TW422841B - Pharmaceutical composition for diagnosis of a disease state in an animal, pharmaceutical composition for imaging an animal, method for the in vitro immunoassay or DNA hybridization of a tissue sample and process for preparing a complex of said compounds - Google Patents

Description

mu A7 _ B7___ IPTl sf · _r. \ J0- U ) mmmm 本發明係關於可用作目測對比促進劑或診斷劑之目測 組織特異性铽、銪、釤或鏑螯合物。 發明背景 多種化學及生物醫學分析中螢光顯像佔有重要地位。 多種分析計畫係基於引進螢光物種作為標記、染色、染料 或指示劑Devoiss.el.le et al., Optical Engineering S2.(2), 239 (1993)； R. P. Haugland and A. Minta, “ Design and Application of Indicator Dyes,M invasive Techniques in CelΪ Biol.. ed., B.H, Satir,. Chap. 1， p 1, (Wiley-Liss, New York, NY, 1990)» D. J. Gross, ^Quantitative Single Cell Fluorescence Imaging of Indicator Dyes,” Noninvasive Techm*aijfis in Cell Biol.. ed. B. H. Satir, Chap. 2, p 21, (tfiley-Liss, Nev York, NY, 1990)] 〇 衍生自鑭条離子之有機螯合物作為時間光學分割螢光 計量檢定分析之敏感螢光標記的重要性漸增[E. P。Diaraandis， ' Clin, Biocheni. 21, 139-150 (1988)； Clin. Chim. Acta. 經濟部中夬標率局員工消費合作杜印製 1MS 19-50 (1990)； Anal. Chem. 62, 11 49Δ-11 57A ( 1990); E. Soini and T. Lovgren, Crit. Rev. Anal. Chem.l, 105-154 (1987)]。特別铽及鋳錯合物由於於 可見光區發出有效螢光，故對此等用途特別有價值（E. P* 〇13贴11(^3,113專利5,312,922)。铽及銪離子於非錯合形 發m弱螢光*但與適當有機鼦合基螯合時發射的可見光顯 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐} 4 42284 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ B7 '厂 f<m ,-ϊΓ? η,* rtrT / \ 12 ) 著增強。如此有機配合基作為吸收紫外光的天線，將此能 量轉到金屬離子，然後以可見光形式發散吸收能量。此種 現象的機轉细節已有徹底研究與報告。[A. P. B。Sinha， Fluorescence and i.asfir Aetion in Rare Rart.h Ch^lat.Aa /Spectroscopy in Tnorganic Chfimistrv Volume II, Academic Press, (1971)] ° 有無數可長時間發螢光的螯合物，但非全部皆適合生 物用途，其中一個原因是於水介質内不安定之故[G。 Kal 1 istratos, Fluorescent. Properties of Aromatic Complexes with Rare Earths and Other Elements of the IIIa-Group/Chemika Chronika. New Series, 11, 249-266 (1982)]。事實上大半螢光螯合物僅可於非水條 件操作。大半原因為錯合物於水溶液不安定，結果導致存. 在有未錯合金屬，而淬熄負責發射可見光的螢光路徑。最 後，此種錯合物於低濃度非敏感標記由於金屬沈積於軟組 纖，可能於活體造成毒性問韙。 近年來證實基於四氮雜巨環糸主鏈的螯合劑用於產生 水蔽安定性鑭糸螯合物極有價值。特別衍生自1,4,110-四氮雜環十二烷之胺基羧酸酯及胺基膦酸酯螯合劑可形成 高度安定鑭糸螯合物[w· P. Cacheris, A. D· Sherry· Inorg. Chem. 2.6., 958-960 (1987)； J. Simon, J. R. Garlich, D. A. Wilson, and K. McMillan, US Patent 4,976,950]。此類螯合物的性質優異，因此可甩作診齟及 醫療等醫學用途，例拓磁共振顯像及骨髓剝雛。此舛，某 (請先閲讀背曲之注意事i

裝-- 窝本頁) ，訂 :線 本紙張尺度埤用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 5 42284 1 A7 £7_:__ 五、發明説明（3 ) 種巨環糸螯合劑合併一個芳族部分例如吡啶核顯示於铽及 銪之極為有效螢光性質（J. Kankare, J. Takalo, and P. ?过33的1邶專利4,920，195)。該專利案中1(3111^”等驗證 含吡啶核之14-員巨環系铕螯合物可共軛接合至人類IgG。 如此所得共軛接合物含有高度敏感的螢光標籤（螯合物）， 可藉螢光免疫檢定分析定量。 使用基於釓（Gd)之順磁性巨環系螯合物作為磁共振顯 像之對比劑吸引相當多注目。鑭系螯合物的吸引力直接來 自於其於人體的水液環境挑釁時具有動力學及熱力學安定 性。可對此型配合基作適當修改，而當鑭糸例如铽（Tb)及 銪（Eu)位在中心越時產生顯著蟹光。Kim et al., Inorg. Chem. Μ, 2233-43 (1995)報告對基於巨環条含Ptfc啶配合 基之若干可能MRI對比劑的晚近研究。研究中藉測量铽及 銪螯合物之螢光性質來測定內球水配位。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 醫學用巨環系鑭条螯合物的重要性隨著組織特異性化 學劑的發展逐漸增高。至目前為止，用途集中於放射性及 順磁性金屬螯合供治療及診斷（J. Simon, J. R. Garlich, D. A. Wilson, K. McMillan, US專利4,976,950 ; MRI用 乱整合物範例為Prohance™ Squibb生產及Dotarem™ Guerbet生產）。但此等螯合物不具有螢光性質。 至目前為止，螢光螯合物的商業甩途主要限於標記蛋 白質及抗體供免疫檢定分析[Ε· P. Diamardis, Clinica Chimica Acta 1M, 19-50 (1990) ; US專利5,312,922]。 FIAgen (CyberFIuor公司加拿大安大略省多愉多）等產物. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（2Ϊ0Χ 297公潑） 6 42284 1 A7 B7 __ _ _ · ^_ ___ ______ 五'發明"S^L» 明（.4 _ )..................................... 可得且可使用4,7-貳（氯磺醯基）-1,10-菲啉-2,9-二羧酸 之銪螯合物作為螢光標記。此型螢光標記極為敏感，可使 用時間光學分割螢光劑於次夸莫耳範園檢測。 診斷及治療劑的最重要特點為必須促進評估與治療病 態的準確度。最常見包括輸送診斷劑至特定器官或軟組織 ，該處懷疑存在有異常。同時小分子（亦即，診斷或治療 片段）共價附接至大型蛋白質或抗體，受大量注意作為達 成組織特異性的上迭方法。然而此種方法複雜昂貴原因為 其包括使用特化抗體必須附接至活性劑。 因此較佳使用小分子診斷劑，其可侷限於身.體的特定 組織而毋須附接至輸送分子例如抗體。此外，若欲穩定螢 光鑭系螯合物具有姐織特異性，則可Μ適當光源照光而目 測螯合物的存在。可能的用途為螢光導引手術過程，骨细 胞生長或彤狀的活體顯像及胃腸道檢査。 圖式之簡蜃說昍 第1圖為相片，顯示含約〇.〇1 mmol/kg PCTMB之大鼠 結腸之剖面圖。 第2圖為相片，顯示含約0.01 imol/kg PCTMB之大鼠 结腸內部平面圖之4倍放大。 第3圖為相片，顯示含約100 iiL ΙΧΙΟ^Μ溶液Tb-BP2P之大鼠骨之10倍放大。 第4_圖為相片，顯示含約100 Ml： 1Χ10·4Μ溶液Tb-BP2P之大鼠骨之4倍放大。 ..第5.圖為用於本發明之錯合物之顯微內視鏡螢光計之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 4228 4 1 a7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作，社印製 五 、發明説明·_(_5·· …........ ............ 方塊圔。 第6圖為相片顯示使用第5圖之顯微内視鏡之大鼠腸 内腔影像並顯示真正螢光影像及假彩色輪廓圔。 第7圖為相片，顯示與第6圖相同之大鼠腸之白光影 像0 第8圖為相片，顯示使用第5圖之顯微内視鏡之切開 大鼠股骨影像及顯示使用單色激光及濾光發射之真實螢光 影像及假彩色輪廓圖。彩色輪廓為：綠-黃=背景信號； 藍-紫= 1.54X10·15冥耳Tb-PCTMP/圖素；紅色= 3.35X 10_s 莫耳 Tb-PCTMP/圖素。 第9圖為相片，顯示第8圖相同股骨之白光反射內視 鏡影像。 第10A圖為相片，顯示由懷疑部分取出的结腸而組織 檢查判定正常部位所得H&E染色組織之標準顯微影像。 第10B圖為取自可疑部分結腸部位（正常）之未經染色 Tb-PTCMB給藥組織之白光反射顯微影像。 第10C圔為取自由可疑部分結勝部位（正常）之H&E染色 組織之未染色Tb-PTCMB給藥組織顯微影像之彩色輪廓促進 的螢光顯微影像。 第11A圖為由可疑部分取出結腸而組織學判定為腺癌 部位所得H&E染色組織之標準顯微影像。 第11B圖為相片，顯示取自可疑結腸部分（腺癌）之未 染色Tb-PTCMB給藥組織之白光反射顯微影像。 . 第1.1C圔為取.自結腸部分（腺癌)之未經染色Tb-PTCMB . 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱禎背面之注意事項-T4·'寫本頁)

