TW444021B

TW444021B - Protective helminth parasite antigen

Info

Publication number: TW444021B
Application number: TW083110250A
Authority: TW
Inventors: Edward Albert Munn; Danielle Mcmichael-Phillip; Margaret Graham
Original assignee: Biotech & Biolog Scien Res
Priority date: 1993-11-03
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2001-07-01
Also published as: WO1995012671A1; US6413521B1; GB9322702D0; NZ275142A; EP0726950A1; CA2175454A1; AU696260B2; AU8065194A; ZA948685B

Description

444 0 21 A7 B7 經濟部中央橾準局—工消費合作社印製五、發明説明（I ) 本發明係有關.新穎之腸寄生蟲抗原及其於控制由腸寄生蟲，待定言之哺乳動物胃腸道之寄生性線蟲，所引起疾病上之用途。腸寄生蟲，特定言之線蟲，感染或侵入許多種動物，包括人類，且不僅在動物體內，而且在人體内，成為普遁且顯著之疾病來源。因此1此等寄生蟲在全世界消耗相當多量經濟資源。此點尤其見於畜牧業，其中草食動物如：羊與牛之寄生蟲感染經常很難控制而且高成本•可能造成經濟上顯著損失。這一方面可特別述及非吸血性線蟲歐斯特牛胃絲蟲 (Ostertagia _ostertagi)及賽康牛胃線蟲 Qstertagia (Teladnrsagi.a) circumnincta (賽康牛宵絲蟲最近再分類成為姐織絲晶（T ,. c i r c u m_cJ n c t a )，但此新名稱尚未廣泛使用）= 其他具經濟重要性之寄生性線蟲包括下列各種腸蟲科屬 :毛狀圓蟲（Tr ichostrongy lus)，细頸線蟲 (Heaiatndirus)，網尾線盡（Dict.vocaulus)，庫柏絲蟲 ((La.o P e r i a .)，鞭蟲（T r i c h u r.i s ) ，管口線蟲 (Qesophagostomum)，仰口線蟲（Runostomum)及肺圓蟲 (ila^astronRYlus)。除了家畜外，亦可感染寵物與人類，致死的結果並不罕見。目前 > 對草食家畜腸寄生蟲之控制主要依賴抗腸蟲藥物 * f并用滅菌處理。然而，無法證實此技術完全令人滿意，因為其成本高旦不方便，而且使藥物抗性迅速提高。抗腸 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 ν.Γ. 經濟部中央標準局員工消費合作社印災 4440211 A? _B7_ 五、發明説明（> ) 蟲藥物必須經常投與，而且有些農場經常無法做到適當滅菌處理，即使可能，也僅限於較有利用價值之草食動物。為了克服這些問題，曾試圖達成免疫控制方法。雖然在鑑定某些保護性抗原作為候選疫苗上已有些成功，尤其在扭轉線蟲（Haj&monchus)上，但此方法經證實很難實行，除了針對牛肺中之網尾線蟲（PictVQCfiiilus v ί v i d a r » ^ )外，其他均尚未在商業上成功。目前最成功的例子偽由成對蛋白質H110D達成，其係自扭轉血矛線蟲（W . c ο n t 〇 r t u s )之腸部中單離之完整瞑蛋白質，且説明於慕恩（Munn)之W 088/00835中。H110D現在代表目前最可行之候選疫苗。慕恩亦曾說明且提出一種與扭轉向矛線蟲腸細胞之管腔表面结合之螺旋形聚合细胞外蛋白質，稱為”康特丁素” (Contortin)作為疫苗（慕恩等人 * Parasitology SA: 385-397, 1987) 〇第三種具有保請性抗原性質之扭轉線蟲腸膜蛋白質亦已發現，且稱為Η 4 5 (慕恩與史密斯（M u η n a n d S m i t h _), V 0 9 0 / 1 1 0 8 6 ) ^ 雖然如H 11 0 D及H 4 5之蛋白質可作為對抗扭轉線蟲之疫苗基礎，但仍舊需要新穎及改良之腸寄生蟲疫苗，尤其是可廣泛用於許多種腸蟲之疫苗。目前大多數研究著重於吸血性線蟲如：扭轉線蟲，且尚特別需要對抗非吸血性腸蟲如：毛狀圓蟲’庫柏絲蟲•網尾ί泉蟲’及尤指牛房錄蟲 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） in. I ι^ϋ I ι^ϋ 1 m^i ^^^1 I -、一-β，I- i —1 ( fin Jin _ - ' 一 -I Hit - ^ ί- (請先聞讀背面之注意事項再填衮本頁) Α7 Β7 444021 五、發明説明（>) (Ostertagia)之疫苗。因此本發明試圖提供新穎抗原，供作為腸寄生蟲疫苗，特定言之作為保護性免疫原，Μ控制非吸血性腸寄生蟲所引致之疾病。更明確言之，本發明係根據發現非吸血性線蟲如：牛贯絲蟲，庫柏絲蟲之腸部含有一種具有胺基肽酶活性之完整膜蛋白質•咸信其為~種重要之保護性抗原*可提供動物對抗腸寄生蟲之保護免疫力。當這種蛋白質自完整之膜上釋出時，例如：利用清潔劑分開時，則為新穎者，且可用於製造對抗腸蟲感染之疫苗。根據本發明一方面係提供一種保護性腸寄生蟲抗原，其特徴為具有似瞭基肽酶活性，且其天然型為一種與非吸血性腸寄生蟲之腸微娀毛结合之完整膜蛋白質，或其同等功能變異性，或抗原性片段或前體。本發明另一方面提供這種保護性抗原，及其同等功能荽異物，抗原性片段或前體，供用於人類或非人類，以哺乳動物較佳，尤Κ反芻動物特別佳，剌激對腸寄生蟲之免疫反應。所探討抗原之前體可為較大型蛋白質，其經過例如：蛋白水解作用處理，產生抗原本身。這種前體可圼酶原形式，意即酵素之無活性前體，經過蛋白水解作用裂解而活化，例如：類似胃蛋白酶/胃蛋白薛原糸統或血液凝結連鎖反應所涉及之習知誨原。本目的所定義之非吸血性寄生蟲為彼等很少或偶而會滲 -6 - 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS M4規格（21〇乂297公釐） {诗先«讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 經濟部中央標準局員工消贽合作社印製 ? ^44 021 A7 B7 經濟部中央橾隼局貝工消費合作社印製五、發明説明（‘）入宿主血液中之線蟲（與吸血性線蟲如：扭轉線蟲恰相反，其幾乎僅吸取宿主血液）’並包括填塞式取食性蟲 (Plug feeder·)與_食幼嫩姐織性蟲（1^〇“^)。填塞式取食性蟲具有脹大之頰囊’可用來包圍一塊宿主姐織•例如：纟帛羊夏視線蟲（C h a b e r t i a, 〇 v i η ^ Ί ，以得到營養素。喷食幼撤姐織性線蟲沒有專供吸附用之口器，其食物之姐成份尚未知’但認為其中包括宿主組缴，细胞外姐織液體 *钻液’或若為琦腸線蟲類時，尚包括宿主之消化物。有竖胃腸線蟲類，持定s之彼等與粘膜緊密结合（例如：跋胃腺中之賽康牛胃絲蟲（Qst&rqgi^ C Ϊ r p i| ip c i n c. t. a )及某些鑽入腸上皮之毛狀圓蟲（Ini_C_b ostrongyl^i^^品種（例如： T·.. ax^l除外）可取食此等物質之混合物。影響經濟重要性之非吸血性腸寄生蟲包括下列類屬及亞種：牛胃絲蟲Istert.as i a (為了避免質疑·其中亦包括姐織絲蟲（Teladorsagia))，毛狀圖蟲屬 (Ixichostro a.K Υ.Ι ILS. S p P .)(例如:τ . 〇 rv I n h r i f 〇 r m i s · L_v.i tr i nn s 與：L—_ax e i )，庫柏絲蟲屬（r η η 〇 s r i ^ s p p _ ) ’细頸線蟲（N eJB a tQ diJULS,) ’夏視線蟲（Γ. hah^rtia)及管口線蟲（Oesophasostomum) ° 本發明新穎抗原不被天然免疫動物之血清所辨識。換言之•感染之宿主之免疫系统通常不會感受此等圼天然形式之抗原*‘因此為"隱藏"，”潛浮·•或•’隱.秘"抗原。本文所使用”保謂性抗原”或"保護性抗原活性”一詞之定義為妓等可產生保護宿主（即免疫原性）之免疫反應之抗原 (诗先wt*背面之注意事項再填寫本頁) 軋· 訂_ f. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4规格（210X297公釐），4 44 021 k; 五、發明説明（-Ο 及其片段或前體，該反免反應即指宿主所產生之反應可κ 產生免疫效應分子*抗體或可傷害，抑制或消滅寄生蟲之细胞，藉Κ”保護”宿主免於臨床或顯微狀前之疾病及喪先生產力。這種保護性免疫反懕通常可由抗體之產生來加強，抗體可以抑制寄生蟲之代謝功能，阻礙生長，不產卵及 /或死亡。如上已述，本發明範圍內包括新穎抗原之同等功能變異物，及其片段與前體。本文所採用”同等功能”之定義為與天然蛋白質有關或由其衍生之蛋白質》其中胺基酸序列已經過單一或多重胺基酸取代，加成與/或缺失而修飾及其中胺基酸經過化學修飾*包括去糖基化或糖基化作用，但仍保留保護性抗原活性，例如：仍可產生對抗寄生蟲之保護宿主之抗體及/或功能免疫力之序列。”加成”荽異物之定義中包括胺基與/或羧基末端融合蛋白質或多肽.其包含另一種蛋白質或多肽與胺基肽_抗原序列融合3上述這種同等功能變異物包括天然生物變異（例如：某品種内之等位變異物或幾何變異）及使用已知方法製備之衍生物。例如，製備同等功能蛋白質時，可利用化學胜肽合成法或採用定位主等之誘變作用，隨機誘變作用，或酵素裂解與本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS M4规格U10 X 297公釐) I*-------表------订------(/ r------X— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦) 同過反多之化而許明。同疫用發物素免使本似養原可據類營抗性根之之明活。種蟲發Β 式品腸本呔形或份過基體屬部娌胺姐蟲一一使似重生.責 Μ ο 圼寄負可果衛同為-效技不能性護知括功活保已包之素有等亦酶酵具接物肽斷體粘異基阻抗酸變胺此之核能信因發或功咸，誘 / 等程應經濟部中央標隼局®:工消費合作杜印褽 444021 a? _B7_________ 五、發明説明（6 ) 種受質分析，例如：丙胺酸，白胺酸及α*"毅胺醒基對硝基替苯胺。本發明抗原已顯示具有許多胺基肽酶活性，最值得注意者為似胺基肽酶Μ (ΑρΜ)及似胺基肽酶A (ΑρΑ)活性’其可分別使用例如：丙胺酸•白胺酸或甲硫胺酸對硝基替苯胺及ct -穀胺酸對硝基替笨胺，於例如：腸蟲萃物中或於受質-凝膠上使用相應之万-甲氧基萘篚胺受質進行聚丙烯_胺凝膠電泳（PAGE)證實。此外*抑制劑實驗顯示抗原為金屬蛋白質。本發明之胺基肽酶抗原為完整膜蛋白質，可由清潔劑溶解實驗證實。例如：抗原不溶於水性緩衝液（如：硝酸鹽緩衝之生埋食鹽水（PBS))及可溶解膜結合蛋白質之清潔劑 (如：聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯（Tween)，但可溶於可溶解完整膜蛋白質之非離子性清潔劑•例如：T R I Τ 0 H X-100 ，或十二综基聚乙稀二醇謎（THESIT，德國漢堡市達斯丁藥廠（Desitin Werk)。經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 (锖先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 姐織化學實.驗已顯示本發明之抗原與寄生蟲腸微绒毛结合。因此例如在非吸血性腸蟲（例如：牛胃絲蟲及庫柏，絲蟲）之冷凍切片染色结果顯示腸緻狨毛區域出現胺基狀_ 活性3 外源凝集素结合實驗進一步顯示，本發明抗原與刀豆素 A (concanavalin A)(ConA)结合*表示出現糖基化作兩，特定言之含有甘露糖與/或果糖殘基，根據本發明較佳抗原可自牛W絲蟲中單離出。特定言之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ή 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 444 021 A7 B7五'發明説明（f) *寶康牛胃絲蟲（[L -G 'ULC ujilc i n c t a )及歐斯特牛胃絲蟲 (Q , ο s t e r t a g i)二者之胺基呔酶活性（包括似- ApA與似 ΑρΜ活性）與一種可在變性條件下，於聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳法分離之條帶有關，其表觀分子量（Mr)約 124,000-126,000 (6-16%SDS-PAGE)。這種蛋白筲及其他非吸血性蟲中之類似物代表本發明特別佳之具體賁施例。根據本發明之抗原可使用適當清潔劑萃取非吸血性腸寄生蟲得到。因此本發明另一方面提供一種製備上述本發明抗原之方法，其包括以清潔劑萃取非吸血性腸寄生蟲粗萃物之步猱 ’例如：使用T w e e η 2 0或類似清潔劑，去除與膜结合之蛋白質，然後M ThesU或類似清潔劑萃取，並回收溶解之完整膜蛋白質。清潔劑萃物則再使用習知製程進一步純化，例如：離心法*選擇性沈澱法，電泳法，層析法，等等。含本發明抗原之部份可利用已知技術分析胺基肽酶活性來鑑定。利用蛋白水解酶如：膀蛋白酶處理，可使抗原圼截短矻式自膜上釋出，不需添加清潔劑即可溶於水中。依此方法得到之抗原形成本發明另一主題。腸寄生蟲之祖萃物可使用習知生化及外科技術製備，例如：取寄生蟲全體或一部份均質化。因此，例如：寄生蟲可在合適緩衝液或介質中如：磷酸鹽續衝生理食鹽水 (P B S )中均質化，離心回收不溶物（即沈澱塊），即形成所需之粗萃物。 -10- 本纸張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注ί項再填转本頁) 衣· 訂 *·广· 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 4440211 Α7 Β7 五、發明説明（y) 因此本發明抗原之合適纯化過程包括（i )取寄生蟲成蟲於P B S中均質化，回收不溶於p B S之物質（例如：離心法 )·可視需要重覆PBS洗滌步驟一次或多次，（ϋ)Κ Tween 20水溶液（例如：PBS溶液）萃取PBS不溶物（即沈澱塊），（iii )回收含有T w e e η不溶物，例如：利用離心法* (iv )以T h e s it水溶液（例如·_ P B S溶液）萃取Ί v# e e η不溶物，（ν)回收含有Thesit可溶性蛋白質之溶解部份（即上澄液，亦已知為ThHS)，然後（vi )於例如：Mono Q管柱上進行離子交換層析法，及/或使用Superose進行凝膠過滹法 *可視需要，例如：在進行離子交換之前，亦包括Con A親和性層析步驟。另一種製法可利用目標抗原具有特定選擇性结合活性之儍點，其係使用親和性層析糸统，其中專一性配位體固定在固相基質上。因此本發明亦提供一種製備上述本發明抗原之方法，該方法包括製備含有上述定義之至少一種保護性抗原之該寄生蟲萃物，自其中純化該抗原，其係使該抗原與包含該抗原之專一结合對象之固定相结合，隨後自該固定相上溶離該抗原。合適之專一结合對象包括受質類似物，例如：抑制劑貝斯抑制素（b e s t a t ί η )及寡醣專一性外源凝集素，例如：C ο η «。如上述定義之腸寄生蟲抗原，及其片段，前體及同等功能變異物可用於製備疫苗姐合物供用於剌激人類或非人類動物對抗腸寄生蟲之免疫反應上。 -11- 本紙張尺度逋用中國國家標牟（CNS ) Α4規格（210X297公嫠） (讳先聞讀背面之注意事項再填弈本頁) 束· 訂經濟部中央標準局負工消費合作社印製 4440211 A7 五、發明説明（γ) 根據本發明，上述定義之一種或多種抗原，其抗原性片段’前體或同等功能费異物，與其醫藥上可接受之載劑或稀釋劑可用於製備一種疫苗组合物，供剌激人類或人類動 %胃抗腸寄生蟲之免疫反應；及用於剌激人類或非人類動物對抗臈寄生蟲之免疫反應，其包括對該動物投與一種如上述定義之疫苗姐合物。動物最好為哺乳動物，且从反芻動物更佳。如上所述 > 根據本發明抗原可由許多棰腸寄生蟲得到。然而*腸蟲最好為線蟲，尤以胃腸線蟲特別佳，包括例如 :牛胃絲蟲與庫柏絲蟲。如上所述，以來自牛戽絲蟲之抗原特別佳。這種抗原可用來製備對抗許多種腸寄生蟲（包括上述住何一種）之疫苗。較佳者為彼等所頡，，廣效"性抗原’其可剌激宿主除了對抗自其中單離之寄生蟲外，尚可對抗許多種其他寄生蟲之免疫反應β 如上所述，由本發明抗原保護其宿主之方法之—為產生抑制性抗體，Κ抑制寄生蟲之生長，维持與/或發展。埴類抗體及其結合抗原之片段（例如：F ( a b ) 2，F a b與F V片段’即抗體中包含抗原結合位置之，，可變，’區片段），可圼單株或多株抗體，形成本發明另一主題，且含此等抗體之疫苗組合物及抗體於製備疫苗姐合物供用於使宿主被動免疫對抗寄生蟲之用途亦為本發明主題。這種抑制性抗髑可使用遺傳性抗體產生。可使用抗遺傳性抗體作為疫苗中之免疫原。除了上述萃取與單離技術外，可利用標準技術進行重姐 -12 - 本紙張尺度適用中國國家榇芈（CMS ) A4規格（210X297公釐） (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣_ 訂 4144 0 2 V. A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印装五、發明説明（（c) DMA技術製備抗原，如述於例如：山布魯克（Sanbr〇〇〇k) 等人’1989’ （分子選殖法，實驗室手冊，第2販，冷泉港出版社（Molecular Cioning, a laboratory manual 2 n d E d i t i ο n，C 〇 i d S p r i n g H a r b o r P r e s s )。因此包含編碼本發明抗原之核苷酸序列之核酸分子形成. 本發明另一個主題。根據本發明核酸分子可為單股或雙股DjU , cDN/^ rNA * M DNA較佳，且包括可編碼抗原或相關之抗原片段或前體之要性•實質上同質性及可雜交之序列。•，賁質上同質性”係指展現至少60% ·最好至少70%或80%序列同質性之序列。本發明範圍包括之雜交序列為彼等在非迫切條件下結合（室溫下，6 X SSC/50%甲醯胺）及在低迫切條件下 (2 X SSC，室溫，更特佳2 X SSC ，42XM或較高迫切條件下，例如：2 :< SSC ，65DC (其中 SSC = 0.15M NaCl， 0 · 0 1 5 Μ檸攆酸納，pH 7 , 2 )洗滌者*及彼等（字碼變性者除外）在上述條件下雜交者。可編碼根據本發明抗原性活性抗原或抗原荽異物之核苦酸序列衍生物可使用相關技藝上習知之一般方法得到。根撺本發明之抗原可於含有重组D N A分子之宿主細胞中表現，製成重組體型，其包含如上述廣泛定義之核苷骹序列，操縱性地連接表現控制序列，或包含含有這種重姐 DNA分子之重姐DNA選殖載體或載體。依此方式表規之合成多肽形成本發明另一個主題（本文所使用”多肽·•一詞偽包括全長度蛋白質及較短長度之胜肽序列）。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210><297公嫠） {請先聞讀背面之注$項再填寫本頁)

••IT 經濟部中央標準局負工消費合作社印策 444 0 21 a? B7五、發明説明（i丨）所表規之抗原可為一種融合多肽，其包含根據本發明全部或一部份抗原，及另~段由所融合之重姐髑分子之DNA 編碼之多肽。其實例可為/9 -半乳糖苷酶，穀胱甘肽-S-轉化酶，肝炎核心抗原或相關技藝之融合蛋白筲中常用之住何其他多肽。之方如例置止記習合多生來獻细來胞 NA之例，位停上在。許核外文主外姻 DN子-如合止獻可規。真入於宿入物之分酸列结终文且表毒或導明物導生原酸核序藉*。關-中病物成說生之核抗核體制白區框相^统苗生形细核子原明組載控蛋子碼及U糸疫核-詳真分：發重入之核縱譯術Μ現與原中已或酸括本明嵌當，操之技Μ表毒入胞術核核包碼發列適子-配知Μ同病。引细技原明如編本序括碼子相習Λ不腺中體體染之發例有據酸包字動接撺多及藝載或感染本可含根苷體止發連根lia許，技等糸轉感據胞括備核載停·.子括^之毒龆此胎或轉根細包製之現與如分包莖載病相將胚形或之主題及原表始例酸可SB記狀於於入轉形義宿主，抗種起t核體有桿明用引之轉定種他現碼這：素明載ί亦括說可或適已述這其表煽。如元發之毒上包亦術-合括上。明及將中例制本明病藝體體技現。包如體發殖括 Αί控用發與技載載知表物亦有物本選包DN譯錄利本體關毒毒已中動明含生此之其體轉轉}據質相病病多胞之發或之因體’載.·與列根之及之他許细因。本，因載法：如}序載知適其物基中胞基本紙張尺度適用中國國家標牮（CNS > A4規格{ 210 X 297公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填^本X) 衣· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ! 444 02 1 A7 ____B7___ 五、發明説明（（>) 如：大腸桿菌L__Cj〇丄，真核生物細胞如：酵母或桿狀病毒-昆蟲细胞糸统，轉形之哺轧動物细胞及導入外來基因之動物與植物。可特別述及導入外來基因之線蟲（參見例如：菲爾（Fire) , 1 986, EMBO J. , S_，2673 中有關線蟲 C-aen〇rhabditi s.^:専入外來基因糸統之討論）。本發明另一個主題提供一種製備如上述定義之本發明抗原之方法，其包括使含有镅碼該抗原全部或一部份之核酸分子之宿主细胞在可Μ表現該抗原之條件下培養，並回收所產生之該抗原。本發明之抗原及同等功能抗原變異物亦可由化學方法製備，如：習知之米利菲德固相合成法（M e r r i f i e丨d s ο I i d Phase synthesis procedure) ° 上述新頴抗原之水溶性衍生物形成本發明另"-個主題。這種可溶型可自蛋白水解之分解作用中得到，例如：使用 g孝素胰蛋白酶。一般而言*抗原之酵素分解作用產生兩部份，一涸清潔劑可溶部份（保留在膜上之部份.)及一個水溶性部份。疫苗姐合物可根據本發明，依疫苗製造之技藝上習知之方法製備。傳统之疫苗調配物可包含根據本發明一種或多種抗原或抗體，及若適當時，在一種或多種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑存在下，共同使用一種或多種合適辅劑· 例如：氫氧化鋁，皂素< q U i 1 A，或其再純化形式，胞壁瞌基二肽，碾物油或植物油，Ν ο V a s 0 m e或非離子性封端共聚物或D E A E葡聚楗。合適載劑包括液f目介質，如：適含作 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4ΪΙ格（210X297公釐） (請先《讀背面之注意事項具填^:本育) 表經濟部中央榇準局負工消費合作社印裝 444 02 1 A7 _ _B7_ 五、發明説明（（>) 為載體將胜肽或多呔引入動物或患者體内之生理食鹽溶液。可包含其他成份如：防腐劑。另一種疫苗調配物可包含病毒或宿主细朐，例如：微生物（例如，疫苗病毒，腺病毒，细菌如：牛分支桿菌 (Mvcobact.ftriuni bQvis_^L 卡美-葛林桿菌品種（Bacnius Calmette-Guerin)(BCG)*或沙門氏菌），其可為活的，死的或減毒的，其中並嵌插根據本發明核酸分子（例如i DNA分子）* Μ刺激對抗由嵌插之核酸分子所編碼之多呔之免疫反應。疫苗姐合物可依任何習用方式投與，例如：經口或非經腸式投與，肌内注射，可視需要間隔投與*例如：兩次注射間隔7至35天。抗原可根據本發明併用由相同或相異寄生蟲品種得到之其他保護性抗原。這種组合疫苗姐合物中除了僅含所需抗原之單獨疫苗製劑外，尚可包含少量不同抗原。若使用單一抗原疫苗可能發生寄生蟲之”適應選擇性”時，組合疫苗較有利。可因本發明而受惠之動物可為任何人類或非人頮動物| 但以寵物，特定言之狗與貓及家畜，尤指反芻動物較佳。可特別述及羊，牛，豬，鹿及山羊。以胰蛋白酶處理來自劻斯特牛胃絲蟲(Q„ _ostertagn瞑製劑時，釋出水溶型且與C ο η A结合之胺基肽酶Μ活性•羥過凝膠過濾法後，產生高活性部份，且於S D S - P A G Ε上，在約116,000處出現考馬希M(Co〇fflassie blue)染色帶。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· ^ 4 44 0 21 A? B7 五、發明说明（f a) 012之分解產物經過DSD-PAGE所得到類似大小條帶之N-末端序列為 Ala Glu Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asn I】e Arg Pro Leu lie Tyr Asp Leu Thr (AEDLRLPTNIRPLI YDLT)。此序列與來自扭轉血矛線蟲 (Haemonchns cont. ortus)之微粒體胺基狀 HH110D-1 * -2及-3 DH A序列上相應區域序列具有67 %相同性及89%相似性，且與H110D經過胰蛋白酶裂解後所釋出水溶性片段之N-末端胺基酸序列具有6? %相同性。在人類*豬，老鼠及小白鼠之微粒體胺基肽酶中均保留此胜肽分別位於位置 6 ，7 ，12 及 15 之胺基酸 Leu，Pro，Pro 及 Tyr。 012微粒體肢基肽酶之完全序列係分析由歐斯特牛胃絲蟲（Q-SJLS-C. tagia ostfirtaei)第一股cDMA與引子產生之選殖 P C R產物之序列而得到，引子之基礎為a )與Η 1 1 0 D微粒體胺基肽酶相同之G A Μ Ε Ν V G L序列，b )位於5 '末端之腸蟲接合引導序列S L 1 ，及c ) 3 '末端之戟賴序列。經濟部中央榡準局負工消費合作社印東 (請先閔讀背面之注意事項再填转本頁) 對抗012之抗體並未在感染過程中形成，但當圼纯型注人牛&羊體内時，則展現高度免疫原性。因對抗歐斯特牛屠絲蟲（CL_ii.sL.&r tas i )之012而產生之抗體會與費康牛贯絲蟲（_tiljj^LiiLc. i nct.a )經過過碘酸盩處理之0 1 2交叉反應’此現象與羊針對C a n Q Η 11 0 D而產生抗體相同。琨在將特別參考歐斯持牛胃絲蟲（n s t e r t a g i_a. t a fs i J之012蛋白質更詳细說明本發明。然而.$ 而許多技術如：组纈化學與西方墨點法均已證實賽康牛宵絲·（ Q-S-^-S-T t a κ l.a c i r c υ gi c i n c t a )與牽柏絲蟲（Coo p -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐) ' ' ----- d44〇2l A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝五、發明説明（等寄生蟲中有012同等物。咸信012蛋白質為 —種多基因複合物，此外，編碼該蛋白質之核苷酸序列可能在腸蟲之不同品種與不同生命循環階段之間出現序列變異。此外 > 可能出現多重酵素型（同功酶），在不同階段$ 不同品種之間有不同表現。此實驗中，已由12天大（早_ SItj 第五期）歐斯特牛胃絲蟲（Qstertagia ostertagi)經過童姐DHA技術自相應於〇12基因之dNA得到cDHA純糸及f>CR 產物從而決定DNA序列，亦即預測胺基酸序列。 PCR產物之序列分析使吾等得以鑑定極相近之012 ，在此稱為 012-1 ， 012-2 ， 012-3 ， 012-4 及 012-5 c 012-1與012-2為約lkb之5’序列*其3'末端以保留葶列 GAMENWGL為基礎之引子終止；012-3 , 012-4及012-5为約2, 5kb之31序列，其5,末端以此引子開始。 012-1及-2與012-3 * -4及-5之闞係可由引子向〇m 及〇〗2-2之3,末端與OI2-3 ，Μ及-S之5'末端，涵括共间之GAMENWGL序列進行PCR來決定。已發現PCR產物所得到序列之差異與變異，此點可待別見於圖1 9與2 0，且綜合說明如下。由圖1 9與20所示核苷酸序列之轉譯作用得到推衍之胺基酸序列之同質性。 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標?MCNSM4規格（210·Χ2们公釐） <請先聞讀背面之注再填踔本頁) 衣 .訂相同性％ 76.3 77.3 95.5 76.8 r 444 0 21 * A7 B7 五、發明説明（/t) 相似性％ 012-1 ： 01 2 -2 86.1 012-3： 012-4 77.3 012-3： 012-5 95.6 012-4:012-5 76.8 其差異性可歸因於不同niRNA多重基因族群° 根據已知序列之電腦數據資料，比較上述各種純系序列，顯示與微粒體胺基肽酶族群（E C . 3 · 4 . 11 .-)具有相當大同質性。以012蛋白質及其部份進行之酵素活性與抑剌罝驗證實該蛋白質事莨上即為微粒體胺基肽酶（<x-胺基醯基肽水解_(徴粒體））。使用酵素胰蛋白_時發現，012可部份裂解，形成兩部份，一個清潔劑可溶部份（保留在膜上）及水溶性部份（稱為01 2S);已發琨似胺基狀酶M活性與水溶性0 1 2 S部份有關。得自012蛋白水解部份之18個胺基酸1末端序列（稱為 Pep A)與H110D-1 ，-2及-3之相應Η段所推衍之DNA序列具有67%相同性及89%相似性。 (诗先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁〕

、1T 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製

其序列為 P e ρ Α : AEDLRLPTNIRPLIYDLT H11-1 ： AEELRLPTTIKPLTYDLV P e p A ： AEDLRLPTNIRPLI YDLT HI 1-2 ： AEELLLPTN I KPVSYDLH -19 - $^尺糾财賴家揉牟卬叫八4規格（2獻297公釐） d^4〇21 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7___五、發明説明（丨7) PepA ： AEDLRLPTKIRPLIYDLT H11 -3 ： AEELLLPSHIKPLSYDLT 這一段序列中，三種推衍之H11序列具有72-77%相同性 (13或14個胺基骹）及83-100%相似性。四種序列均保留9 個胺基酸： A12L3LP45I6P7XYDLX 其他殘基中，1為E或A ，2為Pep A中之D及H11中之E ，3為匕或只，5為料或丁，6為Pep A中之R及 Η 1 1中之K ，且7為L或V (人類•豬，老鼠及小白鼠微粒體胺基肽酶中保留LP Ρ Υ)。比較所決定之Pep Α與H110D (Η11)胺基酸序列時•發現： PepA AEDLRLPTN I RPL I YDLT (分解產物之末端。） Η 1 1 AEELLLPTN IKPVSYDU (.狭蛋白酶片段之末端。）其相同性為67% »相似性為83%。使用相應於H110D保留序列GAMENVGL之寡核苷酸，由歐斯特牛胃絲蟲（0. ostertag i )第一股DHA進行PCR ，產生所期望大小之產物|使用5 ’引子得到約1 k b ，使用3 ’引子則得到約2 , 5 k b 。得到二種極相近但仍可分辨之5 '序列* 稱為012-1及012-2 (見圖19與20)。上逑區域中，012-1 與0 1 2 - 2所推衍之序列具有7 2 %相同性。 (請先閲讀背ώ之注意事碩再填寫本頁) ,衣_ 訂 -20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ 297公釐）五、發明説明（ ih

012-1 AEELRLPSVIPPLLYDLS 012-2 AEELRLPTNIKPLLYHLT P e p A AEDLRLPTNIRPLI YDLT 012-1 AEELRLPSVIPPLLYDLS 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝已決定之PepA胺基酸序列與自純糸012-1所推衍之序列具有7 2%相同性，與純糸012-2之序列具有67%相同性。列不設限黃例將進一步說明本發明，其中： ΐ出示寄生線蟲染色檢測微粒體胺基肽酶活性之冷凍切Η之光學顯微鏡圖。在此等黑白照片中|圼暗帶（箭頭處）出現之紅藍色反應產物沈積現象表示其活性；（a)歐斯特牛胃絲蟲ostMtas i)，似ΑρΜ活性* (b)賽康牛胃絲蟲（Q. circumcincta)似ΑρΜ活性；（c)歐斯特牛馬絲蟲（0, ostertagi)，&U p A活性，（d )賽康牛溥絲蟲 ((L_c ϊ r c u m c i n c t a )似 A p A 活性0 M 2出示經過L -丙胺酸姐織化學試劑染色檢測胺基肽酶活性之未變性6-16%PAGE。軌跡i )富含H110D之製劑； ii )扭轉血矛線蟲（Haemonchus oon tortus)之 Thesit 華物 ;iii )空白姐；iv )扭轉線蟲（Hapmonchu.s)之Tween萃物 ;v )，vi )及vii }，分別為歐斯特牛胃絲蟲(gsJ^£_La^i-a-ostertagi )之 PBS ，Tween 及 Thesit 翠物；箭頭指向 OoThHS 中 fcUpM 活性。圖A出示來自歐斯特牛琦絲蟲(Dster tas i a_ o s t e r t a « i ) ThHS之完整膜蛋白質於陰離子交換管柱上層 -21 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） (谇先ε讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. ,11 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製，0 2 1 A7 -i----- 五、發明説明（f尸）析後之溶離份（fci：圖4比較）；蛋白質吸收280 nm, 0-100 鹽梯度溶離。' 1L丄出示來自圖3所示陰離子交換管柱層析法之溶離份中酵素活性之分佈。Met-pNA ，似胺基肽酶Μ活性，ApA ，似胺基肽酶A'活性。匾_5_出示自圖3及圖4所示陰離子交換層析法所收集溶離份在運原條件下進行6-16%SDS-PAGE结果。i)，v)分子量標記物，ii )溶離份8 ，9與1 0 ; iii )溶離份11，1 2與 13; iv)溶離份14，15與16; vi)富含H110D之製劑.供對照用。0 〇〗2係以箭頭指示出現在第ϋ )條軌跡上。 ϋ_β_出示自陰離子交換管柱收集可能含有胺基肽酶活性之溶離份，並再使用Super ose 12進行凝膠過滤排除法（排除分子量為2 X 1 0 β )分離後之溶離份，於邐原條件下進行δ-16% SDS-P AGE。胺基肽酶活性僅出現在溶離份12，係唯一在1 2 5, 0 0 0處（箭頭處）出現條帶之溶離份。分子量標記物及富含Η 1 1 0 D之溶離份亦加入搡作過程供對照用。 @1.7-出不來自賽康牛胃絲蟲（ClRtert agia c. i r_.c UJB..C L n c t a )之完整咦蛋白質在道原條件下進行6-16% 5051/\0£结果。軌跡丨）分子里標|5物，丨丨）先以？8$及 Tween 20萃取後之可溶於ThesU之蛋白質，箭頭指示處為 Mr 124,000 (0cl2)之條帶。圆8出不經過來自a )金雀花（Hlex eurooaftus)，b )小麥 (Iriticum vulgaris) ; c)刀亘素 A ; d)扁亘（Dolichos b i f丨o r u s )之生物素基化外源凝集素嶷理後之西方墨點分 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) "

•1T 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 444 〇 2 1 Α7 ______Β7___ 五、發明説明（/) 析结果，i )富含H110D之製劑，與ii ) OcThHS及m )分子量標記物比較。（c)上之箭頭表示0cl2。

Hi出示OcThHS先通過金雀花外源凝集素管柱去除低分子最雜質後，於Con A管柱上進行親和性層析法之分離结果。蛋白質吸收280 nm，K〇至100% 0.5M糖（ct -甲基吡喃葡糖苷）梯度溶離。圖一UI出示得自圖9所示Con A管柱層析法之OcThHS溶離份中酵素活性之分佈。Met-pKA，Leu-pNA,似胺基肽酶Η 活性。既丄1_出示先通過金雀花管柱後，自Con Α親和性層析法得到之溶離份於還原條件下進行6-16%SDS-PAGE分析结果。僅出琨似胺基肽酶Μ活性之结合部份含有Mr 124,000 之條帶（箭顗處）。既丄2_出示自Con A層析法中收集與管柱結合且含有胺基肽酶活性之溶離份進行離子交換層析法之结果，蛋白質吸收2δ0 nm，鹽梯度自0至100%。圖.1 3.出示自陰離子交換層析法所得到溶離份中之似胺基肽酶M (Met-pN/U活性之分佈。圖11出示Μ白胺酸對硝基替苯胺為受質時，比較〇〇12與 Η 11胺基肽酶活性之出圖形。實線與虛線分刖代表〇丨2與 Η 11得到之结果。分析法中’分別使用μ E S及Μ 0 P S分別涵蓋出範圍5.5至6.5及6.5至8,0 。使用含5微升012之 PBS/0.1%Thesit ，於0.378毫克/毫升之澹度下，及含 5歡升Η 1 1之C ο η A緩衝液B ，於1 , 2 5毫克/毫升之濃度下 -23 - 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事碩再填寫本页) 訂經濟部中央標準局員工消費合作杜印焚 f 444 021 A7 B7 五、發明説明（xl) 分析胺基肽酶活性，''並分析21分鐘。 1LL5_出示K甲硫胺酸對硝基替笨胺為受質時，比較 0 ο 1 2與Η 1 1之胺基肽酶活性之出圖形。簧線與虛線分別代表0 1 2與Η 1 1得到之结果。依圖1 4之說明進行分析，且分析1 3 . 6分鐘。 ILIA出示Μα -穀胺酸對硝基替苯胺為受質時，比較 0 ο 1 2與HI 1之胺基肽酶活性之出圖形。霣線與虛線分別代表0 1 2與HI 1得到之结果。依圖1 4之說明進行分析，使用含5微升012之ConA緩衝液A ，於0.529毫克/毫升之濃度下，及含5徹升H11之ConA緩衝液B ，於2,5毫克/毫升之濃度下| .分析25分鐘。圖LZ_出示Μ羊α-0ο12Ε血清為探針，分析ConA 0〇12及 C ο η Α Η 1 1之經過過硝酸鈉處理之西方墨點结果。出示以E L I S Α測定接受0 ο 1 2 Ε注射之羊之血清辨識 0 〇】2 ε之结果。抗血清效價隨注射血清後之時間提高，證 *具有0 ο 1 2抗原性。對抗經過過硝酸顗處理之抗原之抗血清效價低於未處理之血清。箭頭指出第二次注射時間。圖L9.出示衍生自選殖之PCR產物之a) 012-1及b) 0 1 2 - 2之核苷酸序列。 Μ 2..Q出示衍生自選殖之PCR產物之a) 012-3，b) 0 1 2 - 4與c ) 0 1 2 - 5之核苷酸序列。 H 2.1a ( i ) - a ( v )出示分別由圖1 9與2 0所示D N /\序列 0 1 2 - 1 ，0 1 2 - 2 ，0 I 2 - 3 ，0 1 2 - 4 與 0 I 2 - 5 預測之胺基序列。 -2 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2]0Χ297公釐） ---------^认------訂------~七 '一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 444 02 j 五、發明説明（v吖 b ( Π - b ( v丨）出示0 1 2 - 1與0 1 2 - 3之預測胺基酸序列，分別與已公開之（i )與（ii )老鼠微粒體胺基肽_ Μ (箏特 (W a 11)等人，1 9 8 9 ) ，（ m )與（iv )小白鼠徽粒體胺基肽酶 A (吳（V u )等人，1 9 9 0 )及（v >與（vi )扭轉線蟲 (H a e in 〇 n c h u s ) Η 11 - 3之胺基酸序列比較；相同者Μ框内表示，虛線表示加入之間隔，Μ便使序列比較之間之同質性達最大程度。胺基酸採用習知之單一字碼。序列上方之水平線表示穿透膜區域*星號表示鋅结合要素。阃22出示胺基酸序列（稱為PepA)與012-1與012-2之預測胺基骹序列之排列。 1L2JL出示由E L I S A測定注射Co η A 0 ο 1 2 (實驗姐，方點）或鐵蛋白（對照姐•圓點）之牛之血清辨識C ο η A 0 ο 1 2之结果。抗血清效價隨注射C ο η A 0 ο 1 2後之時間提高，但不隨趟蛋白改變，證實了 0 0 1 2之抗原性。箭頭指出C ο η A 0 ο 1 2 或鐵蛋白之第一次，第二次及第三次注射時間。羥過劻斯特牛雳絲蟲（(U„(2.s.tej：-t.as D幼蟲感染3 0天後，對照姐對抗 C ο η A 0 ο 1 2之抗血清效價未提高，表示抗原在其來源蟲中之隱Μ性質。 1L2JL出示以羊抗- 0〇12Ε ( 1:1000)，牛抗- ConA 012 (1:1000)及羊抗CamQ Hll IgG (1:〗00)血清為探針分析 ConA 0〇12，ConA H11，及 ConA 0〇12 之西方墨點结果= 圖_2^出示胰凝乳蛋白_分解之Ρ Η P於C ο η A賽弗洛斯 (S e p h a r 〇 s e )上分離後，於6 - 1 6 %荽性，遝原性S D S〜P A G E 凝膠上分析结果。第1及8條含有分子量標記物，第2娆 _ 2 5 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱靖背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 f 444 02 1 at _______B7___ 五、發明説明（>?) (請先聞讀背面之注意事碩再填寫本頁) 含有起始物質，第4條含有不與管柱结合之物質，第5及 6條含有具ApM活性之物質，第7條僅含有500微克胰凝乳蛋白酶。箭頭指出約1 1 6000之條帶。圖2 6出示歐斯特牛胃絲盡（Hstfirt agia ostertagi)經過不同濃度胰蛋白酶分解後所釋出之胺基呔酶活性。 ® 2.7.¾示經過胰蛋白酶分解及於Superdex上進行凝膠過滹之ConA 0〇12 (第1條），與ConA H11 (第2條）烴過 6-16%變性還原性凝膠分析後，K稀釋1 : 100或1 : 1〇〇〇之 otCamQHll IgG為探針進行西方墨點之结果。來自 Superdex分離之ConA 0〇12溶離份含有ΑρΜ活性。發現使用1:100濃度之血清會與0〇12交叉反應。箭頭指出約 1 1 6 0 0 0之條帶。圖2 8出示庫桕絲蟲（Coopftria ο n rr n p h o r a )腸内之微粒體胺基肽酶活性之組織化學定位结果，其係使用白胺酸一為受質，在a)較低倍及b)較高倍下之放大结果。窖例1 m m ih m 將歐斯特牛胃絲蟲（0. ostertagi)與養康牛贾絲蟲（l c i r c u m ο ί n c t a )成蟲在供冷凍切片用之包埋化合物中冷凍經濟部中夬標準局負工消费合作社印製織砠用使後：然下。如片性切活凍 A 冷AP 之iw 米及 MM 0 P 1 A 成似切之下片態切狀析溫分低術於技並學 ’ 化斯拉可拿據根弗勞克格里西及曼 6 2 N C /1. 隼 |標 I家國i? 一 I一认尺張紙本格規

釐公 7 9 2 X 444 02 ] a? B7 五、發明説明（j)

Cytochemistry 5，264-278)及勞達（Lojda)，高斯勞 (Gossrau)與希勃勒（Schiebler)(1979*酵素姐織化學，實驗室手冊*柏林史普林格出版社（Enzyme Histochemistry, A Laboratory Manual , Springer ▽ 之方法。

L -丙胺酸4 -甲氧基-萃蹈胺（希格馬（sigma)公司） 0.7mM 或 L -白胺酸4 -甲氧基-/3 -萘醯胺（希格馬公司）〇 . 7 in Μ 溶於無水乙醇 0 . 0 5毫升蒸餾水 0.45毫升 0.1Μ乙酸鹽緩衝液，cH6.5 5奄升生理食鹽水（0.85%) 4毫升 0 . 1 3 %氪化鉀 0 . 5毫升快速Μ Β (臨用前方調配） 5毫克方法 1 切片於室溫下乾烽 2小時 2 ·於4 下，在甲縮醛钙（f 〇 r m a 1 c a丨c i u m )中固定 1 0分鐘 3 .於4 t：下，在生理食篛水中潤洗（2 x ) 各2 - 3分鐘經濟部中央標準局員工消費合作社印絮 {讀先閲讀背面之注意事項再填寫本再} 4 .於3 7 T:下·在受質中培養 5 - 1 0分鐘 5 .於生理食盩水中潤洗 2分鐘 6 .於0 · 1 Μ硫酸銅中潤洗 2分鐘 7 ·於食篛水中潤洗 2分鐘 8 .加入甘油凝膠中 -2 7 - 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ 297公釐） 444 02 1 A7 B7 五、發明説明（^ 9 .添加5 m Μ 1 , 1 0 -二氮雜菲至培養基中，抑制酵素活性。酵素活性圼藍紅色。胺某狀跑A (勞達（Lojda)與高斯魯（Gossrau)，1980， Histochemistry 67, 267-290) ° 夸皙 L -穀胺酸cc - 4 -甲氧基-召-萘醢胺（希格馬公司）〇 . 9 4 m Μ 溶於二甲基甲醯胺 0.5毫升 0. 1Μ磷酸鹽緩衝液（pH 7.0) 10毫升快速Μ B 5毫克 Ca C1 1 0毫克加溫及過濾器含1%福馬林之3.5%CaCl 方法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局負工消费合作社印製 1 .切片於室溫下乾燥 2小時 2 .於甲縮醛鈣中固定（4 t ) 1 0分鐘 3 .於磷_鹽緩衝液中潤洗 2 X 2分鐘 4.於受質中培養 10分鐘 5 · Μ蒸餾水潤洗（4 t： ) 1 0分鐘 6 .俊固定（室溫） 1小時 7 . Μ蒸餾水潤洗 8 .加入甘油凝膠酵素活性圼紅色。结果示於圖1 ，其中清楚地顯示似A ρ Μ及似Α ρ Α活性均 -28 - 本紙張尺度適用中固國家標隼（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 444 0.2 1 A7 _B7_ 五、發明説明（乂）與歐斯特牛胃絲蟲（0 ostertaaJ)(圖1 ( a )，似A P Μ ;圖 1(C)'似 ΑρΑ)及賽康牛胃絲蟲（CL—Circunicinot.a)(圖 1(b);似ΑρΜ ;圖1(d)似ApA)之腸微绒毛有關。富例2 " ϋ： Mft ^ ^ agia ost. prtag i ) 使歐斯特牛爾絲蟲（Π. ostertaai)接受PBS(產生PHS萃液），1%聚氧乙烯-山梨楗酵酐-單月桂酸酯（Tveen 20 •美國威明頓市IX + CI美加公司之註冊商標（IX + CI Americas Inc, WilBington, USA)) (丁wHS萃液）及 Thesit (ThHS萃液）進行差示萃取。萃液於高速下離心（貝克曼離心機（Beckman Airfuge)，最高速，斜角離心機 )，分析上澄液之似胺基肽酶Μ酵素活性（見表1 )。此萃液中亦出現似胺基肽酶Α活性，但其比活性與缌活性則低得多。胺基肽酶M (Uu/met-pNA)對似胺基肽酶/\(«_ g 1 u - p N A )之活性比為約4 : 1 。離心後之歐斯持牛胃絲蟲（0. ostftrtagi)萃液（P H S， TwHS，ThHS)於6-16%未變性PAGE上分析。供對照用之來自扭轉血矛線蟲（Haemonchus contortus)之富含H110D萃液亦流經相同凝膠。於凝膠上使用丙胺酸姐織化學受質，證簧胺基肽酶Μ活性。在歐斯特牛胃絲蟲(Ost』…gi a ΟΛί,^τ t a kJJ之Thes i t萃液（稱為OoThHS)中之單一條帶具有活性，其移動之距離與扭轉線蟲（Haemonchus)萃液中另兩條移勤較慢且具有胺基肽酶Η活性之條帶之距離相同（圖 2 )。（在牛胃絲蟲（〇 s t e r t a g i 3 )之P B S萃液中亦見到一條 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本.

,1T A7 444 〇 2 f B7 五、發明説明（ - - nf^— ^^^1 U- ill _ I HI- - ^^^1 I- J ^1.^1 一OJ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕移動較快速之條帶I其可能為细胞質（非完整膜）白胺酸胺基肽酶）。離心後之 Thesit萃液（OoThHS)於 10 mM Tris pH 7.2 ， 0 . 1 % T h e s i t中透析，加至陰離子交換管柱中（法馬公司，SMART Mo noQ管柱）。收集洗出之溶離份及因添加氯化納梯度而釋出之结合部份（圖3 )。分析各溶離份之胺基肽闺 Η ，及似胺基肽酶Α活性。大多數胺基肽酶活性在鹽梯度一開始即溶離出（圖4 )。取溶離份樣本於還原條件下之 6-16% SDS-PAGE上分析，所分離之蛋白質經銀染色而可見到（圖5 )。含有大多數胺基呔酶活性之溶離份具有二條特別強之條帶，一條之M r約1 2 5 , 0 0 0 (箭頭處，圖5 )，及一條雙條帶之M r約3 2 , 0 0 0。此等成份娌凝過賺法分離（於 SMART Superose 12管柱上進行），如SDS-PAGE所示（圖 6 )。分析溶離份之似胺基肽酶Μ活性。發現活性僅出現在含有M r為1 2 5，0 0 0之條帶之溶離份中，此蛋白質稱為 0 ο 1 2 ° 以P B S萃取歐斯特牛胃絲蟲（0 . 〇 s t. e r t. a g ΐ )後所得沈殺物質之胰蛋g酶水解物釋出肢基肽_ Μ /丨以A活性比例為 8:1 。所釋出之蛋白質可經SDS-PAGE分離.自凝膠上切下經濟部中央標荜局員工消費合作杜印褽條帶|將蛋白質移至膜上，分析N -末端序列。賽康牛爾絲蟲（Ostertag ia c i r c u m ο ί η c t r ) 依序MPBS，1% Theen 20及Thesit萃取寶康牛戽絲蟲（(L__circumcincta)成蟲之均質抅。華液高速離心。 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局—工消費合作社印¾ 4 4 4 Ο 2 丨 at Β7_ 五、發明説明（移動較快速之條帶，其可能為细朐質（非完整膜）白胺酸胺基肽酶）。離心後之 Thesit 萃液（OoThHS)於 10 tnM T「is pH 7.2 * 0 . 1 % T h e s i t中透析•加至陰離子交換管柱中（法馬公司，SMART MonoQ管柱）。收集洗出之溶離份及因添加氣化納梯度而釋出之結合部份（圖3 )。分析各溶離份之胺基肽酶 Μ ，及似胺基肽酶Α活性。大多數胺基肽酶活性在鹽梯度一開始即溶離出（圖4 )。取溶離份樣本於遨原條件下之 6-16%SDS-PAGE上分析，所分離之蛋白質經銀染色而可見到（圖5 )。含有大多數胺基肽酶活性之溶離份具有二條特別強之條帶，一條之M r約1 2 5 , 0 0 0 (箭頭處，圖5 )，及一條雙條帶之Μ ^約3 2 , 0 0 0。此等成份涇凝膠過濾法分離（於 SMART Superose 12管柱上進行），如SDS-PAGE所示（圖 6)。分析溶離份之似胺基肽酶Μ活性。發現活性僅出現在含有M r為1 2 5 , 0 0 0之條帶之溶離份中，此蛋白質稱為 0〇 1 2 〇以P B S萃取歐斯特牛茼絲蟲（0. ostertaei)後所得沈澱物質之胰蛋_酶水解物釋出胺基肽酶Μ /似A活性比例為 8:1 。所釋出之蛋白質可經SDS-PAGE分離，自凝膠上切下條帶，將蛋白質移至膜上*分析N -末端序列。窖例3 寶康牛胃絲蟲（Ostertag ia oircum^innt. a) 依序KPBS，Theen 20及1% Thesit萃取賽康牛胃絲蟲（0. circumcincta)成蟲之均質掏。萃液高速離心。 ~ 3 0 - 本紙張尺度適用中國國家樣準（匚呢）六4规格（210>：297公釐> {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

444 02 1 A7 B7 五、發明説明（ 6-16%變性PAGE上分析*但甚至在銀染色之後，可以清楚

少很’ W 白S W 蛋II白之之蛋蟲絲 0 牛特斯歐同如 0 用利步一進可化純法析層除 (請先問婧背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4说格u丨0X297公釐） 444 Ο 2 Ί Αν Β7 五、發明説明（> ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印褽

i 、 ¾ hi S m ^ 踩 a 时3： W 5K SK 轻兹迪 m 较 3£ 幽 ο •Η < Ο S 'α a < 2； Οι 1 OJ ι-Η < 1 JJ cu S： < 1 P 0) < < : CO < CO <c H <C CO << fn co 2 129 6 384 12 726 0,3 18 j ίΌ ο m m L〇 I—t 寸 V£> ΓΛ IN m 62 189 74 227 10 31 17 . 51 菊升 1 ：_1 CTt CTi |—1 ΟΛ .-.in 迪孭白筲奄克 1 1 1 ! 00 \D ίΝ 卜 \D \D CO o ro 街白質溜度窀克/窀升 LO H n rH 卜〇 m tn 〇萃液 ί 1 PHS TwHS ThHS (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙痕尺；1適m中國國家標车（CNS ) A4規格（210X297公釐） 444021 A7 B7 五、發明説明（）ί) 經濟部中央標準局員工消费合作社印繁

Φ 一、长鸫 m m m m \ 解 φ W 3；时鹄 η m 兹擗 w 廿1 ΐΗ S iS H © 味 t 口 f—^ <C 0 之； '〇4 ϋ < E t 1~t < < 1 JJ ω S： < 1 口 CL) < < W < Η < CO < CO Η C CO *^r rH 〇 (—f VO o T-i co ΓΊ 卜 in 〇 r-i f—1 C4 CN 寸卜 wi 〇 in VO VD <y\ ir> m t> 含 o f—t CN <N t—i t—1 CO o t—i \o rn S «? m «Η CTi XJD 卜 ΓΟ §2 •E轵芻 Ot \D 卜 in o rH VO σ\ CM fes >fe m m in轵 pa «? r*> cr in r~I CO o m cn Dj tn K CO -C (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -S規 4 A 5 N C i準 1 和國國中用適一 S 尺 |法紙 ;本

一釐公 7 9 2 X 34 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印^ 444 021 B7 五、發明説明（$>) 啻例4 得自歐斯特牛罱絲蟲（门.o s t. r t, a κ i )之Π 〇 1 2之锘宙使用下列方法所製備之0〇12進行下列實驗•其中Con A 緩衝液A為5 m Μ乙酸納，1 πι Μ氯化錳，1 κι Μ無水氯化鈣* 0 . 1 m Μ氯化納，0 . 0 2 %壘氮化納，闭 5 . 2，且C ο η Α緩衝液B為緩衝液A添加0 . 5 Μ甲基-ct - D -吡喃葡糖苷及0.2 Μ甲基甘露糖苷。 1 . 線蟲於1 0倍體積之冰冷P B S + 0 . 0 2 %暨氮化納中均質化（P B S a )，低速離心（1 7 , 0 0 0 g )。 2 . 沈澱塊再懸浮於1 0倍體積P B S a中，再離心。重覆 P B S a再懸浮及再離心一次。P B S低速上澄液（P L S )可在 1 0 0 , 0 0 0 g下超離心，得到高速P B S上澄液（P H S )及高速沈澱塊（Ρ Η Ρ )。 3. 低速沈殺塊再懸浮於10倍體積PBSa + 1% Tween 2 0中，Si 4 t下琨合1 . 5小時，依上述於1 7 , 0 0 0 g下離心。重覆洗滌及離心二次。 4 . 沈豭塊再懸浮於P B S a + 1 % T h e s丨t中，於4 t：下混合一夜。依上述離心。沈澱塊再懸浮於P B S a / T h e s i t中，於4 下混合1 . 5小時，再重覆。收集低速T h e s i t上澄液 (THLS 1-3)，於100,00〇g下超離心，產生Thesit高速上澄液（ThHS)。 5 , T h H S遝使用法馬P D 1 0管柱或使用C ο η A緩衝液+ 0.1% thesit透析，交換緩衝液，並於刀豆素A (ConA)寶弗洛斯管柱上分析。 -35 - 本紙張尺度通用中圉國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 444 02 i A? _ Β7_ 五、發明説明（0) 6. 添加ThHS至FPLC或法馬SMART系統之ConA管柱中， MConA緩衝液A洗掉未合之蛋白質。使用i〇〇%c〇nA緩衝液B溶離结合之物質。溶離之初暫停15-20分鐘*使结合蛋白質之收最達最大量。溶離出含有ΑρΜ活性之溶離份 (由微滴定盤酵素分析法測定），於6 - 1 6 %變性，還原性 PAG Ε上分析，確定012條帶之存在，並收集，產生c〇nA 012 ° 7, ConA 012加至法馬MonoQ離子交換管柱之前，可先透析，或交換緩衝液換至MonoQ緩衝液A (20 Tris， pH 7.2) + 0.1% thesit中。將物質加入含MonoQ緩衝液 A管柱上，使用1%/毫升MonoQ緩衝液B之梯度（M〇noQ緩衝液A與1M NaCl)溶離，達到30%後，3 % /牽升，直到 1 0 0 %孃衝液B。收集含有A p Μ活性之溶離份及2條帶，產生 CamQ 012 。拙制劑富駱方法分析各種不同蛋白酶抑剌劑對〇 0 1 2活性之影崔，且包括艾瑪抑制素（a β a s t a t i η )(胺基呔酶抑制劏+)，肌蛋白抑制素（actinonin)(胺基肽酶抑制劑），貝斯抑制素 (besta t i η)(胺基肽酶抑制劑），EDTA (金屬蛋白酶抑制劑 )’ Ε 6 4 (半胱胺酸蛋白酶抑制劑），胃蛋白薛抑制素

(pepstatin)(天冬肢酸蛋白_抑制劑），ι,ι〇 -二氮雜菲（金屬蛋白酶抑制劑）及3, 4 -二氯異香豆素（DCI,絲胺酸蛋白酶抑制劑）。添加10微升ConA 0〇12及100微升50 mM -36 - 本紙張尺度適用中國國家梯率i CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填湾本萸)

，1T

V A7 B7 444 〇2 五、發明説明（w) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Mops緩衝液，ρΗ 7· 0至微滴定盤井孔中，添加2_4微升酵素抑制劑，終濃度為〇·5 mM及i mM肌蛋白抑制素，5()ίί H 及 100uM貝斯抑制素，1 mn與 15 mM EDTA, 5〇uM 與 100 w Μ E64，l〇及50 w M雳蛋白酶抑制劑，i “與1〇 μ 1,10- —氮雜菲* lOOwM與50〇wM DCI。滴定盤先於m 下培養20-2δ分鐘後，分析APM與APA活性。各井孔中添加100徹升2 白胺酸對硝基替笨胺（ApH)或α-穀胺酸對硝基替笨胺（ApA)/M〇PS，使用ELISA盤讀數器测定4〇5 njn 之光密度（0D)。滴定盤在375C下培養45-4S分鐘後，讀取最後0D讀數。計算每1〇徽升樣本每分鐘〇!)荽化。所有分析均重覆三次。结果.，見表3 。如所期望者’僅金屬蛋白酶與胺基肽酶抑剌劑對胺基肽酶活性具有抑制效果，以1 〇 m Μ二氮雜菲之抑制效果最大。艾瑪抑制素對A ρ Μ及A ρ Α活性之差示效果類似先前技藝之H11 (菖拉漢（Graham)等人，W0 93/23542), 經濟部中央標準局負工消费合作社印裝可分辨0〇12 Ap活性與哺乳動物Ap。奧亞其（Aoyagi)等人 (J. Antibiotics, 43 (2): 143- 148)證簧艾瑪抑制素對豬 A ρ Α之抑制作用授於Α ρ Μ ，但Η 1 1及0〇 1 2則出現相反结果〇兮皙恵一件方法於微滴定盤上1使用—系列受質分析ConA 0〇12之酵素活性，重復三次。各井孔中添加5微升ConA 0〇12{緩衝液 -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210Χ297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印^ 444 02 7 A7 B7 五、發明説明（gf) 換成 PBS/0.1% thesit)或 ConA H11 (含於 ConA 緩衝掖 B) *及100微升50 mH Mops pH 7.0 (或酸式磷酸鹽使用90 nM撺檬酸媛衡液+ 10 inM NaCl. pH 5.0，及7-gtP使用 50 mM Tris, pH 9.0) a滴定盤先培養15分鐘後*添加 100微升2 mM受質（含於適當緩衝液中），然後測定〇D。滴定盤於37TC下培養26分鐘*再測一次0D。若使用酸式磷酸鹽時•添加75微升1.66M NaOH /孔停止反應。當0D為1時，由甲硫胺酸吸收量計算酵素活性比例。结果見表4 。ConA 0〇12對甲碇胺酸展琨最大專一性•且

