TW321604B - - Google Patents

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321604 A6 B6 五、發明説明（3 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 阻發 以 病一 熱 迄 高自之前基 滑往罾。節 該本 S, 要之 濕 但 已 w 則目究 的已白劑關 用，U 劑 主病 風le, 在 法在研 節。 蕖而 利之½S療 為疾 ，ιρ究 現未驗能因 蘭症 I 效炎 及言^ 治 症的 炎It研 率 經可病 起病 有發 以詳㈣穎 炎難 節^ 行 比 離因的 引之ί發節 剤。 新 生困 ray。 進 者 脱原端 質發質開鼦 礙者81之 發療 性ar病方 患 未其尖 物引物能由 阻聞fo闋 織治 濕in疾多A)然。而 性所症未炎 抗有C-有 組而 風ΡΓ等病M4,、仍劑確 症織炎但節 拮法的病。合詳 性 <0 原 Bro法第正 炎组述，闋 殖方因發者結不 慢 ura膠 _ 方療上 種節上面性 增療起的法的雜 含^ende性 。{，療治跟 各關在方濕 之治的症方髖複 包 fro漫法炎 I 治的能 由壊眼礙風 胞之上濕療人因 為 瀰方節 其效未 偽破著阻性 細病殖風治指病 認SC於療闋 ，有發 炎而究的慢 条原增止之乃為 被),^(對治性HS此發開 節進研等 ， 葉膠胞防 ra 病認 病ert 地的濕丨因開究 两亢發F)究 ：> 皮 ， 子 間性細以有原被 原 e 各效風 ％ 。未研 性常開 研 乃漫制藉劑膠， 膠 f 球有性3¾症尚之 濕異的 往 明瀰抑 *該性群 性1C),全到慢0.病今劑 風殖劑 已 發療閘用用漫候 漫atis去找如之的至藥 性增藥 據 本治有作使獮病 瀰UBU 過未例口難，療‘ 慢胞療 根 劑乃合與 的heos尚 人困圍治。 細治 礙明結及 症 。(rBy今 達療範的礎 膜的 I’ ....................................... ...................裝................訂.........…線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） ό 321604 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（4 ) 組嫌受損，最後顯示两節變形，雖然病因未詳，但已瞭解 下列病態有鼷事項： ⑴某種抗原（例如細菌或病毒）到達鼷節部分引起鼷節 發炎。 ② 變成慢性的醑節炎。 ③ 破壤關節组嫌。 其中第⑵項的變成慢性颶節炎的原因，乃偽闋節的滑 膜細胞異常增殖亢進所致。 同時，滑膜的增殖原因被認為跟剌激滑膜細胞的物質 (例如胞質分裂素等）增加有密切的相關。 從其他的藥爾開發研究而觀現在的風濕症的病因研究 ,慢性風濕性鼷節炎首由未知病原因子經由血液到達鬭節 滑膜，在局部發生免疫反鼴，繼之，從血中流入巨噬細胞 (騰acrophage), T細胞，B細胞，睡中性白細胞（ neutrophile leukocyte)等而展開複雜的慢性炎症，最後 認為破壤到闋節組嫌。本發病過程的重要相關因子，首先 是對於抗原有專一性特殊反應而擔任免疫記憶的T細胞以 及其控制下的B細胞等特殊認知糸統之外，邇有跟慢性炎 症的廣泛開連性的胞質分裂素，接合因子，自身抗體（風 濕症因子），蛋白分解_等非專一性条统，已往研究均著 眼於如何抑制上述糸統而發展。特別是最近在抑制胞質分 裂素和接合因子的作用上全球的研究工作者競相展開積極 地研究。從目前的研究結果而言，上述以T細胞為中心的 免疫反應条統，雖然確實是慢性醑節風濕症的病因的重要 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐) 4 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝 -訂 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 部分，至少和破壞醑節組嫌有直接鼸連者確定是非專一性 滑膜間菜糸細胞。 著眼於上述間葉条細胞，不僅和慢性風藤性鼸節炎有 两，也跟瀰漫性謬原病相颶而受到蘭心和注目。 