4228^· ^ Τ-Ν B7 五、發明説明(6 ') 給藥組織之彩色輪廓促進螢光顯微影像。 链B月溉述 本發明係關於新頴組織特異性铽或錡螯合物其可用作 目測診斷劑。特別較佳螯合物係由式I多氮雜巨環糸化合 物組成，該化合物含有吡啶核作為巨環主鏈之一部分或旁 懸配合部分。 本發明你關於新類錯合物其為下式三-及四-環多氣雜 巨環糸化合物及其衍生物 Z^ Ν-Τ 請 先 閏 讀 背 之 注 意 項 再r 填、 ί 一裝 頁 Υ-

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度顧t關 (CNS ) A4规格（210X297公釐） 42284 1 A7 ----^五、發明説明（7 ·) T為-ch2-cooh， 經濟部中央標準局員工消費合作社&製

0 II —CH2—P—OH ； I OR (G) (H) 其中：R為H、Ci-CU烷基或-CH3CF3 ; 以為叩2、NH3、異硫氰酸根、胺基脲基、硫胺基脲基、順 丁烯二醯亞胺基、溴乙醯胺基或羧基； 但當存在有（D)時Z僅為（F)，而當存在有（A)、（B)或（〇時 Z僅為（E); 但當T為（H)或（J)時僅可存在有一個（H)或（J); 與铽（Tb)、銪（Eu)、釤（Sm)或鏑（Dy)之金屬離子纟昔合；或 其醫藥可接受性鹽。 習知螯合物之醫藥溶液可用於製備注射或浸泡或洗滌 所需區域用之醫藥配方。 對史柏格拉力大鼠進行生物分布研究指示具有組織選 擇性。出現骨及腸組織螢光影像，使用鑭糸螯合物進行 位置取向之活體顯像顯示有可能。也可製備一假T之雙官 能配合基及螯合物，然後將其共親接合物製備成生物活性 材料。螯合物[式⑴，此處一個T為⑻或（J)]可用於活體 .......試驗免疫檢定分析或組織樣品.(M如血液、.血漿Λ细胞樣 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Μ規格（210X297公釐） (山 裝-- -/ (請先閒讀背面之注意事寫本頁} 訂 ¼ 10 422844-228-^-fr Α7 Β7 五、發明说明（δ 經濟部甲央標準局員工消費合作社印製 品）之DM雜交，此處將有效量螯合物與樣品一起放置然後 讀出結果。 發明夕譁姐I說昍 早期軟組織之光譜影像準確度可經由使用位置取向分 子（對比劑）（其集中在特定組織）而顯著増進。 使用軾（Tb)或銪（Eu)作為中心金屬原子變成組織特異 性螢光探針極具吸引力。此型衍生物可用作於目測評估組 織情況例如早期檢測癌症而毋須依靠蛋白質共軛接合來達 到目標。此外活性螢光材料集中比較免疫檢定分析可更早 期檢測。本錯合物具有激光帶250-290 nm及尖峰發射之峰 於帶490-510 run、540-560 nm、590-600 nm及615-635 rrn ，高量之效率及毫秒鬆弛時間其可於組織自動螢光平息後 收集信號且可收集正常組織螢光範圍以外的資料。與其它 於水介質容易淬熄的螢光螯合物相反，目測螢光於水中不 會變性，因此極為適合作動物活體顯像用途。此外，衍生 自此類巨環糸配合基之螯合物屬於熱力學及動力學惰性最 高的鑭糸錯合物，由於金屬離子毒性乃其用於生物研究時 的主要考慮重點。 式（I)與本發明使用之術語定義如下。“CU-C4烷基” 包含直鏈及分支鏈烷基。“動物”本發明溫血哺乳類較佳 為人類。此處使用"錯合物” 一詞表示本發明化合物例如 式（I)化合物與金屬離子錯合之錯合物，其中至少一個金 屬原子被螯合或隔離。 “生物活性物質”表示葑受體具有特定親和力之葡萄 請 先 間 讀 意 事 項广 填、 裝

L 頁 訂 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > A4規格（210x297公釐） 42284 1 A7 B7 五、發明説明（9 } 經濟部中央標率局男工消费合作社印製 聚糖，肽或分子或較佳抗體或抗體片段。 "抗體”表示多株、單株、嵌合抗體或非均質抗體》 較佳單株抗體；“抗體片段”表示Fab片段及FUbl之片 段*及對所需抗原決定部位具有特異性的抗體部分。使用 “放射性金屬螯合物/抗體共軛聚合物”或“共軛聚合物 ” 一詞時，抗體表示包含全抗體及/或抗體片段，包含半 合成或基因工程變異株。抗體通常具有高度特異反應性。 本發明使用之抗體可針對例如腫瘤、细菌、真菌、病毒、 寄生蟲、黴漿體、分化及其它妞胞膜抗原、病原表面抗原 、毒素、酶、過敏原、藥物及生物活性分子。可能的抗體 有 11161S-19-9(抗結腸直腸癌）、116-NS-3d(抗CEA)、 703D4(抗人類肺癌）、704A1 (抗人類肺癌）及B72.3。融合 瘤細胞株 1116-NS-19-9、m6-NS-3d、703D4、704A1、 CC49、CC83及B72.3寄存於美國種型培養收集會，存取編 號ATCC HB 8059、ATCC CRL 8019、ATCC HB 8301、ATCC HB 8302、 ATCC HB 9459、 ATCC HB 9453及ATCC HB 8108 〇 此處所逑雙官能螯合劑（以式I表示）可用來螯合或隔 離金屬離子而形成金屬離子螯合物（此處亦稱為"錯合物” 或“雙官能螯合物”）。錯合物由於存在有官能化部分（於 式I MR2表示）可兴價附接至生物活性分子例茆葡萄聚糖 ，對受體具特定親和力的分子或較佳共價附接至抗體或抗 體片段。如此此處所述錯合物可共價附接至抗體或抗體片 段或對受邇具有特定親和力，於此處稱為“共轭接合物” 請 it 閲 讀 背. 之 注 項r 再I fv -I裝 頁 訂 線

