TW508241B - Medicament composition comprising HGF gene - Google Patents

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~ A7 ------~~------- B7 五、發明説明（’） '—~" — — 曼明所屬技術節同 本發明係有關可用於基目治療等之醫藥。更詳細， 係有關由HGF(肝細胞生長因基因.所組 : 含HGF基因之脂質體。 醫樂，及 從來之技術 刪爲顯示種種藥理作用之生理活性肽，對於其藥理 作用，記載於例如實驗醫學ν〇11〇, Ν〇 Η増刊^3〇_ 3 3 9( 1 992)。HGF由其藥理作用可作爲肝硬化治療劑、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

腎疾患治療劑、上皮細胞增殖促進劑、抗癌劑、癌療法用 副作用防止劑、肺障礙治療劑、胃、十二指腸損傷治療 劑、神經障礙治療劑、免疫抑制副作用防止劑、膠原蛋 白分解促進劑、軟骨障礙治療劑、動脈疾患治療劑、肺纖 維症治療劑、肝臟疾患治療劑、血液凝固異常治療劑、血 漿低蛋白治療劑、創傷治療劑、神經障礙改善藥、造血幹一 細胞增加劑、育毛促進劑等（日本專利特開平4 β1 8 〇 2 8號 公報’特開平4 _ 4 9 2 4 6號公報、ΕΡ 4 9 2 6 1 4號公報、特 開平6-25 0 1 0號公報，w〇 93 /8 82 1 、特開平6-1 7 2 2 0 7、特開平7 · 8 9 8 6 9號公報、特開平6 _ 4 〇 9 3 *號公 報、W 0 9 4 / 2 1 6 5、特開平6 - 4 0 9 3 5號公報、特開平6 -5 6692號公報、特開平7-41 429號公報、WO 93/3061、特開平5 — 213721 等）。 有關基因治療，現在對於腺苷脱胺酶缺乏症、AID S基 因治療、癌基因治療，囊胞性纖！維症性基因治療、血友病 基因治療等，國際性地進行活躍之開發研究。 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 508241 A7 經濟部中夬標準局員工消費合作、社印製 '發明説明（ 、然而，對於使用HGF基因之基因治療尚未知道，又對 於基因治療是否爲可能亦不明白。 曼欲解決之誤顳 HGF爲血中半衣期短之藥物之 持續地投藥。 又，由於HGF具各種各樣之藥理作用，所以在期待開 發作爲種種治療劑之反面，由於其之各種各樣之藥理作 用’於全身性投藥，副作用亦會成爲問題。另外，若將 HGF本身靜脈内投藥，由於相當量之滯留於肝臟， 所以有達到治療目標之臟器之t變少之缺點。 进解決課題之半殺 、 , 本發明爲解決前面課題而構成，其要旨有關 (1) 由H G F基因組成之醫藥， (2) 含H G F基因之脂質體， (3) 爲與仙台病毒融合之膜站人 膜融合脂質體之上記⑵記載之 脂質體， ⑷由上記⑵或⑶記載之脂質體組成之醫藥， (5)爲肝硬化治療劑、腎疾电、、二 ν ^ 貧屄心冶燎劑、上皮細胞增殖促 進4抗癌劑、癌療法用副 田丄 〗作用防止劑、肺障礙治療 劑、円、十二指腸損傜、、二 、/σ療W、腦神經障礙治療 劑、免疫抑制副作用防 障礙❶療 一丨私及垃、' ^ 膠原蛋白分解促進 劑、軟Ώ障礙治療劑、動脈志八 ^ η , 氏疾心/〇療劑、肺纖維症 治療劑、肝臟疾患治療判、 t ^ ^ 發月i !血欣疑固異當A泰 、 血漿低蛋白治療劑、創傷.、、二 ” n W /〇療剑、神經障礙改善 因 而，期望於局部 (請先閱|背面<-注意事項^|^本頁) • In 1 -- I—二 I: -------批衣， 訂 丨i,

本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（2ΐ〇Χ297 公釐） 508241 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

AT B7 五、發明説明（3 ) 藥，造血幹細胞增加劑或育毛促進劑之根據申請專 利範圍第1或4項之醫藥， (6) 爲動脈疾患治療劑之⑸所記載之醫藥，及 (7) 爲款骨傷害治療劑之⑸所記載之醫藥。 _附圖之簡單説明 圖1爲表示於試驗例1於將HVJ-脂質體-DNA敏化之大 鼠冠動脈内皮細胞之HGF之表現之圖。 圖2之折線圖爲表示於試驗例2，於將hvj_脂質體-cont敏化之内皮細胞之HGF存·在下或非存在下之細胞增 加率之圖。圖中，HGF表將HVJ-脂質體乂0以敏化之内 皮細胞群’ HGF表於所定濃度之重組人類hgF存在下培 養之群。圖2之長條圖爲表示於試驗例2，將HVJ-脂質體 -DN A敏化之内皮細胞之細胞增加率之圖。圖中，DSF表 將HVJ-脂質體- cont敏化之内皮細胞群，fjGF載體表將-HVJ-脂質體-DNA敏化之内皮細胞群。 圖3爲表示於試驗例2，於抗HGF抗體存在或非存在下 將HVJ-脂質體-DNA敏化之内皮細胞之細胞增加率之 圖。圖中，對照表於IgG對照組之存在下培養之HVJ-脂 質體-cont激敏内皮細胞群；HGF表於IgG對照組之存在 下培養之HVJ·脂質體-DNA激敏内皮細胞群；HGFab表 兔抗人類HGF抗體存在下培養之HVJ -脂質體- DNA激敏 内皮細胞群。又，增加率以對照之增加率爲1 〇 〇之相對％ 表示。 { 圖4爲表示於試驗例3，將HVJ-脂質體-DNA敏化之大 -6- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210\297公^ ~~ ' (請先閱讀背面之注意事項本貢) 訂