雖然相藺研究早已進行，但慢性風濕性鬭節炎為首的 瀰漫性膠原病的有效治療藥劑以及其治療方法至今尚未出 現。 本發明乃克服上述已往科技之極限，提供慢性風濕性 闋節炎相鼷獮漫性膠原病的治療上有效的新穎藥_以及使 用該蕖劑的治療方法為目的。 本發明為解決上述問題，提供含有由構成基因顯現啓 動子的TGAGTCA或TGACTCA所成的4?-1核¥酸為特擞的間葉 条細胞之增殖拮抗阻礙劑。 本發明也提供利用投舆上述AP-1核甘酸而治療慢性風 濕性鼷節炎為首的獮漫性謬原病之治療方法。 奮捕；太發明夕驀佯糍式 本發明在基本上以抑制滑膜間葉条細胞而防止關節組 織破壊等病因之發生者。直言之，例如就慢性風濕性翮節 炎而言，不牽涉到雖然反應正確但問題繁雑的T细胞反應 領域，而抑制直接和颶節組鐵的破壊有相關的滑膜間葉条 細胞藉以逹成治療目的者。這種構思乃本發明研究者把握 病因研究結果播創的新穎方法，迄今無文獻記述。 更詳言之，慢性風濕性關節炎的鼸節病變基本上有二 個重要因子。其一為擔任免疫記億的反應条的T細胞，其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格〔210x297公釐) 5" 裝..........—...........-玎.....................^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A6 B6 五、發明説明（6 ) 二為直接和開節破壊有關的滑膜間蒹糸細胞（參考Shiozawi 等人著，Ann. Rheu·. Dis. 51:869, 1992)。後者為血管 翳（pannus)之主要構成因子，生産跟慢性風濕性醑節炎的 滑膜病變有重要關連的介白素-U簡稱IL-1),介白素-6( 籣稱IL-6) , INF α等胞質分裂素（參考Sh iozawa等人， Se·. Arthritis Rheu*. 21:267, 1992)。血管® 乍看具 有類似腫瘍的增殖能力。實際上，將原腫瘍（ protooncogene)的C-fos基因重组在H-2啓動子的下游領域 而成的H2-c-fos轉移鼠（transgenic lice)上引發蘭節炎（ 抗原誘發性鼸節炎），就會誘發僅由滑膜間葉条細胞所致 两節破壤（參考 Shiozawa等人，《I. Innunol. 148:3100, 1992)。c-fos基因賦與滑膜細胞以特殊形態變化[由樹枝 狀細胞（dendritic cell)轉移成纖雒母細胞]以及增殖能 力（參考 Kuroki, Shiozawa等人，J. Rheuaatol. 20:422， 1 993 )。又造種c-fos基因大量出現在慢性風濕性蘭節炎患 者的滑膜上，藉轉染法将人類c-fos基因持鑛顯現在骨母 細胞，會抑制I型膠原的合成以及bRNA的顯現（參考 Kurok i , Shiozawa等人，BBRC , 1 82:1 389, 1 992 ) 〇 上述情形乃暗示不僅c-fos基因之多餘表現剌激滑膜 間蕖条細胞之增殖而直接跟破壤闋節組嫌有鼴，也可能為 慢性風濕性闋節炎引發骨骼粗鬆症的原因。 本發明乃基於c-fos基因待別能活化間葉条細胞的見 解，並研討其作用機制而完成者。 換言之，c-fos蛋白像作用在慢性風滬性蘭節炎發病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公笈) δ 裝丨：：：訂線 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梯準局員工消費合作社印裝 321604 修止 Α玄— A7 B7 五、 發明説E 月< 7 ) 基 因 的 啓 動 子的 AP - 1 部位而 調整 基因 的表 現 為 前 提 者 〇 該 啓 動 子 具 備 下式 構造 • 參 5 ' -GTG TTA CCC TGA GTC AGA GGA GAA -3 曹 3 ' -AAT GGG ACT CAG TCT CCT CTT GGG -5 AP -1部 位 乃 上述 構造 中劃線 所示 之 TGA GTCA部 分 〇 DNA為 雙 股 鏈 $ 但 蛋白 質合 成 時僅 看一 邊， 而在 雙 邊 結 合 以 C - f 0 s蛋白質複合體。 因 此 t 本發 明如 同前述 像以 構成 基因 顯 現 啓 動 子 的 TGAGTCA或 TGACTCA而 成AP-1核甘 酸做 為間 葉 % 細 胞 增 殖 的 拮 抗 阻 礙 劑 0 據 此 > 慢性 風濕 性關節 炎的 發病 得棰 為 有 效 地 抑 制 〇 上 述 AP -1核 f酸 自然 可 以跟 其他 各種 附加 因 子 調 配 而 使 用 〇 本 發 明 藉資 施例 詳細説 明如 下： 窗 例 在 DBA 1/J雄鼠的皮 下組織以3星期的間隔用FCA和 200 i 1 g 的 I 型騵 原進 行2次 免疫 處理 ,從 第 一 次 免 疫 處 理 後 的 2 星 期 後按 每星 期 2次 ，毎 次投 舆如 下 序 列 的 雙 股 鍵 AP -1核 ¥ 酸 5 /i鼸 於腹 腔 ~ 0 5 ' -GTG TTA CCC ΤΠA GTC AGA GGA GAA -3 • 3 · -AAT GGG ACT CAG TCT CCT CTT GGG -5 另 外 利 用 非 專一 性的 雙股鐽 核苷 酸做 為對 照 用 途 0 在 第 2 次 免 疫 處 理 結束 後的 第3星 期就 足部 两節 進 行 病 理 組 嫌 學 上 的 探 討 0 結 果 * 脚墊 的肥 厚 03 . 7 η η) 在實 驗群 有 6/14 例 舉 (43 % )出現， 在對照群為12/16例舉 (75 « ί ) 〇 從 組 雄 學 上 辯 認 有 顯 著 的 炎 症細 胞浸 滴症狀 者在 實驗 群有 7/14 例 舉 (50 « ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7 (修正頁） 321604 A6 B6 五、發明説明（8 ) ，對照群為8/16例舉（50¾)。顯示無傷害性两節炎的例舉 在實驗群有12/14例（86¾ )，但對照群則僅為2/16例舉（ 13¾ )。另外，試驗動物的髏重變化在實驗前後比較之下* 資驗群為151¾，對照群為144¾，二者之間無顯著差異。 另外在試管中的滑膜培養条裡所投與的AP-1抑制了藉由 AP-1部位（site)而作用的介白素- l(interukin-l)等之顯 現条，但對於不藉由AP-1的基因顯現条則無作用，可確知 其具有專一特異性存在。 由上述結果顯示所投與的AP-1核甘酸確能抑制鼠類的 膠原在關節炎病狀下破壤蘭節組織的作用。對於這種有意 地抑制關節組嫌的破壞而言，關節局部的炎症細胞浸潤程 度在實驗群和對照群並無差異。該結果顯示圃節炎時，所 浸潤的炎症細胞不一定直接跟藺節破壤作用有關連，此現 象和前述H2-c-fos轉移鼠在關節破壊下所得滑膜間葉条細 胞功能之結果符合一致。 商鬈h 刹用袢 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由上述詳細說明藉本發明得治療瀰漫性謬原病，尤其 是慢性風濕性鼷節炎在臨床醫學上可期待發揮很大貢獻。 對慢性風濕性關節炎的病因機制之解明或其他慢性炎症性 疾病，或間葉糸細胞之增殖為重要病因的難治病患者的病 因之解明以及其治療方面，都能應用本發並期待其發揮效 果。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公釐）

Claims (2)

1. 32160

   Η3 附件三

   經濟部中央標準局員工福利委員會印製 第82109114號專利申請莱 補充實酴例 (86年2月27曰） CAT分析 1毫升之含2X106鼠科NIH H-rac细胞相當於本案說明 軎中之滑膜培養糸细胞> (H e 11 a , S . , H . M i y a b 〇 t ο，Η . H a r a , N . Takahashi , and H. Hoiiiia. 1 992. ME491/CD63 抗原基因之基因姐结構及5’-側霣調節序列之功能分析， Bioche·. Bi.ophys. Res. Co^aun. 185:436-442)之 TBS ( 25·Μ Tris, 13aM NaC1 , 5Μ KC l , 0.6Μ Na 2 ΗP04, 0.7 bM CaCl2, 0.5麗MMgCl2, PH7.4)與含 50« s Col-TRE/TK CAT通訊霣體之lng/nl DEAE-葡聚糖之TBS溶疲溫和地混合 。混合物在室溫培育30分鐘。Col-TRE/TK CAT(Michael Karin 等人；Cell.