ConA 0〇12與ConA H1〗之間之最差異在於0〇12對離胺酸之專一性較低•且7 -GTP活性極低。 0〇〗2 Ad诖神之畏谪営t>H 方法於 ConA 緩衝液 A/0,1% Thesit 或 PBS/0.1% Thesit 中，使用α -穀胺酸-pNa (ΑρΜ受質），甲硫胺酸pNa或白胺酸 -pNa UpH受質）分析ConA 0〇12之胺基肽酶活性。選用 50 mM MES (pH 5,5-6.5)及 50 mM MOPS (pH 6.5-8.0)作為緩衝液，涵蓋廣泛之P H範圍，並於p Η 6 , 5重叠。使用定量瓶及MilliQ超纯水製備緩衝液，於微滴定盤上分析三次 (如上述）。每井孔添加5激升ConA 0〇12或5微升ConA H11 (含於ConA緩衝液B中，供對照用），在13.6-25分鐘期間測定0 D變化。结果 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（2丨0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 444 02 } A7 B7 五、發明説明（〆）見圖14-16 。在不同受質之間及012與H11之間出現不同pH圖形，但通常胺基肽酶活性之最適當pH在6.5-7.0之間。當於pH 6.5使用MOPS及MES時，亦出現一些活性變化，表示緩衝液组成亦影甾活性。本紙悵尺度適用中國國家橾準（CNS > A4说格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 W4 02 1 五、發明説明（SY) ^s^f-ms涅缃舀{οο)Μτο v NOU 运 S K S 赵 »—* -< 〇、. a φ 、时 η tH £ < % t — ο 1 ϋ m S in 〇> tH σ\ CD T? u> 系 α ιΠ \〇 C4 <Ν \D 求 o o H 〇 ο Η CNJ in η CS Η sO CO r-> 〇 \〇 ^-4 〇 o <Λ ο ο 'Tf f- r-i 〇 σ\ τ-l Η Ο Η \£> Η Ο w-< rt Ο η w λ ο r- Μ Γ〇 Ο ιο Μ η ο u> H O 〇 Ο Ν \Λ Μ Ο \〇 Η Ν Ο ο w fO ο Ν C0 <Ν ο tn O N o < 1 φ m e H5 * 求 σ\ <*1 \〇承 \〇 CTv 求 CO Ρ\ <Λ Η 承 κ〇 η 云 Η + Ο S' 十 ο 云 χο ο ? r*> h 〇求 σν σι 求 ο ο Η Ο <D > 求 νο C0 求 ΙΛ <Λ fNj eg rH Η Ν y〇 ο ω τί ο ΧΛ rr o o fN CN Ο Ο σχ σι ο CO 卜 ο Η CI Η CO Γ η Η Γ* σ\ Μ »-t r> v〇 N H in ο ο ο Ο 9\ CM Οί ff σ\ 0J γΗ γΗ ιΗ <7ν m ιΗ CD tH (Ν Ο ->? r- o o C-4 Ξ . •c - s J S * - ε窮 m 2 巨〜 1 L0 Ο 1 Η to X 3. Ο Ο γ"| 1 Η i ΙΛ Η S a. ο \η "S. Ο Ο Η 3- Ο γΗ X o I »Η 1 ο Η *3, ο ο Η 2 ο ο ιη 1 X 3. Ο Η *3. O LTJ δ 写 C C ο cr δ g a πι 53 = c 2 cn 01 CQ 5 § = < 卜 Ω y〇 ω C 4<J 5 (Λ α 之 Μ 萏 e i {C a UX. -Γτν Μ ο Η Ο Q » C a (A α *< '5 5 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） > 444 02 1 A7 B7 五、發明説明nl) i R 0 ϋ 寸™· ο το - o ττ o ^ε- τ s * (I ==^1-)^-^^^(-55/3^/ 时 3+¾麻 rwffi^- ττΗ vuo〇

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Ysa-nTD_ti YHd-qnT0- · duv 1i 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）蛵濟部中央標準局員工消費合作杜印装 4 44 02 1 ΑΊ ^___^_ 五、發明説明up) 窖例η 聚^合陷練反膜 miJLA之製法取80毫克羥急速冷凍且倮存在液態氮中之12天大歐斯特牛爾絲蟲(Ostert. agia ost. ftrtagi)(英國品種），在液態氮下磨成粉，並使用mRNA微萃取套姐（法馬公司），根據製造商指示萃取raRNA。簡言之，磨粉後之線蟲溶於含有硫氮酸胍鹽及N -月桂醢基肌胺骹之溶液中，然後以寡（dT)_纖維素自水溶液中萃取bRNA°diRNA存放在-80 1C之乙醇中，直到使用時為止。第_~肸之卸法使用依上述由10毫克歐斯特牛戽絲蟲（0. ofitertagi)^ 得之in 1? N A來製備第一股c D N A。m R Η A溶於1 1 . 5微升無菌水中 ’添加1微升T17配合子-引子（adaptor-priraer)，0.5 微克 / 微升（5， GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ')。此混合钧加熱至6 5 XM 0分鐘*置於室溫下2分鐘，然後置於冰上。合成cDNA時*添加來自cDNA循環套姐（英維真公司Invitrogen)之下列成份.RNase抑制劑至0.5 單位/徹升，逆轉錄酶纆衝液至lx濃度，dATP，dGTP， dCTP及dTTP至1.25 πιΜ·焦磷酸钠至4 mM及AMV逆轉錄酶至〇 . 5單位/微升（均以终濃度表示）。反應混合物於42 TC 下培養δ 5分鐘，然後於98 °C下加熱2分鐘。反應混合物加 1〇〇微升水稀釋，以苯酚萃取，並从旋轉管柱層析法純化 cDNA (馬尼提斯（Maniatis)等人，1982) 。cDNA存放在4 -42 - 本紙張尺度通用中圉國家標隼（CNS ) A4現格（210X291?公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

* 444 〇2 1 A7 _ B7___ 五、發明説明（θ) 。。。 cDKA使用胺其叶柄再一桦引孑谁行PCR擴増作用引孑比較扭轉血矛線蟲（H. f；〇n tortus) ( W 0 9 3 / 2 3 5 4 2 )及線蟲C^-ajQJLT h a h Η i t. i ^ p 1 pgans之DNA序列資料與哺乳動物胺基肽酶之間之同質性，並得到编碼胺基酸G 1 y A 1 a Met GU Asn Trp Glu Leu之保留區。根據此序列製造有意義及反義引子。有意義引子為5’ GGA/TGCIATGGAA/G ATT/C TGGGGICT 3’，反義引子為 5’ AGICCCCAA/G TTT/C TCCATIGCT/A CC 3' 〇上述有意義引子可與來自T17配合子-引子之配合子序列V GACTCGAGTCGACATCGA 3·使用，與歐斯特牛胃絲蟲 (_Q_si£jiia_g_L)之第一股 c D N A 進行 P C R 。經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 有些不同腸蟲之cDHA 5·末端已顯示•在第一個甲硫胺酸之前具有一段22個鹼基對之保留區（黃（Huang), 1990} 。此區域已知為接合引導物（Spliced leader) 1 (SL 1) ，其序列為 5( GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG 3·。此接合引導物已鑑定為扭轉血矛線蟲（H . contortus) (WO 93/23542) 之徹粒體胺基肽酶之5’末端。此接合引導物配合上述反義引子，可用於與歐斯特牛胃絲蟲（0 . 〇 s t e r t a g i )第一股 cDHA進行 PCR 。聚合旃铺反應使用程式化熱循環機（Programmable The「ma丨Cycler1 (M.J. Research Inc.)進行反應。第一種反應混合物包含 -43 - 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS > A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印策 * 444 02 1 A7 A 7 B7 五、發明説明（w) 1微升歐斯特牛雳絲蟲（n. o^tfira&i-)第一股c D N A，1微微莫耳T17配合子-引子，25微微冥耳配合子’ 25微微莫耳有意義引子，1 X Taq摄衝液（百萑曼漢姆公司 B 〇 e h r i n g e r M a η n h e i m )，各 0 . 2 m M d A T P，d C T P 1 ¢3 G T P 與 dTTP，反應髁稹100微升。第二種反應混合物包含1徽升 cDHA，25徽微荑耳SL1引子，25微微莫耳反義引子，其餘刖如同第一棰反應混合物。反應混合物加熱至9 5 °C 2分鐘，然後保持80t：，此時各添加3單位：La_g_聚合酶（百靈曼漢姆公司）。採用下列程序：步驟1 53°或56t 5分鐘步驟2 7 2 t 2 0分鐘步驟3 9 4 t 4 5秒步驟4 53°或56°C2分鐘步驟5 72 12.5分鐘步驟6 至步驟3 · 3 9次步驟7 72t：15分鐘步驟8 保持4 1C。 PCR齑物之紳仆及撰铕烴1 %瓊脂糖凝膠於T A E緩衝液中進行電泳法分離反應產物（曼尼提斯（Maniatis) 1982)。兩種引子姐合在53P或 5 6 1C反懕後之條帶分佈圖形相同，因此混合每對引子之反應產物。這些姐合之反應產物於T A E凝膠上電泳，切下所需之條帶，W玻璃乳（glassrailk)(金克林（Geneclean), B I 0 1 0 1 )纯化 D N A 。 -44 - ___________ 一本紙珉尺度適用中國國家標率（CNS )八4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 經濟部中央標準局負工消费合作社印褽 444 02 1五、發明説明（么>) 純化之DNA與質體載體pT7Blue (諾瓦金公司Hovagen) 粘接，用於轉形適當之Novablue (諾瓦金公司）大腸桿菌細胞。轉形之大腸桿菌塗在盤上，依顔色選拔含有嵌段加載體之群落。自推斷為陽性之群落中製備DHA ·於TBE凝膠中電泳（曼尼提斯* 1982)，選拔含有所需大小嵌段之純糸0 純备之序？II分析使用來自序列酶2.0序列分析套組（Sequenase 2.0 Sequencing kit)(艾茉珊（Anershan)公司），標示 GTP與 ITP ，MT7 DNA聚合酶分析雙股DNA之「寡核苷酸漫步 (oligonucleotide walking)」予 Μ 定序。窖例ft 羊杭而蒱取1.242奄克ConA 0〇12於0,7毫泶8 %變性，遇原性 PAGE上，那近高分子量蛋白質標準物進行分析。自凝膠兩邊切下细長條1 Μ考馬希M (Coomassie blue)染色，定出 012條帶位置。這些凝膠再與凝膠排在一起，估計未染色之01 2條帶位置，切下來。凝膠均質化，與弗洛伊德氏輔劑（Freund’s adjuvant)混合‘注射人一隻羊體内，產生對抗0〇12E之抗體（電泳後為0〇12)。4週後，使用上述方法進行第二次注射，注射量為提高至1.863毫克加至凝_ 上所得到之蛋白質。定期自羊體内收集血液，製備血清。使用ot-〇ol2E血清為探針，與ConA 0〇12及ConA H11進行經過過唉酸納處理之西方墨點分析。C 〇 n A 0 ο 1 2證簧在約 -45 - 本紙乐尺度適用中國國家梂率（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填苑本頁) — 訂 * 444 02 1 A? A7 B7 五、發明説明（4) 1 20 , 000與170 , 000處出現強烈之免疫反應性條帶*而 97及55 kDa處之條帶則較弱（圖17)。Con A H11中，在約 70 kDa處出現免疫反應性條帶，H11相當檳糊。在ConA 012中•在170,000 kDa處出現之免疫反應性條帶需要進一步研究。經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (锖先閱讀背面之注意事項再填寫本萸) 亦使用Elisa法測定血清抗體效價*於4 t：下* K50微升 / 孔 3 微克 / 毫升 ConA 0〇12 塗佈 Dynatech.lBinulon 4 Elisa盤，歷經一夜。M 3x PBS洗滌盤子•於37它下* M PBS/10%胎牛血清（FCS)阻斷反應1小時。盤子的一半 Μ150微升/孔10 mH偏過碘酸納之0.1 Μ乙酸納緩衝液 pH 5. 5溶液處理30分鑌後，於室溫下* Μ 150微升50 raM 氫硼化納之PBS溶液處理30分鐘。盤子另一半羥乙酸鹽媛衝液處理後，Μ P B S單獨處理。Μ 3 X P B S潤洗井孔*添加 100微升/孔初级抗血清（得自注射前與注射後之羊血清 )(稀釋1:1000，含於PBS/10%FCS中各血清重覆分析三次，加至經偏過碘酸納處理及未處理之并孔中。盤子在 3 7 °C 下培養 1 小時，K 3 X P B S / 0 . 0 5 % T w e e η 2 0 潤洗，添加50微升/孔猴子α -羊IgG過氧化酶共軛物（稀釋 1:1000，含於PBS/10%FCS中）。盤子於371下培養1小時，W 3x PBS/Tween潤洗·並添加150微升/孔下列展開溶液：1δ毫升MilliQ水，2毫升1M乙酸納pH 6,0，200微升TMB (10毫克/毫升DMS0溶液）與20微升6%H2〇2 ，使用四甲基聯苯胺（Τ Μ B )展開。展開1 0分鐘後· K 3 0微升/孔 3Μ H2S〇4停止反應。於ELISA盤讀數器上，於450 nm下謅 -4 6 - 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Α7

k 444 Ο 2 T _____Β7___________ 五、發明説明（么取0D。 (请先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 结粜見圖18。〇〇12E在羊體內圼抗原性’其抗血清效價隨時間上升。Μ過确酸納處理抗原，瑝成0D下降’表不大多數免疫反應計對碳水化合物，較少針對蛋白質抗原決定基° 官例7