L 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4228^ 1

經濟部中央檫準局.勇工消費合作社印製 B7 一一—' 五、發明说明110 ; 0 此處使用“醫藥可接受性鹽”一詞表示式I化合物之 任一種鹽或鹽混合物，其用於動物較佳哺乳類之診斷充分 無毒。如此，該鹽可用於本發明。藉標準反應由有機及無 機來源生成之鹽之代表例包含例如硫酸、鹽酸、磷酸、乙 酸、丁二酸、檸檬酸、乳酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、 棕櫚酸 '膽酸、palmoic acid、黏酸、麩胺酸、葡萄糖酸 'd-樟腦酸、戊二酸、乙醇酸、駄酸、酒石酸、甲酸 '月 桂酸、硬脂酸、柳酸、甲烷磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味 酸、苯甲酸、桂皮酸及其它適當酸。也包含藉標準反應由 葙機及無來源生成之鹽，例如銨或1-去氧-U甲胺基）-D~ glucitol、驗金屬離子、驗土金屬離子及其它類似離子。 特佳為式I化合物之鹽，此處鹽為鉀、鈉或銨。也包含前 逑鹽之混合物。 當然可使用式I化合物之自由態酸也可使用化合物之 質子化形，例如羧酸根被質子化及/或氮原子，亦即生成 鹽酸鹽。 難 錯合物係藉業界眾所周知的方法製備。如此例如參見 Chelating Agents and Metal Chelates, Dvfyer δε Mellort /ieadeiitic press (1964)，Chapter 7° 也參見^故11的！〇：

Production and Utilization of Amino Acids, (Rameko 等_輯）John Wiley & Sons (1974)之胺基酸製法°錯合 物之製備範例包括雙環多氮雜巨環膦酸與金屬離子於水條 家標準（CNS ) A4規格（2 丨0X 297公釐） ---------7ΤΊ 裝-- 广, (請先閲讀背面之注意事項界^:寫本頁) 訂 ¾ 13 42284 1 五、發明説明（11 修正^ R7 ί懸本f邪啊 件下於pH 5-7反應。生成的錯合物獲得安定核種組成物 例如核種不由配合棊解離而安定。 如下反應圖1_-3提供本發明錯合物製備之討論细節。 反應圖1

經濟部中央標準局員工消費合作社印象

反應圖1顯示製備具有一個吡啶部分之員四氮雜巨 環糸結構之合成。首先’將2,貳（羥甲基）吡啶轉成氯甲 基衍生物。另一步驟中*二伸乙基三胺被甲苯磺酸化及轉 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS > Α4規格（210 X 297公釐） 4-------Γ1.ν 裝-- 1-... (討先閱讀背面之注$硯私填寫本頁) 、1Τ 線 42284 1 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（12 成鈉鹽。然後，二反應劑於DMF組合獲得Ν-甲苯磺酸化巨 環。然後，於乙酸（AcOH)及HBr之混合物加熱完成胺之脫. 保護。然後，經由巨環之第二胺與三烷基亞磷酸酯及三聚 甲醛於四氫呋喃（THF)反應合成N-烷基膦酸酯。然後所得 膦酸酯於鹼性條件下選擇性水解獲得單烷基膦酸酯，其K Tb、Eu、Sm或Dy氯化物處理獲得所需螢光螯合物。 反應圖2 + NaN-S-r^ ^ kJ-CR, Ts —

3步驟 參見反應圖1 3步驟 參見反應圖1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（210X297公釐） 15 42284 1 τ^β-4-θ- A7 B7 五、發明説明（13 ) — 反應圖2 (續)

(請先閱讀嘗g之注意事免i寫本頁) -裝. 反應圖2摘述主鏈含有2個及3個吡啶部分之巨環糸 結構之合成。基本結構係經由K甲苯磺醯胺處理貳（氯甲 基）吡啶產生。單一反應可產生容易分開的12及18-員巨環 。隨後生產螢光螯合物的反應類似反應圔1摘述之步驟。 訂 線 經濟部中央操準局負工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公麈） 42284 1 A7 B7 五、發明説明（14 反應圖3

-〇(r〇K〇)ph2c、 /-Ο N—|

:N -〇(RO)(〇)PH2c/ 1-1 ^CHiPCOJCOR)0' O(R0)(0)PH2Cn '0(R0)(0)PH2C^ i N—η M+3 ] M+3 = Tb, Eu, Sm, H2P(〇)(〇R)〇' 反應圖3敘述具有一個吡啶旁懸部分附接於第二氮位 置之一的12-員四氮雜巨環之合成。吡啶部分之共價附接 係經由1，4,7,10-四氮雜環十二烷與2-氯甲基吡啶於質子 惰性溶劑如DMF反應完成。轉成所需配合基及隨後轉成螯 合物摘述於反應圖1。 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS } A4規格（210X297公釐） 42284 1 五_ _ν_發_明説明_( 15 __ A7 B7 本發明之錯合物係Μ配合基對金屬雛子比至少約1 : 1 ，較佳1 : 1至3 : 1，更佳1 : 1至1.5 : 1投予。大額過量的 配合基不合所需，原因為未錯合配合基可能對動物體有毒 ，結果導致心臓停止或血鈣過低性抽搐。 本發明之雙官能化合物可如反應圖4所述製備。 反應圖4

Η—拘 扣一η HOCHzCN · NCH2C—N 1^-CH2CN

A R02c Br 請先閱讀背©之注章事^:斯寫本頁) 丨裝.

、N] N〇2 O2CH2C—I<i ii—CH2C〇2* o2c

N〇2 H2/Pt〇. ch3cn K2C〇3 nch2c-

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N—CH2CN 訂 [h3o+] R〇2( N〇2 "樣 經濟部中央標準局舅工消費合作社印製 o2ch2g

nh2 —ch2co2' o2ch2c—ivr"3 ch2co2· M+3C1；3- ) -〇2c, M+3 = Tb, Eu, Sm* NH2 反應圖4摘述可兵價附接至生物活性物質例如單株抗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 42284 1 A7 _ B7

經濟部中央標準局員工消費合作社印I 五、發明説明（16 ) 體之雙官能螯合物之合成。3,6,9,15-四氮雜雙環[9.3·1] 十五碳-1(15) ,11,13-三烯（PYCLEN)與乙醇腈於pH 5-7反 應。然後，所得3,9-貳取代腈又使用溴（4-硝基苯基）甲基 乙酸醑於6-位置烷化？然後，所得產物於酸性或鹼性條件 下水解將兩種睛及酯官能化轉形成胺基羧酸。然後芳族硝 基取代基使用氫及氧化鉑（HE/Pt〇2)遷原成苯胺官能基。 反應圖4可用於任一種式I化合物之處一個T為（H)或（J) 。然後，所得配合基與螢光鑭糸化合物螯合及藉已確立的 程序共軛接合至生物活性物質。 式I化合物之較佳特點為此處：至少一個T為-CH2P(0) (OH) (OR)及一個T為（Η)或（J)部分。 秘始物料 式（ΙΑ)及（ΙΒ)配合基由發明人之1995年1月31日獲頒 之美國專利5,385，δ93已知（併述於此Κ供參考）。另一相 當的公告察為W0 94/26726，1994年11月24日公告。 式（1C)配合基由發明人之同在審查中之美國專利申請 案08/058,101，申請日1993年5月6日已知（併述於此Κ供 參考）。另一個相當公告案卯93/11802，1993年6月24日 公告。 式（ID)配合基由發明人之美國專利5,462,725，1995 年10月31日獲頒已知（併述於此Μ供參考）。另二相當公告 案為W0 94/26275，1994年11月24日公告。 “錯合物”及“螯合物”於此處用於表示金屬離子於 式（I)所示配合基。 .......... I-------VI ^ — .. ; (請先閱讀背面之注意事w^填寫本頁) 訂 r 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 19 A7 B7 五、發明説明（Γ7 ) “雙官能螯合物”表示錯合物或螯合物，此處式（I) 之一個T為（H)或（J)。

