素標示之捕獲探針所使用之不同的印染緩 衝溶液（依據此所述）。在微陣列上所顯示之正反應如深 色點狀，且指出經標示的捕獲探針存在。 正雜交控制組（B ) 此實驗根據標準微陣列程序進行以確定整個系統之運作 -40- 1243072

五、發明說明（39) 。正反應在微陣列上呈現深色點狀’且指出未標示之捕獲 探針連接至基質，且繼之以其互補的經標示序列雜交。 負雜交控制組（c) 如果在實驗A或B中爲假陽性則進行此實驗。雜交溶液 中無相對應目標序列的捕獲探針配入印染緩衝液’然後以 適當方法（例如噴墨印表機）將其應染至基質之小點，至 實驗完成，無雜交發生於點上，因此深色點狀表示例如經 標示的目標序列非特異性結合於不佳的設計基質之問題。 結果之說明 第2圖可見，無論印染緩衝液組成物（表2中舟狀墨點 “ 1”至“ 5 ” ）、 固定控制組（A )及正雜交控制組（b )實驗皆獲得陽性結果（即相對應欄中深色點狀）。因此 塗覆實例4之基質確實結合胺基化DNA捕獲探針，而獲得 正確的微陣列（生物晶片）。在所有情形中負雜交控制組 實驗（C )獲得陰性結果（即無深色點狀在欄中），表# 在本實驗中塗覆實例4之官能化基質的確不給予任何丨爲胃 性。 因使用印染緩衝液所導致的一些差異可見於第2目， 在深色點狀之形狀或大小上的一些變化，其爲陽性結$。 重要的是如影像分析軟體一般使用於讀取結果，而# ± 的幾何變化會改變讀取。沒有淸洗經任何機制的結@胃$ 相信此變化被導致由塗層引起的表面能量差異的原医j。_目 信其可經由實質上不影響試驗的方法改質印染緩衝液力口 U -41 - 1243072 五、發明說明（4〇) 彌補，以保持本發明微陣列免於產生不同形狀之點。 第1及2圖所給予之結果顯示在此所製備的配方（實例 8)可被塗覆於任何適當的基質，以製造適當的實用微陣 歹丨J。

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Claims (1)

1243072 — 六、申請專利範圍 第9 1 1 05757號「基質，製法及用途」專利案 ( 2005年5月修正） 六申請專利範圍 1. 一種製備基質之方法，該基質具有可與分子探針反 應基反應之位置，此方法包含施用一種物質於基質 表面之步驟，其物質包含一種或多種如式la之具 有經活化的乙烯化未飽和雙鍵之反應性位置：

r3 式la 其中， 心及R2各獨立代表H、甲基或〇H; R3爲Η或CH3 ;以及 R4爲Ci_6烴基鹵化矽烷； 且在另一步驟中，使分子探針之反應性基共價地鍵 結至具有式1 a之反應位置的經活化的乙烯化未飽和 雙鍵。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其式1 a中： L及R2均爲Η ; R3爲Η或CH3 ;以及 R4爲烷基氯矽烷 1243072 六、申請專利範圍

式lb 3.如申請專利範圍第2項之方法，其中R3爲Η且R4爲（ 丙基）三氯矽烷

4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中基 質係選自奈倫、聚苯乙烯、玻璃、矽晶圓、乳膠、 聚丙烯、聚碳酸酯及聚酯。 5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中分 子探針係選自包含DNA、RNA、生物素、毒素、除草 劑、農藥、碳水化合物、藥物標的、抗生素、細胞 有毒物質、類固醇、胜肽、核苷酸、胜肽核酸、共 結合物、蛋白質及附著素。 6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中與 反應位置之雙鍵反應的分子探針反應基爲胺基。 7·如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中以 熱或輻射將式la之反應位置聚合於基質上，以便保 留未反應的活性未飽和雙鍵，其可進一步地經由分 1243072 六、申請專利範圍 子探針之反應基反應。 8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中聚 合物前驅物被聚合於保有未反應官能基之基質上’ 該官能基隨即與具有可反應基之式la的反應位置反 應（已反應之經活化的未飽和雙鍵以外者），經活 化的未飽和雙鍵進一步與分子探針之反應基反應。 9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中式 1 a之反應基係經由基質所帶有之羥基與式1 a之烴基 鹵化矽烷丙烯酸酯之鹵化矽烷基反應而直接與基質 結合，該經活化的未飽和雙鍵並進一步與分子探針 之反應基反應。 1〇· —種根據申請專利範圍第1至9項中任一項之方法以 製造微陣列之方法，其中微陣列被支撐在選自如膜 、微孔、離心管、薄膜、載玻片所組成之物質上。