鼠VSMC之培養上清液對於大鼠冠狀動脈内皮細胞之細胞 増殖效果t圖。圖中，對照爲添加HVJ_脂質體4〇1^敏 化之大鼠VSMC之培養上清液之群；HGF爲添加將11乂1· 月曰貝體- DNA敏化之大鼠vsMC之培養上清液之群。 圖5爲表示於試驗例3，將HVJ•脂質體-dna敏化之大 鼠VSMC之培養上清液iHGF濃度，用抗人類HGF抗體 測足之結果之圖。圖中，無處理爲、非敏化之VSMC之培養 上清液群·’對照爲將HVj_脂質體-c〇nt敏化之大鼠 VSMCi培養上清液群；HGF爲將HVJ•脂質體-DNA敏 化之大鼠VSMC之培養上清液亨。 圖6爲表不於試驗例3將HVJ-脂質體_Dna敏化之大鼠 VSMC之培養上清液之HGF濃度，用抗大鼠]9[〇}17抗體測 足（結果之圖。圖中，無處理爲非敏化之VSMC之培養上 /月液群’對照爲將Η V J -脂質體-c 〇 n t非敏化之大鼠· VSMC之培養上清液群；HGF爲將HVJ_脂質體_DNA# 敏化之大鼠VSMC之培養上清液群。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖7爲表示於試驗例4，脂質體- DNA敏化之大 鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液對於大鼠冠狀動脈内皮 細胞之細胞增殖效果之圖。圖中，A爲添加將hvj_脂質 體- DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之 群；B爲添加將HVJ-脂質體<〇1^敏化之大鼠冠狀動脈内 皮細胞之培養上清液之群；C爲無處理之群。 圖8爲表示於試驗例4，於抗η gf抗體存在下之將HVJ-脂質體-DNA敏化之，大鼠冠狀動脈内皮細胞培養上清液對 -7- 本紙張適用中準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -- A7 五、發明説明（5 ) ~ -- 大鼠冠動脈内皮細胞之細胞增殖效果之圖。圖中，A爲添 加將脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之 =養上清液之群，· 3爲添加將HVJ_脂質體<〇1^敏化之大 鼠冠狀動脈内皮細胞上清液之群；c爲將hvj•脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加 HGF抗體之群、；D爲將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加對照抗體之群。 圖9爲表示於試驗例5，將HVJ_脂質體_dna敏化之人 類VSMC與非敏化之人類内皮細胞共同培養時之内皮細胞 之細胞增加之圖。圖中，對照爲與]9[¥1_脂質體乂〇1^受 敏化之VSMC之共同培養群；脂質體_DNA 受敏化之VSMC之培養上清液群。 圖10爲表示於試驗例6，將HVJ·脂質體-DNA敏化之 大鼠VSMC與非敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞共同培養時一 之内皮細胞之細胞增加之圖。圖中，對照爲與H VJ_脂質 體-cont受敏化之VSMC之共同培養群；hGF爲HVJ_脂 質體- DNA受敏化之VSMC之培養上清液群。 圖11爲表示於試驗例8，將HVJ-脂質體-DNA直接注 入之大鼠心肌之微小血管數增加之圖。圖中，HGF爲直 接注入HVJ-脂質體-DNA之大鼠心肌之微小血管數，對 照爲直接注入Η V J -脂質體-c 〇 n t之大鼠心肌之微小血管 數。 ， 圖12爲表示於試驗例9，於關節内投予H VJ-脂質體… D Ν Α後3週之曱苯胺藍染色，確認合成被染色之蛋白聚酶 本纸張尺度適用中國國家標準（CMS) A4規格（210X297公釐） —in —^ϋ ml —m — I*·-- (請先閱讀背面之注意事項本買) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 508241 —A7 B7 五、發明説明（6 ) 之軟骨樣細胞之出現之圖。 圖13爲表示於試驗例9，於關節内投予HVJ-脂質體-DNA後4週之甲苯胺藍染色確認合成被染色之蛋白聚酶之 軟骨樣細胞之出現之圖。 圖1 4爲表示於試驗例9，於關節内投予於比較例2製作 之HVJ-脂質體-DNA(TGF-p)後4週之甲苯胺藍染色，無 法確認被認定合成被染色之蛋白聚酶之軟骨樣細胞之圖。 圖1 5爲表示於試驗例9，於關節内投予於比較例1所製 作之HVJ-脂質體-cont後4週之甲苯胺藍染色，無法確認 被認定合成被染色之蛋白聚酶之'軟骨樣細胞之圖。 供實施本發明之最佳形態 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 於本發明所使用之「HGF基因」係指得以將HGF表現 之基因，於該基因，所表現之多肽只要實質上與HGF同 效，亦包括如其基因序列之一部分缺失或由其他之鹼基置一 換、一邵分插入其他之驗基序列、於末端結合驗基之因 子。作爲如此之H G F基因，可例示如n a t u r e，342. 440 ( 1 989)、特開平 5 - 1 1 1 3 8 3 號公報、Biochem Bi〇phys Res. C〇mmun· μ，967(1 989)、特開平弘2 5 5 〇96號 公報等1己載之HGF基子，此等之基因可於本發明使用。 HGF基因，使用併入於適當載體者。例如，作爲於後 面所舉之病毒之基因中併入HGF基因之病毒載體，或將 HGF基因併入之適當之表現載體使用。 於本發明Γ醫藥」係指基於HGF所具有之藥理作用之 人類疾患之治療劑或.預防劑，例如可舉上記之治療劑或預 -9- 狀度適用巾關( cNS ) A4規格⑺公p 508241 - A7 B7 五、發明説明（7 ) 防劑。根據本發明，HCG基因導入細胞後，HGF於該細 胞表現，其HGF顯示藥理作用。因而，本發明之醫藥， 對於與HGF之對象疾患同樣之對象疾患有效。 例如，將H GF基因導入細胞内時，如同實施例中之記 載，促進血管内皮細胞之增殖，但無促進血管平滑肌細胞 之增殖。另外，如同實施例中之記載，於使用大鼠之動物 實驗，於身體内心臟中導入HGF基因時，可見血管新 生。因而，H GF基因有用於起因於以動脈疾患，尤其血 管平滑肌細胞之異常增殖爲主·體之障礙之各種疾患（例 如，血管擴張術（PTC Α)後之哥-狹窄、動脈硬化症、末梢 循環不全等）之治療、預防、心肌梗塞、心肌症、末梢性 血管閉塞症、心機能不全等之疾患之預防、治療。又， H GF本身亦促進血管内皮細胞之增殖，但無促進血管平 滑肌細胞之增殖’可用爲同樣之治療劑、預防劑，藉由 HGF基因之效果爲基於HGF本身之效果。 經濟部中央標李局員工消費合作社印製 另外，如同實施例中之記載，將HGF基因導入關節内 則促進關節軟骨細胞之修復，促進合成蛋白聚酶之細胞之 增殖。因而’ H G F基因對於種種軟骨傷害，例如骨形成 異常症、變形性關節症、變形性椎間板症、骨折之修復、 治癒不全、來自運動之外傷、奇帕恰（丰一六y千十）病等 之疾患之預防、治療有效、H G F本身亦促進軟骨細胞之 修復、增殖’可用爲同樣之治療劑、預防劑，藉由H G F 基因之效果爲基於HGF本身之效果。 「脂質體」爲以内、部具有水層之脂質兩層形成之閉鎖小 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 508241 - Af ---------- B7 五、發明説明（8 ). 胞姐’已知其之脂質2分子膜構造極近似於生體膜。作爲 氣作本發明之脂質體時使用之碍脂質，例如有卵轉脂、溶 血印磷脂等之磷酯醯膽鹼、磷酯醯絲胺酸、蹲酯醯甘油、 瑪醋酶肌醇、磷酯酸等之酸性磷脂質，或此等之醯基取代 成十二酿基、十四醯基、油醯基等之磷脂質、嶙醋酿。乙 醇胺、神經鞘髓磷脂等之神經鞘磷脂質等。又，亦可添加 膽固醇等。脂質體可自存在於通常之細胞膜中之脂質等之 天然材料以通常已知之方法製造。含有本發明之hgf基 因之脂質體，例如可將精製之磷脂質之薄膜懸浮於含有 HGF基因之溶液，施以超音波處理而製造。 又’含本發明之HGF基因之脂質體，亦可以與適宜之 病毒融合之膜融合脂質體。此種情形，將病毒以例如紫外 線使失活爲佳。作爲特佳之膜融合脂質體，可舉與仙台病 毒（日本血凝病毒：HVJ)融合之膜融合脂質體。此膜融合 脂質體可以日經科學，1 944年4月號、3 頁，j