TbCl3及EuCla購自Aldrich化學公司。 雖 本發明之錯合物雙官能螯合物及共軛接合物可K所述 方式用作診斷劑。此等配方圼套件組形式，兩種成份（亦 即配合基及金屬，錯合物及抗體或配合基/抗體及金屬） 於使用前之適當時間混合。無論預先混合或圼套件組，配 方皆需要一種醫藥可接受性載劑。 本發明之注射組成物可圼懸浮液或溶液。適當配方製 備中須了解一般而言，鹽之水中溶解度大於酸形式。圼溶 液形式時錯合物（或若有所需，個別成分）溶解於生理可接 受性載劑。載劑包括適當溶劑，保藏劑如苯甲醇，及若有 所需，緩衝劑。適當溶劑包含例如水、醇水液、二醇類、 及膦酸酯類及碳酸酯類。水溶液含不超過50v%有機溶劑。 注射懸浮液為本發明組成物，需要液體懸浮介質含或 未含佐劑作為載劑。懸浮介質例如為聚乙烯基吡咯啶酮水 液，惰性油如植物油或高度精練礦物油，或狻甲基纖維素 水液。若需維持錯合物於懸浮液，則適當生理可接受性佐 劑可選自增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、明 膠、及裼藻酸鹽。適當界面活性劑也可作為懸浮劑，例如 卵磷脂、烷基酚、聚環氧乙烷加合物、禁磺酸酯、烷基苯 磺酸酯、及聚氧伸乙基聚山梨糖醇酯。 洪注射甩，活性螯合锪劑量約0·001至約nunolAs 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 2耵公釐） A2284 1 Α7 Β7 五、發明説明（18 ) 。使周時，組織事先於檢查前使用螢光螯合物清洗，螯合 物溶液之濃度隨特定需求改變。 如此彤成的錯合物可附接（共價鐽结）至抗體或其Η段 及用於治療及/或診斷目的。錯合物及/或共軛接合物可 配方供活體試驗或試管試驗用。調配妥的共軛接合檄之較 佳用途為診斷動物體特別人體之疾病狀態（例如癌症）。 因此本發明使用生理可接受性載劑、賦形劑或媒劑。 配方之製法為眾所周知。配方可呈懸浮液注射液或其它適 當配方。可使用含或未含佐劑之生理可接受性懸浮劑。 有效量之配方用於診斷。劑量隨動物之疾病及生理參 數如體重改變。本發明之配方預期用於活體診斷。 雖 組織特異性也可藉下述方法實現》將螯合物Μ離子附 接或共價附接至天然或合成分子(例如經由含一個（Η)或（J) 之Τ，此處R2為卯2、ΝΗ2、異硫氰酸根、胺基脲基、硫胺 基脲基、順丁烯二醯亞胺基、溴乙醯胺基或羧基），該分 子對目標組織具有特異性。此種方法之一種可能用途係經 由使甩螯合物共軛接合單株抗體，其轉蓮螯合物至患病組 織因而可以目測。然後，外科醫生使用偶合適當檢測器之 紫外光來源照射軟組纖，及若有所需*以手術去除該組織 〇 , 與本發明式I化合物生成之錯合物或雙官能螯合物可 使用檢測發光方法顯像，該方法使用違處顯像技術組合顯 微界面靣顏示活體影像。適當裝置示放第.5圖。目標樣品 本紙&尺度適用中國_家操準（CMS ) A4規格（2!0X 297公疫） I-------;:!1裝—— ^ - 請先閲讀背S之注意事項，#.%寫本頁 訂 i： 經濟部中夬標準局員工消费合作，社印製 42284 1 A7 B7 五、發明説明（Η >-....... 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (1)放置於光學分割目標並通過光學分割目標撿視，該目 標具有一組線及元件，及其係由黑色乳液沈積於白色正背 景（透明玻璃）形成。影像係使用光源例如IR濾光氙放電燈 或液體光導附有150瓦紫外光源作背面或正面照射獲得。 光之色彩Μ電子方式控制。可能出現快速反應且螢光與日 光影像間可能容易移位。來自光纖的光束通過具有室内構 造的擴散器或通過270 run干涉濾鏡（9)(帶寬10 nm)。視野 頂（(2)左端）與目標（1)間選擇可獲得最佳對焦影像。影像 利用內視鏡螢光顯像顯微鏡（2)成像，該顯微鏡含有石英 纖維素或细桿透鏡製成的軟性或有脊成像轉蓮裝置。光纖 螢光顯像顯微鏡為軟性；桿透鏡螢光顯像顯微鏡有脊但光 線的通過較佳。用於本發明之最佳光學分割具有光纖導管 含10,000圖素，各個測量得3 μιβ直徑。最佳市面可得螢光 顯像顯微鏡較佳含大於20,000圖素，各別直徑3 mid。影像 可相對於细桿透鏡內視鏡中央視軸K不同的檢視角成像。 10倍顯微鏡物鏡（3)放置於距離顯微鏡10 nun，其收集、放 大、並顯示影像於電荷偶合裝置（CCM5))，可經熱電冷 卻。干涉濾鏡（4)存在於顯微鏡物鏡（3)與CCD(5)間例如當 獲得螢光影像時為520 nm或550 nm濾鏡。干涉濾鏡之範例 有二位置濾鏡輪（白光不存在有滹鏡），液晶濾鏡（特異性 極高Cambridge研究儀器公司）*或單色光儀。CCD收集的 影像顯示於高解析度影像監視器（7)其提供可即時顯示的 影像，由圖框捕捉器捕捉並下載至個人電腦（6)供影像處 理器分析或記錄於錄影帶(VCR)供鼴後數位化之用。攝影 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2 i 0 X 297公釐） 42284 1, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（20 ) 機控制單元（CCU)可存在於監視器（7)與個人電腦（6)間。 軟體產生光強度呈横跨成對線條之位置函數之圖。數位化 影像可提供灰階影像。限制解析度（LP/ntm)係使用有氧影 像調變（AIM)圖計算。此種方法有助於於穩定光強度及固 定放大倍率情況下，做非侵入性定量蓮送過程。此乃本發 明錯合物之較佳用法。 其它方法也已知，也可利用US 5,507,287所述之内視 鏡影像糸統。 龙發瞄捆論 不欲受理論所限，但相信本發明之優異结果係由於本 發明之全部螯合物，陽離子位在12-員巨環的頂點位置且 經由離子與膦酸配合基交互作用維持定位。此乃官能化氮 位置與配合基於聚合架構內的獨特組合使得化學改質，结 果導致組織選擇性。 鑭系元素如Tb及Eu鹽於水溶液之螢光極微弱，原因為 離子無法有效吸收所需能量。然而當金屬與適當有機配合 基錯合時離子螢光大增。 於此獨特錯合物中，配合基圾收紫外光，且由基底狀 態（SD)激發至激發態（心）。當配合基開始回到最初基底態 時，若干能量由配合基的三元體狀態轉移至鑭系離子之適 當4f能階。當接收來自酝合基三元體狀態之能量時*離子 達到共振態，可作放射轉變，結果發出金屬離子的特徵線 (離子螢光）。此種螯合物結構中，配合基主要作為吸收能 量的天線，能量轉移給金屬離子再度K可見光形式發射。 本紙張尺度適用中國國家標孪（CNS > A4規格（210X297公釐） ----------Γ 裝-- (請先閱讀背面之注意事項r'#.寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4228 4 1 A7 五、發明説明、2i ’厂.’… · 也較佳有一種配合基其吸收與金屬離子發射的波長顯著不 同波長能量來減少干擾（Stoke移位）。 曾經報告無數螢光螯合物。大半螯合物僅能於無水介 質操作，原因為螢光被水淬熄。本發明之螯合物供生物用 途遠更優異，原因為可於水環境形成安定螢光螯合物。吡 啶官能基的獨特位置呈部分巨環糸環或旁懸基，可使能量 有效轉移至金屬子，也可放大整體螯合物安定性。 本發明經由考慮下列實例將更顯然易明，此等實例純 然供舉例說明本發明之用。 塾合物合成 富例1 :铽3,6,9-參（亞甲基膦酸）-3,6,9,15-四氮雜雙環 [9.3.1]十五碳-1(13),11,13-三烯〇'1)-?(^1»«>)之製備。 3,6,9-參（亞甲基膦酸）-3,6,9,15“四氮雜雙環[9·3·1] 十五碳-1(13),11,13-三烯自由酸（PCTMP) (50 mg, 0.1 mmol) 最初溶解於去離子水（1 mL)獲得pH=1.3之水溶液。然後 氯化铽六水合物（38 ms，0.1 mmol)溶解於水（1 mL)及一 次加入配合基溶液且連續攪拌（pH= 1.4)。然後K每份50 微升加入氫氧化鈉0.1N直到維持pH = 5.5為止。藉反相HPLC 監測錯合，Μ甲醇/水（80 : 20)溶離。然後溶液通過〇·2 um過濾膜適滹及凍乾獲得錯合物呈絮凝白色固體，使用紫 外燈照射時具有亮綠色可見光。錯合係藉HPLC評估產率為 定量。 2 ：弒N，N'_貳（亞甲基膦酸）-2,11-二氮雜[3,3]-(2, δ)ϋ!±Π定劳（pyridinophane) {Tb-BPSP)之製備。 本紙張尺度適用肀國國家標準（CMS ) A4規格（210X 297公釐.) I —裝-- 請先閱讀背面之注意事#寫本頁) 訂 :線 42284 1 a? B7 五、發明説明(22 ) ........ …一 11，『-貳（亞甲基膦酸）-2,11-二氮雜[3,3]-(2,6)8比啶 芳（BP2P)自由酸（80·8 mg，0.19 mmol)水溶液（3 mL)K攪 拌與氯化絨六水合物（85 mg，0.23 mmol)水溶液（3 mL)組 合（pH==4)。然後氫氧化鉀（5N)分成小份的(20 mL)加入直 到溶液變成鹼性（pH=9)。攪拌18小時後過濾溶液（0.45 iua)及凍乾。所得固體溶解於甲醇（16 mL)及過濾去除Tb( 0H) 3。甲醇.滹液經真空濃縮獲得固體，固體溶解於水（10 mL)，過濾（0.2 jm)及凍乾。分離錯合物里絮凝灰白色固 體。錯合係藉HPLC評估及產率為定量。 管例3 ；銪3,6,9-參（亞甲基膦酸正丁酯）-3,6,9,15-四氮 雜雙環[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯$11-?(7^8)之製 備。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PCTMB鉀鹽（150 mg，0.19 mmol)溶解於去離子水（3 mL)獲得pH 10.5溶液。pH使用IN HC1伴K連續攪拌降至 5.5。氯化銪六水合物（85.5 mg，0.23 mmol)之水溶液一 次加入其中獲得pH 3.47溶液。藉加熱0.1 mL整份0.1N Κ0Η緩慢升高pH。維持pH 6.4時終止添加KM。此時均質溶 液變成皂狀，觀察到顯然混濁。然後混濁溶液凍乾，所得 固體溶液溶解於氯仿：甲醇（3 : 1，40 mL)。有機箏液通 過希來特（elite)過滹及濃縮獲得玻璃樣固體。固體再溶 於水（20 mL)通過〇·2ίΐ過滹及凍乾_得鍇合物里i={狀，雪 白色固體。錯合物分離呈絮凝灰白色固體。錯合藉肝1^評〔 估及產率為定量。 v献3，69-參（亞审基膦酸正丁酯）-3,6，115-四氮 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 ^2204-θ 42284 1 發明説明（23 T ' . 雜雙環[9.3.1]十五碳-1(15)，11，13-三烯（Tb-PCTMB)之製 備。 PCTMB鉀鹽（150 mg，0.19丽〇1)溶解於去離子水（3 mL)獲得pH 10.5溶液。pH使用IN HC1伴Μ連缡攪拌降至 5.5。氯化弒六水合物（85.5 mg，〇·23 mmol)之水溶液一 次加入其中獲得pH 3.47溶液。藉加熱0.1 niL整份〇·1Ν 1(刖緩慢升高卩[^維持？116.4時終止添加1(〇}1。此時均質溶 液變成皂狀觀察到顯然混濁。然後混濁溶液凍乾*所得固 體溶液溶解於氯仿：甲醇（3 : 1 ’ 40 niL)。有機溶液通過 希來特過濾及凍乾獲得錯合物圼片狀，雪白色固體。錯合 物分離圼絮凝灰白色固體。錯合藉HPLC評估及產率為定量 Ο 管例5 ：鏑或釤3,6,9-參 (亞甲基膦酸正丁酯）-3,6,9，15-四氮雜雙環[9,3,l]十五碳-l(15),ll,13-三烯（Dy-PΠm 或Sm-PCTMB)。 重覆實例4之程序但使用適當金屬氯化物獲得對應螯 合物。 半物分布研究 組織生物分布研究綑節如下。準備153SmCl3溶液作為 適當配合基溶液。兩種溶液於pH = 2徹底混合及溶液之pH 使用0.IN NaOH升高至7有助於錯合。然後錯合之評估方 式係將樣品溶液（100 uL)通過Sephadex C-25柱，使用（2 X3 mL)4: 1鹽水（0.85%NaCI/NfU0H)溶離及比較溶離分 子放射性於柱上其於放射性（自由金屬殘留於柱上.）。然後 本紙張尺度適用十國國家標準（CNS ) A4规格（2I0X297公釐） ---------1—^-- (請先闆讀背面之注寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 42284 1 Α7 _Β7_ 五、發明説明（24 ) _ 使用三顗史桕格拉力大鼠（180-220g)測量，放射性錯合物 之活體分布，各大鼠注射100 iiL(pH=7.5)放射性錯合溶 液。經30分鐘或2小時後犧牲動物。取出器官秤重及計數 。骨含有總劑量百分率係使用相對於總體重百分率之標準 假設求出。例如骨樣品（股骨）佔總骨骼系統之25分之1重 量而總肌肉計量係假設肌肉佔總體重之43%計算。