第49卷，第 729-739 頁（1987))含有 得自人類膠原_基因之-71至-65之AP-1寡核苷序列，該膠 原基因俩冀接有Hind II /BamHI鍵嫌序列並予無性繁殖至 PBL-CAT2细胞氣徽素乙醮轉移SMCAT)質艨之Hind H/Ban HI位置（Angel，P., M. I*agawa, R. Chiu, B. Stein, R·J . libra, H.J. Rahnsdorf , C . Jonat, P . Herrlich ，及M. Karin, 1987大戟二秸酵SI可誘發之基因含有由 TPA-調節反作用因子辨識之一般顚式元素· Cell 49:729- 739)。洗嫌後，细胞（2.5Χ105/·1)置於35bb碟中並在含 * 或不含AP-1寡核苷下在37t：培育60小時，除了 AP-1寡核节 及Ctrl寡核苷K外，於此CAT分析中所用之雙股DNA寡核甘 為較短態之AP-1寡核甘： 衣紙張尺度逋用中B國家標準（CNS )A4規格（210 X 297公爱) H3 欠yi导 >月> -—*ΑΡ-1β 寡核甘 5 ·-CCCTGAGTCAGA-3， 3 ' -GGGACTCAGTCT-5 * AP-ls 寡核 ϊ 5 ’-CTGAGTCA-3 ’ 3 * -GACTCAGT-5 * 在AP-1共有序列附近之寡核甘序列及TGAGTCA與CAT霣 體（catAP-1寡核¥)之放》子相同之24-»er DNA寡核苷為 5,-GTAGCTTGATGAGTCAGCCGAGAA-3,
2. 3,-CGAACTACTCAGTCGGCTCTTGGG-5, 具有輿CAT霣髓序列（但AP-1共有序列位置（cat -非AP -1寡核苷）除外）相同序列之24-eer寡核ΐ為： S'-GTAGCTTGAGCGTATCGCCGAGAA-S· S'-CGAACTCGCATACCGGCTCTTGGG-S' 對照组之24-ner寡核Ϊ為： 對照組 5'-GTGTTACCCGCCTAAGGAGGAGAA-3' S'-AATGGGCGGATTCCTCCTCTTGGG-S· 使用放射活性 CAT 分析（Gorman, C.M., L.P. Mot’fot, 及B . H . Η o w a「d , 1 9 8 2 .於哺乳動物细胞中表現氣鼸素乙 經濟部中央標準局貝工福利委貝會印製 黼轉移_之簠組基因組，Hoi. Cell. Biol. 2:1044-1051 )或 CAT EL I SA分析（Boehringer Ma ηnhei GbbΗ， Mannhei·,德國）（Porsch, P.· S. Merkelbach， J. Gehlen,及H. Pladung, 1993,非放射活性之氯ft素乙釀 縛移酶-酵素踺明之免疫吸附分析《用於植物原生霣髏中 4 之敢動子活性研究，Anal. Bioche·. 211:113-116)測定 於细胞萃取液中之CAT活性*且兩分析間之结果«導人内 .嫌而予公稱化。於放射活性CAT分析中，藉由切下含未反 本紙張尺度適用中•國家標準（CNS )Λ4規格（210 X 297公漦) 2 修止 H3 Φτ^Γ 應[14C]氣微素及其乙醢化態之區帶並K液體閃爍計數器 测定放射活性量而使结果定量化。於CAT ELISA分析中· 在轉染细胞溶菌後，於Μ抗-CAT抗»塗佈之撤滴定盤中添 加含CAT酵素之细胞萃取液，接著添加地谷新配霣（ digoxigenin)-標犧之對CAT之抗髓。洗滌後，該盤與遇氧 揉織之抗-地谷新配霣抗體反應*接著與含基霣增進劑 (Boehringer Mannhei·)之ABTS基霣溶液反應，並使用微 滴定盤讀取機定ft通氧_酵素之活性，结果示於圖1。 經濟部中央標準局貝工福利委員會印製 張 ，紙 .本

   3 3216(5$ 附 件 H3 痛充 經濟那中央標準局員工福利委貝會印製 ± ^'^0. \ 第82109114«專利申請案 申請専利範園修正本 (86年2月27曰） 一種間葉系细胞之增殖拮抗阻礙用醫藥組成物，其特 徽為含有由構成基因顯現啟動子之TGAGTCA或TGACTCA 而成AP-1核甘酸者。 一種治療膠原病之B藥組成物，其特徵為由申請專利 範園第1項之拮抗阻礙用翳蘗組成物而檐成者。 如申請専利範園第2項之轚藥组成物，係提供慢性風 濕性Μ節炎的治療劑用途者。 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4规格（210 X 297公»)