Biol Chem·，266(6)，3 3 6 1 -3 3 64 ( 1 99 1 )等記載之方 經濟部中央標举局員工消費合作社印製 法製造，例如將以紫外線使失活之精製之HVj與含hgf 基因載體之脂質體懸浮液混合，緩慢攪拌後，藉由薦糖密 度梯度離心法除去未結合之HVJ，而可製備HVJ融合脂 質體（Η V J -脂質體）。又，使對標的細胞具有親和性者結 合於脂質體，可提高基因導入細胞之效率。作爲對標的細 胞具親和性者，可舉例如抗體、受體等之配位體等。 作爲HGF基因導入細胞内之方法，可大分爲藉由病毒 載體者及其他者（日經科學，1 994年4月號，20-45頁 -11 - "^紙張尺度適用中國國家標準（(：奶）八4規格（210/ 297公釐) 一 " 508241

五、發明説明（9 ) 月刊藥事，36(1)，23 -48 ( 1 994)，及此等之引用文獻 等）。於本發明之醫藥，可適用任何之方法。 作爲藉由病毒載體之導入方法，可舉例如於倒逆病毒、 腺病毒、與腺有關之病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰 質炎病毒、辛畢斯（夕y匕、只）病毒其他Rna病毒等中併 入HGF基因導入之方法。其中，以使用倒逆病毒、腺病 毒、與腺有關之病毒等之.方法特佳。 作爲其他導入方法，可舉脂質體法、脂染素法、微注射 法、磷酸鈣法、電泳脈動法等，·以脂質體法特佳。 又，於實際上將HGF基因作-爲醫藥作用，有直接體内 導入HGF基因之活體内法，及自人類採取某種細胞，於 體外將HGF基因導入該細胞，再使其細胞回至體内之活 體外法（日經科學，年4月號，20-45頁，月刊藥 事，1^X11，23_48 (1994)，及此等之引用文獻等）。於- 本發明之醫藥’按照治療目的之疾患、標的臟器等，可選 擇適宜之任何之方法。 活體内法與Ex Vivo法比較，費用與所發時間少且簡 便。活體外法，HGF基因導入細胞内之效率佳。 於本發明之醫藥，藉由In Vivo法投予時，可按照治療 目的之疾患、標的臟器等之適當投予途徑投予。例如可投 丁靜脈、動脈、皮下、肌肉内等，或直接投予腎臟、肝 臟、肺、腦、神經等之疾患之對象部位。若直接投予疾患 部位，則可臟器選擇性地治療”例如於使用對「p T C A後 之再狹窄」之基因治療，可以動脈内投予實施（實驗醫 -12- 本纸杀尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ 297公犛） ： 一 (請先閱讀背面之注意事項 -- 本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 508241 五、 發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 予 ’ 12 (15 增刊），1 298_1993 (1 994))，較好將本發 明醫藥上藥於PTCA之球端，塗於血管則可如此導入於血 皆内皮細胞及血管平滑肌細胞。 又’藉由活體外法之情形，依習用法，採取人類之細胞 (如淋巴球、造血幹細胞等），以本發明之醫票將其敏化， 進行基因導入後，進行將HGF產生細胞放回人類。 藉由活體内投予之情形，得取種種製劑形態（如液劑 等）’但一般採含有爲有效成分之HGF基因之注射劑等。 又’按照必要’亦可加慣用之載劑。該注射劑等可依習用 法製備，例如可藉將HGF基因溶於適宜之溶媒（例如經滅 菌水、緩衝液、生理食鹽水等）後，以濾膜等過濾滅菌， 接著充填於於無菌之容器而製備，又代替HGF基因，亦 可將併入HGF基因之病毒載體製劑化。另外，於包埋 HGF基因之脂質體（或ηJV-脂質體），可做成懸浮液、冷-滚劑、離心分離濃縮冷凍劑等之脂質體製劑之形式。 製劑中乏HGF基因之含量，可依治療目的之疾患、標 的臟器、患者年齡、體重等而適宜製備，但通常作爲 HGF基因，以0·000 1毫克〜100毫克，較佳〇 〇〇1毫克 〜10毫克，將此於數日至數月中1次投予爲適當。 實施例 ^ 以下，舉實施例更詳細説明本發明，但本發明並不限於 此等實施例。又，使用之實驗材料及方法，概要如下。 實驗材料及方法 ι 〇_HGF表現載體 (請先閲讀背面之注意事項本頁) I t In.. I - 1------ 士£%: 訂 13 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 508241 A7 第85113780號專利申請案 中文說明書修正頁(88年6 m

五、發明說明（ HGF表現載體之製備，藉於puc-SRa表現載體（FEBS 6 1 -66 ( 1 993))之Eco RI與Not I部位之間插入人 類 HGF cDNA (2.2kb ·· Biochem. Biophys. Res

Commun.，L72? 3 2 1 -3 27 ( 1 990)；曰本專利公開平5· 1 1 1 3 8 3 )而進行。於此質體載體，HGF cDNA之轉錄由 SRa 啟動子控制（Nature 3 42. 4 4 0 _ 4 4 3 ( 1 9 8 9 。 ②細胞培養 大鼠之冠狀動脈内皮細胞，藉由自8週齡之Sprague_ D awl ey (_.S D)大鼠之心臟以酵素消化，以密度梯度離心 法分離（Transplantation 5 7 . 1653-1660 (1994))。 大鼠之大動脈平滑肌細胞（以下稱為V S M C )自1 2週齡S D 大鼠以酵素處理而得（J· Clin· Invest.，9 3 · 3 5 5 -3 6 0 (1 994))。此等細胞，以含1 〇%(體積/體積）牛胎兒血 清、盤尼西林（100單位/毫升）、鏈徽素（100微克/毫升） 之DMEM培養基維持。細胞於37。(：、95%空氣-5%C02 之加溫大氣中，每2日交換培養基培養。此等細胞藉由免 疫組織學上及形態學上之觀察，顯示分別為内皮細胞及平 滑肌細胞。 人類大動脈内皮細胞（5代繼代）及人類VSMC(5代繼代） 使用購自克拉波（夕今求）公司者，以同上記之方法，於含 5 %牛胎兒血清、上皮成長因子（1 〇毫微克/毫升）、鹼性纖 維芽細胞成長因子（2毫微克/毫升）及地塞米松（1 μΜ)之 MCDB131培養基培養。 又，靜止期之内皮細胞，依】· clin· Invest.仏， -14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

