TW518229B - Prophylaxis and/or treatment agent for septicemia - Google Patents

Description

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【發明技術領域】 本發明係有關一種以腫瘤細胞致毒因子（τ·〇γ Cytotoxic Facto卜n :tcf—e)為有效成分之敗血症 防及/或治療劑。經由本發明可提供對於至少一種以 自由感染症、烫傷、手術、癌症、後天性免疫不全選 un)S)、放射線治療、化學療法、長期中心靜脈營^候群 (TPN)所成組群為主要發症因素之敗血症之優異預防 或治療劑，且該藥劑可作為醫藥品使用。 / 【發明技術背景】 一般之敗血症為身體組 害處，由該病菌侵害處，細 入血流中而發症之重症全身 包括例如惡性腫瘤、白血病 全症候群（AIDS)、膠原病、 礙、糖尿病等基礎疾病之病 性免疫不全者及細胞性免疫 腎上腺類固醇或抗腫瘤劑之 療或留置導尿管、血液透析 置、進行手術時為誘因而發 生素對敗血症進行治療，但 氧苯青黴素耐性黃色葡萄球 現，所以敗血症仍占全體致 患由於敗血症而死亡。 織或臟器之某處有細菌感染侵 菌或其產物不斷地或斷續地侵 性感染症。敗企症為以對帶有 、惡性淋巴腫、後天性免疫不 腎不全、肝疾病、腦血管障 患、高齡者、早產兒之類之液 不全者之抵抗力減弱之宿主作 化學療法、鈷照射之放射線治 、臟器移殖、心臟手術等之處 症。近年來開發各種有力之抗 是，由於有所謂對青黴素或甲 菌等之各種抗生素耐性菌出 命率之約25%，每年有許多病 有關敗血症之原因菌， 除了上述之各種抗生素耐性菌

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以外還可列舉如腸鏈球菌、 膿桿菌、*雷白氏菌、【形菌之大腸菌、綠 桿菌所引起之敗血症，☆初期發：革蘭氏陰性 換氣及ϊ = 抗降低、心搏出量增加、過度 不全。之德：尚乳酸血症等症狀，甚至於導至心 毒、音埸iv陷入血壓及心搏出量降低、代謝性酸中 至 ^ A低血糖荨嚴重狀態，甚至於導 ，對於治療這些敗血症之重要性被提倡著。 咬補：：，對細菌侵入生體内之途徑可分為為了注射輸液 脈内留置導管或穿刺針，而成為感染途徑之 腸、首L 分布於以腸道為首之人體内之常在菌經由 侵入之内因性2大類。此種細菌或細菌產生物由腸 f移動稱為細菌移位或内毒素移位，為導至敗血症之導 線而被注意。細菌或細菌產生物由腸道之移動係在烫傷 =大手術等之高度侵襲時，或對手術後之病患或意識障礙 病患長期施行TPN時被發現，而成為大問題。 對於包括細菌移位之敗血症之治療，抗生素為第一選 擇’但是雖然抗生素可轉認一定之效果，卻會產生副作 用、耐性菌，甚至導至休克，此點被認為是抗生素效果之 界限。又，為達恢復病患免疫機能之目的，亦可實施經由 輪液補給營養或是經由7 -球蛋白製劑之治療，但此法只 疋使用作為抗生素治療之補助治療法，為無效果性之治療 法〇 【發明之陳述】

C:\Program Files\Patent\310493.ptd 第 5 頁 518229 五、發明說明（3) 本發明人們對於敗血症之治療藥物作深入研究之結果 發現，已知之作為腫瘤細胞致毒因子之TCF- Π對於敗血症 具有優異之預防及治療效果。因此，本發明以提供以TCF-Π為有效成分，對於敗血症，尤其是對至少一種選自由烫 傷、手術、癌症、後天性免疫不全症候群（AIDS )、放射線 治療、化學療法、長期中心靜脈營養（TPN)所成組群為主 要發症因素之敗血症之預防及/或治療劑為課題。 經由本發明，可提供以TCF- Π為有效成分之敗血症之 預防及/或治療劑。本發明之藥劑可用作為敗灰症=其 是至少一種選自由感染症、燙傷、手術、癌症、後天性免 疫不全症候群（AIDS)、放射線治療、化學療法、長期 靜脈營養（TPN)所成組群為主要發症因素之敗灰症 及/或治療劑。 ’預防 本發明之有效成分TCF- E為來自人體纖維芽細胞 & 知之蛋白質，具有下述之特性 i )分子量（S D S電泳分析法） 非還原下：78, 000 土 2, 00 0或 74, 000 土2, 000 還原下：52,000 土 2,000 (光譜帶八） 30, 000 土 2, 000 (光譜帶 B ) 26, 00 0 土 2, 00 0 (光譜帶 C ) i i )等電點 ：7. 4至8. 6 上述之TCF- Π可由將人體纖維芽細胞培養液濃 吸附於離子交換體，其溶出液用親和層析法精翻’ 衣 < 万法