顧傲 富例I 史桕格拉力大鼠（180-200g)M0,l mmol/kg計量注射 Tb螯合物。犠牲動物取出器官作光譜檢査。然後使用顯微 鏡拍照，K配備有可見光濾鏡的2.54 nm手持紫外燈照射 含Tb螫合物的組織樣品。第3圖頚示大鼠股骨區，此處存 在有高濃度螯合物由發出強力光可證。第3圖顯示螯合物 Tb-BP2P。螯合物的分布相當均勻，可於骨骼多孔區檢測 ，此處富於微血管供應。於端末谞區的發光顯然較強，其 與幼年動物成長快速組織符號合一致。 此等錯合物除了具有獨特光譜性質外也具有高度組織 選擇性。陰離子Tb-PCTMP及Tb-BP2P顯示骨骼系統攝取； 中性Tb-PCTMB顯示實質親脂特性。Tb-PCTMB可促進螯合物 與血中蛋白的交互作用，結果導致實質肝膽攝取。由於大 鼠不含膽囊，故螯合物直接轉蓮到胃腸道。如此小腸的Tb -PCTMB集中於小腸，Tb-BP2P主要存在於骨。第1及2圖 顯示Tb-PCTMB之結果。 基於此等結果，顯然舫等螯合物百用來檢測患病例如 本紙張尺度適用中國國家操準（CNS ) A4規格（21 ϋ X 297公澄） ^—11- fin 1^1··. 1^1 (請先閛讀¾面之注惫事?r再4^-寫本頁) -訂_ 27 — 經濟部中央標準局®r工消費合作杜印製 42284 1 A7 ______B7 立、發明説明（25 ) 鬆骨病之動物例如人類的異常，原因為其可溶於血液或其 它可用於生物體液環境的水介質。 奮例It 大鼠小腸之活體内定量、多尺寸、違方、顯微内視鏡 顯像係使用Tb-PCTMB (實例I製備）進行。光列可於微米層 製作空間顯像及於夸克程度的靈敏度。 所用顯微内視鏡螢光計之方塊圖示於第4圖。樣品通 過附有150瓦紫外光源的液體光導由遠處照光*光導偶合 至具有10 nm帶寬的干涉滹鏡。使用210 nin Hopkins细桿 透鏡收集螢光影像。來自內視鏡的影像通過帶寬10 rrn的 550干涉濾鏡，然後顯示於熱電冷卻CCD。CCD信號顯示於 個人電腦上使用攝影及伴隨的控制軟體捕捉圖框。使用適 當軟體進行定量影像分析。完整裝置的先列為415 nma視 域解析度為181 LP/mm。 儀器校準係將已知量TB-PCTMB輸注於高度反光的含纖 維固體基質達成，該基質的型態類似研究的組織。校準標 準品及組織樣品安裝於相對於顯微鏡的相同位置。標準品 係於六個分析级濾紙錠（直徑5 mn上製備）°Tb-CTMB水溶 '液係使用如下濃度製備：3X10-%、4xl0_B、5X10_B、 i5xi0—e、7父1〇-8及8\10·6。對個別且施用各5 iiL Tb-PCTMB。一旦乾燥，各個皿分別輸注15、20、25、30、35 及40p莫耳Tb-PCTMB。標準錠放置於樣品座使用270 rm光 激光且於各種CCD積分時間（3至S秒）求螢光。來自各錠的 螢光信號葑Tb-PCTMB冥耳數及攝影機積分時間繪圖。圖產 ----------^ — \| .... {請先閲讀背面之注意事寫本頁) h. 訂 -線- r 4228 4 1 Α7 Β7 五 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 發明说明（26 ) 生莫耳數相對於時間及莫耳數柑對於灰階信號的校準曲線 Ο 史桕格拉力大鼠（180-220Θ尾靜脈注射1〇〇 uL Tb~ PCTMB錯合物（pH = 7.5，6Χ10·ΒΜ)溶液*由大鼠取得含位 置標記（Tb-PCTMB)的組織樣品。化合物注射量粗略相當於 1 mg Tb-PCTMB/kg大鼠蟫重。3Q分鐘後將動物安樂死取出 小腸。重3 nig的小腸剖面使用安裝蠟安裝於樣品座且使用 CCD於不等積分時間顯像。除了收集的螢光影像（第5圖） 外*使用150瓦白光源收集腸樣品的白光影像（第6圖）（白 光係於照光時去除濾鏡）。定量螢光影像並基於校準曲線 圖测定Tb砰CTMB量。 定量结果 . 組織樣品就激光來源之穿透深度（《5 )而言視為均質且 大。樣品具有吸收係數，繞射係數及繞射各向異性（分別 為Ma、/is及g)。此乃基於Monte Carlo模擬的一度空間模 式*該橫式處理相對於來自光源之光線指數衰減的流速及 散逸函數，並考慮光線蓮送通過表面邊際的相關性。假設 包含激光沿表面之法線方向均匀輸送且就穿透深度而言為 寬；及光分布僅隨穿透深度改變。流速（在）及散逸函數（G) 列舉如下： Φ ⑵ exp(-k·] ζ/δ)·〇2€〇Φ(^2Ζ/δ)】 G(z)=C3exp(-k3z/5) 此處Z為來源螢光發射圑深度Cl、C2、C3、Kl、“及“為 與擴散反射率Rd相關的參數。此等參數之實驗式為； 本紙鉍尺度適用中國國家榡準（CNS )六4規格（.2丨OX.297公慶） 29 Α7 Β7 &4=θ=~ 42284 1 五、發明説明（27 ) 對螢光信號評估散逸函數之參數計算值 參數 77組織/η空氣 計算值 Rd 8χρ{-7δη3) 0.42 C, 3.09 + 5.44Rd-2.12exp{-21-5Rd) 5.37 ki 1-{1-1/V(3))exDi-20.lRd) 1,00 C2 2.09-1'.47Rh-2.126Xp(21 .5Rd) 1.47 k2 1.63exp(3.40Rd) 6.80 0.28+0.78Rrt-0.14exp(-1〇.7Rd) 0.61 1-0.31exp(-6.12Rd) 0,98 請 先 閲 讀 背