-丨線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 508241

Af B7 五、發明説明（12 ) 1690-1697 ( 1 9 9 0);同前，9 4. 824-829 (1994)製 備。 ③ HVJ-脂質體之試營内導入基因 經敏化之内皮細胞或VS MC，1 〇8個播種於6個孔洞培 養皿，使增殖至80 %會合培養。細胞以含2 mM氣化鈣之 平衡鹽類溶液（137 mM NaCl、5.4 mM KC1，10 mM Tris-HCl，pH 7.6，以下稱爲「BSS」）洗3次，加實施 例1所得之H VJ-脂質體-DN A(含2.5毫克脂質及10微克 之包埋DNA)之溶液1毫升或比較例1所得之HVJ -脂質體-cont之溶液1毫升，於4°C、5尹，再37°C、30分培養。 細胞洗淨，於含1 0 %牛血清之新鮮培養基中，以C 〇 2培養 箱維持。 ④ 内皮細胞及VSMCH中之HGF濃麿之剃佘 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 敏化内皮細胞及V S M C產生之H G F濃度之測定以-ELISA法進行。亦即大氣或人類之内皮細胞或vsmC於6 孔洞之培養皿（Corning公司製）中以5 X 1〇4細胞/平方厘 米之細胞密度播種，培養24小時。敏化後24小時，交換 培養基再培養48小時。爲檢討HGF之放出，將敏化之細 胞（敏化48小時後）洗淨，加至含有胰島素（5 X 1 〇-7M)、 運鐵蛋白（5微克/毫升）及抗壞血酸（0·2 mM)之無血清培 養基中。24小時後，收集培養基，以6〇〇 g離心1〇分， 於-20C下保存。 培養基中之HGF濃度，以使用抗大鼠hgf抗體或抗人 類HGF抗體之酵素免疫法測定（Exp· Celh Ret 210 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2lOX 297公釐） 508241 五、發明説明（13 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 弟85113780號專利申請案 中文說明書修正頁（89年11月） q g修正,

補充I 326-335 (1994) ； Jpn. J. Cancer Res. 1262- 1266 (1992))。將免抗大鼠或抗人類HGF IgG於4t下 1 5小時塗佈於9 6孔洞培養皿（C o r n i n g公司製）。以含3 % 牛血清白蛋白之PBS(磷酸緩衝食鹽液）封阻後，加培養基 至各孔洞，2 5 °C下培養2小時。孔洞以含〇 . 〇 2 5 %吐恩（卜 々 < — > )之PBS(PBS-吐恩）洗3次後，加生物素化之免 抗大鼠HGF IgG或抗人類HGF IgG，於25°C培養2小 時。以PB S -吐恩洗淨後，孔洞與西洋山茶菜，過氧化酶 結合鏈抗生物素蛋白-生物素複合物（p B S -吐恩溶液）培 養。藉添加基質溶液（含2.5 mM鄰苯二胺、100 mM磷酸 鈉、50 mM檸檬酸、0.0 15%過氧化氫）開始酵素反應。 酵素反應藉添加1 Μ Η 2 S 0 4而停止，測定4 9 0 n m之吸光 度。又，抗人類HGF抗體只與人類HGF交叉反應，不與 大鼠HGF反應，又抗大鼠HGF抗體只與大鼠HGF交叉反 應，不與人類H G F反應。

0HGF 使用之人類及大鼠重組HGF使用自以含人類或大鼠 HGF cDNA之表現質體敏化之CHO細胞或C-127細胞之 培養液精製者（Cell，77., 26 1 -27 1 ( 1 994) ； J. Clin. Invest，3 5 5 -3 60 (1994))。 ⑥統計上解析 全部之實驗至少進行3次，測定值以平均值±標準誤差 表示。測定值之統計上解析，以當肯法（D u n c a η' s試驗） 進行。 16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規袼（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

B7 五、發明説明（14) 木精伊紅（HE)染色、阿丈（Azgjjj染色 導入HGF基因之大鼠於基因導入後、1〇天，以加肝素之 生理食鹽水灌流、宰殺，接著進行藉由以p B S製備之4 % 多聚曱趁之固定一夜。固定後進行石壞包埋，製作切片， 依常法進行HE染色、阿丈染色。於顯微鏡下數微小血管 數。 實施例1 盒jjGF表現載體之HVJ-脂質體之製 於四氫呋喃中，將磷酯醯基絲胺酸、嶙酯醯基膽鹼及膽 固醇以1 : 4 · 8 : 2之重量比混合。-四氫呋喃以旋轉蒸發器餾 除’使此脂質混合物（1 0毫克）析出於容器壁。自牛胸腺 精製之HMG 1核蛋白（高流動性群1核蛋白）96微克與質 體DNA(3 00微克）之BSS(200微升）溶液於2〇X：混合i小 時，接著添加上記之脂質。脂質體-DNA-HMG 1複合體-懸浮液以渦旋混合，超音波處理3秒，攪摔30分。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 精製之Η V J (Z株）於鹽使用前以紫外線照射（〗1 〇耳格/ 平方t米秒）3分使失活。將上記所得之脂質體懸浮液 (〇·5亳升含脂質1〇毫克）與HVJ(20,〇〇〇血凝單位）加BSS 使全液量成4¾升，混合。此混合物於4 °C培養1〇分，再 於37 °C慢慢攪拌30分。未融合之HVJ以蔗糖密度梯度離 心法’自HVJ -脂質體除去。亦即以收集於薦糖密度梯度 之上層，得含有HGF表現載體之HVJ-脂質體（含1〇微克/ 毫升之H GF表現載體）。以下!將含有η GF表現載體之 HVJ-脂質體稱爲HYJ-脂質體-DNA。 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 508241 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - A7 ___ B7五、發明説明（15 ) 實施例2 含HQF表現載體之HVJ-脂質體之投予^^ 含HGF表現載體之HVJ-脂質體之製備，使用64微克 HMG 1核蛋白，200微克質體DNA，依實施例記載之方 法進行’又，脂質體懸浮液0.5毫升，含毫克脂質）與 HVJ(3 5,000血凝單位）加BSS使成全液量爲2毫升，混 合0 對於SD大鼠（400-500克；自日本查爾斯里巴（千十一 a久' y a —）公司購入），腹腔内投予戊巴比妥鈉鹽（〇 1毫 升/100毫克）麻醉，保溫，由自-動呼吸器確保呼吸。大鼠 實施左側開胸術，用3 0G之注射針將HVJ-脂質體-DNA 或Η V J -脂質體-c ο n t (2 0微升）直接、愼重地注入心尖。 比較例1 不含HGF表現載體之HVJ-脂質體之製造 於不含HGF基因之載體，進行與實驗例1記載方法相同 之操作，製造不含HGF表現載體之HVJ-脂質體。以下將 不含HGF表現載體之HVJ-脂質體稱爲HVJ-脂質體-cont 0 比較例2 含人類TGf-β表現載體之HVJ-脂質體之製備 用人類TGF-β表現載體，與實施例1同樣地製造含有人 類TGF-β表現載體之HVJ-脂質-。 以下將含人類TGF-β表現載體之HVJ -脂質體稱爲 HVJ-月旨質體-DNA(TGF-p)。

訂 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 508241 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 —Μ Β7 五、發明説明（16 ) 試驗例1 將HVJ-脂質體_DNA敏化之大鼠冠狀動脈内i細胞之 HGF之表現 將HVJ-脂質體-DNA(脂質體中之HGF表現載體濃度： 10微克/毫升）於大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：108個） 中敏化，以ELIS A法測定HGF之產生量。作爲對照，使 用HVJ-脂質體- cont進行同上記之試驗。另外對於非敏 化之冠狀動脈内皮細胞亦測定HGF產生量（無處理群）。 其結杲示於圖l(n = 6)。圖中）HGF爲將HVJ_脂質體 -DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮;I田胞群。 如圖1所示，將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈 内皮細胞產生分泌高含量之HGF。相對於此，無處置群 及HVJ-脂質體- c〇nt受敏化之冠狀動脈内皮細胞群，無 認定實質上產生HGF。 試驗例2 經敏化之H G F之表現載體對於内皮細胞增龜之效果 於人類内皮細胞中將Η V J -脂質體· c 〇 n t感化，於外源 性添加之重組人類H GF存在下（1，1 〇及丨0 〇毫微克/毫 升）’或非存在下培養，測定細胞數之增加率（％) 3其結 果示於圖2(折線圖）（n = 6)，圖中，DSF表將HVJ-脂質體 -cont敏化之内皮細胞群，HGF表所定濃度之重組人類 HGF存在下培養之群（* : p<〇〇5，** :?〈〇〇!(對 DSF))。 ， 如圖2之折線圖所示，明白藉外源性添加之H G F促進内 -19- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 (請先閲讀背面之注意事項寫本頁}

、^1 508241 第85113780號專利申請案 中文說明書修正頁(88年6月） A7 五、發明說明（ 17 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 皮細胞增殖。 一方面，培養將HVJ-脂質體_DNA(濃度·· 1()微克/亳 升）敏化之内皮細胞，測定細胞數之增加，求增加率 (%)。又，作為對照，培養將^1¥厂脂質體乂❹以敏化之内 皮細胞，測定細胞數之增加，求增加率（％)。其結果示於 圖2(長條圖）（n = 6)。圖中，DSF表將HVJ·脂質體_cont 敏化之内皮細胞群，HGF載體表將HVJ-脂質體_0：^八敏 化之内皮細胞群（** : Ρ<0·01 (對DSF)，# : p<〇 〇5 (對 HGF，l〇p毫微克/毫升）。 如圖2之長條圖所示，明白了將HVj_脂質體-DNA敏化 之内皮細胞之增加率與對照組相比顯著地高，又對外源性 添加之H G F之效果亦有意性地高。 另外’將上兒之Η V J -脂質體-D Ν Α敏化之内皮細胞， 於兔抗人類HGF抗體存在下或非存在下進行，測定細胞 數之增加，求增加率（Q/。）。又，作為對照，將HVJ_脂質 體-cont敏化之内皮細胞培養，用樣地求細胞數之增加率 (%)。又，兔抗人類HGF抗體藉文獻（Jpn j Cancer Res，H 1 262- 1 266 ( 1 992))中記载之方法精製，此抗 體於10微克/毫升之濃度，可將1〇毫微克/亳升之生物活 性中和。另外’抗人類HGF抗體只與人類hgF交叉反 應，不與大鼠HGF反應，抗大鼠HGF抗體只與大鼠hgf 交叉反應’不與人類HGF反應。又，使用正常之兔血，生 I g G (1 0微克/毫升）為對照組。 其結果示於圖3(n = 6)。圖中，對照表於IgG對照之存 20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項$寫本頁) · •線- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 508241 a7 B7 五、發明説明（18 ) 在下培養之HVJ-脂質體-cont敏化内皮細胞群；HGF表 於IgG對照之存在下培養之HVJ-脂質體-DNA敏化内皮細 胞群；HGFab表免抗人類HGF抗體存在下培養之HVJ-脂 質體-DN A敏化内皮細胞群。又，增加率（％)以對照之增 加率爲1 0 0之相對％表示（* : P < 0.0 1 (對對照），# : P<0.05(對 HGF)。 如圖3所示，由於抗人類HGF抗體之存在，HVJ -脂質 體-D N A敏化内皮細胞之增殖受抑制，爲與對照同程度之 細胞増加率。由此明白，HGF爲内皮細胞之増殖因子。 試驗例3 - 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC之培卷上渣湓對 大鼠冠狀動脈内皮細胞之效杲 將HVJ -脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC之培養上清液 加入於爲靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞培養系（細胞· 數·· 1 0 5個），培養3天，調查該内皮細胞數之增加。作爲 對知、’使用將Η V J -脂質體-c ο n t敏化之大鼠v S M C之培 養上清液，同樣地調查内皮細胞數之增加。其結果示於圖 4(η = 6)。圖中，對照爲添加將HVJ-脂質體-cont敏化之 大鼠VSMC之培養上清液之群；HGF爲添加將HVJ-脂質 體-DNA敏抱之大鼠VSMC之培養上清液之群。 如圖4所示，於添加將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 VSMC之培養上清液之群，内皮細胞數可見有意性之增 加0 { 將上記之HVJ·脂質體-DNA*HVJ_脂質體-c〇nt敏化 _ -21 - 本纸張尺度適用中晒家標準（CNS 格（------ (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 衣. 本 訂 508241 A7 B7 五、發明説明（19 ) 之大鼠VSMC之培養上清液之HGF濃度，以使用抗人類 HGF抗體及抗大鼠HGF抗體之ELISA法測定。又，非敏 化之VSMC之培養上清液中亦測定HGF濃度（無處置 群）。 使用抗人類H GF抗體之測定結果示於圖5，使用抗大鼠 HGF抗體之結果示於圖6(任一者皆η = 6)。圖中，對照爲 將HVJ-脂質體-cont敏化之大鼠VSmc之培養上清液 群；HGF爲將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC之培 養上清液群。 -