ConA 0〇12牛抗俞请根據實例4前段說明之方法，自歐斯特牛胃絲蟲d 〇 s t e r.,t a r i ) thesit 萃液製備ConA 0〇12 。為6 隻小牛 (12至27週大）注射含於弗洛伊德氏輔劑中之ConA 0〇12三次。前兩次劑量投與250徽克/隻牛，最後一劑投與200 微克，每次注射間隔3週。對照姐之6隻小牛分別接受三次注射含於弗洛伊德氏輔劑中之1 5 0微克鐵蛋白（1型’來自馬脾臟）。使小牛感染40000隻歐斯特牛胃絲蟲d os. t e r t a g i )幼蟲。每週收集血樣，製備血清，並依下法’ 使用E i i s a法測定血清抗賴效價。經濟部中央標準局員工消費合作社印製於4 °C下，K 5 0微升/孔3微克/毫升C ο η A 0 〇 1 2塗佈 Dynatech Immulon 4 Elisa 盤一夜。W3X PBS 洗將盤子· 於3 7 f下，Μ P B S / 5 %胎牛血清（F C S )阻斷反應1小時。以 3Χ PBS/0. 05% Tween 20潤洗井孔，添加100微升/孔初鈒抗血清（稀釋1 : 1 0 0 0，含於P B S / 5 % / F C S中）。各血清重覆分析三次。盤子在371下培養1小時，W3X PBS/Ο . 05 % Tween 20潤洗，添加50微升/孔兔子or-羊IgG過氧化 _共轭物（稀釋1 : 1 0 0 0，含於p B S / 1 0 % F C S中）。盤子於 -4 7 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CMS ) A4规格（2I0X297公釐）經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 » 444 021 A7 B7 五、發明説明（β1) 37 °C下培養1小時，Μ 3Χ PBS/Tween潤洙，並添加1 50微升/孔下列展開溶液：18毫升MilliQ水，2毫升1M乙酸訥 pH 6.0，200微升TMB (10毫克/毫升DXSO溶液）與20微升 6%H2〇2 ，使用四甲基聯笨胺（TMB)展開。展開15分鐘後，以30微升/孔3M H2S〇4停止反應。於450 nm下讀取0D。结巣見圖23。抗血清效價随時間上升，表示Co nA 0〇12在牛體內呈抗原性》官例8 牛與羊0〗2抗命渣夕免涛反膜忡使用標準thesit萃取過程，以新鲜填装之ConA賽弗洛斯管柱，自寶康牛胃絲蟲（0. circumcincta)中製備C ο η A 0〇12，Μ含0.5M甲基吡喃葡糖苷與0.2H甲基甘露糖苷之 ConA緩衝液自管柱中溶離出结合物質。ConA 0cl2與 ConA 0〇12及ConA H11共同於二份6-16%變性，遝原性凝膠上分析。每一條各使用約4微克製劑。蛋白質隨後在 Immobi丨on P上進行西方墨點分析•並Μ下列血清作為探針：羊抗 C a m Q Η 1 1 I g G (1 : 1 0 0 )，羊抗-0 ο 1 2 Ε (依簧例 6 製麂* 1:1000)，牛抗ConA 0〇12血清（依賁例7製備* 1 : 1 000)，及免疫前之羊與牛血清（1 : 1 000)作為陰性對照姐。结果見圖 24°ConA Hll，ConA 0〇12 及 C〇nA 0cl2 均對三種免疫血清展現免疫昃應性。0 ο 1 2看起來小於0 c 1 2，此可能因 -4 8 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297+公釐） (诗先E讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消费合作.社印装 44402 / Α7 ____ Β7__ 五、發明説明u句 0〇12降解之结果。〇cl2與〇〇12之抗血清交叉反應•而且 0〇12 &羊體中誘發免疫反應，此表示〇〇12可作為雙價疫苗 ’ 抗賽康牛雳絲蟲及其來源之線蟲。實例9 . S1-L2—水鏟夕分解作宙 .之蛋白睢分眩方法；使0〇 PhP再懋浮於50 mM Mops緩衝液，pH 7.0中 ’形成〇 . 1毫克沈澱塊/毫升。取5 0撤升於3 7 °C下預溫熱 39分鐘。添加5微升α -胰凝乳蛋白酶（希格馬VII型* 50單位/毫克固形物），枯草桿菌蛋白酶（希格馬^11型， 1 1 . 6單位/毫克画形物），胰蛋白酶（希格馬，經TPCK處理之XIII型，9700單位/毫克固形物）或嗜熱菌蛋白酶（希格馬’ 37單位/毫克固形物，溶於1 mM HC1/2 mM CaC丨中 )*蛋白终澹度為5 >50，500 ，1000及2000微克/毫升。取含有胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶或祜草桿菌蛋白酶之部份於3 7 C下培養1小時，添加1徽升1 〇 m Μ 3 , 4 -二氯異香亘素（D C I)抑制蛋白酶活性。含暗熱菌蛋白酶之部份於 37 °C下培養2小時，添加1微升〇 . 2 5 Μ E D Τ Α抑制活性。樣本於2 0 p s i之離心楗（a i「f u g e )上，室溫下高速離心2 0分鐘。取5微升樣本使用徹滴定盤法分析ΑρΜ活性，分析時間2 9,6分鐘，Μ甲硫胺酸-ρ ν Α作為受質。结巣見表5 。四種蛋白酶均使phP釋出ΑρΜ ，但嗜熱菌蛋白 _之效果最低。 -4 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本I)

*tT

V Α7 Β7 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印策 4 44 〇2 1 五、發明説明up ' PHP之陴凝乳蛋白睢分龆作用放大規模進行上述實驗，進一步純化所釋出之ΑρΜ活性〇使0〇 ΡΗΡ 2與3再懸浮於50 mM Mops* pH 8.0中，形成 0.1毫克沈澱塊/毫升，取4.5毫升在371下預溫熱20分鐘。依上述進行分解作用，α -胰凝乳蛋白酶之添加量達 500微克蛋白酶/毫升懸浮之ΡΗΡ 。添加15微升/毫升 10 raM DCI抑制蛋白酶活性。分解液於貝克曼超離心機上離心2次，係使用S W60向外懸吊式離心機，於3 1 00 0 r p m 下離心1小時20分鐘。酵素分析法證實pHF>釋出Apm及 ApA活性（使用Met-pNA時，0.734毫微莫耳/分鐘/ 10微升；使用Leu-pNA時，0.414毫微莫耳/分鐘/ 1〇徽升；及使用ot-Glu-pNA時，0.304毫跆莫耳/分鐘/ 1〇微升）。其餘上澄液使用法馬PD10管柱·將媛衝液換成 ConA緩衝液A ·然後加至SMOT糸统之新鲜填装ConA賽弗洛斯管柱上。將物質加至含於ConA緩衝液A之管柱上，Μ 一個步驟使用含有0·5Μ甲基吡喃葡糖苷及0.2Η甲基甘露楗 ¥之100 % Co η Α緩衝液Β溶離。僅收集含有ΑρΜ活性之溶離份。於6 - 1 6 % P A G Ε上分析。此等溶離份在約；π 6 0 0 0處出現強烈條帶（圖25)。收集之溶離份於Centricon 10中濃縮，於6-16%要性’谡原性迷你凝膠上，與未分解之pup ，僅胰凝乳蛋白酶•及對照用之ConA 0〇12與ConA H11共同分析，於經1 0 m Μ偏過硝酸納處理之I n m 0 b π ο η P上，以羊α-0ο12Ε Π:〗〇〇〇)為探針•進行西方墨點分析（使用 -50 - 本紙張尺度適用中國國家#準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦j

經濟部中央標华局貝工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（e/) B i 〇 R a d半乾式糸統）。分解後之沈澱塊於約1 1 6 0 0 0 _ 1 200 00處出現強烈之免疫反應性條帶。來自分解之PHP之上澄液使用含〇 9 2 Μ麥黃萌替代甘胺酸之槽緩衝液’於第二條凝膠上分析。凝膠依上述進行墨點及探針檢測'自吸墨點上切下免疫反應性條帶’並分析胺基酸序列。發現5亥序列不同於任何已知序列。晡番白豳分解作用由歐斯特牛胃絲蟲（0^- ostertagi)於含0,02%©氮化钠之磷酸顗緩衝之生理食鹽水（PBSa)中之均質液於向外懸吊式離心槠中，Μ 2 6，5 0 0 g (最高速）離心2 0分鐘’得到之殘質MPBSa再萃取3次*使用1 %聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯（Tween 20)之PBSa溶液萃取一次，使用50 mM 3-[N -嗎啉基]丙磺酸（MDPS)，pH 8.0萃取一次。萃取之殘質再恝浮於50 ra M MOPS中*產生相當於每毫升0.17克線蟲起始物質。取一部份經每毫升0.5 ，50或500微克 TPCK-胰蛋白酶（經L-1-甲苯磺鹺胺-2-笨乙基氯甲基酮處理之胰蛋白酶）分解。添加lOmMDCI (15微升/毫升）停止分解作用。使用50微克TPCK-胰蛋白酶（485單位）之處理釋出最大量微粒體胺基肽酶Μ活性（圖26)。使用0-50微克 TPCK-胰蛋白酶/毫升分解沈澱塊所釋出之微粒體胲基肽酶Α活性微乎其微。另一項實驗中，Μ 50微克/毫升TPCK-胰蛋白酶分解來自5克歐斯特牛胃絲蟲（0 . 0 R r t ^ g i )之物質2次=第二次分解後之A p Μ釋出量為原來之約3 3 %。收集兩次分解物 -51 - 本纸張尺度適用中圉國家樣準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 \ 經濟部中央標準局負工消費合作社印装五、發明説明（么/^) ，於刀豆素A上行親和性層析法•激粒體胺基肽酶Μ活性與管柱结合，但使用0.5Μ甲基吡哺葡糖苷僅溶離出原添加活性之32%。溶離份於SDS-PAGE，6-16%迷你凝膠上分析。經過考馬希Μ染色後，一條出現在丨1 6 , 0 0 0範圍左右之條帶，其大小約為012之胰蛋白酶分解作用產生之大小* 則含在具有微粒體胺基肽_活性之溶離份中。（此條帶及相鄰條帶之胺基酸序列不同於資料庫中之任何序列）。再取4.3克歐斯特牛胃絲蟲（Q, ostertasi)依上述經 TPCK-胰蛋白酶分解兩次。溶解之缌胺基肽酶活性等於 455毫微其耳/分鐘（表6 )。第一次與第二次分解物之高速上澄液（胰蛋白酶HS1 & HS2)之緩衝液換成Con A媛衝液 A >並通過Co η A赉弗洛斯管柱。加至管柱中之起始物質富含ΑρΜ活性，ApM:ApA之比例為18:1。所有ΑρΜ活性均與管柱结合（在洗出液中無活性）；Κ 0 . 5 Μ甲基吡哺葡聚楗+ 0.2Μ甲基甘孬糖苷溶離•回收其中67%活性。（因此溶離媛衝液中使用兩種糖類時，自C ο η Α管柱回收Α ρ Μ —倍Κ上 )。收集含Α ρ Μ活性之溶離份，濃縮|進行凝膠過滹法於 FPLC Superdex 75 HR10/30 (法馬公司）管柱上進行）°濃縮溶離份，分析A p Μ活性，於6 - 1 6 % S D S P A G E上分析。出現數條蛋白質條帶*經過西方墨點分析 > 並以抗C a m Q ill 1抗體為探針檢測後，在1 1 0 , 0 0 0 - 1 1 6 , 0 0 0之間出現一條帶，證寅其免疫反應性。（圖27)。取ConA及Sitperdex溶離份再通過6 - 1 6 %遢原性/荽性迷你凝膠，使闬〇 . 1 9 2 Μ麥黃詷替代甘胺酸之槽緩衝液，於P r 〇 b 1 〇 11上進行電子墨.點 -52 - 本紙張尺度適用中國S家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 ΔΛ4 〇2 1 五、發明説明（ο (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 分析。切下數條條帶•分析序列（但所產生之序列不同於資料庫中之任何序列）。經蛋白闺水解後所得到序列如下：

EPLAPGAANP KGVANDTMQF DXEEEXQPEN GXRTRGRXPX DEXCAVPEEA XGVDXPVXGE XVFPGTEYGA LLQFAQANAQ RQNLR DVPGADDDNG QDNDGEFVGE APFEDDAPPA GGPKGLLEXL SAGLA LQNQLPAF

KXDPGDGNYG GGXGGFQGHL SIPNGDTGPX XNGYXAENYK QGGXE DXEPGPREPG GSECERQPEE G XAEDLRLPTN IRPLIYDLTR RGVVXPVDXX QTPVPGQPVK XXQGSPYDXX 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝使用1% thesit或500微克TPCK-胰蛋白酶/0.15克沈澱塊•自歐斯特牛胃絲蟲（0. ostertagi)之P B S a與1 % Tween 20萃取超離心所回收之沈澱塊中，成功地萃取出 ΑρΜ活性。胰蛋白酶分解液使用抗CaraQ Hll IgG為探計進行西方墨點分析，並切下免疫反應性條帶，分析胺基酸序但是沒有適闬之序列可以決定。 -53 - 本紙乐尺度適用中國國家#準（CNS M4規格（210X297公釐） 4 Δ 經濟部中央標準局負工消費合作杜印製 4 Ο 2 1 Α7 Β7 五、發明説明（θ) 叶斯恃牛甭该蟲（的丁叩丁如丨A nSTRRTAGI) PHP經蛋白闽分解作用所釋出之胺基狀豳Μ活性 _ 微克蛋白痴/ 0.1毫克ΡΗΡ/毫升鲜索活性奄微莫耳/分鐘/5微升 - 高速上澄液）Met-pNA 0 0.08 d-胰凝轧蛋白缠 5 0.08 50 0.15 500 0.37 1000 0.54 2000 0.88 枯箄桿菌蛋白酶 5 0.06 50 0.10 500 0.35 1000 0.S6 2000 0.95 賊蛋白庳 . 5 - 0.118 50 _ 0.246 500 1.075 '1000 1.273 2000 1,068 咭熱菌蛋白闼 0 _ 0.06 5 0.06 50 0.07 500 0.08 1000 0.11 2000 0.19 -54 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家橾準（<^5)八4規格（2丨0犬297公釐} 444021五、發明説明（ί：巧經濟部中央標準局員工消費合作社印製劫明堪盏嫌苕wa DvlalaV 3vn3Ia)«s^SEil-t:芸玆逑汆趄-053罢皿芘cd…砌 S S 轵 m ffi g ti ^ J iiS 5 S w垣时 «诹 Η 貂葵 m s? w 4 〇1 1 0 fH 〇 1 Ϊ5 < Η Γ- CN ο < ta ι—1 〇 % t JJ 0> S Ε-ι Ο to m in ο Η CD 邙 Η ο\ τΗ mi dr Vf^- ΓΤΝ 恝擗 CN rH τΜ CN LH η CN fN m -m 寸 CN ΙΤϊ 赵击 «< m 辣、· Π跃班窫卜 r~t —1 (Ν ιη (Ν 掛 - »—< ΐ/Ί 运 01 £ CVJ 运 Έ 班莒 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央樣準局負Η消费合作社印製 -Λ44 02 1 A7 B7 五、發明説明（1¾ S^IULQ.

ApH在塵柏路蟲（nonoeria oncophora)中夕.位晉- 依組織化學法，使用白胺酸-召Μ ΝΑ染色庫柏絲蟲之10微米冷凍切片（依實例1進行）。發現ΑρΜ活性位於腸微娀毛 (見圖2 8 )。苜例1 1 泮射ΓΜ ；>後之杭gg反膜及牛之疫苗試驗將1 2隻未接觸線蟲之小牛置於戶內，分成2姐’ C與E ，配合年龄，品種及性別，各6隻一姐。所有小牛於第 -63天時接種初次疫苗。E姐接種250微克ConA 0〇12、 C姐接種150微克禺脾锇蛋白（購自英國道希特省普爾市希格馬化學公司（Sigma Chennical Co， Ltd.， Poole, D o r s e t , U K) *作為陰性（輔劑）對照姐。初次免疫作用使用氫氧化鋁及弗洛伊德氏完全輔劑（F C A ) 。2 1天後（第 -42天），所有小牛接受二次疫苗接種，再過21天，接種第三次疫苗。（兩次均使用200微克Con A 0〇 12或150微克鐵蛋白） > 兩次均使用弗洛伊德氏不完全輔劑（FIA)。第0天時，所有小牛接受外來約40,000隻歐斯特牛房絲蟲（(L__ostertasi) L3幼蟲感染。由糞中卵數追踪線蟲感染程度•感染27至28天後，解剖測定蟲感染數。结果接種012之小牛體内平均蟲數相對於接種馬脾蛋白之對照姐動物已減少。啻例1 2 -56 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

444 02 1 A7 B7 五、發明説明（^) 含-η ο 1 ? ：»抗腊：?· Φ rfn涪對cn 2徽粒體胺-基肽酶活使用E LIS A盤法進行酵素分析法（實例7 )，於活體外測定1 )免疫前血清，Π )抗镦蛋白血清（對照姐）及iii )牛抗- ConA 0〇12 (免疫）血清對ConA 0〇12之微粒體胺基肽酶活性之影響。免疫前血清（i )為自感染前70天之實驗姐小牛（E姐’實例7)中收集之血清，抗鐵蛋白血清（ii)為自對照姐小牛（C姐，簧例7)收集之血清，及牛抗c〇n A 0〇12血清（iii )為感染2 7 / 2 8天後之實驗姐小牛（E姐，實例7 )收集之血清。經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在微滴定盤各井孔中添加1〇微升ConA 〇〇12 (337微克/ 毫升）及70微升50 mM MOPS緩衝液，pH 7.0。每井孔添加 20微升血清*使每井孔之缌體積達1〇〇微升。對照培養姐包括緩衝液空白姐（僅含MOPS緩衝液）及不添加血清之 ConA 0〇12 。盤子於37T；下預先培養30分鐘，然後添加 100微升/井孔2 ιπΜ甲硫胺酸對硝基替苯胺或白胺酸對硝基替苯胺之MOPS緩衝液溶液。於ELISA盤讀數器上，在 450 n m處»取0D ·盤子再於37Γ下培養30分鐘。再謅取 0D —次·計算微粒體胺基肽酶活性之吸收變化與減少百分比0 -5 7 - 本纸張尺度適別中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公瘦） 4 44 02 1 A7 B7 五、發明説明（/) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製结果樣本 A p Μ活性降低％ Μ甲硫胺酸-Ρ Ν Α為受質 C ο η A 0 ο 1 2 + 2 0微升免疫前血清（E姐） C ο η A 0 ο 1 2 + 2 0微升對照姐血清（C驵） 21.4 Con AO〇12 + 20微升免疫血清（E姐） 41.7 以白胺酸-ρ Ν A為受質 ConA0ol2 + 20微升免疫前血清（E姐） 17.1 C ο η A 0 ο 1 2 + 2 0微升對照姐血清（C姐） 1 S . 3 C ο η A 0 ο 1 2 + 2 0徹升免疫血清（E姐） 40.2 接種ConA 0〇12之牛之血清相較於得自接種疫苗前之牛之血清（免疫前血清）或注射馬脾賴蛋白之對照姐牛之血清，顯著地抑制0 1 2之胺基肽酶活性。 8 5 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS)A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

4 4 4Τ)8^ΡΜι,^»« 中文申謫専利範Η修正本(9〇年3月） LL//i 利範固告不 a)b) c) d)e) f )

種保護性臈寄生盎抗原，其特微為具有似胺基肽驊活性：其圼天然型，且為牛霣絲裊fflstertagia QStertagi)之腺微娀毛结合之完整膜蛋白質*或具胺基肽酸活性及衍生自牛费躲a属：其可得自牛甭躲矗靨(Qstertag ia)；經SDS-PAGE於6-16%凝鏐上•在變性條件下測得之表觀分子ft (Mr)為約124· 000至126,000 ; 其含有具下列之胺基酸序列： AEDLRLPTHIRPLIYDLT:及其包含選自由下列序列姐成之群之一或多種胺基酸序列： (請先«讀背面之注^^項再4寫本頁) > 订 ⑴ 趣濟部中夬揉车局貝工消费合作社印装 MTAQWAKRTV 51 KDHPGGDDNS 101 GQVEISMWM 151 EKLEFLLKKR 201 ASQMEPTDAR 251 NGDWIISKFE 301 MTQYALDAGI LRFTPISLLV PSAEELRLPR EPTRSIVLNA LEKDQKVLLK RMVPCLDEPN TTPBMSSYLL RCLEFYESFF ASLAMALAIA SVIPLfYDLS KNITVIPEKC VIYIGLISNT YKANWTVTVI AVIVSEFDFI GIKFPLQKQD LSIGLTYHFV IKTYLPNYVD EVFSGDEKLE LGGLYQATYT HPKGTRAVSN EGNTTSGVRF MVALPDFSAG RNAYDTSHNG FPPEKNLTFD IESVMEHERL HTDGTTKIAA GIETNGEGDI RIWSRPEAKN AMENWG ；本紙張尺度逋用中«顧家揉率（CNS ) A4規格（210X297公* ) A8 B8 C8 D8 經濟部中央揉率局員工消费合作社印轚六、申請專利範圍 (ϋ) 1 GAMENWGLIT YRENSLLYDE RYYAPLNKER VAIWAHELA HQWFGNLVTL 51 KWWDDLWLNE GFATFVEFIG ADHISNGTFR MKDYFRLDAL VDALEADAVA 101 SSHPLSFKID KASEVYEAFD AITYSKGASV LimQALIGE ENFKQAVTQY 151 LNKFSFDNAK. ASDLWGVFDE WKDVKGPDG NPMKTTEFAY QWTTQMGYPI 201 VTVETFNATS LKVSQNRYKT NKDAQEPEKY RHPKYGFKWD VPLWYQEGES 251 NEIKQTWLTR GEPLYLHVSS SDDSIWNAD KHGFYRQNYD AMGWRKIIRQ 301 LKDNHEVYSP RTRNAIISDA FAAALLDNGL KYETVFELLE YAKNEQEYLP 351 WDEIISGFYS ILEFFGNEPE SKWAKSYMMN ILKPMYDNSS MQYIADNYKN 401 DSLFFENNLQ KAVIDAYCRL GSKDCIGKYK DLF 工 KEVMEK CEDDEEASKC 451 VTVAAPLRSR VYCYGVKEGG DDAFDKVMGL YSAENVQLEK DILLRALGCH 501 RDITALKGLL LRALDRNSSF VRLQDVSDVF MAVSGKPVGE EFMFNFLLER 551 601 WEEIVESLPS FDEGIERAEH EHTSVEKVIR KVDWIK ? DCSTGIRSEQ QIEQLRNLHK NGRNARDYGA 1 MEEPRARRRT VLRLTPITIiS IALLGIAVAV ALSIGLTYLF TRNAYDTSRK 51 PKEPDHPGGG DDNPPSAEEL RLPTNIKPLL YNLTIKTYLP GYVDFPSEKN 101 LTFDAQVLIS MWVEPTKSI VLNAKKITAL PKECEVFAGD QKLDIESVTD 151 HERLEKLEFT LKQQLEKDQK IQLKWYSGL ISDTLGGLYQ ATYKDTDGTT 201 KIVAVSQMEP TDARRMVPCF DEPSFKANWT VTIIHPRGTT AASNGIETNG 251 EGEPDGDWIT SKFKTTPRHS SYLLAVIVSE FKYIEGRTKS GVRFRIWSRP 301 EAVKMTKFAL DAGVRCLEFY EKFFDXRFPL EKQDMVALPD FSAGAMENWG ； (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逋用中*家標率< CNS ) Α4ϋ格（210X25*7公漦） 02t A8 C8 D8 經濟部中央標準局貝工消費合作社印*. (請先閱讀背面之注意事項再4寫本頁) 六、申請專利範圍 iiv) 1 GAMENWGLIT YRETALLYDE 51 EWWDNLWLNE GFASFMQYIG ;101 SHPLSFKVDK AAJDWEAFDD i ί f 151 IKFSYNNANA SDLWNVFDEV I 201 TVETFNATTF RISQSRYKKN ；251 DVXRIWLTRD KPTYLHVNSS ;301 KDNHKYYSPR TRNAIISDAP 351 EIITGFYSIL EYFGSEbESK 401 LFFENNLQKA IIEAYCYFGS i 451 VAAPLRAMVY CYGVNEGGDD i * 501 ITALKGLLLL ALDRNSSFVR 1 GAMENWGLIT YRENSLLYDE 51 KWWDDLWIiNE GFATFVEFIG 101 SSHPLSFKID KASEVYEAFD 151 LNKFSFDNAK ASDLWGVFDE 201 VTVETFNATS MCVSQNRYKT 251 KEIKQTWLTR GEPLYLHVSS 301 LKENHBVYSP RTRNAIISDA 351 WDEIISGFYS ILEFFGNEPE 401 DSLFFENNLQ KAVIDAYCRL 451 VTVAAPLRSR VYCYGVKEGG 501 RDITALKGLL LHALDRNSSF 551 WEEIIESLPS EHTSVEKVIK 601 FPEGIERAEH KVDWYK RLYAPVNKKR VASWAHELS HQWFGDLVTM TNEITRDNFK liKDYFLVDSF AQGM^ADVAS VTYRKGASIL TMLQALIGEQ NFQRAIRQYL VKDVAGPDGS HMKTSEFADQ WTTQMGYPW KNAQEPEKYR HPKYGFEWDV PVWYQDSKNS DASIWNADR HGFYRQNYDE DGWRKIIKIL AAALIDKLEY ETVFDLLEYA NQEEEFLPWN FAKNYMMSIL KPMYDKSSVD Y工AENYTNDS KGCIQKFKEL FDKEWQKCK GGHKASKCVD AYDKVMELYY AETVQLEKDY LLGALA.CHKD LQDMANVS · RYYAPLSKER VAIWAHELA HQWFGNLVTL ADHISNGTFR MKDYFLLDAL VDALEADSVA AITYSKGASV LTMLQALIGE EKFKRAVTQY WKDVKGPDG NPMKITEFAY QWTTQMGYPI NKDAQEPEKY RHPKYGFKWD VPLWYQEGES SDDSIWNAH RHGFYRQ3^YD ANGVJRKIIRQ FAAALLDNGL EYETVFELLE YAKI^EQEYLP SKWAKAYTMS ILKPMYDNSS MQY工AENYKN GSKDCIGKYK DLFVKEVMEK CEDGEEASKC DDAFDKVMGL YSAENVQLEK DILLRALGCH VRLQDVSDVF MAVSGNPVGE EFMFNFLLER DCSTGIRSEQ QIEQLRNLHK NGRNARDYGA 本纸張尺度逍用中函國家樣準（CNS > A4規格（210 X 297公釐） Α8 Β8 C8 D8 Μ4021 '中請專利範圍 2‘ —種製備如申請專利範圍第1或2項之抗原之方法*其包括M TWeen 20萃取非吸血性腸寄生蟲牛爾絲蟲粗萃物之步驟·从去除與膜结合之蛋白霣，然後KThesist溶解’ Μ回收完整膜蛋白質，及尚包括至少再一個層析純化步驟。 3* 一種製備截短型之如申請専利範圍第1或2項之抗原之方法*該方法包括Κ蛋白水解_處理牛霣絲蟲之膜，使之釋出截短型抗原。 4·—種製備如申謫專利範函第1或2項之抗原之方法，該方法包括製備含有至少一種根據申請専利範圍第1項所定義之保護性抗原之該寄生蟲之萃物，自其中純化抗原時•使孩抗原與包含該抗原之専一性结合對象之固定相结合*隱後自該固定相中溶離該抗原。 5. 一種埔碼保護性腸寄生蟲抗原之核酸分子，其由下列核苷酸序列，及其簡併序列姐成： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· . 經濟部中央揉隼局貝工消費合作社印装本紙涑尺度逋用中國國家樣準（CNS )八4狀（210Χ297公釐） Α8 Β8 C8 D8 50505050505050505050.5 )112233445566778899^^ 六、申請專利範圍 GGTTTAATTA CCCAAGTTTG AGATGACAGC ACAATGGGCT AAAAGGACAG TGTTACGGTT TACGCCCATC AGCCTTCTCG TCGCTTCATT AGCAATGGCT CTAGCAATCG CTCTCTCCAT AGGTCTCACT TATCACTTCG TGCGAAATGC TTATCACACT TCACACAATG GAAAGGATCA . CCCTGGAGGT GATGACAATT CTCCTTCTGC AGAAGAACTA CGTCTTCCGA GAAGCGTAAT ACCGTTGCTA TACGACTTGA GCATCAAAAC GTATCTGCCC AATTACGTGG ATTTCCCGCC AGAGAAGAAT CTCACCTTTG ATGGGCAAGT GGAAATCTCC ATGG.TAGTGA TGGAACCAAC^TAGAAGTATT GTACTAAATG CGAAGAATAT TACTGTGATA CCAGAGAAAT GCGAGGTGTT TTCGGGCGAT GAAAAACTGG AAATTGAAAG TGTGATGGAG CATGAGCGGC TTGAGAAGCT GGAATTCCTG TTGAAGAAGC GGTTAGAAAA AGATCAAAAA GTTCTGCTCA AGGTAATCTA CATCGGCCTT ATTAGCAACA CCCTTGGTGG ACTGTACCAA GCTACTTATA CACACACGGA TGGAACCACC AAAATTGCTG CAGCTTCTCA AATGGAACCA ACAGATGCCC GTCGAATGGT GCCATGTCTA GACGAACCCA ACTATAAAGC TAATTGGACA GTCACTGTGA TTCACCCGAA AGGCACAAGG GCCGTATCGA ATGGTATTGA AACGAACGGC GAAGGGGATA TCAATGGCGA CTGGATCATA TCGAAGTTCG AAACCACTCC ACGGATGTCC TCCTATCTAC TGGCAGTTAT TGTCTCGGAA TTCGACTTCA TCGAAGGCAA CACGACAAGT GGTGTGCGGT TCCGAATATG GTCACGCCCT GAAGCGAAGA ATATGACACA ATATGCCTTA GACGCCGGCA TCAGATGTTT AGAGTTTTAC GAGAGCTTCT TCGGCATAAA ATTCCCTTTA CAAAAGCAAG ATATGGTTGC GCTTCCTGAC TTCTCTGCAG GAGCCATGGA AAACTGGGGC CT ' (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- lllllllxxxxlllllllllll 505050505050505050505 11223344556677889900 ^ 11 b GCCGAGGGCA CGGAGGCGGA CGATCGCTTT GTTAGGCATA ACCTATCTCT TCACACGAAA ACCAGATCAC CCCGGAGGCG TACGTCTCCC CACAAACATA ACGTATCTGC CCGGTTACGT CGATGCTCAA GTGCTAATTT TCGTGCTGAA TGCCAAGAAA TTCGCAGGCG ATCAAAAACT GCTGGAGAAG CTGGAGTTCA AAATCCAGCT CAAGGTTGTC GGACTGTATC AAGCTACTTA CGCAGTCTCT CAAATGGAGC TTGACGAGCC GAGTTTCAAA AGAGGTACAA CAGCCGCATC ACCCGACGGT GATTGGATCA CTTCTTATGT GCTGGCCGTT CGCACGAAAA GCGGTGTGCG ；ACG AAATTCGCGT .GTT TTTCGACATT GCTCTTCCTG ATTTCTCAGC T 經濟部中央棵準局真工消费合作社印«. AAAAATGi ATGAAAAC

GGTTTAATTA CAGTGCTACG GCAGTTGCCG TGCCTACGAT GGGATGACAA AAGCCGTTAC GGATTTCCCA CCATGGTGGT ATCACGGCGC GGACATTGAA CTCTGAAGCA TATAGCGGCC CAAAGACACG CAACAGACGC GCCAACTGGA GAATGGCATA CATCAAAATT ATTGTCTCAG GTTCCGAATA TAGACGCCGG CGATTTCCTC AGGAGCCATG CCCAAGTTTG GCTCACGCCC TTGCGCTCTC ACGTCGCGGA TCCTCCTTCT TGTACAATTT TCGGAGAAGA AGTGGAGCCA TACCGAAAGA AGTGTGACGG ACAACTAGAA TCATTAGCGA GATGGAACGA TCGTCGAATG CAGTAACAAT GAAACTAACG CAAAACCACT AATTCAAATA TGGTCACGTC TGTCAGATGT TTGAGAAGCA GAGAACTGGG AGATGGAGGA ATCACCCTTT TATTGGTCTC AACCGAAGGA GCAGAAGAAT GACCATCAAA ATCTCACCTT ACCAAAAGTA ATGCGAGGTG ATCATGAAAG AAAGACCAGA CACCCTTGGT CCAAAATCGT GTGCCGTGTT AATTCATCCA GTGAAGGAGA CCACGAATGT TATTGAAGGG CAGAGGCGGT TTGGAATTCT AGATATGGTT GCCT 本紙張ΛΑ逋用中( CNS > Α4*ΜΜ 210X297公兼） 444 021 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 111111 1 1111 1 1 11111 1 1 1 1 1 1 1 l· 1 1 IX 1 505050505050505050505050505050505050 11223344556677889900112233445566778 GGTGCGATGG GTACGATGAA TGGTTGCTCA AAGTGGTGGG ATTCATCGGT ATTTTCGATT TCAAGCCATC AGCTTTCGAC TGCAAGCGTT CTCAATAAGT CTTCGATGAA AAACCACTGA GTCACAGTGG ATACAAGACG AATATGGGTT AACGAAATAA CGTGAGCAGT TTTACAGGCA CTCAAGGATA AAGTGACGCA CTGTTTTCGA TGGGATGAAA CGAGCCAGAG CGATGTATGA GATTCCCTAT CTGTCGCCTT TTAAAGAAGT GTGACGGTTG AGAGGGCGGA AAAATGTTCA CGAGATATCA TTCGTCGTTT CTGGAAAGCC TGGGAAGAAA AGTGATCAGG AGTTGAGAAA TTCGACGAGG AGAATTGGGG GCTCATCACT TACAGAGAGA ATTCCTTGTT AGATACTATG CACCGTTGAA CAAGGAACGG GTTGCCATCG TGAACTTGCC CATCAGTGGT TCGGTAATCT TGTCACGTTG ATGATTTGTG GCTGAACGAA GGTTTCGCAA CATTTGTTGA GCAGATCATA TCAGCAATGG AACCTTTAGA ATGAAGGACT GGATGCACTT GTAGACGCCT TGGAGGCTGA TGCGGTAGCT CGCTATCATT CAAAATCGAT A^AGCTTCAG AAGTTTACGA GCTATCACGT ACTCCAAAGG AGCGTCAGTT CTCACAATGT GATTGGTGAA GAAAATTTCA AACAAGCCGT AACGCAATAC TTTCGTTCGA CAACGCGAAA GCGTCCGATC TTTGGGGTGT GTTGTTAAGG ACGTCAAGGG CCCCGACGGT AATCCTATGA ATTCGCTTAT CAGTGGACGA CTCAGATGGG CTACCCAATA 7AACGTTCAA CGCAACTTCT TTGAAAGTCT CACAAAACCG AATAAGGACG CCCAGGAGCC GGAAAAGTAC CGTCATCCAA CAAGTGGGAT GTTCCTTTAT GGTATCAAGA AGGCGAAAGC AGCAGACCTG GTTGACCAGA GGCGAGCCCC TTTATTTGCA TCTGATGATT· CCATTGTG^T GAACGCCGAT CGGCATGGAT AAACTACGAT GCCAACGGTT GGCGAAAGAT TATCAGACAA ATCATGAGGT CTACAGTCCA AGGACACGGA ACGCGATCAT TTTGCGGCAG CACTGCTTGA CAATGGGCTC AAGTATGAGA ACTATTGGAA TACGCAAAGA ACGAACAGGA ATATCTTCCA TCATTTCTGG ATTCTATTCA ATTCTTGAAT TCTTTGGCAA TCAAAATGGG CTAAAAGCTA TATGATGAAC ATATTGAAGC CAATAGCAGT ATGCAGTACA TCGCTGACAA CTACAAAAAC TTTTCGAAAA CAATCTCCAA AAAGCGGTCA TTGATGCGTA GGATCAAAAG ATTGCATAGG AAAGTATAAG GATCTCTTCA CATGGAAAAA TGCGAGGATG ATGAAGAGGC AAGCAAATGC CCGCTCCTCT GCGATCGAGG GTTTACTGCT ATGGTGTGAA GACGATGCTT TCGACAAGGT TATGGGGCTG TACAGTGCAG GCTGGAGAAG GACATTCTGC TTCGAGCGCT AGGAIXSTCAC CAGCTCTAAA AGGGTTACTT CTGCGAGCGC TGGATCGGAA GTTCGCCTTC CGTGGGCGAG TAGTCGAAAG GACTGTTCTA TCTTCACAAA GAATCGAACG AAGATGTGTC GAATTCATGT CTTACCGTCG CAGGCATTCG AATGGCCGAA AGCAGAGCAC TGACGTCTTT ATGGCTGTAT TCAACTTCCT TCTAGAGAGA GAACACACTT CAGTTGAAAA ATCCGAGCAA CAAATAGAAC ATGCTCGAGA TTACGGTGCA AAAGTCGACT GGATAAAA (請先M讀背面之注$項再填寫本頁) 訂 «濟部中央標率^負工消费合作社印«. -6 - 本紙張尺度逋用中•國家梯準（CNS >A4规格（210XW7公釐） 444 02 1 AB B8 C8 D8 六、申請專利範圍 d) 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 7 51' 801' 851 .901 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551 GGAGCGATGG GTACGATGAA TGGTTGCTCA GAATGGTGGG ATATATTGGC ATTTCCTGGT AGCCATCCGC TTTTGATGAT AAQCGTTAAT ATAAAGTTCT TGACGAAGTT CCTCTGAATT ACAGTGGAAA CAAGAAGAAC ATGGGTTTGA GATGTGAAGC GAACAGTTCC ACCGGCAAAA AAGGATAATC CGATGCGTTT TTGATCTTCT GAGATTATAA GGAATCAAAG ACGACAAGAG CTATTTTTCG TTTTGGATCG AGGTTGTGCA GTTGCTGCTC CGGAGATGAT TTCAGTTGGA ATCACAGCCT GTTTGTTCGC AGAACTGGGG GCTTATCACT AGACTCTACG CACCGGTTAA CGAACTTTCT CATCAATGGT ATAATCTGTG GTTGAATGAA ACAAATGAGA TTACCCGCGA GGACTCGTTT GCGCAAGGCA TATCCTTTAA AGTCGACAAG GTCACTTATC TGGTGAACAA CGTACAATAA GTCAAGGATG TGCCGATCAG CGTTCAATGC AAGAACGCTC ATGGGATGTT GTAAAGGAGC AACTTCCAAC TGCGAACGCT TTGCGGGACC TGGACGACTC AACTACCTTC AGGAGCCGGA CCTGTATGGT GGATCTGGTT' AACCAGGGA(? GATGCGTCCA TCGTTGTGAA CTACGATGAA GATGGCTGGC ATAAGTACTA TAGTCCGAGA GCAGCTGCCC TTATTGACAA GGAATACGCT AATCAAGAAG CTGGATTCTA TTCAATTTTG TTCGCAAAGA ACTACATGAT CAGCGTTGAT TATATCGCCG AAAACAATCT TCAAAAGGCA AAGGGCTGTA TCCAAAAGTT GAAATGCAAG GGCGGTCACA CTCTTCGAGC *GATGGTTTAC GCATACGACA AGGTGATGGA GAAGGACTAC CTTCTCGGAG TGAAAGGACT TCTTCTGCTG CTTCAAGATA TGGCCAACGT TACAGAGAAA CTGCTCTGTT TAAGAAAAGA GTTGCTTCAG TCGGCGATCT TGTTACAATG GGTTTTGCAT CGTTCATGCA TAACTTTAAG ATGAAGGACT TGGAAGCTGA CGTAGCTTCA GCTGCAGATG TTGTTGAAGC ATCGATTCTC ACAATGCTAC GGGCCATAAG GCAATAC TCCGATCTCT GGAATG1； TGACGGTAGC CGCATGJ AGATGGGCTA CCCAGTAGTT AAAATATCAC AAAGTCGATA AAAATATCGT CATCCAAAAT ACCAGGACAG CAAAAACAGC AAGCCGACTT ATTTGCATGT CGCCGACAGG CATGGATTTT GAAAGATTAT AAAGATACTC ACCAG^AACG CTATCATAAG ACTTGAGTAC GAGACTGTTT AGGAATTTCT ACCGTGGAAC GAGTACTTTG GCAGCGAGCC GAGCATTCTG AAACCAATGT AGAACTACAC GAACGATTCG ATTATCGAGG CCTACTGCTA TAAAGAACTC TTCGACAAAG AGGCAAGCAA ATGTGTGGAC TGCTATGGTG TGAACGAAGG GTTATATTAC GCAGAAACTG CTTTAGCATG TCACAAAGAC GCTCTGGATC GTAATTCGTC TTCT VCCTC ；TTTT ΪΑΑΑΑ (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) -r· 訂及經濟部中央揉隼扃貞工消费合作社印簟 7 本纸張尺Jt適用中••家揉準（CNS M4規格U10X297公羡） 444 02 1 I D8六、申請專利範圍經濟部中央梂车局貝工消费合作社印$t llllixlllllllxlllllxlxllllxllxlllllll 50505050505050.5 050505050505050505050 11223344556677889900112233445566778 GGTGCGATGG AGAACTGGGG GCTCATCACT GTACGATGAA AGATACTATG TGGTTGCTCA TGAACTCGCC AAGTGGTGGG ATTCATCGGT ATTTTCTATT TCAAGCCATC AGCTTTCGAC TGCAAGCTTT CTCAATAAGT CTTCGATGAA GTTGTAAAGG AAATCACTGA ATTCGCTTAT GTCACAGTGG 'AAACGTTCAA ATACAAGACC AATAAGGACG AATATGGGTT CAAGTGGGAT AAGGAAATAA AGCAGACCTG ATGATTTGTG GCAGATCATA GGATGCTCTT CGCTATCATT GCTATCACGT

GTAGACGCTT TAAAATCGAT ACTCAAAAGG GATTGGTGAA GAAAACTTCA TTTCGTTCGA TAACGCGAAA ATGTCAAGGG CAGTGGACGA CGCAACTTCT CCCAAGAGCC GTTCCTCTAT GTTCACTAGA CGTGAGCAGT .TCGGATGATT. CCATTGTGgT TTTACAGGCA AAACTACGAT GCCAACGGffT CTCAAGGAAA ATCATGAGGT CTACAGTCCA AAGTGACGCA TTTGCGGCAG CACTGCTTGA CTGTTTTCGA ACTATTGGAA TACGCAAAGA TGGGATGAAA TCATTTCTGG ATTCTATTCA CGAGCCAGAG TCAAAATGGG CCAAAGCGTA CAATAGCAGT ATGCAGTACA TTTTTGAAAA CAATCTCCAG GGATCAAAAG ATTGCATAGG CATGGAAAAA TGCGAAGATG CCGCTCCTCT TCGATCGAGA GACGATGCTT TCGACAAGGT AAAATGTTCA GCTGGAGAAG GACATTCTGC CGAGATATCA CAGCTCTAAA AGGATTACTT TTCGTCGTTT GTTCGCCTTC AAGATGTGTC CAGGAAATCC CGTGGGCGAG GAATTCATGT TGGGAAGAAA TAATCGAAAG CTTACCGTCG AGTGATCAAG GACTGTTCTA CAGGCATTCG AGTTGAGAAA TCTTCACAAA AATGGCCGAA TTTGACGAGG GAATCGAACG AGCAGAGCAC CGATGTATGA GATTCTCTAT CTGTCGCCTT TCAAAGAAGT GTGACGGTTG AGAGGGCGGA TACAGAGAAA CAAGGAACGG TCGGCAACCT GGTTTCGCAA AACTTTCAGA TGGAGGCGGA AAAGCTTCGG AGCGTCAGTT AGCGGGCTGT GCTTCCGATC CCCCGACGGT CTCAGATGGG TTGAAAGTCT GGAAAAGTAC GGTATCAAGA GGAGAGCCCC GAACGCCCAT GGCGAAAGAT AGGACACGGA CAATGGGCTC ACGAACAGGA ATTCTTGAAT TACGATGAGC TCGCTGAAAA aaagcagtca AAAGTATAAG GTGAAGAGGC GTTTACTGCT TATGGGGCTT TTCGAGCGCT CTTCGAGCGC TGACGTCTTT TCAACTTCCT GAACACACTT ATCCGAGCAA ATGCTCGAGA AAAGTCGACT ATTCCTTGCT GTTGCCATTG TGTCACGTTG CATTTGTTGA ATGAAGGACT TTCGGTAGCT AGGTTTACGA CTCACAATGC GACGCAATAT TTTGGGGTGT AATCCTATGA CTACCCAATA CACAAAACCG CGTCATCCGA AGGCGAAAGC TTTATTTGCA CGGCATGGAT TATCAGGCAA ACGCGATCAT GAGTATGAGA ATATCTTCCA TCTTTGGCAA ATATTGAAGC CTACAAGAAC TTGATGCGTA GATCTCTTCG AAGCAAATGC ATGGTGTGAA TACTCTGCAG AGGATGTCAC TGGATCGGAA ATGGCTGTAT TCTAGAGAGA CAGTTGAAAA CAAATAGAAC TTACGGTGCA GGTACAAA- (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) ^. 訂本紙張尺Α逍用中國國家標率（CNS ) Α4规格（210X297公釐）