意 Ψ 再' * 填V 裝 經濟郎中央榡準局員工消費合作，杜印製 定量結果須要就兩方面校準顯微内視鏡螢光計：（1) 使用灰階測量被分析物數量之函數測量螢光信號.；及（2) 對固定量被分析物信號強度之函數產生檢測器積分時間之 時間-反應曲線。使用輸入Tb-PCTMB的標準錠來校準顯微 内視鏡螢光計介於螢光信號（積分4秒）與Tb-PCTMB莫耳數 間之建立直線定量關係：I = 4.58Q-49.0 ; r = 0.994,此處 Q為Tb-PCTMB數量（莫耳)及I為螢光信號，影像灰階平均值 。灰階平均值與平均螢光信號/攝影機圖素有關。校準樣 品錠為13,000圖素，此乃錠之影像大小。由於測量平均信 號/圖素，故經由產生平均信號/圖素（灰階值）相對於被 分析物莫耳數/圖素之校準圖來作其它調整測定樣品（大 小非13,000圖素）内之被分析物數量。 小腸之白光影像示於第7圖，對應螢光影像示於第6 圖。影像之灰階度由0至255，低灰階值對應於影像之暗區 ，大灰階值對應於亮區（高度反射型態）。第6圖顯示假色 圖其可經由記錄該區色彩找出對應Tb~PCTMB量/鬮素色階 本紙張尺度適用中國國家襟準 ( CNS > Α4Ϊ兄格（210X297公釐} 訂 麵 42284 1 A7 B7 __ 五、發明説萌（2δ ) 而決定組織樣品内任一點的Tb-PCTMB數量。例如第6圔假 色圖第一次估計腸，分成3部分對Tb-PCTMB之總存在量計 算。结果反應於下表：