如圖5所示，於將HVJN脂質葶-DNA敏化之大鼠VSMC 之培養上清液檢出H G F，其値相對於對照爲有意性地 高。 又，如圖6所示，於將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 VSMC之培養上清液亦檢出大鼠11(}17，其値相對於對照 爲有意性地高。 又，如圖5與圖6所示，於無處理群及對照群，培養上 清液中無存在可以E LIS A法測定之程度量之H G F。 試驗例4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 避耳V J DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞 鼠冠狀動脈内皮細胞之效旲 .將HVJ-脂質體_DNA敏化之大鼠冠狀動脈内丰細胞之 培養上清液加入於靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞培養系 (細胞數105個）中，培養3天”調查該内皮細胞數之増 加。又’作爲對照，，使用將HVJ-脂質體_cont敏化之 -22- 本纸張尺度適用中關家榡準（⑽）a4^ ( 2似297公羡 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 508241 _ ΑΊ __ B7 五、發明説明（20 ) 鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液，同樣地調查内皮細胞 數之增加。其結果示於圖7。圖中，九爲添加將HVJ -脂質 體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之群 (n = 8) ; B爲添加將HVJ-脂質體-cont敏化之大鼠冠狀動 脈内皮細胞之培養上清液之群（n = 8) ; C爲無處置群 (n=15) 0 如圖7所示，於添加將HVJ_脂質體·〇ΝΑ敏化之冠狀動 脈内皮細胞之培養上清液之群，内皮細胞數可見到有意性 地增加，相對地於對照群，細胞數與無處置群同程度。 (對照群·· 0.117±〇·〇〇2 ;—Α 群：〇·ΐ48±〇·〇3 ， Ρ<0·01)。 其次，於將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠冠狀動脈内 皮細胞之培養上清液中加抗HGF抗體，與上記同樣調查 内皮細胞數之增加。其結果示於圖8(n = 8)。·圖中，a爲 添加知Η V J -脂^體敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養 上清液之群；Β爲添加將HVJ-脂質體_cont敏化之大鼠冠 狀動脈内皮細胞之培養上清液之群；c爲於脂質體· DNA-敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液中添加 4/lHGF抗體之群；D爲於HVJ-脂質體_dnA敏化之大鼠 冠狀動脈内k細胞之培養上清液中添加對照抗體之群。 如圖8之A及C所示，將HVJ-脂質體-dna敏化之大鼠 冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之細胞増殖促進活性，藉 由添加抗HGF抗體而完全消失。f藉此明白，將hvj_脂質 體-D N A敏化之大鼠冠狀動脈内皮細胞之培養上清液之細 -23- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

508241 -A7 B7 五、發明説明（21) 胞增殖促進活性歸因於HGF。 試驗例5 將H_YJV脂質—體-DNA敏化之人類VSMC對人類内皮細胞 之效果 播種於人類VSMC細胞培養插板（克斯特（—只夕一） 公司製，孔徑0.45微米）以添加1〇 %牛血清之DMEM培養 基使增殖。一方面，人類内皮細胞播種於6孔洞培養皿， 以加1 0%牛血清之DMEM培養基維持。至VSMC成80% 含合培養時，與HVJ-脂質體-DNA(脂質體中之DNA含 量·· 10微克）或HVJ-脂質體- ccTnt於4°C培養5分，接著於 37°C培養30分。敏化後，將含敏化VSMC之插板加於含 靜止期之人類内皮細胞之孔洞内。將VSMC與内皮細胞於 含0.5%牛血清之DMEM培養基中共同培養3天，用WST-細胞數測定套組（和光公司製）進行細胞數之測定。其結果-示於圖9(n = 6)。圖中，對照爲與HVJ-脂質體- cont受敏 化之VSMC之共同培養群；HGF爲HVJ-脂質體-DNA受 敏化之VSMC之培養上清液群。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如圖9所示，明白HVJ -脂質體- DNA受敏化之人類 VSMC，使靜止期之非敏化人類内皮細胞之增殖有意性地 增加。 試驗例6 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC對大鼠冠妝韌 内皮細胞之效果 ! 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC(細胞數：1〇8 -24 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " ~ 508241 "ΑΊ B7 五、發明説明（22 ) 個）與靜止期之大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：1 0 5個）共 同培養3天，調查該冠狀動脈内皮細胞之增加數。又，作 爲對照’使用HVJ-脂質體-cont受敏化之大鼠VSMC， 同樣地共同培養，調查内皮細胞數之增加。其結果示於圖 l〇(n = 6)。圖中，Hgf爲將HVJ-月旨質體DNA敏化之大鼠 VSMC群，對照爲將HVJ-脂質體-cont敏化之大鼠 VSMC 群。 如圖10所示，藉由將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠 VSMC所放出之HGF刺激内皮細胞之增殖，可確認細胞 數之增加（對照群：0·126±0·00Ί5，HGF 群：0.156 士 〇·〇1 Ρ<0.05) 〇 試驗例7 將H VJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC之增殖 將HVJ-脂質體-DNA敏化之大鼠VSMC與HVJ-脂質體一 -c ο n t敏化之大鼠V S M C分別個別培養，檢討細胞數之增 加，但將HVJ-脂質體-DNA敏化對細胞增殖並無予以任 何影響。自此明白HGF對於VSMC並無細胞增殖促進活 性0 試驗例8 於直接注入HVJ -脂質體-DNA之大鼠心肌之新生血管增 將直接注入HVJ-脂質體-DNA之大鼠心肌、直接注入 HVJ-脂質體-cont之大鼠心肌及無處置之大鼠心肌以HE 染色、阿丈染色，以.顯微鏡數微小血管數。其結果示於圖 -25- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公瘦） (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) 太 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 508241 "A7 B7 _______ ____—_____________ — 五、發明説明（23 ) 1 1。圖中HGF爲直接注入H VJ -脂質體- DNA之大鼠心肌 之微小血管數，對照爲直接注入HVJ -脂質體- cont之大 氣心肌之微小血管數。 如圖1 1所示，於注入HVJ-脂質體DNA之大鼠心肌，與 注入HVJ -脂質體- cont之大鼠心肌及無處置之大鼠心肌 比較，有意性地增加微小血管數。此顯示具内皮細胞增殖 作用之HGF，於生體具血管新生作用。 試驗例9 藉由於關節内直接導入HVJ_腊質體- DNA之關節軟骨之 - 於10週齡之費氏（7 4 vシ十一）大鼠之大腿骨顆間 部，用1.8毫米之基爾希呢（牛小夕二十一）鋼線貫穿軟骨 下骨製作損傷。於手術後1週之時點，將實施例1所製作 之HVJ-脂質體- DNA(100微升/膝）直接導入關節内。作_ 爲對照，將比較例1所製作之HVJ-脂質體-cont及比較例 2所製作之HVJ-脂質體-DNA(TGF-p)同量投予關節内。 於導入此等基因1、3、4週後，將大鼠宰殺，組織學上觀 察修復部位。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其結果如圖12所示，於HVJ-脂質體-DNA投予關節内 後3週’於秦復組織中之一部分確認被認定合成以甲苯胺 監染色可被染色之蛋白聚酶之軟骨樣細胞之出現。又如圖 13所不’於HVJ-脂質體-DN A投予關節内後4週，再確認 被認足合成蛋白聚酶之軟骨樣細胞之出現範圍擴大之傾 向0 _____ -26- ^紙張尺中國國家標準（y 508241 - Af 一 B7 五、發明説明（24 ) 如圖1 4所示，比較例2所製作之ΗVJ-脂質體-DNA(TGF-P)投予關節内之情形，於投予後4週無法確認 此種款骨樣細胞之出現。又，如圖1 5所示，於比較例1所 製作之HVJ-脂質體-cont投予關節内之情形，於投予後4 週，無法確認此種軟骨樣細胞之出現。 試驗例1 0 將含有大鼠HGF之DNA之腺病毒敏化之大鼠冠狀動脈内 皮細胞之HGF之表現 使含有大鼠HGF之DNA之腺病毒（理化學研究所 (RIKEN GENE BANK) : Adixl CA 大鼠 hgf )感染於 來自人類胎兒腎之293細胞，2〜3日後得高力價病毒液（實 驗醫學，1 804〜1 8 1 0 ( 1 994))。將所得之病毒液 1〜5 X 1 0 8 p fu於大鼠冠狀動脈内皮細胞（細胞數：1 0 8個） 中以MO II〜5敏化，以ELISA法測定HGF之產生量。其· 結果，將含有大鼠HGF之DNA之腺病毒敏化之大鼠冠狀 動脈内皮細胞產生分泌高含量之HGF。 產業上之利用可能性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之醫藥，與HGF本身之投予相比，治療效果爲 持續性，又由於可使局部選擇性地作用，可減低HGF之 副作用。 -27-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 508241 ., r '丫、！ 平月α π.乂 i •ΊΛ. i 第851Β78Ό號專利申請案 補充說明書（89年12 試驗例11 利用含有HGF基因之HVJ脂質體在心肌症上之治療效果 實驗材料及方法 實驗動物 心肌症倉鼠（Biol4.6)係由東方酵母（公司）購得。 HGF某差 所採用之人類HGF基目，係由人叙HGF的Cdna (日本特許第 2777678)依通常方法所選殖，並將其插入表現載#豊pcDNA (Invitrogen 公司製）者。 貫驗方法 1.在超音波使用下，以HVJ脂質體將報導者基因的螢光素酶導入心 肌症倉鼠的心臟中，於1週之後檢測其活性。對照組則只有在超 首波的使用下導入PBS。螢光素酶之活性測定係以螢光測定計 (LamatLB9507 (BERTHOLO 公司)）進行。 2·在超音波心臟動態探測儀（MD500, YOKOKAWA-GE)的操作下， 對於心肌症倉鼠(12週大)的心臟之偏腹部心肌，進行脂質體 製劑之注入，並如下述之1)〜3)之研討。 1)以ALP染色測定心肌内之毛細血管密度，並將HGF基因與對 照組之情形作比較。

U:\T\TE\WCK\JKP\B\45205SUP.DOC 2) 以雷射•都卜勒•影像捕捉（LDI)評*器，來評估心臟中有被 投與HVJ脂質體製劑時之血流量，並將HGF基因與對照組之 情形作比較。 3) 進行心肌之Ma麵純，·電騎析麵定纖維化之分布 密度，並將HGF基因與對照組之情形作比較。 HVJ脂質體製劑之製作 將10晕克〈乾燥脂f (磷脂酿絲胺酸、鱗脂臨膽驗、膽固醇的 1:4.8:2之混合物），以及含有HGF基因（1〇〇^g) _ mobility group i nuclear protein，25~ 之等張液（i37 _ Naa，5·4 _ KC1，1G_ Tris_HC1; pH 7.6) 川昆合，激親掉後施以超 首波，而形成脂質體。將純化之仙台病毒（z株）照射^ (11〇吨/醜I) 3分鐘。將脂質體懸浮液與仙台病毒（簡）混合， 於代下加溫1〇分鐘，再於37。〇下加溫：3〇分鐘。除去游離之 HVJ，而取得hvj脂質體製劑。 I光素酶活性之須il宕 、對於倉鼠⑽6隻）投與螢光素酶基因心g之脂質體製劑，並 於1週後測定其螢光素酶活性。結果示於圖丄。 如圖1所TF ’ ^臟中讀光麵顯示較高值，證明在超音波使用 下可以導入基因。 因治療心肌症会| 將月曰貝體製劑注入I2週大之心肌症倉鼠（1群6隻）的心臟腹部側 〜肌中。對照組為將含有對照載體之脂質體襲同樣地注入12 u:\type\wCk\jkp\b\45205SUP D〇c 週大之心肌症倉鼠（1群6隻）中，另外，未處理群則為無處理的心 肌症倉鼠（1群6隻）。其後，每週注入脂質體製劑，共計8次。8週 後，將20週大之心肌症倉鼠心臟之心肌内的毛細血管密度，利用 ALP染色加以測定，並以LDI評分器來評估該血流量。又，於讓倉 机士矣化之後，摘取其心臟並進行Masson染色，再利用電腦加以 解析來測定纖維化之分布密度。 藉由ALP染色，HGF基因治療群可顯著地見到由血管新生所造 成的毛細管密度上升現象。其結果示於圖2。 LDI評分器，若將對照組當成1(^%時，則H(}F基因治療群為 163±7%，其血流量顯著地增大。該結果示於圖3。

Masson染色《解析方面，在HGF基因治療群可顯著地見到纖維 化分布密度有減少。其結果示於圖4。 試驗例12 : 到用含趣繼4豊在下肢缺▲卜士治療教罢 實驗材料及方法 實驗動物 投與群：糖尿病大氣__大鼠）之Tit&m 對照组•大氣：正常大氣之下肢缺血大鼠 脂質體擊劑^ 利用在^腫瘤抗生素㈣eptozQtGein)，而使16週大之 U (1群6隻：）4發糖尿病’以外科手術切除其單側大腿動脈的一 部分，而將其下肢部製作成缺血狀態。

