TW293845B

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Publication number: TW293845B
Application number: TW082100428A
Authority: TW
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1991-12-23
Filing date: 1993-01-20
Publication date: 1996-12-21
Also published as: EP0618924A1; CA2124928C; JPH07502653A; DE69231693T2; DE69231693D1; US5736316A; EP0618924A4; ATE199158T1; EP0618924B1; WO1993013120A1; CA2124928A1

Description

293845 A6 B6 五、發明説明（1 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 技術領域本發明是核酸雜交分析之領域。特言之，其僳有闋用於偵測B型肝炎病毒（H BV)之新穎的核酸探針。背景枝蕗病毒性肝炎是一種条統性疾病，主要涉及肝，且 H BV是幾乎所有血清或長期培育肝炎之主因。 HBV之抗原特性衍自見於病毒表面複雜的蛋白質。命名為a之抗原特異性是所有HBV表面抗原（ HBsAg)所共有的，而另二組互相獨佔的決定子，則造成Η B S A g 4個主要的亞型：adw ayw，adr， ay r 〇

Pasek et al. (Nature 282: 575-579，1979)掲不 HBV基因體DNA ayw亞型之完整的核替酸序列。

Valenzuela e t al. (Animal Virus Genetics, F i e 1 d e t a 1 .，e d s A c a d m i c p r e s s，N Y 1 9 81)報造 HBV adw2亞型DNA之完全的核苷酸序列。經濟部中失標準局K工消费合作社印製 E P A pub No. 0068719 掲示自 adw血清型中，HBsAg之序列及表現。

Fujiyama e t al. (Nucleic Acid Research 11 ： 4601-4610, 1983)掲示血清型 a d r HBV DNA 完整的核苷酸序列。英國專利案No. 2034323A,公告於6/4 /80,描述HBV基因體之分離及選殖，及其於血清中本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） · 1 3 ~ A6 B6 293845 五、發明説明（2) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 偵測Η B V之用法。

Berninger et a 1 . (J. Med· Virol. 9：57-68.1982) 掲示一種以核酸雜交為基礎之分析，其可偵測及定量血清中之HBV，並使用完全的HBV基因體為探針。美國專利案4, 562,159掲示HBV偵測法及測試套組，傜以經選殖之基因體HBV DNA為探針，由DNA雜交而得。共有的美國專利案No. 4， 868,105中描述一種溶液相之核酸三明治式雜交分析法，其中欲分析之核酸先於第一容器中，先與溶液中之經標記探針組及捕獲探針組雜交。之後探針一分析物複合物再轉移至第二容器中，其中含有固化在固相上之探針，其實質上與捕獲探針之片段互補。片段與經固化之探針雜交，因此自溶液中移去複合物。令分析物呈經固化複合物之型式後可助於分析中接下來之分離步驟。最後，經過標記探針組之單股片段與經標記探針雜交後，可經由直接或間接得自標記物之訊號偵測含有分析物之複合物。經濟部中央標準局員工消費合作社印製共有的歐洲第二案（EPA) 883096976掲示與美國專利案4， 868,105中所述分析法不同之變化法。擴大作用中僳使用核酸多體。這些核酸多體是分支之聚核苷酸，其經構築具有一段片段像可專一地與分析物核酸雜交，或與結合至分析物上之核酸（分支或線型的 )雜交，並與專一雜交地經標記探針之第二Η段交互作用。於應用多體之分析中，像依循於第一容器中分析物與標本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） -A - 經濟部中央標準局S工消費合作社印¾ A6 _ B6_ 五、發明説明（3) 記物或擴大探針組及捕獲探針組之雜交之第一步驟，再將複合物轉移至另一含有經固化核酸之容器，其像可與捕獲探針之片段雜交。多體再與經固化之複合物雜交，且經標記之探針再依序與多體上之第二Η段交互作用雜交。由於多體可提供許多供標記探針粘附之位置，由是擴大訊號。所掲示之擴大子及捕獲探針序列有Β型肝炎病原、淋病奈瑟氏球薗、於淋病奈瑟氏球菌中之青徽素及四環徽素抗性、及砂眼表原體〇於1 990年7月27日公告之共有的美國專利案 No. 558，897,描述可用於上述溶液相分析中之大的梳狀分支型多核苷酸多體之製備。此梳狀物在分析中較較小型多體可提供更多之訊號粘附作用。發明之捃示本發明一方面是用於H BV三明治式雜交分析中充作擴大探針之合成的寡核苷酸，其包括核苷酸序列實質上與核酸片段互補之第一片段，及核苷酸序列實質上與寡核苷酸多體互補之第二片段。本發明另一方面是於HBV三明治式雜交分析中充作捕獲探針之合成的寡核苷酸，其包括核苷酸序列實質上與核酸互補之第一片段，及核苷酸序列實質上與結合至固相之寡核苷酸互補之第二片段。本發明另一方面是用於偵測樣品中有HBV存在之溶液相三明治式分析法，其包括：本紙張尺度適用中國园本標準（CNS)甲4規格（21〇 X 297公货） (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) i裝· •訂. A6 B6 經漓部中央標準局員工消费合作社印？农五、發明説明（4) (a) 將樣品於雜交條件下與過量的下列接觸，（i )一種擴大探針寡核苷酸，其包括核苷酸序列實質上與 HBV核酸片段互補之第一片段，及核苷酸序列實質上與核酸多體之寡核苷酸單位片段之第二片段，及（i i) 一種捕獲探針寡核苷酸，包括核苷酸序列賁質上與HBV 核酸Η段互補之第一片段，及實質上與固化至固相上之寡核苷酸互補之第二Η段； (b) 在雜交條件下將（a)步驟之産物與結合至固相上之該寡核苷酸接觸； (c) 之後分出未結合至固相之物質； (d) 在雜交條件下將（c)步驟之經結合産物與核酸多體接觸，該多體包括實質上互補於擴大探針多核苷酸之第二片段之至少一種寡核苷酸單位，及實質上互補於經標記寡核替酸之許多第二種寡核苷酸單位； (e )移去未結合之多體； (f)在雜交條件下將（e)步驟之固相複合物産物與經標記之寡核苷酸接觸； (s)移去未結合之經標記之寡核苷酸；及 (h) 於（g)步驟之固相複合物産物中偵測標記物之存在。本發明另一方面是用於偵測Η B V之套組，包括用於偵測樣品中Η Β V之套組，包括混合 (i) 一組擴大探針寡核苷酸，其中擴大探針寡核苷本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦） -6 — (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 附许二（A) 第8210〇428，號專利中猜案中文说明嘗修正霣 A? 民颺 B7 JLO ·*"* ..··*— *** T | 五、發明説明（5 ) 酸包括核苷酸序列實質上與Η B V核酸片段'乏ΐί —片段，及核苷酸序列實質上與核酸多體之寡核苷酸單位互補之第二片段： (i ί—組捕獲探針寡核苷酸，其中捕獲探針寡核g 酸包括核替酸序列實質上與HBV核酸互補之第一片段，及實質上與結合至固相之寡核苷酸互補之第二片段： (i i i )酸多體，該多體包括實質上互補於擴大探針多核苷酸第二片段之至少一種寡核苷酸單位，及實質上互補於經檫記寡核苷酸之許多的第二寡核苷酸單位：及 (i v —種經檫記之寡核苷酸。基於此中所揭示的，這些及其他的具體實例對—般精藝者應是淺顯的。圓式簡單說明附圓三明治雜交分析法，利用多個分析物特定之獲探針及擴大探針。如下所示序列表中符號之意義： ^ 裝—. 訂 I 夕 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製本紙張尺度遑用中國國家橾牟（CNS } A4規格（210X297公釐） 293845