Tb-PCTMB之定量計算结果 樣品d區 平均灰階 樣品圖素 校正灰階 Tb-PCTMB之 總莫耳數 1 85.66 1976 69.73 1.63X10-11 2 77.18 228 62.83 1.43X10'11 3 67.94 684 55.30 1.23X10-" 結果驗證發明人可定量鍇合生物基質內夸萁耳濃度的 探針標記之存在。 PCTMB之生物分布資料示於下表。此種責料係使用史 桕格拉力大鼠進行。放射性金屬i53Sm與PCTMB錯合。將2 itiL 3X10_4M 153SmCh於0.1N HC1 加至2 mL 3Xl〇-4M iS3SntCl3載劑溶液準備is3SmCl3備用溶液。然後於去離子 水準備適當配合基溶液。兩種溶液徹底混合（PH = 2)使用 NaOH輔助錯合將pH緩慢升高至7。然後將樣品溶液（ 100 mU 通過Sephadex X-25柱，M(2X3 mL)4 : 1鹽水（ 0.8S%NaCl/mU0H)溶離及比較溶離份之放射性於柱上殘 留放射性（自由金屬殘留於柱上）而評估錯合程度。然後大 鼠如前注射錯合犓> 30分鐘後斬首犧牲，取出器官。組織 之放射性計數獲得各型組織之螯合物數量。 七紙張尺度適用中國國家標準（) Λ4規格 42284 1 五、發明説明（29 ) A7 B7 153Sm-PCTMB之生物分布 組織或器官 分布％ 骨 3.73 肝 2.70 腎 0.43 脾 0.05 肌肉 1.09 血液 0.14 心 0.02 肺 0.04 腦 0.00 賈 0.08 小腸 57.98 大腸 0.77 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 數值總和不等於100%，因為其餘部分經排泄糸統排 除或攝取於未分析的組織。3 mg組織樣品得自給藥大鼠（ 0.1 ramol/kg體重）留在小腸之被分析物總量僅占注射總量 之58%。因此可作單純質量平衡計算。 資料係以被分析器官的質量表示，於小腸、大鼠注射 0,1 rnnol探針/kg小腸。取3 mg樣品，使用適當轉化因數 ，則樣品內約含193 pmol探針分子。第6圖螢光信號來自 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ _2〗〇X 297公釐） 32 4228 4 1 經濟部中央標準局貝工消費合作社印12. 五、發明説明（30 ) 小腸總表面約23% (表示樣品含44.39 pmol)。被分析物總 量為43.02 pmol (3.18%誤差），代表可使用小樣品及小量 被分析物。此種檢測限度顯示早期警報且極少侵襲性的即 時診斷大有可為。 實例皿 所用光列示於第5圖。供解析研究使用1951 USAF新 目標。解析目標由具有已知寬、長及間距的元體(線條)組 成。目標上線條係由黑色乳液沈積於白色正性背景（透明 玻璃）製成。使用紅外光濾光氙放電燈由後方照明解析目 標獲得影像。來自光纖的光束通過室內構造擴散器，替代 第5圖所示之270 nm干涉濾鏡（4)。鏡頭尖端距離目標距 離（1.5mm)係選擇可獲得最佳對焦影像者。影像經由相對 於薄桿透鏡內視鏡中軸藉0β、30°及60°檢視角收集。10倍 顯微鏡锪鏡放置距離内視鏡10 μ，收集、放大及顯示影 像於CCD(5)。CCD收集的影像顯示於高解析度視頻監視器 ，以圖框捕捉器捕捉並下載至個人電腦作影像處理及分析 。軟體產生光強度呈跨越成對線條位置函數之圖。使用空 氣影像調變（AIM)圖求出限制解析度（LP/nim)定義為dl/dx 保持恆定之點。 視野的測量係再度安置目標使單線横跨内視鏡視野。 圖形視野容易計算，已知解析目標的線條長度表示檢視區 段直徑。犠牲影像细節，視野可放大故可檢視大段骨。供 螢光測量*鏡頭與骨樣品間距約5 mm。最佳對焦影像出現 於顯徽鐃的物鏡接近工作距離，而距桿透鏡糸统後端21 —---------^--r、 {請先閱讀背面之注意事^r4K寫本頁) 1

I 訂 I........... 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i0x 297公螯.） 經濟部中央標準局員工消f合作社印？π 4228 4 1 A7 B7 五、發明説明(31 ) Μ處。 生物分布研究係如實例I所述使用對應153Sm-PCTMP 錯合物進行。約l mg/kg溶質投予大鼠。2小時後動物安 樂死，取出組織秤重並計算放射性。骨内之劑量總百分率 計算時假定骨樣品（股骨）表示骨骼糸統總重之25分之1而 分布均勻。總血劑量係假定血液占總體重6.5%求出。總 肌肉劑量係假定肌肉佔總體重43%計算。 153Sm-PCTMP及 153Sm-BP2P 之生物分布 組織或器官 PCTMP BP2P 骨 34,87 60,08 肝 0.99 3.71 腎 1.42 1.21 脾 0.07 0.05 肌肉 4.77 1.53 血液 6.27 0.87 心 n/a 0.07 肺 n/a 0.17 腦 n/a 0.01 賈 n/a 0.2 小腸 n/a 0.39 大腸 n/a 0.13 n/a表示由於未測量故無法得知 ---------z—裝II (請先閲讀背面之注意事再勒寫本頁) 訂 :等 本纸張尺度適用中國國家榡準（CMS ) Α4規格（23；0X297公釐） 34 經濟部t央樣率局負工消費合作社印製 42284 1 A7 B7 五.v 發明説·明（32. ) ……一，........... 供骨螢光分析之用，兩頭大鼠注射Tb-PTMP或Tb-BP2P 。平衡2小時後動物安樂死，取出股骨。 供螢光測量，修改第5圖儀器。外部照射來自於紫外 光源（固化燈）裝配270 nra帶通濾鏡通過軟性液體光導至達 樣品。550 rm帶通濾鏡放置於顯微鏡物鏡（3)與CCD(5)間 來選擇螢光及區段背景光。收集的影像轉成TIFF的格式處 理。採樣若干不同頻率的線對，其調變值圼線頻率之函數 繪圖。3部內視鏡之AIM圖指出限制解析度對3倍內視鏡 約略相等。解析度係於用來顯示或檢視影像的模式或方法 有關。 目測檢梘高解析度視頻監視器（7)時獲得181 LP/mm解 柝度。此種解析度可解析間隔距雛2.76 Mm的物體。此種 放大可分析小於细胞的小器官例如核（5-6 /m)或内質網（ 3 im)。電子傳真度下降後，獲得112 LP/irn解析度，相當 於解析力4.46 jura。第8圖之螢光影像及候色影像驗證此 種能力。白光影像示於第9圖。類似實例E的校準曲線用 來估計骨顯像區（表面）之Tb-PCTMP溶質存在量。當於約 270 rrn激光而發光於550 nm時光學採樣約6 ura，產生螢光 流約66%。以類似實例I之方式計算，可估計特殊顯像區 段的溶質量。經由採樣整區計算為約5.19 pmol溶質。

督例TV 此種糸統可基於螯合物的結合特性檢視大體組織胗態 差異。已知正常組織與腫瘤組織的生理條件大為改變[see R. K* Jain-and G,. R, Martin, Cancer Res. 54. 5670 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )从規格⑺〇χ 297公釐y ； I---------1¾.-- \~ / (請先聞讀背面之注意事寫本頁)

I 訂 經濟部中央棣準局員工消費合作社印聚 4228 4 lj A7 __B7 -fj、明 1¾ 明（gg ) ^--" — (1994)]。如此系統内存在有螯合物可於活體内顯像並輔 助診斷。 經由注射1,2,二甲基肼二鹽酸鹽隨後餵食高脂、肉膳 食於史桕格拉力大鼠誘生腫留。可能患有结腸異常的大鼠 使用3步驟式方法鑑別。i)體重減輕進食困難的大鼠作 為可能的候選者；U)檢視是否有直腸出血或黑糞粒徵象 ，.且經常有顯著生長異常诅）最後使用2.5 mm直徑，3 m長 .... ·· 軟性顯微內視鏡於白光下檢査動物大腸確定存在有異常組 織。觀察有病變的一頭動物麻醉灌臈引進螢光標記時使大 鼠呼吸。0.1 mmol/kg動物體重濃度之Tb-PTCMB水溶液使 用1.0 mm顯微内視鏡供作管腔投予史桕格拉力大鼠。標記 溶液的引進係於可K組織部位進行，而溶液量為填滿整個 大腸需要量（美國專利5,456,245所述方法）。標記溶液於 大腸停留20分鐘隨後犧牲大鼠解剖。 剖開大腸發現大的阻塞物質約4.5 cmx 5,0 cm距離直 腸約15 cm。由可疑物質去除約10 era長度之腸子收集正常 組織。得自小腸腫瘤及正常區的組織樣品置於鹽水即刻進 行進一步分析準備。全部樣品皆準備4片冷凍切片。各組 織區的4片玻Η首先未染色進行螢光顯微鏡顯像(如下逑) ，然後以蘇木素及伊紅(Η&Ε染色）染色。使用標準組織學 診斷根據。可疑部位取得的組織測得為腺癌[參見S. S· Sternberg Ed. ^Histology of the Οοΐοη^ in Histology for Pathologists (Raven Press, 1992)； W. M. Copenhaven st alHistology of the Intestine，i. in Bailey's. 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八扣見修（2丨0><297公釐）

y —裝 訂 ^ (請先閲讀背面之注奮事|4^寫本頁) /J 36 經濟部_央標準扃員工消費合作社印製 4228 4 1 at B7 五、發明说明（34 ) 一… ……