U:\TYPE\WCK\JKP\B\45205SUP.DOC 將含有HGF基因之HVJ脂質體製劑，與試驗例u同樣地作成， 並將其注入下肢缺血骨骼肌中。 在脂質體製劑投與之後，利用雷射散亂光解析原理之雷射•都卜 勒•影像捕捉器（LDI)，來測定其下肢血流，以之作為觀察其側副 血行路徑軸以及血流改善效果之指標。將崎於正f下肢的缺血 下肢之色調鮮分布喊（eQlOTed histQgram)之平均值，作為 血液回流比（perfusionratio)。 以驗性磷酸酶⑽巧染色來測定下〜肢缺血部分的毛細血管密度， 並將糖尿病下肢缺血大鼠群與_組之T肢缺血^、群，作相^之 比車又。另外’亦將HGF基因的投與群與未投與群作比較。 治療對於糖屁症下肢缺血士窟夕姑平迅 對於該利贿㈣投與鎌瘤抗生素而驗之16週大之糖尿病 大藏（1群6隻）以及16週大的正常大鼠（1群6隻），以外科手術切 除其單側大腿鎌的-部分，而將其下肢轉作成缺錄態。在以 外科手術切除其大腿紐之後，將含有卿基因⑼㈣之_脂 質體製劑，導入下肢缺血部位之肌肉内。 3週之後雷射·都卜勒•影像捕捉器測定缺血部位之血液 回流比率，投與HGF基目之糖尿病下肢缺血域，其缺血部位 之血液回流比率，若鱗照組之下·血大⑼及未投與之上述糖 尿病下肢缺血大鼠相比較時，係顯著地增加。 若將對照組之下肢缺血大鼠之血液回流比設為1〇〇%時，未投與 U:\TYPE\WCK\JKP\B\45205SUP.DOC -4- 麟从“ 6.7%，而投與hgf基因之糖尿 肝肢缺血大藏則為129%。其結果如圖5所示。 缺製同處理之糖尿病下肢缺血大鼠、以及對照組之下肢 而進行rGF翻治療。5週後，取出各大鼠之下肢缺血 ^心肌’進彳T ALP染色，以比較其每單位面積之血管數。在 T HGF翻之糖尿病下肢缺血大鼠中，其麟照組之下肢缺 大队相比車乂’則具有統計上有意義之較少的血管數；有投與恥ρ 土 尿病下肢缺血大鼠，其血,則為統計上有意義地增加。 此結果示於圖6。 試驗例13 直接下肢缺血的治♦於早 吾人檢視了「裸」人類HGF f體觀錢子後腿缺血模型之情 形:在偵測人類HGF蛋白質的同時，利用雷射•都卜勒·影像捕 、-進行#估’可發現人類HGF質體注射於肌内可導致明顯的血 机立曰加。相對於以芝白載體轉染之兔子，在以人類那F轉染之兔 子中’可發現其毛細血管密度在劑量依存下（p<001)冑明顯地增 加更重要地，在轉染5週後，該由HGF質體轉染所誘導之血管新 生程度，顯著地大於單次注射之重組HGF所謗導者。在人類基因 ’ 口療的研旯上’吾人亦使用了兔子後腿缺血模型作為前臨床研究。 將裸」人類HGF質體注射於兔子缺血之後腿肌内，其中，股動 脈係被用於誘導後腿單側缺血。手術後第10天在肌内注射HGF質 U.\T\T>E\WCKVTKP\B\452〇5sup D〇c 月旦/人而於第31及45天在缺血模型中以血管顯影術評估時，可 發現有明顯地側血管增生之現象（p<aG1，圖7)。—系列的血管顯 影圖顯示，在該HGF-轉染之動物中，其側血管之線性延伸情形係 由起點的幹祕4至再構築之發源血管的末梢點。此外，相對於以 空白載體轉染之兔子，在以人類HGF質體轉染之兔子中，可觀察 到其在都卜勒血流評估上，血流有明顯之增加，同時其血壓比（缺 血後腿相對於正常後腿）亦有明顯之增加（Ρ<〇·〇1，圖8)。 試驗例14 利用HGF基因之直接導入在心肌梗塞上之治療效果 以LAD連合來製作豬的心肌阻斷模型。在結合24小時之後，使 用導管將作為賴組之人類HGF基® (「裸」DNA)或勞光素酶基 因（由CMV啟動子所啟動）注射至心尖（Αρ)、前壁（Αη)、中隔壁 (S)、或外側壁（L)(各質體250/ig)。在注射々天之後，可在所有的 心肌節中偵測到螢光素酶活性（Ap:482±189, An:512±187, S:398±140 L:265±78, Xl〇4RLU/g組織）。這些資料顯示了以導管進行之基因轉 染的可行性。相似地，人類HGF基因也可在所有的心肌節中被偵 測到螢光素酶活性（Αρ:4·2±1·5, An: 6.4±2.0, S:5.4±l.l，：l.55+18 ng/g組織）。人類HGF基因之表現甚至可在轉染4週後偵測得到。 此外，HE染色顯示以HGF基因轉染之心肌血管數目，相較於對照 組係明顯地增加（Ρ<_)。進-步，吾人亦藉由螢光微球粒評估了 血液之供應量。以HGF基因轉染之心肌血流量，其相較於對照组 係明顯地增加（C; Αρ:1·45±0·26，Αη:1.07±0·24，S:1 37+0 55

U:\T\TE\VVCK\JKP\B\45205SUP.DOC L：2.04±0.45, HGF; AP:1.98±0.39*5 An:1.36±0.18*5 S:2.58±0.42*, 組織，*Ρ<0·01 vs c)。冠狀血管顯影圖亦顯示 經由HGF誘發之側面形成之由再管道形成的^^。 [圖面說明] 圖1係使用HVJ將報«基因之勞光素酶導入心肌症倉鼠的心臟 中’藉由使錢光細活性齡為冑值，而翻在超音肢用下可 以導入基因之結果的圖。 圖2係以ALP染色來測定，續中之毛細血管密度，而表示膨 基因與對照組之比較結果之圖。 圖3係以雷射·都卜勒•影像捕捉（LDI)評分器，來評估心臟中 之血流量，而為HGF基_、對照組群與非處·之比較結果 圖。 圖4係以Masson染色來測定心肌中纖雒化之分布密度，而為 HGF基因與對照組之比較結果圖。 圖5係對於糖尿病之下肢缺血大鼠，其^^基因投與群及未投與 群，以及麟正常域被繼而產生下肢缺蚊對照組群，其血回 流比之測定結果圖。 圖6係對於糖尿病之下肢缺血大鼠，其HGF基因投與群與未投與 群，以及對於正常大鼠被刺激而產生下肢缺血之斜照組群，將其下 肢缺血部位之倾廳ALP加以純後，每單位血的比較結果 圖。 圖7係表示在兔子後腿缺血模型在外科手術後，將hgf質體注射

U:\T\TE\WCK\JKP\B\45205SUP.DOC 至肌内，以血管 形之圖。 顯影 々所外估時，其所產生之明顯地側血 管增生情 2係表’抑之好，在以卿質體轉染之 、 料到其在都卜勒血流評估上，血壓比（缺血後腿相對於 正常後腿）有_地增加_之圖。 、；

U:\TYPE\WCiC\JKP\B\45205SUP.DOC 508241 圖1 ο 20 1500 1000 500 2000 ο ο ο 5 0 5 1 i— ^3/mdt,0L* ο

未處理組 對照組 HGF組 0 508241 圖3 20 5 ο 〇 ο 5 1 it 次聲与#ί^φ 〇 20 5 ο

未處理組 對照組 HGF組

圖4

NS p<0.01

HGF組

未處理組 對照組 508241 20 (次)^沒赠^名 圖5 ρ<〇·〇1 Ρ<〇·01 50 ο ο ο 5 40C20( 〇 翻iil 對照組 糖尿病大鼠 糖尿病大鼠/ HGF基因投與群 圖6

對照組 糖尿病大鼠 糖尿病大鼠/ HGF基因投與群 508241 \ - · 圖7 ο 40 00 3 ο 20 ο ο 1 ο 盈分數（3W) 图分數（5W)

對照組 HGFlmg HGF2mg 508241 圖8

200「

Claims (1)

1. 508241 第85113780號專利申請案 中文申請專利範圍修正本（91年3月） A8 B8 C8 六、申請專利範圍 補态丨-種 公告本 ill 一種膜融合脂質體，係與仙合病毒（HVJ; Hemaggluttinating Virus of Japan)融合，含有可 表現HGF蛋白之HGF基因。 2. —種醫藥組合物，其係以前述申請專利範圍第1項所記 載之膜融合脂質體為有效成分，係用作為動脈疾病治 療劑或軟骨障礙治療劑。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）