_____；_B7 M R S 五、發明説明（) L„ 1 . 代表意義 R..·.·........... A_G A M T/U c或G c 或 t/u ! G 或 T/U A 或C 或 G: r|IXT/U i A或C或T/U;沸 A 或 G 或 T/U:#rC C 或 G 或 T/U:.非Γ： A (A或C或<3或T/U)或知濟其您1咏） · W............... S................. V.................. K.................. V................ Η................. D.................i B................:· N................. • _l 1 . (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央棣準馬員工消費合作社印製童行本發明夕方法 ~溶液相核酸雜交分析#意指於共有的美國專利案 1^〇.4，868，105及£?八883096976 中所述及申請專利範圍之分析技術。 |經修飾之核苷酸/意指可穩定地納入多核苷酸中之梭苷酸單《，且其具有額外的官能基。較好，經修飾之核苷酸是5 - —胞嘧啶核苷，其中N4 —位置經修飾以提供官能性羥基。 %擴大子多體#意指一種分支之多核苷酸，其可同時值接或間接地雜交至分析物核酸及許多多核苷酸交互作用本紙張尺度遑用中國國家·橾隼（CNS ) Λ4说格（210X297公釐） 7 經濟部中央標準居員工消#合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明（6 ) 上（即是另一多體之交互作用或經標記探針之交互作用）。多髏上之分支可由共價鍵結達成，且多體由二型寡核苷酸單位組合，其可分別雜交至分析物核酸或雜交至分析物核酸及許多經標記探針上。此種多體之組合物及製備，描述於EPA 883096976及美國糸列No. 558，897 (公告於1990年7月2 7日），其掲示均列為本案參考。 *擴大探針〃一語意意表分支或線型之多核苷酸，其經構築可具有與分析物核酸可專一性雜交之片段，且可與專一雜交至擴大多體之第二Η段交互作用。 ν捕獲探針〃意指一種寡核苷酸，其具有可實質上與標的DNA之核苷酸序列互補之片段，及實質上與固化在固相之探針核苷酸序列互補之片段。 '"大"於此中所用的係描述本發明之梳狀分支多核苷酸，意指具有至少約15個分支位置及至少約20個經標記探針結合序列之交互作用之分子。 a梳狀"於此中所用的是描述本發明分支多核苷酸之結構，意指具有線型架構之多核苷酸，並自骨架中伸出許多側鏈。 “可解離之鏈結子分子〃意指可穩定納入多核苷酸鍵中之分子，且其包括可為化學處理或物理處理打斷或解離之共價鏈，如經由照射。此中所掲示的所核酸片段均以5/至3/方向書寫出來。核苷酸之設計依IUPAC—IUB生化命名協會之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） _ 8 — ------------------------裝---!---.訂 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（7 ) 核苷酸符須而定。溶液相雜交分析以下為溶液相三明治式雜交法之一般策略。分析物核酸與過量的二種單股核酸探針組，共置於微滴定孔洞中： (1) 一組捕獲探針，各自具有實質上互補於分析物之第一結合序列及實質上互補於結合至固相載體上之核酸之第二結合序列，如孔洞表面或珠粒，及（2) —組擴大探針 (分支或線型的），各自具有可專一地結合至分析物之第一結合序列，及可專一地結合至多體片段之第二結合序列。也虚放崖物是經其第一結合序刭，二暴钍雜_^^北班物之三組份核酸複合物。探針之第二結合序列因未同時互 ______ ~·——~ . 補至分析物，故保留呈單股Η段。此複合物經由捕獲探針之第二結合序列而雜交至固化在固相表面之探針上。圭之産物包$經由雙體結合至固相表面之複合物，此雙體像由結合至固相表面之寡核苷酸及捕獲探針之第二結合序列所形成的。未結合之物質再自表面中除去，如利用洗滌。之後再於雜交條件下，將擴大作用多體加至經結合之複合物上，使多體可雜交至複合物擴大探針中可應用之第二結合序列上。再自任何未結合多體中以洗滌分出所生成之複合物。於條件下再加入經標記之寡核苷酸，以雜交至多體之實質上互補的寡核苷酸單位上。再洗滌所生成之經固化經標記核酸複合物，以除去未結合之經標記寡核苷酸 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) —裝. .•訂. 乂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） -9 - 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 ^'^3845 A6 ____B6_ 五、發明説明（8) 分析物核酸可得自各種來源，如生物流體或固體粒子，且可製備以用於各種方法之雜交分析中，如蛋白酶K/ SDS、離液序列高之塩類，等。同時，減小分析核酸平均大小是有益的，可採用酵素性、物理性或化學方法，如限制酶、音波震盪、化學降解（如金屬離子）等。片段可小至O. lks,通常至少約0. 5kb,且可大於1 kb。於分析時分析物序列呈單股型式。當序列以單股型式自然存在，則變性將不需要。然而，當序列呈雙股型式，序列應予以變性。變性可以各種技術來進行，如鹼，通常為由約0. 05至Ο. 2M之氫氧化物、甲醯胺、塩類、熱、酵素、或其混合。實質上互補於分析物序列之捕獲探針及擴大探針之第一結合序列，各自至少15個核苷酸，通常至少25個核苷酸，且不多過約5kb,通常不多過約1 kb,較好不多過約1 ◦0個核苷酸。其通常約3 ◦個核苷酸。其通常經選擇以結合至分析物之不同序列上。第一結合序列可基於各種考慮來選擇。依據分析物之本質，將可著眼於一致片段、與多型性有關之片段、特殊之表現型或基因型、特殊之品条、或其他。所使用之不同擴大及捕獲探針之數目會影響分析之靈敏性，因為使用愈多的序列，由分析糸統提供之訊號愈大。再者，使用愈多之探針序列可使用更為通切之雜交條件 ,由是減少偽陽性結果之發生。因此一組中探針之數目，為至少一種捕獲探針及至少一種擴大探針，更好是二種捕本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 2耵公釐） -10 - -----------------ο------裝—-----.訂 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) A6 B6 五、發明説明（9) 獲及二種擴大探針，且最好5 - 100種捕獲探針及5 - 100種擴大探針。 HBV之探針設計如下。EPA 88309676掲示一組由Gen Bank所報告的9種 H BV亞型DNA序列經由排列而設計之Η B V探針組。接下來的實驗分析説明，這些探針像互補於HBV不完全雙股區之次基因體股（即正股），因此，這些探針不同的子集與不同的病毒雜交，因為次基因體股之長度各種株中有異。因此，再設計探針組使包括實質上互補於HBV基因體一長段（即負股）之序列，且含較少之空間區域，以包括更多的寡核苷酸於探針組中，由是可增加分析条統之靈敏度。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) .裝· 一般而言，選擇HBV分離物中有最高同質性之區域為捕獲探針，而較少同質區為擴大探針。因此可應用更多的HBV株或分離物，由新株或分離物之序列與用來設計本發明探針之核苷酸序列排列可設計適當之探針，並選擇有最高同質性之區域充作捕獲探針，而更少同質性之區域為擴大探針。目前較佳之探針組，及其捕獲或擴大突出區，即，與固化在固相載體上之序列，或擴大多雜交之區域，均列於實例中。選擇捕獲探針及擴大探針之第二結合序列，使其實質上分別互補於結合至固相表面之寡核苷酸，及多體之片段，且如此不為樣品/分析物中之内源序列遇到。第二結合序列可接於第一結合序列，或由中間之非互補片段隔開。本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公笈） -11 - A6 B6 五、發明説明（1〇若必要時探針可包括其他的非互補序列。這些非互補序列必須不可阻礙結合序列之結合，或造成非專一性結合。捕獲探針及擴大探針可以寡核苷酸合成步驟，或以選殖法製備，較好是前者。要了解，結合序列未必要完美的互補，以生成同二體。在許多狀況下，雜二體己足夠，其中少於10%之鹼基配對錯誤，可忽視5個以上核苷酸之環。因此，於此中所用的'、βΜ .之；1補，其中在結合區中的每一鹸基確實地相當，且、'實質上互補〃意指9〇疼Μ ±趾質。經標記之寡核苷可包括實質上互補於多體重覆寡核苷酸單位之序列。經標記之寡核苷酸包括一種以上之分子（ ”標記物〃），其直接或間接地提供可偵測之訊號。標記物可結合至實質上互補序列之個別成員，或可呈末端成員或具許多標記物之末端尾部型式存在。將標記物結合至寡核苜酸序列之各種方法，文獻中已有述。如見，Leary e-t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80：4050; Renz and Kur z * Nuc1 > Acids Res· (1984) 12 * 3435 ； R — -----------------------裝-------·" (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i chardson and Gumport，Nuc 1 Acids Res· (1983) 11 : 616 7 ϊ Smith e t a 1 . , Nuc1 « Acids- Res· (1985) 13 : 2399； Meinkoth and Wahl, Anal· B i ochem· (1984) 138 :267。標記物可共價或非共價地結合至實質上互補序列上。可應用之標記物包括放射核種、螢光劑、化學發光劑、染料、酵素、酵素受質、酵素輔因子、酵素抑制劑、酵素亞單位、金屬非子及其他。可說明之特殊標記物包括：螢本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货〉經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（1]) 光素、若丹明、德州紅、藻紅朊、缴形酮、魯米諾、 NADPH、α -々一半乳糖苷酶、择菜過氧化酶、鹼性磷酸酶等。捕獲探針及擴大探針對預期莫耳分析物之比率，各自至少為化學計量，且較好過量。此比率較好至少約1 . 5 :1,且更好至少2: 1。通常在由2: 1至106 : 1 之範圍中。各個探針之濃度通常由約1 0_5至1 0~SM, 樣品核酸濃度由1 0_2i變化至1 0<2 Μ。分析中雜交步驟通常花費10分至20小時，較好可在1小時内完成。雜交在略升高之溫度下進行，通常由約2 0 °C至8 Ot：，更常是由約3 5 °C至7 ◦ °C，特別是6 5 °C。雜交反應通常於水性介質中進行，特別是經缓衝之水性介質，其中包括有各種添加物。可應用之添加物包括低濃度之去污劑（◦. 01-1%)、塩類、如檸檬酸鈉（ 0. 0 17至0. 17M)、Ficoll、聚乙烯吡咯啶酮、載體核酸、載體蛋白質等。非水性溶劑可加至水性介質中，如二甲替甲醯胺、二甲亞硕、醇類、及甲醯胺。這些其他溶劑之含量通常由2至5〇%。可以溫度、塩濃度、溶劑条統及其他，控制雜交介質之迫切度。因此，依據重點序列之長度及本質，可變化迫切度。依據標記物之本質，可應用各種技術以偵測標記物之存在。於螢光劑時，可應用各種不同的螢光計。配合酵素，可提供螢光、化學發光或有色産物，且以螢光、化學發本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货) _飞3 - ------------------------裝—.—‘訂 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消赍合作社印製 A6 B6 五、發明説明〔1¾ 光、分光光度或目視法決定。已應用於免疫分析中之各種標記物，及可應用至免疫分析之技術，均可應用於本分析中。依據本發明，進行經擴大核酸雜交分析之套組，包括下列試劑之包裝組合：擴大探針或探針組；捕獲探針或探針組；擴大多體；及適當的經標記寡核苷酸。這些試劑通常於套組之分別容器之中。套組中也可包括將分析物變性之變性試劑、雑交缓衝溶液、洗液、酵素受質、陰性及陽性控制組、及進行分析之書寫指示。以下實例說明本發明。這些實例不欲以任何方式限制本發明。

奮例管例I 梳狀分守多核g酴夕合成此實例說明具有15個分支位置及三個經標記探針結合位置之側鏈伸展之梳狀分支多核苷酸之合成。.此多核苷酸經設計可用於EPA 883096976所述之溶液相雜交方法中。寡核苷酸的所有化學合成，均於自動DNA合成儀上進行（Applied Biosystems, Inc., (ABI) 3 8 0 B 機型 )。使用/3 —氡基乙基型之胺基磷酸酯化學，包括應用P-hos tel 〃試劑（ABN)之5 / —磷醛化作用。除了另有所示，使用標準的ABI策略。當指示使用許多循環時（本紙張尺度適用中S國家標準（CNS〉甲4规格（210 X 297公货） _ 14 — -----------------ο------裝-------" (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局β工消费合作社印5Ϊ A6 B6 五、發明説明（13 如12個循環），於所示循環中應用由ABI提議之許多標準量之胺基磷酸酯。此中所附加的是於Applied Biosy-stems 3 8 0 B型DNA合成儀上進行1. 2及6. 4循環之程式。先製備以下結構之梳體： 37Τ18(TTX,)15GTTTGTGG-5#

I (RGTCAGTp-5,）15 其中是分支的單體，且R是高碘酸塩可解離之鏈結子。以1. 2循環策略，使用33. 8毫克之胺丙基一衍生化之胸苷控制孔玻璃（CPG) (2000A,每克載體有7.4徹莫耳胸苷），先合成經由15 (TTX>)重覆子之梳體部份。分支位置之核苜酸具下式： bactbooc-

ckbooc 其中R 2代表

於合成梳體（不包括側鍵）時，/3-氡基乙基胺基磷酸酯單體於A、C、G及T時之濃度為◦. 1M,於分支本紙張尺度適用中囷國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -----------------------裝---Γ---.訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中*標準居員工消1?合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明（14 位置單體E為Ο. 15M，及Ph〇stelr«試劑為〇 . 2 Μ 。於去保護作用過程中，利用逐步之流過以3%三氣醋酸 /二氣甲烷進行去三苯甲基化作用。結論為DMT以乙醯基取代。如下於每一分支單髏位置處合成化式3 > -RGTCAGTp (SEQ ID NO:1)之可解離鍵結子R及六鹼基側鐽伸展作用。手工進行鹼基保護基之去除（於上式中之R2 ),同時保留於合成梳體相同管柱中之CPG載體。於R2 =乙醯丙醯基之例子時，引入 0. 5M水合肼於吡啶/冰醋酸（1 : lv/v)之溶液，並保持與CPG載體接觸90分鐘，並每15分鐘更新液體，再以吡啶/冰醋酸（1 : 1 v/v)及後的乙腈充份洗滌。一旦將可解離鏈結子R去保護後，可利用 6 . 4循環加入六鹼基側鍵之伸展。於這些合成中，胺基磷酸酯之濃度為◦. 1M (除了 0 . 2 M R 及 Phostel7^ 試劑；R 為 2，3-二（苄醛氧基）丁氧基）苯基）乙基一 2 -氰乙基—Ν，N -二異丙基胺基磷酸2— (4— (4 — （2—二甲氧基三苯甲基氧基）乙基）苯氧基酯）。以3%三氯醋酸/二氣甲烷之溶液，利用連續流過以達成去三苯甲基作用，之後以甲苯/氯甲烷（1 : 1 v / v )溶液潤濕。於3 8 ◦及中利用''' C E N Η , 〃循環，自動地將分支之多核苷酸鏈自固相載體上除去。氫氧化銨溶液收集於4毫升有螺蓋之Wheaton小瓶中，並在 ---------r-------ό------裝---.---•訂 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -16 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 ___B6_ 五、發明説明（13 60*0下加熱12小時以除去所有的鹼基保護基。冷卻至室溫後，溶劑於高速真空蒸發器中除去，殘留物則溶於 1 ◦ 0微升水中。 .也利用自動合成儀，進行以下結構之3-骨架伸展（片段A)、側鏈伸展及連接模板/鏈結子： 3’架構伸展 3 ' -TCCGTATCCTGGGCACAGAGGTGCp-5 1 (SEQ ID N0：2) 側鏈伸展 3 ' -GATGCG(TTCATGCTGTTGGTGTAG) 3-5 ' (SEQ ID NO： 3) 用於鏈結 3 ’架構伸展之連接模板 3 ’-AAAAAAAAAAGCACCTp-5 ’ (SEQ ID N0：4) 用於鏈結側鏈伸展之連接模板 3’-CGCATCACTGAC-5’ (SEQ ID NO：5) 粗製的梳體以標準的聚丙烯醯胺凝膠（7 %加上7 Μ -----------------------裝———*" (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（Cis’s>甲4規格（210 X 297公货〉 -17- 4 4 經濟部中央標準局R工消费合作社印製 A6 B6

i、發明説明（IQ 尿素，及IX TBE操作缓衝溶液）方法純化。如下將3/架構伸展及側鏈伸展連接至梳體上。梳髏 (4徹徹莫耳/微升）、3 >架構伸展（6. 25微撤莫 1、側鏈伸展（9 3 . 7 5微微莫耳/微升）、側鍵鏈結楔板（75徹微莫耳/微升）及架構鍵結模板（5微微莫耳/微升）混合於ImM ATP/5mM DTT/ 5 〇 m M Tris-HCl, ρΗ8. 〇/l〇mM MgC12/2mM亞精胺中，並加上Ο. 5單位/徹升之丁4多核苷核激酶。混合物於3 7 t：下培育2小時，再於水浴中加熱至9510，之後缓慢冷卻至3 5°C以下歴1 小時。加入 2mM ATP、1 0 m M DTT、14% 聚乙二醇，及Ο. 21單位/微升T4連接酶，混合物在 23°C下培育16 — 24小時。DNA沈澱於NaCi?/ 2*醇中，懸浮於水中，再接受如下之第二次連接作用。混合物調整至ImM ATP, 5 m M DTT、14%聚乙二醇、50mM Tris-HC5, pH7. 5, 1 0 m M MgCj?2、2mM 亞精胺、0.5 單位 / 微升T4多核苷酸激酶且加入0. 21單位/徹升T4連接酶，且混合物於23 °C下培育1 6 — 24小時。連接産物以聚丙烯醯胺凝膠電脈純化。經過鏈接及純化後，部份産物標以32P，並在R位置接受解離，僳以N a I 0 4水溶液氧化1小時而達成。樣品有以PAGE分析以決定所納入之側鏈伸展數目，像定量凝膠中帶上之放射活性探針。發現産物共有4 5個經標 --------U----Γ----ο------裝——"----^ -玎 (請先閲#面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公货） -18 - 經濟部中央標準局員工消t合作社印製 A6 B6 五、發明説明（17 記之探針結合位置。實例2:HRV^DNA雜交分析於此實例中使用、、15X3 "擴大之溶液相核酸三明治式雜交分析型式。〜15X3 "之設計衍自此型式應用二種多體之事實：（1)擴大探針具有可結合至CMV之第一片段（A)，及可雜交至（2 )擴大多體之第二Μ段 (Β),此擴大多體（2)具有可雜交至片段（Β)之第一Η段（Β*),及15個片段（C)之交互作用，其中片段（C)雜交至三個經標記之寡核苷酸。擴大及捕獲探針片段，及其個別於本分析法中之名稱如下。 ----------------ό------^-------..玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐） -19 - 五、發明説明（# ) Η B V 擴大探針 A6 B6 HBV.104* (SEQ ID NO:6) TTGTGGGTCTTTTGGGYTTTGCTGCYCCWT HBV.94* (SEQ ID NO:7) CCTKCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTT HBV. 76* (S.EQ ID NO:8) TCCATGGCTGCTAGGSTGTRCTGCCAACTG HBV.87* (SEQ ID NO:9) GCYTAYAGACCACCAAATGCCCCTATCYTA HBV.45* (SEQ ID NO :10) CTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGT HBV.93* (SEQ ID NO:11) CATGGAGARCAYMACATCAGGATTCCTAGG HBV.99* (SEQ ID NO:12) TCCTGGYTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT HBV.78* (SEQ ID NO:13) GGCGCTGAATCCYGCGGACGACCCBTCTCG HBV.81* (SEQ ID NO:14) CTTCGCTTCACGTCTGCACGTHGCATGGMG HBV.73*070590-C (SEQ ID NO:15) (揞先閲讀背面之注意事項再填寫夂經滴部中央標準局員工消f合作社印製本紙張尺度適用中國园家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公坌）五、發明説明（/彳） A6 B6 經濟部中央標準局S工消費合作社印製

GGTCTSTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAA.CC HBV.77^070590-b (SEQ ID N0:16> CCTKCGCGGGACGTCCTTTGTYTACGTCCC HBV.D44*070590-A (SEQ ID NO:17) MCCTCTGCCTAATCATCTCWTGTWCATGTC I HBV.79* (SEQ ID NO:18) CGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGG HBV.82* (SEQ ID NO:19) TGCCCAAGGTCTTACAYAAGAGGACTCTTG HBV.71* (SEQ ID N0:20) CGTCAATCTYCKCGAGGACTGGGGACCCTG HBV.102* (SEQ ID NO:21) ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAMTTCCAGGA HBV.101* (SEQ ID NO:22) ATCTTCTTRTTGGTTCTTCTGGAYTAYCAA HBV.10Q* (SEQ ID NO:23) ATCATMTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC HBV.98* (SEQ ID NO:24) CAATCACTCACCAACCTCYTGTCCTCCAAY HBV.97* (SEQ ID NO:25) GTGTCYTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC HBV.96* (SEQ ID NO:26) CTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG -------------.-----------裝-------•訂A (請先閲f面之注意事項再埸寫本頁) 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公浚） 21 五、發明説明〇>〇 ) A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

HBV.95* (SEQ ID NO:27) GACAAGAATCCTCACAATACCRCAGAGTCT HBV.92* (SEQ ID NO:28) TTTTGGGGTGGAGCCCKCAGGCTCAGGGCR HBV.91* (SEQ ID NO:29) CACCATATTCTTGGGAACAAGAKCTACAGC HBV.88* (SEQ ID NO:30) ACACTTCCGGARACTACTGTTGTTAGACGA HBV.86* (SEQ ID NO:.31) GTVTCTTTYGGAGTGTGGATTCGCACTCCT HBV.D47* (SEQ ID NO:32) TTGGAGC^iWCTGTGGAGTTACTCTCKTTTT HBV.D46* (SEQ ID NO:33) TTTGGGGCATGGACATYGAYCCKTATAAAG HBV.85* (SEQ ID NO:34〉 AAWGRTCTTTGTAYTAGGAGGCTGTAGGCA HBV.84* (SEQ ID NO:35) RGACTGGGAGGAGYTGGGGGAGGAGATTAG r HBV.83* (SEQ ID NO:36) CCTTGAGGCMTACTTCAAAGACTGTKTGTT HBV.80* (SEQ ID NO:37) GTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGWCCGTGT HBV.75* (SEQ ID NO:38) AGCMGCTTGTTTTGCTCGCAGSMGGTCTGG HBV. 74* (SEQ ID NO·· 39) GGCTCSTCTGCCGATCCATACTGCGGAACT ----------------------裝------•訂 (特先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)肀4規格（210 X 297公釐）五、發明説明（21) A6 B6

HBV.72* (SEQ ID N0:40) MTKAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGG HBV.51* dSEQ ID N0:41) GTGGCTCCAGTTCMGGAACAGTAAACCCTG HBV.67* (SEQ ID N0:42) KAARCAGGCTTTYACTTTCTCGCCAA.CTTA HBV.70* 062890-A (SEQ ID NO:43) CCTCCKCCTGCCTCYACCAATCGSCAGTCA HBV.65* (SEQ ID NO:44) ACCAATTTTCTTYTGTCTYTGGGTATACAT H B V捕傅揲針 -------I---.----o------裝---·-玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 HBV.60* (SEQ ID NO:45) TATTCCCATCCCATCrTCCTGGGCTTTCGS HBV.64* (SEQ ID NO:46) TATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAG HBV.63* (SEQ ID NO :47) CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTC HBV.62* (SEQ ID NO:48) GCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG HBV.61* (SEQ ID NO:49) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） -23 - A6 B6 經濟部中標員工消費合作社五、發明説明（23 CCTATGGGAGKGGGCCTCAGYCCGTTTCTC HBV.89* (SEQ ID NO:50) GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCG HBV.90* (SEQ ID NO:51) ACGMAGRTCTCMATCGCCGCGTCGCAGAAGA HBV.D13* (SEQ ID NO:52) CAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATYCC HBV.D14* (SEQ ID NO:53)

GACTCATAAGGTSGGRAACTTTACKGGGCT 每一擴大探針，除了實質上互補於HBV序列之序列外，尚含有互補於擴大多體片段之下列5/伸展， AGGCATAGGACCCGTGTCTT (SEQ ID NO:54)· 每一捕獲探針，除了實質上互補於HBV DNA之序列外，尚含有互補於結合至固相DNA之下列下游序列 (卽互補於X T 1 *), CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (SEQ ID NO:55) · 一^國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐 -----------------ο------裝-------'玎 (請先面之注意事項再填寫本頁) ^<^3845 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五 '發明説明（23 微滴定盤之製備如下。自Dynatech Inc.購得White Microlite 1 Removawell長條（聚苯乙稀微滴定盤，9 6 孔洞/盤）。各個孔洞充填以IN HC{2〇0微升，並在室溫下培育1 5 — 20分。之後以1 XPBS洗盤4 次，且吸取孔洞以移去液體。孔洞再充填以1N NaOH200撤升，並於室溫下培育15—20分。盤再次以1XPBS洗4次，且吸取孔洞以移去液體。多（phe—lys)購自 Sigma Chemicals， Inc· 。此多肽具1 : 1莫耳濃度比率之Phe : 1 ys，且平均分子量為每莫耳47, 900克。其具有309個胺基酸之平均長度，且含155胺/莫耳。1毫克/毫升之多肽溶液與2M NaCj/ixPBS混合至0.1毫克 /毫升（PH6. 0)之終濃度。取此溶液100徹升加至各孔洞。盤再覆以塑膠膜以避免乾燥，並於3 ου下培育一夜。之後盤以1XPBS洗4次，並吸取孔洞以除去液體。使用以下步驟以偶合寡核苷酸XT 1 #至盤中。 XT1*之合成述於 EPA 883096976。20 毫克的辛二酸二琥珀醯亞胺基酯溶於3 0 0微升的二甲替甲醯胺（DMF)中。26 0D2<?。單位之XT1*加至100微升的偶合缓衝溶液中（50mM磷酸鈉，pH 7. 8)。再加偶合混合物至DSS — DMF溶液，並以磁性攪拌器攪拌30分。NAP — 2 5管柱，以10mM 磷酸鈉PH6. 5平衡。於4¾下，偶合混合物DSS— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货) -2义二 " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（24 DMF溶液加至2毫升16mM磷酸鈉，pH6. 5中。混合物渦旋以混合，並填料至已平衡之NAP—25管柱中。以DSS—活化之XT1米 DNA以3.5毫升 10mM磷酸鈉，pH6. 5溶離出管柱。 5. 60Dw。單位之經溶離的DSS -活化之XT1* DNA加至1500毫升50mM磷酸鈉，pH7. 8中。此溶液取5 ◦徹升加至各孔洞，且盤培育一夜。盤再以 1XPBS洗4次，且吸取孔洞以除去液體。盤最終之汽滌完成如下。含0. 5% (w/v) SDS之200微升Ο. 2N Na〇H加至各孔洞。盤再覆以塑膠膜並於65 °C下培育60分。之後以IX PBS洗盤4次，再吸取孔洞以除去液體。經汽滌之盤加上乾燥劑小珠貯於2—8C下。樣品之製備包括將12. 5徹升之P — K緩衝溶液（ 2毫克/毫升蛋白酶K於1 OmM T r i s - H C i?, pH8. 0/0. 15M NaC^/lOmM EDTA, pH8. 0/1% SDS/40撤克/毫升經音波震盪之鞋魚精子DNA)遞送至各孔洞，之後每孔洞加入10微升於DMEM/10%FCS之各受試樣品。HBV DNA標準曲線之製備，偽將經選殖之HBV 、亞型adw、 DNA稀釋於HBV陰性之人類血清中，並將各份稀釋液遞送至各孔洞，使相當於1〇〇〇、 3〇0〇、10， 000、 30, 000 或 100, 000分子。加純化的DNA或感染細胞至各孔本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） ~ 26 ~ --------U--------ο------裝------- (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 __ 五、發明説明（23 洞，以進行與異質DNA之交叉一雜交試驗。各有機物之量示於表中。盤加蓋，並攪動以混合樣品，再於65¾下培育以釋出核酸。將HBV專一性擴大及捕獲探針（上述）之摻合液加至各孔洞（5毫微微莫耳/孔洞，於1 N N a Ο Η中）。盤加蓋，緩和攪動以混合試劑，再於65¾下培育30 分。再加中和作用缓衝溶液至各孔洞（0. 77M的3 — (N —嗎福啉基）丙烷磺酸/1. 845M NaCi?/ 0. 185M檸檬酸鈉）。盤加蓋，並於6 5Ό下培育 1 2 — 1 8小時。攪動各孔洞之内容物，以移去所有流體，孔洞再以洗將缓衝溶液（0. l%SDS/0. 015M NaC义 /0. 0015M檸檬酸鈉）洗滌2次。再加擴大多體至各孔洞（3 0毫微徹莫耳/孔洞，於 4XSSC/0. l%SDS/〇.5% 阻斷試劑（丑〇6-hringer Mannheim，Cait No. 10961767)。盤子加蓋後並攪動以混合孔洞之内容物，盤再於5 5 °C下培育3 0分鐘〇經室溫下再5—10分鐘後，孔洞如上述般洗滌。之後將掲示於EP 883096976中之鹼性磷酸酶標記探針加至各孔洞（2. 5毫微微莫耳於40微升 /孔洞）。經55t!下培育1 5分鐘後及室溫下5 — 1 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）一27 — -------------Γ----ο------裝——------訂 (»-先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2^384^ A6 B6 五、發明説明（20 分鐘後，孔洞如上述地洗二次，再以〇. 015Μ N a C又/ 0 . 0 0 1 5 Μ檸檬酸鈉洗3次。應用得自Lumigen, Inc之酵素啓動之dioxetane ( S-chaap et a 1 · , Tet· Lett. 1 9 1 9 8 7 ) 2 8 : 1159-1162 及 EPA Pub. No. 0 2 54 0 5 1。偵測步驟如下。加3 0微升之Lumiphos 5 3 ◦ ( Lumigen )至各孔洞。孔洞輕拍使試劑落至底部，再缓和旋轉以將試劑均勻分佈於底部。孔洞加蓋，並在37 °C下培育40分鐘。盤於Dynatech ML 1000發光計中讀取。於反應中當産生之光完全積分則示出産量。結果示於下表。以陰性控制組之平均加2値標準偏差及樣品之平均或2個標準偏差（δ)間之差異來表示各標準樣品之結果。若δ大於◦，樣品被視為陽性。結果顯示這些探針組自異質有機體中分別HBV DNA之能力，及約1〇00—30〇0HBV分子之靈敏度。 ------------：----ο------裝------.訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標箏扃員工消费合作社印制取本紙張尺度適用中國圉家標準（CNS〉甲4规格（210 X 297公釐） -28 - A6 B6 五、發明説明（27 表„ 經濟部中央標準局員工消CH合作社印製樣品量 δ HBV lxlO5 25.99 HBV 3xl04 6.51 HBV lxlO4 3.00 HBV 3xl03 0.93 HBV lxlO3 -0.20 控制組 — — HCV 8xl05 -0.39 CMV1 3.3x10s -0.48 HTLV-II2 lxlO5 -0.07 HTLV-I2 lxlO5 -0.23 HIV lxlO7 -0.31 PBR325 lxlO7 -0.27 血鏈球菌 lxlO7 -0.31 動物醸膿鏈球菌 lxlO7 -0.36 肺炎鏈球菌 lxlO7 -0.38 糞鏈球菌 lxlO7 -0.28 無乳鏈球菌 lxlO7 -0.26 流行鏈球菌 lxlO7 -0.31 金黃色葡萄球菌 lxlO7 -0.34 粘質沙雷氏菌 lxlO7 -0.30 -----------------ο------裝-------.玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） ~ 29 ~ 經濟部中央標準局8工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（2d 緣膿捍菌 lxlO1 2 3 4 5 6 7 -0.23 奇異變形菌 lxlO7 -0.43 厭氧消化鏈球菌 lxlO7 -0.46 嗜酸乳桿菌 lxlO7 -0.33 肺炎克雷伯氏菌 lxlO7 -0.12 流感嗜血菌 lxlO7 ~0.34 大腸埃希氏菌 lxlO7 -0.44 産氣腸桿菌 lxlO7 -0.23 麻瘋分枝桿菌 lxlO7 -0.18 -----------------ο------裝------ (1先閲讀食面之注意事項再塡寫本頁) 1 .表示感染細胞中之P f U 2.表示前病毒套數 2 上述進行本發明模式之變化，對於精於生化學、核酸雜交分析及相關領域之人士是淺顯的，且意欲包括在以下申請專利範圍之内。序列表 3 (Γ) 一般資料 4 (i )申請人：Irvine，Bruce D.

Kolberg ， Janice A.

Running, Joyce A . 5

Urdea，Michael S. 6 (i i)發明標題：用於溶液相三明治式雜交分析内之 7 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格（21〇 X 297公® ) 二30 - — 一~ 附件三A : 第82100428號專利申請案中文說明書修正頁 B7 民國84年4月修2 中 ^ 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製五、發明説明（抑-丨）修正如下所示序列表中符號之意義：符撕代表意義；-— R····.............. Α或G ' W................. A 或 T/U S.................. C或G V.................. C 或 T/U K.................. G 或 T/U V.................. A或C或G·，非T/U Η.................. A或C或T/U;非\ G D.................. A或G或T/U:非C Β ·_··..·........... C或G或T/U;非A Ν.................. (A或C或G或T/U)或（·未，知或其它 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -裝. I T :-° '線 ^'^3845 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印*'1农五、發明説明（2与 Η B V探針 (iii)序列數目：55 (i V)通訊住址 (A )收信人:Morrison & Foerster (B )街：755 Page Mi 11 Road (C )市：Palo Alto (D )州：加州 (E )國家：U S A (F ) ZIP:943 0 4-1018 (v )電腦可讀型式 (A) 介質型式：Floppy disk (B) 電腦：IBM PC可相容 (C) 操作条統：PC-DOS/MS- D 0 S (D )軟體：Patent In Release #1.0，Ve r s -ion #1.25 (vi)目前申請資料 (A) 申請編號：07/813, 586 (B) 立檔日期：22 — DEC-1991 (C )分類： Uiii)法律事務資料 (A) 名稱：Thomas E.. Ciotti (B) 註册號：21, 013 (C) 參考/索引：22300 — (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） -31 - 五、發明説明（30 ix)電傳資料 A6 B6 2 0 2 3 4. 0 0

(A) 電話：415 — 813-5600 (B) 電報：4 1 5 — 494 — 0792 (C) 電傳：706141 (2 ) S E Q. ID ΝΟ:1 之資料 (i )序列特性 (A)長度：7鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 1 TGACTGR ----------------ο------裝——-----^訂-----f f (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製

(2 ) S E Q ID N〇:2 之資料 (i )序列特性 (A)長度：60鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID NO

CGTGGAGACA CGGGTCCTAT GCCT 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货）一32 一經滴部中央標準局員工消费合作社印S衣 ^^3845 A6 _B6_ 五、發明説明（3i (2 ) S E Q ID N〇:3 之資料 (i )序列特性 (A)長度：60鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 Ui)序列說明：SEQ ID N 0 ： 3 ： GATGTGGTTG TCGTACTTGA TGTGGTTGTC GTACTTGATG TGGTTGTCGT ACTTGCGTAG (2 ) S E Q ID N〇:4之資料 (i )序列特性 (A)長度：1 6鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 4 ： TCCACGAAAA AAAAAA (2 ) S E Q ID N〇:5 之資料 (i )序列特性 -----------------ο------裝---r----，玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） -33 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（33 (A)長度：12鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 5 ： CAGTCACTAC GC (2 ) S E Q. ID N〇:6 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 6 ：

TTGTGGGTCT TTTGGGYTTT GCTGCYCCWT (2 ) S E Q ID N0:7 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）一 34 _ ,.|------.----r----ο------裝-1^---- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經漓部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（3含

(xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 7 ： CCTKCTCGTG TTACAGGCGG GGTTTTTCTT (2 ) S E Q. ID N0:8 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(X i)序列説明：S E Q ID N〇：8 : TCCATGGCTG CTAGGSTGTR CTGCCAACTG (2 ) S E Q ID N〇:9 之資料 (i )序列特性 (A )長度：3 0鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 9 ： GCYTATAGAC CACCAAATGC CCCTATCYTA i.-------r---.----ο------裝------*、玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -35 - ^93845 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印*'衣五、發明説明（34 (2 ) S E Q ID N0:1〇之資料 (i )序列特性 (A)長度·· 30鹼基對 (B )型式··核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO： 10： CTGTTCAAGC CTCCAAGCTG TGCCTTGGGT (2 ) S E Q ID N〇：11之資料 (i )序列特性 (A)長度：30驗基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 11: CATGGAGARC AYMACATCAG GATTCCTAGG (2 ) S E Q ID N0:12 之資料 (i )序列特性 (A )長度：3 1鹼基對 (B )型式：核酸 _·'------.----：----ο------裝——丨---rn (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -36 - A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（33 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (X i)序列說明：S E Q ID NO： 12： TCCTGGYTAT CGCTGGATGT GTCTGCGGCG T (2 ) S E Q ID N0:13 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO： 13： GGCGCTGAAT CCYGCGGACG ACCCBTCTCG (2 ) S E Q ID N0:14 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID NO： 14： (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) .0. .裝 " 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） -37 - 經濟部中央標準局員工消t合作社印製 A6 _B6_ 五、發明説明（36)

CTTCGCTTCA CCTCTGCACG THGCATGGMG (2 ) S E Q ID NO: 15 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO： 15：

GGTCTSTGCC AAGTGTTTGC TGACGCAACC (2 ) S E Q ID NO: 16 之資料 (i )序列特性 (A)長度：3 ◦鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

Ui)序列説明：SEQ ID NO： 16：

CCTKCGCGGG ACGTCCTTTG TYTACGTCCC (2 ) S E Q ID NO: 17 之資料 (i )序列特性 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) ο -丨裝· " 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） -38 - A6 B6 經部中央標準局員工消费合作社印3Ϊ 五、發明説明（33 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學··線型 (xi)序列説明：SEQ ID NO： 17： MCCTCTGCCT AATCATCTCW TGTWCATGTC (2 ) S E Q ID NO:18 之資料 (i )序列特性 (A)長度：3 0驗基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID NO： 18： CGACCACGGG GCGCACCTCT CTTTACGCGG (2 ) S E Q ID NO: 19 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (請先閱讀背面之注意事項再場寫本頁)

C .裝. · -f 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公發） -39 - 經漓部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（3沒

(Xi)序列説明：SEQ ID NO： 19： TGCCCAAGGT CTTACAYAAG AGGACTCTTG (2 ) S E Q ID N0:20 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹺基對 (B )型式··核酸 .(C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 2 0 ： CGTCAATCTY CKCGAGGACT GGGGACCCTG (2 ) S E Q ID NO :21 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 2 1 ： ATGTTGCCCG TTTGTCCTCT AMTTCCAGGA (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) -裝· ，11· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货）一 40 一 ^93845 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（39 (2 ) S E Q ID N0:22 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(X i)序列說明：S E Q ID NO ： 2 2 ： ATCTTCTTRT TGGTTCTTCT GGAYTAYCAA (2) SEQ ID NO:23之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

U i)序列説明：S E Q ID Ν Ο : 2 3 ·· ATCATMTTCC TCTTCATCCT GCTGCTATGC (2) SEQ ID N0:24之資料 (i )序列特性 (A)長度：3 ◦鹸基對 (B )型式：核酸 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· 訂_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -41 - A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印？.衣五、發明説明（40 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 2 4 ： CAATCACTCA CCAACCTCYT GTCCTCCAAY (2 ) S E Q ID N0:25 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 2 5 ： GTGTCYTGGC CAAAATTCGC AGTCCCCAAC (2 ) S E Q ID NO:26 之資料 (i )序列特性 (A)長度·· 30驗基對 (B )型式··核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 2 6 ： (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝. -訂. 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） -42 - A6 B6 經滴部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（41) CTCGTGGTGG ACTTCTCTCA ATTTTCTAGG (2 ) S E Q ID NO:27 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 7 ： GACAAGAATC CTCACAATAC CRCAGAGTCT (2 ) S E Q ID N0:28 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 ,(xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 8 ： 1 TTTTGGGGTG GAGCCCKCAG GCTCAGGGCR (2 ) S E Q ID N〇:29 之資料 (i )序列特性本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -43 - -----------------------裝---r---玎 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) *^^3845 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印制衣五、發明説明（40 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 2 9 ： CACCATATTC TTGGGAACAA GAKCTACAGC (2 ) S E Q. ID NO :30 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 Ui)序列説明：SEQ ID NO: 3〇： ACACTTCCGG ARACTACTGT TGTTAGACGA (2 ) S E Q ID NO:31 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (請先閲讀背面之注意事項再塌寫本頁) -丨裝. •ΤΓ. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）一 44 — A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

五、發明説明（43) (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 3 1 ： GTVTCTTTYG GAGTGTGGAT TCGCACTCCT (2 ) S E Q ID NO:32 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 32: TTGGAGCWWC TGTGGAGTTA CTCTCKTTTT (2 ) S E Q ID N〇:33 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 3 3 ： TTTGGGGCAT GGACATYGAY CCKTATAAAG (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -45 - A6 B6 經濟部中央標準局員工消赍合作社印製五、發明説明（4伞 (2 ) S E Q ID N0:34 之資料 (i )序列特性 (A)長度：3 ◦鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 3 4 ： AAWGRTCTTT GTAYTAGGAG GCTGTAGGCA (2) SEQ ID N0:35之資料 (i )序列特性 (A)長度：30齡基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 3 5 ： RGACTGGGAG GAGYTGGGGG AGGAGATTAG (2) SEQ ID N〇：36之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. “訂‘ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公) -46 - 293845 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（4力 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 3 6 ： CCTTGAGGCM TACTTCAAAG ACTGTKTGTT (2 ) S E Q ID N0:37 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 3 7 ： GTCTGTGCCT TCTCATCTGC CGGWCCGTGT (2 ) S E Q ID N0:38 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 3 8 ： (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. -訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210乂 297公楚·) -47 _ A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印5衣五、發明説明（物 AGCMGCTTGT TTTGCTCGCA GSMGGTCTGG (2 ) S E Q ID NO: 39 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 39: GGCTCSTCTG CCGATCCATA CTGCGGAACT (2 ) S E Q ID N〇:40 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID N〇：4〇： MTKAACCTTT ACCCCGTTGC TCGGCAACGG (2 ) S E Q ID N0:41 之資料 (i )序列特性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公笼）一48 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝- 訂_ A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製五、發明説明（4) (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 Ui)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 4 1 ： GTGGCTCCAG TTCMGGAACA GTAAACCCTG (2 ) S E Q ID N0:42 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30驗基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 4 2 ： KAARCAGGCT TTYACTTTCT CGCCAACTTA (2 ) S E Q ID NO :43 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .丨裝· 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -49 - 293845 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（4沒

(xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 4 3 ： CCTCCKCCTG CCTCYACCAA TCGSCAGTCA (2) SEQ ID NO :44 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(X i)序列説明：S E Q ID Ν Ο ： 4 4 ： ACCAATTTTC TTYTGTCTYT GGGTATACAT (2) SEQ ID N〇:45之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(X i)序列説明：S E Q ID N 0 ： 4 5 ： TATTCCCATC CCATCRTCCT GGGCTTTCGS (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) —裝· -訂. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發）一50 _ A6 B6 五、發明説明（49 (2 ) S E Q ID N〇:46 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹸基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(χί)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 4 6 ： TATATGGATG ATGTGGTATT GGGGGCCAAG (2 ) S E Q ID N0:47 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型經濟部中央標準局員工消费合作社印？" (請先閲讀背面之注意事項再碩寫本頁) -裝.

(xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 4 7 ： CGTAGGGCTT TCCCCCACTG TTTGGCTTTC (2) SEQ ID NO :48 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公辁） -51 - A6 B6 五、發明説明（50) (C )股性··單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 4 8 ：

GCTCAGTTTA CTAGTGCCAT TTGTTCAGTG (2) SEQ ID N0:49之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

(xi)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 4 9 ： CCTATGGGAG KGGGCCTCAG YCCGTTTCTC (2 ) S E Q ID N0:50 之資料 (i )序列特性經滴部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再^寫本頁) .裝. (A)長度：3 ◦鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型

Ui)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 5 0 ：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） -52 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 293845 A6 _；_B6 五、發明説明（51)

GTCCCCTAGA AGAAGAACTC CCTCGCCTCG (2 ) S E Q ID N0:51 之資料 (i )序列特性 (A )長度：3 1鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 5 1 ：

ACGMAGRTCT CMATCGCCGC GTCGCAGAAG A (2 ) S E Q ID N〇:52 之資料 (i )序列特性 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性··單股 (D )拓撲學：線型

Ui)序列説明：SEQ ID Ν Ο ： 5 2 ：

CAATCTCGGG AATCTCAATG TTAGTATYCC (2 ) S E Q ID N0:53 之資料 (i )序列特性 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· -11· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公坌） -53 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（52 (A)長度：30鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 5 3 ：

GACTCATAAG GTSGGRAACT TTACKGGGCT (2 ) S E Q ID N0:54之資料 (i )序列特性 (A)長度：20鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 5 4 ：

AGGCATAGGA CCCGTGTCTT (2) SEQ ID N〇:55之資料 (i )序列特性 (A)長度：20鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線型本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公货） -54 ~ (請先閲讀背面之注意事項再墙寫本頁) .裝. 訂_ A6 B6 五、發明説明（53

(xi)序列說明：SEQ ID NO ： 5 5 ： CTTCTTTGGA GAAAGTGGTG ------------------一-------裝------l.訂----- (請先閲讀背面之注意事項再罐、寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货）

Claims

203845 J修正補无經濟部中央標準局員工消費合作社印製 f·咁』 C8 D8々、申請專利範圍附件一（A )：第82 1 00428號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國85年10月修正 1 . 一種合成的寡核苷酸，其係充作B型肝炎病毒（ Η B V )三明治雜交分析中之擴大探針，其係由下列片段所組成第一片段，其核苷酸序列係至少9 0%同質於HBV 核酸片段；及第二片段，其係包含至少9 0 %同質於一核酸多體之寡核苷酸片段的核苷酸序列，其中該核酸多體是一種分枝的多核苷酸，其係包含至少一種.至少9 0%同質於該第二片段之寡核苷酸片段，且其中該第二片段不與HBV核酸互補，其中該至少9 0%同質於HBV核酸片段的核苷酸序列係選自 TTGTGGGTCTTTTGGGYTTTGCTGCYCCWT (SEQ ID NO: S), CCTKCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTT (SEQ ID NO : 7 ), TCCATGGCTGCTAC-GSTGTRCTGCCAACTG (SEQ ID NO : 8 ), GCYTAYAGACCACCajVATGCCCCTATCYTA (SEQ 工D NO :9), CTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGT (SEQ ID NO: 10), CATGGAGARCAYMACATCAGGATTCCTAGG (SEQ ID NO: 11), , TCCTGGYTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT (SEQ ID NO: 12) , j ^ GGCGCTGAATCCYGCGGACGACCC3TCTCG (SEQ ID NO :13),ί 0 __ · ' .- CTTCGCTTCACCTCTGCACGTHGCATGGMG (SEQ ID NO: 14), ' ^ -_____________ " GGTCTSTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACC (SEQ ID NO : 15 ), CCTKCGCGC-GACGTCCTTTGTYTACGTCCC (SEQ ID NO :16), MCCTCTGCCTAATCATCTCWTGTWCATGTC (SEQ ID.NO :17), CGACCACGCGGCGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID ^0:10), TGCCCAAGGTCTTACAYAAGAGGACTCTTG (SEQ ID NO: 19), 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂1 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 CGTCAATCTYCKCGAGGACTGGOGACCCTG (SEQ ID N〇：20), ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAMTTCCAGGA (SEQ ID NO :21), ATCTTCTTRTTGGTTCTTCTGGAYTAYCAA (SEQ ID -NO :22), ATCATMTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC (SEQ ID NO : 23 ), CAATCACTCACCAACCTCYTGTCCTCCAAY (SEQ ID NO :24), GTGTCYTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC (SEQ ID NO :25), .CTCGTGGTGG.ACTTCTCTCAATTTTCTAGG (SEQ ID NO:2 6), GAC^AGAATCCTCACAATACCRCAGAGTCT (SEQ ID NO:27), TTTTGGGGTGGAGCCCKCAGGCTCAGGGCR (SEQ ID NO :28), CACCATATTCTTGGGAAC)_AGAJCCTACAGC ACACTTCCGGAiL\CTACTGTTGTTAGACGA GTVTCTTTYGGAC-TGTGGATTCGCACTCCT TTGGAGCWWCTGTGGAGTTACTCTCKTTTT TTTGGCC-CATGGACATYGAYCCKTATAiAG AAWGRTCTTTGTAYTAGGAGGCTGTAGGC\ RGACTGGC-AGGAGYTGGGGGAGGAGATTAG CCTTGAGC-C-ITACTTCAAAQACTGTKTGTT GTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGWCCGTGT AGCMGCTTGTTTTGCTCGCAGSMGGTCTGG GGCTCSTCTGCCGATCCATACTGCGC-AACT MTKAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGG GTGGCTCCAGTTCMGGAACAGTAAACCCTG KAARCAGC-CTTTYACTTTCTCGCCAACTTA CCTCCKCCTGCCTCYACCAATCGSCAGTCA ACCAATTTTCTTYTGTCTYTGGGTATACAT (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO :29), NO :3 0), NO :31), NO :3 2), NO :3 3), NO :3 4), N〇：3 5), NO :3 6), NO :3 7), NO :3 8), NO :3 9), NO :4 0);. NO :41), NO :4 2), NO:43), NO:44). 及 I。一裝------訂—.----(線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 2.如申請專利範圍第1項所述之合成的寡核苷酸，其中該第2片段包括AGGCATAGGACCCGTGTCTT (SEQ ID No：54) s ί '.一 3. —種合成的寡核苷酸，其係充作HBV三明治雜交分析中之捕獲探針，其係由下列片段所組成 J· Λ«< r9 wit · -Λτ rn 1 - r-et ，― ι____. 个 A s N c 竿樣豕因 τ 公 7 9 2 X 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 A8 B8 C8 · D8c、申請專利範圍第一片段，其核苷酸序列係至少9 0%同質於H B V 核酸片段；及第二片段，其係包含至少9 0 %同質於結合至固相之寡核苷酸的核苷酸片段，其該第二片段不與Η B V核酸互補，其中該至少9 0%同質於HBV核酸片段之核苷酸序列係選自 TATTCCC\TCCCATCRTCCTGGGCTTTCGS (SEQ ID NO:45), TATATGGATGATGTC^TATTGGC-C-C-CCAAG (SEQ ID NO:46), ' CGTAGGC-CTTTCCCCCACTGTTTGC-CTTTC (SEQ ID NO: 47), i ' GCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG (SEQ ID NO :48), * CCTATGC-GAGKGGGCCTCAGYCCGTTTCTC (SEQ 工D NO :49 ), ' .GTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCC-CCTCG (SEQ 工D NO :50), ACGMAGRTCTCMATCC-CCGCGTCGCAGAAGA (SEQ ID NO :51), CAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATYCC (SEQ ID NO :52), 及 GACTCATAAGGTSC-GRAACTTTACK.GGGCT (SEQ ID NO :53). 4.如申請專利範圍第3項所述之合成的寡核苷酸，其中該第二片段包括 I CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (SEQ ID No：55) V τ ^ 5. —種合成的寡核苷酸組，其係充作HBV三明治雜交分析中之擴大探針，其包含至少二種不同的寡核苷酸探針，其中每個寡核苷酸探針包含：第一片段，其核苷酸序列係至少9 0%同質於HB V ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 3 _ ml mu I I 1— n i 1 - i ml —81 —l·—I、一 ·- 1:-- In 1 —— I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一93845 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍核酸片段；及第二片段，其係包含至少9 0%同質於一核酸多體之核苷酸片段的核苷酸序列，其中該核酸多體是一種分枝的多核苷酸，其係包含至少一種至少9 0%同質於該第二片段之寡核苷酸片段，且其中該第二片段不與Η B V核酸互補，其中該至少9 0%同質於HBV核酸片段的核苷酸序 ι 列係選自 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局員工消費合作社印製 TTGTGGGTCTTTtGGGYTtTGCTGCYCCWT. (SEQ ID NO: 6), CCTKCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTT (SEQ ID NO :7), TCCATGGCTGCTAGGSTGTRCTGCCAACTG (SEQ 工D NO :8), • - -- - * . GCYTAYAC-ACCA.CCAAATGCCCCTATCYTA (SEQ ID NO : 9 ), r] CTC-TTCAAGCCTCCAAGCTC-TC-CCTTGGGT (SEQ ID NO: 10), 广 CATGGAGARCAYMACATCAGGATTCCTAGG (SEQ ID NO: 11), 、） TCCTGGYTATCGCTGC-ATGTGTCTGCC-GCGT (SEQ ID NO :12), GGCGCTGAATCCYGCGGACGACCCBTCTCG (SEQ ID NO:13), CTTCGCTTCACCTCTGCACGTHC-CATGGMG (SEQ ID NO： 14), GOTCTSTGCCAAGTGTTTC-CTGACGCAACC (SEQ ID NO :15), CCTKCGCC-GGACGTCCTTTGTYTACGTCCC (SEQ 工 D NO: IS ), 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐厂4 -

經濟部中央揉準局貞工消費合作社印裝 MCCTCTGCCTAATCATCTCWTGTWCATGTC. (SEQ ID NO: 17), CGACCACGC«CGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID NO :18), TGCCCAAGGTCTTACAYAAGAC-GACTCTTG (SEQ ID NO： 19),: • · 1 CGTCAA.TCTYCKCGAGGACTGGGGACCCTG (SEQ ID NO : 20 ) , | ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAi-iTTCCAGGA (SEQ ID NO : 21), ATCTTCTTRTTC-GTTCTTCTGGAYTAYCAA (SEQ ID NO :22), ATCATMTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC (SEQ ID NO :23), CAATCACTCACCAACCTCYTGTCCTCCAAY (SEQ ID NO:24), GTGTCYTGGCC^AAATTCC-CAGTCCCCAAC (SEQ ID NO : 25) , i CTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG (SEQ ID NO:26), GACAAGAATCCTCACAATACCRCAGAGTCT (SEQ ID NO : 27), TTTTGGGGTGGAGCCCKCAGGCTCAGGGCR -(SEQ ID NO:28), CACCATATTCTTGGGAACAAGAKCTACA.GC (SEQ ID NO:29), ACACTTCCGGAilACTACTGTTGTTAGACGA (SEQ ID NO: 30), GTVTCTTTYGGAGTGTGGATTCGCACTCCT (SEQ ID NO :31), TTGGAGCWWCTGTGGAGTTACTCTCKTTTT (SEQ ID NO: 32) , | TTTGGC-GOVTGGACATYGAyCCKTATAAAG (SEQ ID NO : 3 3 ), A.ZIWGRTCTTTGTAYTAGGAGGCTGTAGGCA (SEQ ID N〇：34), RGACTGGGAGGAGYTGGC-GGAGGAGATTAG (SEQ ID NO : 3 5 ), CCTTGAC-GC>ITACTTCAAAGACTGTKTGTT (SEQ ID NO : 3 6 ), GTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGWCCGTGT (SEQ ID N〇：3 7), AGCMGCTTGTTTTGCTCGCAGSMGGTCTGG (SEQ ID NO : 3 8 ) , | GGCTCSTCTGCCGATCCATACTGCGGAACT (SEQ ID NO: 39), MTKAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGG (SEQ ID NO : 40 ), GTGGCTCCAGTTCWGGAACAGTAAACCCTG (SEQ ID NO: 41), KAARCAGGCTTTYACTTrCTCGCCAACTTA (SEQ ID NO : 42 ), CCTCCKCCTGCCTCYACCAATCGSCAGTCA (SEQ ID NO:43), ! ACCPATrrrrCTTYTGTCTYTGGGTATACAT (SEQ ID NO :44).

一 I 裝 ~一 ''訂一.----ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .ii 293845 AS B8 C8 D8 經濟部中央標準局員工消費合作社印袋、申請專利範圍 6. 如申請專利範圍第5項所述之合成的寡核苷酸組，其中該第二片段包括h: AGGCATAGGACCCGTGTCTT (SEQ ID NO：54) 7. —種合成的寡核苷酸組，其係充作 Η B V三明治雜交分析中之捕獲探針，其係包含至少二種不同的寡核苷酸探針，其中每個寡核替探針包含：第一片段，其核苷酸序列係至少9 0%同質於HBV 核酸片段；及第二片段，其係包含至少9 0%同質於結合至固相之寡核苷酸之核苷酸序列，其中該第二片段不與Η Β V核酸片段互補，其中每一個至少9 0%同質於HBV g酸片段的該核苷酸片段係選自 TATTCCCATCCCATCRTCCTGGGCTTTCGS (SEQ ID NO: 45), TATATGGATGATGTGGTATTGGGC-GCCAAG (SEQ ID NO: 4S), CGTAGGGCTTTCCCCC^CTGTTTGGCTTTC (SEQ ID ：47), GCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG (SEQ ID NO : 4 8 ), CCTATGC-GAGKGC-GCCTCAGYCCGTTT.CTC (SEQ ID NO : 49 ), GTCCCCTAC-AAGAAGAACTCCCTCGCCTCG (SEQ ID NO: 50), ACGMAGRTCTC-IATCGCCC-CGTCGCAGAAGA (SEQ ID NO : 51), CAA.TCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATYCC (SEQ ID NO :52), 及 GACTCATAAGGTSGGRAACTTTACKGGGCT (SEQ ID NO: 53). 8.如申請專利範圍第7項之合成的寡核m酸組，其中該第二片段包括CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG (SEQ ID N0:55)。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 良紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐厂 S93845 ABCD 經濟部中央橾隼局貝工消費合作社印裝六、申請專利範圍 9 .—種於樣品中偵測Η B V存在的溶液相三明治式雜交分析方法，其包括 (a )於雜交條件下，將樣品與下列探針接觸：（i )擴大探針，包括申請專利範圍第5項之合成的寡核苷酸組’及（i i )捕獲探針，包括申請專利範圍第7項之合成的寡核苜酸組，其中有莫耳數超過樣品中分析核酸的擴大探針或捕獲探針； (b )在雜交條件下，將（a )步驟產物與結合至固相之該寡核苷酸接觸； (c )之後分出未結合至固相之物質： (d )於雜交條件下，將（c )步驟之結合產物與核酸多體接觸，該多體包括9 0%以上同質於擴大探針多核 Μ酸第二片段之至少一種寡核苷酸片段，及9 0 %以上同質於經檩記寡核奋酸之許多的第二寡核苷酸片段； (e)移去未結合之多體； (f )在雜交條件下，將（e )步驟之固相複合物產物與經標記之寡核苷酸接觸： (g )移去未結合之經標記的寡核苷酸；及 (h )於（g )步驟之固相複合物產物中偵測標記物之存在。 10.—種於樣品中偵測HBV用之套組，其包含下列之組合 f丨裝""" ^訂^----^ ·線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐/ ^〇3Q45 Δ8 Ασ Β8 C8 * ___ D8 七、申請專利範圍 (i )—組擴大探針寡核苷酸，其包括申請專利範圍第5項之合成寡核苷酸組； (i i ) 一組捕獲探針寡核苷酸，其包括申請專利範圍第7項之合成寡核苷酸組； i i) 一種核酸多體，該多體包括90%以上同質於擴大探針多核替酸第二片段之至少一種寡核苷酸片段 ’及9 0%以上同質於經標記之寡核苷酸之許多的第二寡核苷酸片段；及 (i v )—種經標記之寡核苷酸。 -------_裝丨-------訂丨·----f 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局WC工消費合作社印裝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M规格（2丨〇χ297公釐）'