518229 五、發明說明（4) (W0 90/10651號公報）或用基因工程技巧（WO92/01053號 公報）獲得。 本發明之有效成分TCF- ϋ可使用來自人體纖維芽細胞 IMR-90，或使用根據於WO90 /1 〇65 1號公報所揭示之基因 序列，將微生物或其他細胞進行基因重組之產物。又，亦 可使用根據W092/01053號公報所揭示之基因工程技巧所 獲得之產物。此時，由於宿主細胞或微生物不同，其糖鏈 亦不同，因此，可使用不與糖鏈結合之產物，但是，較好 使用與糖鏈結合之產物。根據這些方法所獲得之Tcf— jj可 用一般之單離精製法加以濃縮、精製彼等方法可列舉如經 由有機溶劑之沉澱法、鹽析、凝膠過濾、使用單株抗體之 親和層析法、電泳分析法等。經由使用單株抗體之親和層 析法進行精製時可使用於特開平5-97號公報所揭示之單^ 抗體進行精製，所獲得之精製TCF- Ε可用冷凍乾燥或冷；東 保存。其他只要是具有與TCF- Π相同活性者即可作為與本 發明相同之藥劑而予以利用。例如：具有與TCF- Π蛋白質 5胺基酸不同之蛋白質之肝細胞增殖因子（HGF :特開昭 63-22526 號）或精製離散因子（Scatter Factor)(SF : Gherardi 及 Stocker· Nature， 346， 228(1990))等。 ^ 本發明之敗血症預防及/或治療劑可作成注射劑經由 靜脈、肌肉或皮下投予。這些製劑可依照公知製劑學:梦 法製造之，必要時可添加如pH調整劑、緩衝劑、安定化^ 等。將本發明之製劑投予病患時之量依投予病患之症狀程 度、健康狀態、年齡、體重等之條件而異，並無特2之^

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制，但是成人每曰以含有精製代卜Ε 〇· 6mg至6〇〇1^ 好含有6mg至6〇mg之製劑，i日}次或1次以上投予即可交 【圖式之簡單說明】 ° 第1圖為實施例1之吖卜π對於盲腸穿刺敗血 之效果。 〃正模型 _為溶劑投予群 _為TCF- Π投予群 第2圖為實施例2之TCF- Π對於LPS誘導細菌移位 效果。 < □為溶劑投予群 為TCF- Π投予群 【實施本發明之最佳形態】 曰以下以實施例對本發明作更詳細之說明，這些實施 只是為例子而已，本發明並不只限於這些實施例。 歹 〔製造例1〕 KF- Π之精邀 根據W09 0 /1 〇 6 5 1號公報所揭示之方法及東尾等之方 ^(Higashio, K B. R. C. , 170 4, ^ 3 97-4 04 I ( l 990 ) ) 細胞培養，獲得精製TCF- Π。亦即，將3Χ106個人體纖维 芽細胞IMR-90(ATCC CCL—186)移殖到裝有含5%胎牛血1 之DMEM培養基100ml之滾柱瓶中，邊以〇·5至2旋轉/分之^ 轉速度邊旋轉邊繼續培養7天。於總細胞數成為i χ ι〇γ個 時，經由胰蛋白酶將細胞剝離，細胞集中於瓶底，將5至9 網目之陶竟100g(東芝陶瓷公司）殺菌、投入，靜置24小 ，、培養，其後，加入上述之培養液500ml，繼續培養。 每7至10天將培養基全量回收，補給新鮮培養基，如此操

518229 五、發明說明（6) 作2個月，繼續生產，每支滾柱瓶回收4公升之培養液。 經由上述操作獲得之培養液之活性率為32 # g/m 1。培養液 750公升經由膜濾器（MW60 00切；亞米空公司）處理UF濃縮， 再經由進行CM交聯葡聚糖（Sephadex)C-50(法瑪西亞 公司；Pharmasia)、ConA 瓊脂糖（Sepha r 〇 s e )(法瑪西亞公 司）、MonoS管桎（法瑪西亞公司）、肝素瓊脂糖（Heparin

Sepharose)(法瑪西亞公司）4階段之層析精製，獲得精製 TCF- Π。 〔製造例2〕 基因重組TCFj <纟i 依照WO9 2 /〇 1 〇 5 3號公報所揭示之方法培養含有τcF -E基因之細胞，獲得精製TCF- E。培養形質轉化之那瑪瓦 (Namalwa)細胞，獲得培養液2〇公升。將該培養液於裝有 CM-交聯葡聚糖C — 5〇層析（法瑪西亞公司）、c〇n一A瓊脂糖 CL-6B層析（法瑪西亞公司）、Mon〇s管柱（法瑪西亞公司）之 HPLC之順序進行處理，獲得約1 img之精製。 〔製造例3〕 、 TCF- Π製劑之掣i告 下列例示為由製造例1及2所獲得之TCF_ E之注射劑 製造例。 (1) TCF- Π 20 以 人體血清白蛋白 100mg 將上述之組成溶解於pH值6.03之檸檬酸緩衝液中，調 製全罝為20ml’滅菌後於每安瓶中分別注入冷凍乾

C:\Program F iles\Patent\310493. ptd 第 9 頁 518229 五、發明說明（7) 燥後密封。 (2) TCF- Π 40

Tween 80 1 mg 人體血清白蛋白 100mg 將上述之組成溶解於注射用生理食鹽水中，調製全量 為20ml， 滅菌後於每安瓶中分別注入2ml， 冷凍乾燥後密 封。 (3) TCF- Π 20 /zg

Tween 80 2mg 山梨糖醇 4g 將上述之組成溶解於pH值6.03之檸檬酸緩衝液中，調 製全量為2 0 m 1， 滅菌後於每安瓶中分別注入2 m 1， 凜結乾 燥後密封。 (4) TCF- Π 40 μ g

Tween 80 1 mg 甘胺酸 2g 將上述之組成溶解於注射用生理食鹽水中，調製全量 為20ml， 滅菌後於每安瓿中分別注入2ml， 冷凍乾燥後密 封。 (5) TCF- Π 40 μ g Tween 80 1 mg 山梨糖醇 2g 甘胺酸 lg 將上述之組成溶解於注射用生理食鹽水中，調製全量

C:\Program F iles\Patent\310493. ptd 第 10 頁 518229 五、發明說明（8) 為2 0ml，滅菌後於每安瓶中分別注入2ml， 冷凍齡妒 封。 死柘後密 (6) TCF- Π 20 //g 山梨糖醇 4g 人體血清白蛋白 50mg 將上述之組成溶解於pH值6· 03之檸檬酸緩衝液中 製全量為20ml，滅菌後於每安瓿中分別注入2ml， 冷；東乾 燥後密封。 ^ (7) TCF- Π 40 //g 甘胺酸 2g 人體血清白蛋白 50mg 將上述之組成溶解於注射用生理食鹽水中，調製全量 為20ml，滅菌後於每安瓿中分別注入2ml，冷凍乾燥後密 封。 (8) TCF- Π 4 0 β g 人體血清白蛋白 50mg 將上述之組成溶解於pH值6· 03之檸檬酸緩衝液中，調 製全量為20ml， 滅菌後於每安瓶中分別注入2ml， 冷康乾 燥後密封。 〔實施例1〕 里·於盲腸穿刺敗血症老鼠投予TCF- ϋ之效果 於7週歲之SD雄性老鼠，用22G注射針1次穿刺到盲 腸内，作成敗血症模型（j. Surgical Research 29· 189-2 01(1980))。於敗血症模型作成之48小時前將老鼠分

C:\Program Files\Patent\310493.ptd 518229 五、發明說明（9) ' ----—〜一 成只投予溶劑之對照群（溶劑投予群）〇5隻）及投予TCF〜 7卜π投予群⑴隻）兩群，每12小時5次於靜脈内投予 岭劑，TCF- Π，TCF- Π之投予量每次為1〇〇〇 #g/Kg。至敗 众症棋型作成後之第2天為止生存率變化之結果如第^ 戶:示。I吉果，、於第2天之生存率與溶劑投予群相比較， 卜Π投予群為有意義地高，敗血症老氣投予^卜e之生 存率為有意義地上昇。亦即，確認TCF—[可顯著地改善敗 血症發症後之生存率。 〔實施例2〕 Π對於移位之效果 於7週歲之ICR雄性老鼠靜脈内投予Lps 5mg/Kg。於 LPS投予30小時前將老鼠分成只投予溶劑之對照群（溶劑 扠予群）（6隻）及投予TCF- π之TCF - Π投予群（6隻）兩群， =時3次於靜脈内投予溶劑或KF— TCF— E之投予 里為每次20 0 # g/Kg。LPS投予24小時後於腸間膜淋巴結 中檢出細菌數之結果如第2圖所示。與溶劑投予群相比 較，於TCF-Π投予群檢出之細菌數為有意義地低，經由投 予TCF- E，對於由於投予LPS所誘導細菌從腸管移動可有 意義地抑制。亦即，對於成為敗血症導火線之細菌移位 (Berg, R.D·:】· Med 2 1 7-244 ( 1 992 )，確認TCF- Π 可 顯著地改善生存率。 【產業上之利用可能性】 經由本發明可提供以TCF— Ε為有效成分之敗血症之預 防及/或治療劑。本發明之藥劑可作為敗血症，尤其是至

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Claims (1)

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