Textbook of Histology (The Uilliams & Wilkins Co. Baltimore, MA, 17th Ed 1978) Chap. 16, pp 495-509； K. M. Fozharisski, wTumors of the Intestines” ,

In Pathology of tumors in Laboratory Animals, E. V. Turosov Ed. (IARC，Lyon) 1，119-140 (1973)]。由異. 常部位所得組織測得為正常。該區的顯微鏡影像使用H&E 方法染色示於第l〇A及11A圖。 使用室內型修改顯微鏡，將動物之可疑區及遠區樣品 顯像。可疑區及遠區結腸的白光反射影像示於第10B及11B 圖。第10C及11C圖顯示該組織各區之螢光影像。如前逑各 區隨後也藉H&E染色進行姐_學評估。螢光影像的假色、 輪廊對應於發光強度且表示姐織内夾帶標記的相對量。溶 質攝取的顯著差異以正常組織相對於腫瘤組織之螢光強度 差異大表示。攝取螯合物表示於正常組織檢知螯合信號（ 第10C圖）。又基於信號強度，各組織之標記溶質數量相對 差異估計約一幅度大小。雖然並非絕對可作結論，但觀察 的螢光信號差異足夠，提示Tb，PCTMB偏好由異常結腸組織 攝取。此種明顯相對差異可促進结腸癌的對比因此改良檢 測。由於低濃度灌腸水液通過内視鏡工作管腔發生標記偏 好攝取現象，故可使用大腸鏡進打結腸攝影時，蓮用此種 技術放大對比而修改供螢光顯像用。

甯例V HT〜29细胞株得自美國種型培養收集會（ATCC)並維持 於含10%胎牛血清的杜別克改質鷹式培養基(DMEM)。融合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ).·Μ规格（2!0X297公馇）

42284 1 at Β7 五、發明說明（35 ) 前3日细胞接種2 mL 2 mM Tb-PCTMB使其生長成融合。融 合前2日使用PBS洗4次，取出未結合的Tb-PCTMB »使用3 raL胰蛋白酶由燒瓶移出细胞。细胞懸浮液使用12 mL生長 培養基轉移至離子管，於lOOOg離心10分鐘使细胞形成丸 粒。取出培養基及胰蛋白酶，细胞懸浮液再度懸浮於5 mL 培養基。為方便計數，100 «1细胞懸浮液於微離心管與 100 mL培養基混合_。50 mL.稀釋液與5.0.iuL Trypan藍色染 色混合並載入血球計數器。計算血球計數器上5個方塊的 细胞，被染色细胞死亡而未染色细胞存活。每個方塊的平 均數乘Μ稀釋因數（4)獲得细胞數X 1(T 4/mL。報告细胞數 為3次各別係計數平均。 细胞毒性結果HT-29细胞 對照 接種 Tb-PCTMB 總细胞族群: 5.30X106 總數（細胞/ml)1* : 4.70X106 活细胞：94.3% 活细胞：91.5% 死细胞：5.7% 死细胞：8.5% 3次計數平均 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 上表記敍資料由Μ. P. Hubbard及D. J. Bornhop於 199S年估計為log K=19。此值可媲美IL P。Cahceris et al。》Inorg. Chem· 958-960 (1987)及S. Aime et al., J. Chem. Soc., Chem, Commun. 1885-1886 (1966) 類似的化合物。本式I螯合物的羧酸值類似物顯示熱力學 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 38 42284 1 A7 B7 « ，之^ t*T f 、 V36 ) 安定性常數log K=19.5。 經濟部中央樣準局員工消費合作杜印裝 UMR 106細胞得自美國種型培養收集會及維持於含i〇 %胎兒血清的基本鷹式培養基。细胞繁殖故25 roL含有3X 107的细胞。融合前1日細胞接種2 mL 2X 10~3M Tb-PCTMP 。融合時以PBS洗4次移出培養基及Tb-PCTMB。使用3 mL 胰蛋白酶由燒瓶分離细胞移到含12 niL培養基的離心管及 於lOOOg離心丨0分鐘而使细胞造粒。丸粒再度懸浮於2 mL 培養基將離心管沈浸人液態氮内而冷凍。冷凍混合物由管 内挖出移到研缽。混合物內加入等重海砂及10 mL液態氮 。混合物K研杵研磨30分鐘至液化。所得混合物移到離心 管及於10,000 n>m離心15分鐘留下完整细胞、砂及膜於丸 粒而胞質小细胞於上清液。上清液於離心管於45,000 n>m 離心90分鐘使小器官造粒。膜、细胞及砂混合物通過粗濾 膜過濾去除砂，及通過10 um濾膜過濾去除完整细胞〔此 種差別離心逑於Η· Pertoft and T. C. Laurent in Methods of Cell Separations, N. Castimpoolas, Ed. (C. Plenum Press，NY, 1st Ed。1977) Chapt. 7.]。膜和小器官於 顚微鏡玻H上抹片使用蔡司（Zeiss)顯微鏡分析修改以紫 外光激光。對照玻片的小器官抹片不具有可分辨的螢光， 而給藥細胞的抹片測得顯著螢光。對照後給藥细胞的膜抹 片皆未測得信號。 本紙張尺度適用中國國家標準Y^NS ) 公釐) 39 12284 1 五、發明说明（37 Α7 Β7 细胞毒性結果IEC-6细胞 對照 Tb-PCTMB 接種 细胞總數* : 5.7〇xlOe 细胞總數H : 5.30X10S 活细胞：89.5% 活綑胞：90.6% 死細胞：10.5% 死细胞：9.4% "3次計數平均。程序詳述於參考文獻27 本發明之其它具體例對業界人士經由考慮本說明書或 此處揭示之本發明之實務將顯然易明。預期說明書及實例 僅供擧例說明之用，本發明之真正範圍與精髓係由隨附的 申請專利範圍界定。 元件標號對照 1 ....目標樣品 2 ....內視鏡 3....顯微鏡物鏡 4 ....干涉濾鏡 5 ....電荷耦合裝置 6 ....個人電腦 7....監視器 (請先閱讀背®之注意事齊再壤寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙掁尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格1210X297公釐）

Claims (1)

1. 六、f請專利範圍 第86113684號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正曰期：89年〇3月 1. 一種用於診斷在一動物體内之一疾病狀態的藥學組成 物，包含有一有效量之一種由一個具有下式⑴的化 合物與一為铽（Tb)、鋇（Eu)或鏑（Dy)之金屬離子“錯 合而成的錯合物或其藥學上可接受之鹽：

   <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -¾--------訂--------綠

   ⑼ $ 0L^J0 或 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製

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   本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

   A8S8D8 六、申請專利範圍 τ 為-ch2-cooh， -CH2一P—OH 1 OR(G) (Η)

   2. 經濟部智慧財產局貝工消費合作杜印製 3. 4. 5. 其中：R為Η、烷基或-CH2CF3 ; R2為N〇2、NH2、異硫氰酸根、胺基脲基、硫 胺基脲基 '順丁烯二醯亞胺基、溴乙醯胺基或 羧基基團； 但有條件是當存在有（D)時，Z僅為，而當存在有 (A)、（B)或（C)時，Z僅為（E); 但有條件是當T為（H)或（J)時，僅可存在有（H)或⑺其 中一者； 該錯合物會發出螢光以產生一螢光映像來供該疾病助 狀態之診斷用。 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該藥學組 成物係呈一注射液或洗液形式來供投予。 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該錯合物 之劑量係由0.001至0.2 mmol/kg » 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中映像之獲 得係藉由使用一個内視鏡螢光顯像顯微鏡。 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該映像 -42- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (猜先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 表---- 訂---------線(： 之 Γ A8 B8 C8 D8 42284 1 六、申請專利範圍 獲得係藉由利用一個紫外線（uv)光源。 6. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中一定量之 位在該藥學組成物中的錯合物係要在活體内於一欲予 以映像之组織中予以測定之。 —---！./ 裝 -------訂---------綠,-V (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -43- 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐）