TW585775B - Medicament composition comprising HGF gene - Google Patents

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2 2五、發明説明（ 、然而，對於使用HGF基因之基因治療尚未知道，又對 於基因治療是否為可能亦不明白。 發明欲解決之諜顥 HGF為血中半衰期短之藥物之一。因而，期望於局部 持續地投藥。 又，由於HGF具各種各樣之藥理作用，所以在期待開 發作為種種治療劑之反面，由於其之各種各樣之藥理作 用’於全身性投藥，副作用亦會成為問題。另外，若將 HGF本身碌脈内投藥，由於相當量之滞留於肝臟， 所以有達到治療目標之臟器之量變少之缺點。 供解決誤顥夕丰鉛 . 本發明為解決前面課題而構成，並 ⑴由HGF基因組成之醫藥，…有關 (2) 含H G F基因之脂質體， (3) 為與仙台病毒融合之脸SX /ν ^ 口 I腰㈤合脂質體之上記⑵記載之 脂質體， ⑷由上記⑵或⑶記載之脂質體組成之醫藥， ⑸為肝硬化治療劑、腎症症、、Α 4貫畏病治療劑、上皮細胞增殖促 進劑、^劑、癌療法用副作用防止劑、肺障礙治 胃+ — “腸損傷治療劑、腦神經障礙治療 劑免疫抑制田1]作用防止劑、膠原蛋白分解促進 劑、軟骨障礙治療劑、動它 、 、 、 動脈疾病治療劑、肺纖維症 台療劑、肝臟疾病治疼痛卩 口療W、血液凝固異常治療劑、 血漿低蛋白治療劑、釗復、人、▲ ^ 則傷治療劑、神經障礙改善 -5- 本紙張尺度適财料(CNS) A4規格(2ι〇) 297公釐） 585775

藥’造血幹細胞增加劑或育毛促進劑之根據申請專 利範圍第1或4項之醫藥， ⑹為動脈疾病治療劑之⑸所記載之醫藥，及 (7)為軟骨傷害治療劑之⑸所記載之醫藥。 里__圖之簡軍說明 圖1為表示於試驗例1於將11¥厂脂質體_DNA敏化之大 鼠冠動脈内皮細胞之HGF之表現之圖。 圖2之折線圖為表示於試驗例2，於將hvj -脂質體-c 〇 n t敏化之内皮細胞之H G F存在下或非存在下之細胞增 加率之圖。圖中，HGF表將HVJ-脂質體乂〇以敏化之内 皮細胞群，HGF表於所定濃度之重組存在下培 養之群。圖2之長條圖為表示於試驗例2，將hvj -脂質 體-DNA敏化之内皮細胞之細胞增加率之圖。圖中，dsf 表將H VJ-脂質體_cont敏化之内皮細胞群，HGF載體表 將HVJ-脂質體- DNA敏化之内皮細胞群。 圖3為表示於試驗例2，於抗HGF抗體存在或非存在下 將HVJ-脂質體-dnA敏化之内皮細胞之細胞增加率之 圖。圖中，對照表於IgG對照組之存在下培養之η VJ-脂 質體-c0nt激敏内皮細胞群；HgF表於igG對照組之存在 下培養之HVJ-脂質體-DNA激敏内皮細胞群；HGFab表 兔抗人類HGF抗體存在下培養之HVJ -脂質體- DNA激敏 内皮細胞群。又，增加率以對照之增加率為1〇〇之相對0/〇 表示。 圖4為表示於試驗例3，將HVJ-脂質體- DNA敏化之大 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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队V S M C之均養上清液對於大鼠冠狀動脈内皮細胞之細 胞玉曰殖效果之圖。圖中，對照為添加h v j _脂質體_ c 〇 n t 敏化之大乳V S M C之培養上清液之群；H G F為添加將 HVJ-I曰質體- DNA敏化之大鼠VSM(：之培養上清液之 群。 圖5為表示於試驗例3，將hvj_脂質體_DNA敏化之大 鼠VSMC之培養上清液iHGF濃度，用抗人類HgF抗體 測定之結果之圖。圖中，無處理為非敏化之VSMC之培 養上清液群；對照為將HVJ-脂質體-cont敏化之大鼠 VSMCl培養上清液群；HGF為將HVJ_脂質體-DNA敏 化之大鼠VSMC之培養上清液群。 圖6為表示於試驗例3將HVJ-脂質體-DNa敏化之大鼠 VSMC之培養上清液<HGF濃度，用抗大鼠HGF抗體測 足义結果之圖。圖中，無處理為非敏化之VSMC之培養 上清液群；對照為將HVj-脂質體_C〇nt非敏化之大鼠 VSMC之培養上清液群；HGF為將HVJ·脂質體— DNA非 敏化之大鼠VSMC之培養上清液群。 圖7為表示於試驗例4，將HVJ_脂質體-DNA敏化之大 鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液對於大鼠冠狀動脈内皮 細胞之細胞增殖效果之圖。圖中，A為添加將η v J -脂質 體-D Ν Α敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之 群，B為添加將HVJ-脂質體_cont敏化之大鼠冠狀動脈内 皮細胞之培養上清液之群；C為無處理之群。 圖8為表示於試驗例4，於抗HGF抗體存在下之將HVJ_ 本紙張尺度適用中國画家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585775 A7 ____B7 五、發明説明（5~" "" 脂質體-D N A敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞培養上清液對 大鼠冠動脈内皮細胞之細胞增殖效果之圖。圖中，A為添 加將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之 培養上清液之群；B為添加將HVj-脂質體<〇肘敏化之大 鼠甩狀動脈内皮細胞上清液之群；C為將η V J -脂質體-DN Α敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加 HGF抗體之群、；D為將HVJ-脂質體- DNA敏化之大鼠 冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加對照抗體之群。 圖9為表示於試驗例5 ’將HVJ -脂質體-DNA敏化之人 類VSMC與非敏化之人類内皮細胞共同培養時之内皮細 胞之細胞增加之圖。圖中，對照為與HVj_脂質體_c〇nt 受敏化之VSMC之共同培養群；HGF為HVJ-脂質體-DNA受敏化之VSMC之培養上清液群。 圖10為表示於試驗例6，將HVJ -脂質體- DNA敏化之 大鼠VSMC與非敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞共同培養 時之内皮細胞之細胞增加之圖。圖中，對照為與Η v J -脂 質體-cont受敏化之VSMC之共同培養群；HGF為HVJ-脂質體-DNA受敏化之VSMC之培養上清液群。 圖11為表示於試驗例8，將HVJ-脂質體-DNA直接注 入之大氣心肌之微小血管數增加之圖。圖中，HGF為直 接注入Η V J -脂質體-D N A之大鼠心肌之微小血管數，對 照為直接注入Η V J -脂質體-c 〇 n t之大鼠心肌之微小血管 數。 圖1 2為表示於試驗例9，於關節内投予H VJ -脂質體- -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 585775 A7 B7 五、發明説明（6 ) DNA後3週之甲苯胺藍染色，確認合成被染色之蛋白聚酶 之軟骨樣細胞之出現之圖。 圖1 3為表示於試驗例8，於關節内投予HVJ-脂質體_ DNA後4週之甲苯胺藍染色確認合成被染色之蛋白聚酶之 軟骨樣細胞之出現之圖。 圖1 4為表示於試驗例9，於關節内投予於比較例2製作 之HVJ-脂質體_DNA(TGFj)後4週之甲苯胺藍染色， 無法確認被認定合成被染色之蛋白聚酶之軟骨樣細胞之 圖。 圖1 5為表示於試驗例9，於關節内投予於比較例1所製 作之HVJ-脂質體4〇1^後4週之甲苯胺藍染色，無法確認 被認足合成被染色之蛋白聚酶之軟骨樣細胞之圖。 供實施本發明之最佳形熊 於本發明所使用之「HGF基因」係指得以將HGF表現 之基因’於該基因，所表現之多肽只要實質上與Hgf同 效，亦包括如其基因序列之一部分缺失或由其他之鹼基置 換、一部分插入其他之驗基序列、於末端結合驗基之因 子作為如此之HGF基因，可例示如Nature，3 42· 440 ( 1 989)、特開平％ 1 1 1 3 8 3號公報、

Biophys. Res. Commun. 163· 9 6 7 ( 1 9 8 9)、特開平 3 -25 5 096號公報等記載之HGF基因，此等之基因可於本 發明使用。 HGF基因，使用併入於適當載體者。例如，作為於後 面所舉< 病毒 < 基因中併入HGF基因之病毒載體，或將 本紙張尺度適用中國國家標準公爱)

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hgf基因併入之適當之表現載體使用。 於本發明「醫藥」係指基於HGF所具有之藥理作用之 人類疾病之治療劑或預防劑，例如可舉上記之治療劑或預 防劑。根據本發明，HGF基因導入細胞後，HGF於該細 胞表現’其hgf顯示藥理作用。因而，本發明之醫藥， 對於與HGF之對象疾病同樣之對象疾病有效。 例如’將H G F基因導入細胞内時，如同實施例中之記 載，促進血管内皮細胞之增殖，但無促進血管平滑肌細胞 <增殖。另外，如同實施例中之記載，於使用大鼠之動物 實驗，於身體内心臟中導入HGF基因時，可見血管新 生。因而，HGF基因有用於起因於以動脈疾病，尤其血 管平滑肌細胞之異常增殖為主體之障礙之各種疾病（例 如，血管擴張術（PTC A)後之再狹窄、動脈硬化症、末梢 循環不全等）之治療、預防、心肌梗塞、心肌症、末梢性 血管閉塞症、心機能不全等之疾病之預防、治療。又， HGF本身亦促進血管内皮細胞之增殖，但無促進血管平 滑肌細胞之增殖，可用為同樣之治療劑、預防劑，藉由 HGF基因之效果為基於HGF本身之效果。 另外，如同實施例中之記載，將HGF基因導入關節内 則促進關節軟骨細胞之修復，促進合成蛋白聚酶之細胞之 增殖。因而，HGF基因對於種種軟骨傷害，例如骨形成 異常症、變形性關節症、變形性椎間板症、骨折之修復、 治癒不全、來自運動之外傷、奇帕恰（丰一〆y千个）病等 之疾病之預防、治療有效、H G F本身亦促進軟骨細胞之 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 修復、增殖’可用為同樣之治療劑、預防劑，藉由H G F 基因之效果為基於HGF本身之效果。 「脂、體」為以内部具有水層之脂質兩層形成之閉鎖 小胞體’已知其之脂質2分子膜構造極近似於生體膜。作 為製作本發明之脂質體時使用之磷脂質，例如有卵磷脂、 落血印磷脂等之磷酯醯膽鹼、磷酯醯絲胺酸、磷酯醯甘 油、磷酯醯肌醇、磷酯酸等之酸性磷脂質，或此等之醯基 取代成十二醯基、十四醯基、油醯基等之磷脂質、磷酯 酿。乙醇胺、神經鞘髓磷脂等之神經鞘磷脂質等。又，亦 I添加膽固醇等。脂質體可自存在於通常之細胞膜中之脂 為等之天然材料以通常已知之方法製造。含有本發明之 H GF基因 < 脂質體，例如可將精製之磷脂質之薄膜懸浮 於含有HGF基因之溶液，施以超音波處理而製造。

又，含本發明之HGF基因之脂質體，亦可以與適宜之 病毒融合之膜融合脂質體。此種情形，將病毒以例如紫外 $使失活為佳。作為特佳之膜融合脂質體，可舉與仙台病 毒（日本血凝病毒：HVJ)融合之膜融合脂質體。此膜融合 脂質體可以曰經科學，1 944年4月號、32_38頁，L

Biol Chem·，266(6)，3 3 6 1 _3 3 64 ( 1 99 1 )等記載之方 法製造，例如將以紫外線使失活之精製之hvj盥本h(?f 基因載體之脂質體懸浮液混合，緩慢攪拌後，藉由篇糖密 度梯度離心法除去未結合之HVJ，而可製備hvj融合脂 質體脂質體）。又，使對標的細胞具有親和性者結 合於脂質體’可提高基因導入細胞之效率。作為對標的細 585775 A7 ________ B7 五、發明説明（9~~ "~ --- 胞具親和性者，可舉例如抗體、受體等之配位體等。 作為HGF基因導入細胞内之方法，可大分為藉由病毒 載體者及其他者（曰經科學，1994年4月號，2〇-45頁， 月刊藥事，36(1)，23_48 (1"4)，及此等之引用文獻 等）。於本發明之醫藥，可適用任何之方法。 作為藉由病毒載體之導入方法，可舉例如於倒逆病 毒、腺病毒、與腺有關之病毒、⑴疹病毒、牛痘病毒、脊 髓灰質炎病毒、辛畢斯〇7>匕只）病毒其他RNA病毒等 中併入HGF基因導入之方法。其中，以使用倒逆病毒、 腺病毒、與腺有關之病毒等之方法特佳。 作為其他導入方法，可舉脂質體法、脂染素法、微注 射法、磷酸舞法、電泳脈動法等，以脂質體法特佳。 又’於實際上將HGF基因作為醫藥作用，有直接體内 導入HGF基因之活體内法，及自人類採取某種細胞，於 體外將H GF基因導入該細胞，再使其細胞回至體内之活 體外法（曰經科學，1 994年4月號，20-45頁，月刊藥 事，1^01，23 -48 ( 1 994)，及此等之引用文獻等）。於 本發明之醫藥，按照治療目的之疾病、標的臟器等，可選 擇適宜之任何之方法。 活體内法與Ex Vivo法比較，費用與所發時間少且簡 便。活體外法，HGF基因導入細胞内之效率佳。 於本發明之醫藥，藉由In Vivo法投予時，可按照治療 目的之疾病、標的臟器等之適當投予途徑投予。例如可投 予靜脈、動脈、皮下、肌肉内等，或直接投予腎臟、肝 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585775 A7 B7

臟、肺、腦、神經等之疾病之對象部位。若直接投予疾病 部位，則可臟器選擇性地治療。例如於使用對「p T匚a後 之再狹窄」之基因治療，可以動脈内投予實施（實驗醫 學，12 (15增刊），1 298- 1 993 ( 1 994))，較好將本發 明醫藥上藥於PTCA之球端，塗於血管則可如此導入於血 管内皮細胞及血管平滑肌細胞。

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又，藉由活體外法之情形，依習用法，採取人類之細 胞（如淋巴球、造血幹細胞等），以本發明之醫藥將其敏 化，進行基因導入後，進行將HGF產生細胞放回人類。 μ藉由活體内投予之情形，得取種種製劑形態（如液劑 等），但一般採含有為有效成分之HGF基因之注射劑等。 又，按照必要，亦可加慣用之載劑。該注射劑等可依習用 法製備，例如可藉將HGF基因溶於適宜之溶媒（例如經減 菌^緩衝液、生理食鹽水等）後，以㈣等過滤減菌' 接著充填於於無菌之容器而製備，又代基因，亦 可將併入HGF基因之病毒載體製劑化。另外，於包埋 HGF基因之脂質體（或HJV-脂質體），可做成懸浮液、冷 凍劑、離心分離濃縮冷凍劑等之脂質體製劑之形式。7 製劑中之HGF基因之含量，可依治療目的之疾病、標 的臟器、患者年齡、體重等而適宜製備，但通常作= HGF基因，以0.000 1毫克〜1〇〇毫克，較佳〇 〇〇ι亳克 〜10毫克，將此於數日至數月中！次投予為適當。 實施例 以下，舉實施例更詳細說明本發明，但本發明並不限 -13-

585775 A7 ____ B7 五、發明説明（^ ) 於此等實施例。又，使用之實驗材料及方法，概要如下。 實驗材料及方法 ① H G F表現裁轉 HGF表現載體之製備，藉於puc-SRa表現載體（FEBS， 61_66 ( 1 993 ))之Eco RI與Not I部位之間插入人 類 HGF cDNA (2.2kb : Biochem. Biophys. Res. Commun·，12X 3 2 1 -3 27 ( 1 990);日本專利公開平5-111383)而進行。於此質體載體，HGF cDNA之轉錄由 S R a 啟動予控制（n a t u r e 3 42· 440-443(1989))。 ② 細胞培卷 大鼠之冠狀動脈内皮細胞，藉由自8週齡之30^§1^-Dawley (SD)大鼠之心臟以酵素消化，以密度梯度離心 法分離（Transplantation 57^, 1 65 3 - 1 660 ( 1 994))。 大鼠之大動脈平滑肌細胞（以下稱為V S M C)自1 2週齡S D 大鼠以酵素處理而得（J. Clin. Invest.，93., 3 5 5 -3 60 (1 994))。此等細胞，以含ι〇%(體積/體積）牛胎兒血 清、盤尼西林（100單位/毫升）、鏈徽素（1〇〇微克/毫升） 之D Μ E Μ培養基維持。細胞於3 7 °C、9 5 %空氣-5 % C Ο 2 之加溫大氣中，每2日交換培養基培養。此等細胞藉由免 疫組織學上及形態學上之觀察，顯示分別為内皮細胞及平 滑肌細胞。 人類大動脈内皮細胞（5代繼代）及人類V S M C ( 5代繼代） 使用購自克拉波（夕今求）公司者，以同上記之方法，於含 5 %牛胎兒血清、上皮成長因子（1 0毫微克/毫升）、鹼性纖 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)

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線 585775 A7 B7 _ 五、發明説明（12 ) 維芽細胞成長因子（2毫微克/毫升）及地塞米松（1 ΡΜ)之 MCDB131培養基培養。 又，靜止期之内皮細胞，依J. Clin. Invest.仏， 1690-1697 (1990);同前，824·829 (1994)製 備。 ③ Η VJ-脂質體夕琴管内導入基因 經敏化之内皮細胞或VSMC，1〇8個播種於6個孔洞培 養皿，使增殖至8 〇 %會合培養。細胞以含2 m Μ氯化鈣之 平衡鹽類溶液（137 mM NaCl、5.4 mM KC1，10 mM Tris-HCl，pH 7.6，以下稱為「BSS」）洗3次，加實施 例1所得之HVJ-脂質體-DNA(含2.5毫克脂質及10微克 之包埋DNA)之溶液1毫升或比較例1所得之HVJ-脂質體-cont之溶液1毫升，於4°C、5分，再37°C、30分培養。 細胞洗淨，於含10%牛血清之新鮮培養基中，以C02培 養箱維持。 ④ 内皮細腧及VSMCH中之HGF濃庹之測定 敏化内皮細胞及VSMC產生之HGF濃度之測定以 ELISA法進行。亦即大鼠或人類之内皮細胞或VSMC於6 孔洞之培養皿（Corning公司製）中以5 X 1〇4細胞/平方厘 米之細胞密度播種，培養2 4小時。敏化後2 4小時，交換 培養基再培養48小時。為檢討HGF之放出，將敏化之細 胞（敏化4 8小時後）洗淨，加至含有胰島素（5 X 1 (Γ7 Μ )、 運鐵蛋白（5微克/毫升）及抗壞血酸（〇·2 mM)之無血清培 養基中。2 4小時後，收集培養基，以6 0 〇 g離心1 〇分， -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 585775 A7 B7 五、發明説明（13 ) 於-20C下保存。 培養基中之HGF濃度，以使用抗大鼠HGF抗體或抗人 類HGF抗體之酵素免疫法測定（Exp· Cell. Res. 210· 3 26-3 3 5 ( 1 994) ； Jpn. J. Cancer Res. 8J„, 1 262-1266 (1992))。將免抗大鼠或抗人類HGF IgG於4 °C下 1 5小時塗佈於％孔洞培養皿（Corning公司製）。以含3% 牛血清白蛋白之PBS(磷酸緩衝食鹽液）封阻後，加培養基 至各孔洞，2 5 °C下培養2小時。孔洞以含〇 . 〇 2 5 %吐恩（卜 々彳一 > )之P B S (P B S -吐恩）洗3次後，加生物素化之免 抗大鼠HGF IgG或抗人類HGF IgG，於25°C培養2小 時。以P B S -吐恩洗淨後，孔洞與西洋山荼菜、過氧化酶 結合鏈抗生物素蛋白-生物素複合物（P B S -吐恩溶液）培 養。藉添加基質溶液（含2.5 mM鄰苯二胺、1〇〇 mM磷 酸鈉、5 0 m Μ檸檬酸、0 · 0 1 5 %過氧化氫）開始酵素反 應。酵素反應藉添加1 Μ Η 2 S 0 4而停止，測定4 9 0 n m之 吸光度。又，抗人類HGF抗體只與人類HGF交叉反應， 不與大鼠HGF反應，又抗大鼠HGF抗體只與大氣HGF交 叉反應，不與人類HGF反應。

⑤ HGF 使用之人類及大鼠重組HGF使用自以含人類或大鼠 HGF cDNA之表現質體敏化之CH0細胞或C-127細胞之 培養液精製者（Cell，71, 26 1 -27 1 ( 1 994) ; j. Clin. Invest，3 5 5 _ 3 6 0 ( 1 9 9 4))。 ⑥ 統計上鮮;bf -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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線 ---- —_ B7 五、發明説明（ ） 14 , 全部之實驗至少進行3次，測定值以平均值士標準誤差 表不。測定值之統計上解析，以當肯法（Dlincan，s試驗） 進行。 紅（HE丄染色、阿古（八以…銮氙 導入HGF基因之大鼠於基因導入後1〇天，以加肝素之 生理食鹽水灌流、宰殺，接著進行藉由以PBs製備之4% 多聚甲醛之固定一夜。固定後進行石蠟包埋，製作切片， 依常法進行HE染色、阿丈染色。於顯微鏡下數微小血管 數。 實施例1 全JLSX表現盤體之hvj-脂皙體之， 於四氫呋喃中，將磷酯醯基絲胺酸、磷酯醯基膽鹼及 膽固醇以1 ·· 4 · 8 : 2之重量比混合。四氫呋喃以旋轉蒸發器 餾除，使此脂質混合物（1 0毫克）析出於容器壁。自牛胸 腺精製之HMG 1核蛋白（鬲流動性群1核蛋白）96微克與 質體DNA(300微克）之BSS(200微升）溶液於2〇。〇混合1 小時’接著添加上記之脂質。脂質體· D N A - Η M G 1複合 體懸浮液以滿旋混合，超音波處理3秒，揽拌3 〇分。 精製之HVJ(Z株）於鹽使用前以紫外線照射（11〇耳格/ 平方毫米秒）3分使失活。將上記所得之脂質體懸浮液 (〇·5毫升含脂質10毫克）與HVJ(20, 〇〇〇血凝單位）加 B S S使全液量成4毫升’混合。此混合物於4 培養1 〇 分’再於37 °C慢慢擾拌30分。未融合之hvj以薦糖密度 梯度離心法’自Η V J -脂質體除去。亦即以收集於薦糖密 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 585775 A7 B7 五、發明説明（ 度梯度之上層，得含有HGF表現載體之HVJ-脂質體（含 10微克/毫升之H GF表現載體）。以下將含有η GF表現載 體之HVJ-脂質體稱為HVJ-脂質體-DNA。 實施例2 含HGF表現載體之HVJ-脂質體之措子士气 含HGF表現載體之HVJ-脂質體之製備，使用64微克 HMG 1核蛋白，200微克質體DNA，依實施例記載之方 法進行，又，脂質體懸浮液〇 , 5毫升，含1 〇毫克脂質）與 HVJ(3 5,000血凝單位）加BSS使成全液量為2毫升，混 合。 對於SD大鼠（400-500克；自曰本查爾斯里巴（千十一 々X U〆一）公司購入），腹腔内投予戊巴比妥鈉鹽（〇」毫 升/100¾克）麻醉，保溫，由自動呼吸器確保呼吸。大鼠 實施左侧開胸術，用30G之注射針將HVJ-脂質體-DNA 或HVJ-脂質體_cont(2〇微升）直接、慎重地注入心尖。 比較例1 不含HGF表現盤體夕HVJ-脂質體之製造 於不含H G F基因之載體，進行與實驗例1記載方法相同 之操作’製造不含HGF表現載體之HVJ-脂質體。以下將 不含HGF表現載體之HVJ-脂質體稱為HVJ-脂質體-c ο n t ° 比較例2 含人類_TGF-B表現盤體之HVJ-脂質體之製備 用人類TGF-β表現載體，與實施例1同樣地製造含有人 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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585775 五、發明説明 類T G F - β表現載體之Η V J -脂質體。 以下將含人類TGF-β表現載體之HVJ-脂質體稱為 HVJ-脂質體-DNA(TGF-p)。 試驗例1 將HVL-j旨質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内古細啤^ H G F之表現 將HVJ-脂質體-DNA(脂質體中之HGF表現載體濃度： 1 0微克/毫升）於大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：1 〇 8個） 中敏化，以ELISA法測定HGF之產生量。作為對照，使 用HVJ-脂質體-cont進行同上記之試驗。另外對於非敏 化之冠狀動脈内皮細胞亦測定H G F產生量（無處理群）。 其結果示於圖1(η = 6)。圖中，HGF為將HVJ -脂質體 -DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞群。 如圖1所示，將H VJ-脂質體-DNΑ敏化之大鼠冠狀動脈 内皮細胞產生分泌高含量之H G F。相對於此，無處置群 及HVJ-脂質體- c〇nt受敏化之冠狀動脈内皮細胞群，無 認定實質上產生HGF。 試驗例2 經敏化之HGF之袅現盤體對於内虔細胞增殖之故果 於人類内皮細胞中將HVJ-脂質體-cont感化，於外源 性添加之重組人類HGF存在下（1，10及100毫微克/毫 升），或非存在下培養，測定細胞數之增加率（％)。其結 果示於圖2(折線圖）（n = 6)，圖中，DSF表將HVJ -脂質 體-cont敏化之内皮細胞群，HGF表所定濃度之重組人類 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 585775 A7 ______ _ B7 五、發明説明（17 ) HGF存在下培養之群（* : p<〇〇5，** : ?<〇〇“· DSF))。 如圖折線圖所示，明白藉外源性添加之hgf促進内 皮細胞增殖。 一方面’培養將HVJ-脂質體-DNA(濃度：10微克/亳 升）敏化之内皮細胞，測定細胞數之增加，求增加率 (%)。又’作為對照，培養將Hvj-脂質體“。“敏化之内 皮細胞’測疋細胞數之增加，求增加率（％)。其結果示於 圖2(長條圖）（n = 6)。圖中，DSF表將HVJ-脂質體-cont 敏化之内皮細胞群，HGF載體表將HVJ-脂質體-DNA敏 化之内皮細胞群（** : p<〇()1(對Dsf)，# : p<〇〇5(對 HGF，100亳微克/毫升）。 如圖2(長條圖所示，明白了將hvj-脂質體-E)NA敏化 (内皮細胞之增加率與對照組相比顯著地高，又對外源性 添加之H G F之效果亦有意性地高。 另外，將上記之H VJ·脂質體-dn Α敏化之内皮細胞， 於兔抗人類HGF抗體存在下或非存在下進行，測定細胞 數之增加，求增加率（％)。又，作為對照，將H VJN脂質 體- cont敏化之内皮細胞培養，用樣地求細胞數之增加率 (%)。又，兔抗人類HGF抗體藉文獻（Jpn j Caneer

Res，ϋ，1 262- 1 266 ( 1 992))中記載之方法精製，此抗

體於10微克/毫升之濃度，可將10亳微克/毫升之生物活 性中和。另外，抗人類HGF抗體只與人類HQF交叉反 應，不與大鼠HGF反應，抗大鼠Hgf抗體只與大鼠HGF -20- 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '—~一-- 585775 A7 B7 五、發明説明（18 交叉反應，不與人類HGF反應。又，使用正常之兔血清 IgG(10微克/毫升）為對照組。 其結果示於圖3 (η = 6)。圖中’對照表於I g g對照之存 在下培養之HVJ -脂質體-c〇nt敏化内皮細胞群；HGF表 於IgG對照之存在下培養之HVJ-脂質體-DNA敏化内皮 細胞群；HGFab表免抗人類HGF抗體存在下培養之 Η V J _脂質體-D N A敏化内皮細胞群。又，增加率（％)以 對照之增加率為1 〇 〇之相對％表示（* : p < 〇 〇丨（對對 照），# ·· Ρ<0·05(對 HGF)。 如圖3所示，由於抗人類HGF抗體之存在，Hvj-脂質 體-D Ν Α敏化内皮細胞之增殖受抑制，為與對照同程度之 細胞增加率。由此明白，HGF為内皮細胞之增殖因子。 試驗例3 將HY.J-脂g_l-DNA敏化之女鼠VSMC之培卷_匕清_對 大鼠冠狀動脈内皮細胞之效罢 將HVJ-脂質體_DNA敏化之大鼠VSMC之培養上清液 加入於為靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞培養系（細胞 數：1 0 5個），培養3天，調查該内皮細胞數之增加。作為 對照’使用將Η V J _脂質體· c 〇 n t敏化之大鼠v s M C之培 養上清液’同樣地調查内皮細胞數之增加。其結果示於圖 4(η = 6)。圖中，對照為添加將HVJ-脂質體-cont敏化之 大鼠V S M C之培養上清液之群；η G F為添加將η V J ·脂質 體-DNA敏化之大鼠VSMC之培養上清液之群。 如圖4所示，於添加將HVJ-脂質體_dNa敏化之大鼠 •21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 訂 585775 A7 B7 五、發明説明（19 ) V S M C之培養上清液之群，内皮細胞數可見有意性之增 加。 將上記之HVJ-脂質體-DNA或HVJ-脂質體-cont敏化 之大鼠VSMC之培養上清液之HGF濃度，以使用抗人類 H G F抗體及抗大鼠H G F抗體之E LI S A法測定。又，非敏 化之V S M C之培養上清液中亦測定η G F濃度（無處置 群）。 使用抗人類H GF抗體之測定結果示於圖5，使用抗大鼠 H G F抗體之結果示於圖6 (任一者皆η = 6)。圖中，對照為 將HVJ -脂質體-cont敏化之大鼠VSMC之培養上清液 群；HGF為將HVJ-脂質體_DNA敏化之大鼠VSMC之培 養上清液群。 如圖5所示，於將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC 之培養上清液檢出H G F，其值相對於對照為有意性地 高。 又，如圖6所示，於將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 V S M C之培養上清液亦檢出大氣η G F，其值相對於對照 為有意性地高。 又，如圖5與圖6所示，於無處理群及對照群，培養上 清液中無存在可以E LIS Α法測定之程度量之η G F。 試驗例4 ^^1-脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀會y脈内古細腧夕毕 清液對大鼠冠狀動脈内皮細胞之#罢 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之 -22- 中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 585775 A7

五、發明説明（ 培養上清液加入於靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞培養系 (細胞數1 05個）中，培養3天，調查該内皮細胞數之增 加。又，作為對照，使用將HVJ-脂質體-c〇nt敏化之大 鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液，同樣地調查内皮細胞 數之增加。其結果示於圖7。圖中，A為添加將hvj_脂質 體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之群 (η 8)’B為添加將hvJ-脂質體_c〇nt敏化之大鼠冠狀動 脈内皮細胞之培養上清液之群（n = 8) ; c為無處置群 (n= 1 5) 〇 如圖7所示’於添加將HVJ-脂質體-DNA敏化之冠狀動 脈内皮細胞之培養上清液之群，内皮細胞數可見到有意性 地增加’相對地於對照群，細胞數與無處置群同程度。 (對照群：0.117±0 002 ; A 群：0·148±0·03 ， Ρ<0.0 1)。 其次’於將HVJ-脂質體_dna敏化之大鼠冠狀動脈内 皮細胞之培養上清液中加抗HGF抗體，與上記同樣調查 内皮細胞數之增加。其結果示於圖8(n = 8)。圖中，A為 添加將H VJ -脂質體敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養 上清液之群；Β為添加將HVJ_脂質體<〇nt敏化之大鼠冠 狀動脈内皮細胞之培養上清液之群；C為於ηVJ-脂質體-DNA-敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加 抗HGF抗體之群；D為於HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加對照抗體之群。 如圖8之Α及C所示，將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 585775 A7 ___B7 五、發明説明（21 ) 冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之細胞增殖促進活性，藉 由添加抗HGF抗體而完全消失。藉此明白，將η VJ-脂質 體_ D Ν Α敏化之大氣危狀動脈内皮細胞之培養上清液之細 胞增殖促進活性歸因於H G F。 試驗例5 將HVJ-脂質體_DNA敏化之人類VSMC對人類内虔細腧 之效果 播種於人類VSMC細胞培養插板（克斯特（口一只夕一） 公司製，孔徑0 · 4 5微米）以添加1 〇 %牛血清之d Μ E Μ培養 基使增殖。一方面，人類内皮細胞播種於6孔洞培養皿， 以加1 0 %牛血清之D Μ Ε Μ培養基維持。至V S M C成8 0 % 含合培養時，與HVJ-脂質體_DNA(脂質體中之DNA含 量：10微克）或HVJ-脂質體-cont於4°C培養5分，接著於 37 °C培養30分。敏化後，將含敏化VSMC之插板加於含 靜止期之人類内皮細胞之孔洞内。將V S M C與内皮細胞 於含0.5 %牛血清之DMEM培養基中共同培養3天，用 W S Τ -細胞數測定套組（和光公司製）進行細胞數之測定。 其結果示於圖9 (η = 6)。圖中，對照為與η V J -脂質體· cont受敏化之VSMC之共同培養群；HGF為HVJ-脂質 體- DNA受敏化之VSMC之培養上清液群。 如圖9所示，明白HVJ -脂質體-DNA受敏化之人類 V S M C，使靜止期之非敏化人類内皮細胞之增殖有意性 地增加。 試驗例6 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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k 585775 A7 _____B7 五、發明説明（22 ) 逝,Η V J -j旨質體-D N A敏化之大鼠V S M C對大鼠冠狀動脈 内皮細胞之效吴 將HVJ·脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC(細胞數：108 個）與靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：1 〇 5個） 共同培養3天，調查該冠狀動脈内皮細胞之增加數。又， 作為對照，使用HVJ-脂質體-cont受敏化之大鼠 V S M C，同樣地共同培養，調查内皮細胞數之增加。其 結果示於圖10(η = 6)。圖中，HGF為將HVJ-脂質體DNA 敏化之大鼠VSMC群，對照為將HVJ-脂質體-cont敏化 之大鼠VSMC群。 如圖10所示，藉由將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 V S M C所放出之H G F刺激内皮細胞之增殖，可確認細胞 數之增加（對照群：0.126土0.006 ，HGF群： 0. 156±0.01 Ρ<0.05)。 試驗例7 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC之增殖 將HVJ·脂質體_DNA敏化之大鼠VSMC與HVJ-脂質 體-c ο n t敏化之大鼠V S M C分別個別培養，檢討細胞數之 增加，但將HVJ-脂質體-DNA敏化對細胞增殖並無予以 任何影響。自此明白HGF對於VSMC並無細胞增殖促進 活性。 試驗例8 於直接注入HVJ -脂質體-DNA之大鼠心肌之新生血管增 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公茇) 585775 A7 B7 五、發明説明（ 將直接注入HVJ-脂質體-DNA之大鼠心肌、直接注入 HVJ -脂質體- cont之大鼠心肌及無處置之大鼠心肌以HE 染色、阿丈染色，以顯微鏡數微小血管數。其結果示於圖 11。圖中HGF為直接注入HVJ-脂質體-DNA之大鼠心肌 之微小血管數，對照為直接注入HVJ-脂質體-cont之大 鼠心肌之微小血管數。 如圖11所示，於注入HVJ_脂質體DNA之大鼠心肌， 與注入H VJ -脂質體· c 〇nt之大鼠心肌及無處置之大鼠心 肌比較，有意性地增加微小血管數。此顯示具内皮細胞增 殖作用之HGF，於生體具血管新生作用。 試驗例9 藉由於關節内直接導入HVJ-脂質體-DNA之關節軟骨之 修復 於10週齡之費氏（7 < 7シ十一）大鼠之大腿骨顆間 部，用1.8毫米之基爾希呢（丰71^>二十一）鋼線貫穿軟骨 下骨製作損傷。於手術後1週之時點，將實施例1所製作 之HVJ-脂質體-DNA(100微升/膝）直接導入關節内。作 為對照’將比較例1所製作之HVJ-脂質體-cont及比較例 2所製作之HVJ-脂質體- DNA(TGF-P)同量投予關節 内。於導入此等基因1、3、4週後，將大鼠宰殺，組織學 上觀察修復部位。 其結果如圖12所示，於η VJ-脂質體-DN A投予關節内 後3週’於修復組織中之一部分確認被認定合成以甲苯胺 藍染色可被染色之蛋白聚酶之軟骨樣細胞之出現。又如圖 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董)

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k 585775 A7 B7 五、發明説明（24 13所示，於HVJ_脂質體-DNA投予關節内後4週，再確 認被認定合成蛋白聚酶之軟骨樣細胞之出現範圍擴大之傾 向。 如圖14所示，比較例2所製作之HVJ -脂質體 DNA(TGF-p)投予關節内之情形，於投予後4週無法確 認此種款骨樣細胞之出現。又，如圖1 5所示，於比較例1 所製作之HVJ-脂質體-cont投予關節内之情形，於投予 後4週，無法確認此種軟骨樣細胞之出現。 試驗例1 0 將含有大鼠HGF之DNA之腺病毒敏化之女鼠冠狀勳敝内 皮_細胞之HGF之表現 使含有大鼠HGF之DNA之腺病毒（理化學研究所 (RIKEN GENE BANK) : Adexl CA 大鼠 HGF)感染於 來自人類胎兒腎之293細胞，2〜3日後得高力價病毒液 (實驗醫學，H 1804〜1810 (1994))。將所得之病毒 液1〜5 X 1 〇 8 p f u於大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：1 〇 8 個）中以Μ 0 11〜5敏化，以E LIS A法測定H G F之產生 量。其結果，將含有大鼠HGF之DNA之腺病毒敏化之大 鼠冠狀動脈内皮細胞產生分泌高含量之H G F。 產業上之利用可能性 本發明之醫藥，與H G F本身之投予相比，治療效果為 持續性，又由於可使局部選擇性地作用，可減低H G F之 副作用。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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Claims (1)

1. 585775 A B c D 第089125130號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年2月) 申請專利範圍 等Λ 8 修正丨補充

   1. 一種醫藥組合物，其係以可表現HGF蛋白之HGF基因為 其有效成分，係用作為腦神經障礙治療劑、軟骨障礙治 療劑、創傷治療劑、神經障礙改善劑。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）